phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase

Laccase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như tẩy trắng bột giấy,tẩy màu thuốc nhuộm vải, ứng dụng trong chế biến thực phẩm thông qua việc đưa vàocác quy trình xử lý sinh học

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, em đã nhận được những sự quan tâm giúp đỡ của rất nhiều cá nhân và tập thể.

Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc của mình đến giảng viên ThS Trịnh Thị Thu Thủy người đã dành nhiều thời gian, tâm huyết, tận tình giúp đỡ và trực tiếp hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp này.

Em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm, chỉ bảo của thầy giáo TS Nguyễn Văn Giang, ThS Nguyễn Thị Bích Lưu cùng các thầy cô và cán bộ trong khoa Công nghệ sinh học – Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho em trong quá trình thực hiện đề tài.

Cuối cùng em xin gửi tới gia đình, bạn bè và tập thể lớp CNSH-K52 lời cảm ơn cùng những tình cảm chân thành nhất vì những sự động viên giúp đỡ quý báu mà mọi người đã dành cho em trong suốt thời gian qua.

Em xin chân thành cảm ơn!

MỤC LỤC

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Laccase 3

2.2 Các nguồn thu laccase 3

2.2.1 Laccase vi sinh vật 3

2.2.2 Laccase từ thực vật 4

2.3 Cấu tạo của laccase 5

2.3.1 Khối lượng phân tử 5

2.3.2 Cấu trúc không gian 6

2.4 Đặc tính của laccase 8

2.4.1 Các chất ức chế hoạt tính laccase 8

2.4.2 Tính đặc hiệu cơ chất 8

2.4.3 Nhiệt độ và pH tối ưu 9

2.4.4 Km và Vmax 10

2.4.5 Các isozyme 12

2.5 Cơ chế xúc tác của laccase 12

2.6 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp laccase 14

2.6.1 Nguồn cacbon 14

2.6.2 Nguồn nitơ 15

2.6.3 Nhiệt độ 15

2.6.4 pH 15

2.7 Ứng dụng của laccase 16

2.7.1 Ứng dụng trong công nghiệp 16

2.7.2 Ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường 16

PHẦN III VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 18

ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 18

3.1 Địa điểm nghiên cứu 18

3.2 Thời gian nghiên cứu 18

3.3 Đối tượng và vật liệu nghiên cứu 18

3.3.1 Đối tượng 18

3.3.2 Thiết bị và hóa chất 18

3.3.3 Môi trường 19

3.3.4 Cơ chất 20

3.4 Phương pháp nghiên cứu 20

3.4.1 Phương pháp vi sinh vật 20

3.4.2 Phương pháp hóa sinh – Phương pháp xác định hoạt tính laccase 21

3.4.3 Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng nấm mốc phân lập được 23

3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase của chủng nấm 24

3.4.5 Xác định một số tính chất hoá sinh của laccase thô 25

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26

4.1 Phân lập các chủng nấm mốc sinh tổng hợp laccase 26

4.2 Đánh giá khả năng tổng hợp laccase của 5 chủng phân lập được 33

4.3 Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng BV1 34

4.4 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp laccase của chủng BV1 35 4.4.1 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh tổng hợp laccase 35

4.4.2 Ảnh hưởng của pH đầu đến khả năng sinh tổng hợp laccase 36

4.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sinh tổng hợp laccase 38

4.4.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng sinh tổng hợp laccase 38

4.4.5 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp laccase 40

4.4.6 Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 lên khả năng sinh tổng hợp laccase 42

4.4.7 Ảnh hưởng của các chất cảm ứng đến sinh tổng hợp laccase 43

4.5 Xác định một số đặc tính của laccase 44

4.5.1 Xác định nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt của laccase 44

4.5.2 Xác định pH tối ưu và độ bền pH 44

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Kiến nghị 44

TÀI LIỆU THAM KHẢO 44

ABTS 2,2'-azino-bis 3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid

NAD(P)+ Nicotine-Adenine Dinucleotide Phosphate+

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1: Khối lượng phân tử và số lượng isozym laccase từ một số chủng nấm mốc….5Bảng 2: Một vài đặc tính của laccase từ một số chủng nấm ………10Bảng 3: Thành phần phản ứng ……….22Bảng 4: Một số đặc điểm hình thái của 5 chủng nấm mốc phân lập được ………… 29 Bảng 5: Hoạt độ enzyme laccase và trọng lượng khô của 5 chủng nấm mốc……… 33

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Cấu trúc bậc ba của laccase từ Melanocarpus albomyces……… 7

Hình 2: Trung tâm hoạt động của laccase ……… 7

Hình 3: Quá trình oxy hóa syringaldazine thành dạng quinone tương ứng bởi laccase 8

Hình 4: Cơ chế xúc tác của laccase……… 13

Hình 5: Các kiểu xúc tác của laccase ……… 14

Hình 6: Khả năng phân hủy axit tannic chủng BN2-2 ……….27

Hình 7: Khả năng phân hủy syringaldazine của chủng BV1 ……… 27

Hình 8: Hình ảnh khuẩn lạc, sợi nấm và bào tử của 5 chủng nấm mốc ……… 32

Hình 9: Ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh trưởng của BV1 ………….40

Hình 10: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trưởng của BV1……….42

Hình 11: Ảnh hưởng của nguồn nitơ lên khả năng sinh trưởng của BV1……….43

Hình 12: Ảnh hưởng của pH đệm đến khả năng phản ứng của laccase ……… 47

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ

Đồ thị 1: Tỷ lệ giữa hoạt độ laccase và sinh khối của 5 chủng nấm mốc ………33

Đồ thị 2: Đường cong sinh trưởng của chủng nấm mốc BV1……… 34

Đồ thị 3: Ảnh hưởng của thời gian tới khả năng tổng hợp laccase của BV1 ……… 35

Đồ thị 4: Ảnh hưởng của pH đầu tới khả năng tổng hợp laccase của BV1 ………… 37

Đồ thị 5: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng tổng hợp laccase của BV1 ……… 38

Đồ thị 6: Ảnh hưởng của nguồn carbon đến khả năng tổng hợp laccase ……….39

Đồ thị 7: Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp laccase ……… 41

Đồ thị 8: Ảnh hưởng của nồng độ CuSO4 lên khả năng sinh laccase ……… 42

Đồ thị 9: Ảnh hưởng của các chất cảm ứng lên khả năng sinh laccase ………44

Đồ thị 10: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng của laccase ………45

Đồ thị 11: Ảnh huởng của nhiệt độ đến độ bền của laccase từ chủng BV1 ………….46

Đồ thị 12: Ảnh hưởng của pH đệm đến phản ứng của laccase ……….47

Đồ thị 13: Độ bền pH của laccase từ chủng BV1 ………48

TÓM TẮT

Laccase (E.C.1.10.3.2) thuộc nhóm enzyme oxidase, cụ thể là polyphenoloxidase có chứa 4 nguyên tử đồng ở trung tâm hoạt động và có khả năng oxy hóa cơchất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử

Laccase được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau như tẩy trắng bột giấy,tẩy màu thuốc nhuộm vải, ứng dụng trong chế biến thực phẩm thông qua việc đưa vàocác quy trình xử lý sinh học xử lý các nguồn nước thải bị ô nhiễm bằng việc loại bỏcác hợp chất phenol, ứng dụng trong việc xử lý phụ phẩm của sản phẩm nông nghiệp

để tạo nguyên liệu cho các quá trình khác

Đề tài được tiến hành nhằm mục đích phân lập và tuyển chọn các chủng nấmmốc có nguồn gốc từ gỗ mục trong tự nhiên có hoạt tính laccase, nhằm tạo ra mộtlượng lớn enzyme laccase dùng để xử lý hợp chất lignin từ các phụ phẩm của ngànhnông nghiệp

Để tìm được chủng nấm mốc có các đặc tính phù hợp với yêu cầu của đề tàinghiên cứu, chúng tôi tiến hành thu thập nhiều mẫu gỗ mục ở các địa phương khácnhau, nuôi cấy và làm thuần đối với các chủng phân lập được Sau đó chúng tôi thựchiện các phuơng pháp sàng lọc định tính và xác định hoạt độ enzyme tổng số để chọn

ra chủng có hoạt độ laccase cao nhất phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo, bước đầuthu được một số kết quả sau:

- Phân lập được 5 chủng nấm mốc có hoạt tính laccase kí hiệu là: BN1,

BN2-1, BN2-2, ĐA3-1 và BVBN2-1, tuyển chọn đuợc chủng BV1 là chủng có hoạttính laccase cao nhất

- Đánh giá được đặc điểm hình thái khuẩn lạc, đặc điểm của sợi nấm và bào

tử nấm của 5 chủng nêu trên

- Xây dựng được đường cong sinh trưởng của chủng BV1

- Tìm được các điều kiện thích hợp cho sinh trưởng và tổng hợp enzyme củachủng BV1 như: thời gian nuôi cấy là 6 ngày, nhiệt độ thích hợp là 300C, pH

5, nguồn carbon và nitơ phù hợp nhất là glucose và asparagine, nồng độCuSO4 thuận lợi cho tổng hợp enzyme là 200µM, chất cảm ứng sinh tổnghợp enzyme thích hợp nhất là ABTS (2mM)

- Xác định đuợc một số tính chất hoá sinh của laccase thô thu được từ chủngBV1 bao gồm: nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của enzyme là 400C và

pH 6.5 Laccase thô từ chủng BV1 bền nhiệt ở ngưỡng nhiệt độ dưới 600C

và độ bền pH đạt được ở mức pH 7

PHẦN I: MỞ ĐẦU

Ngày nay việc sử dụng enzyme trong sản xuất và đời sống ngày càng đượcnhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu và thực tế cho thấy chế phẩm enzyme đangđược sử dụng phổ biến ở nhiều nước đã mang lại lợi ích kinh tế khá lớn, đặc biệt là cácenzyme có khả năng phân hủy các hợp chất thơm đa vòng Điển hình trong số đó làenzyme laccase

Laccase thuộc nhóm polyphenol oxydase do đó có khả năng oxy hóa diphenol

và các hợp chất có liên quan Ưu điểm vượt trội của laccase là có tính oxy hóa mạnh

và sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử vì vậy mà có thể tiến hành nghiên cứu

để đưa vào ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp cũng như trong xử lý ô nhiễm môitrường Laccase còn được biết đến như một enzyme thân thiện với môi trường do trongphản ứng laccase chỉ cần lấy oxy từ không khí và sản phẩm phụ duy nhất tạo thành sauphản ứng là nước (Sergio Riva, 2006)

Laccase có thể được thu từ các nguồn khác nhau như thực vật, vi khuẩn, côntrùng và phổ biến nhất là nấm mốc Hiện nay nhiều chủng nấm sợi đã được phát hiện

cho thấy khả năng tổng hợp laccase rất tốt như: Rhizoctonia solani (J D Crowe và S Olsson, 2001), Trametes versicolor (R Bourbonnais và cộng sự, 1995), Melanocarpus

albomyces (Laura và L.Kiiskinen, 2005), Trametes modesta (G.S Nyanhongo và cộng

sự, 2002) Đồng thời do nấm mốc có khả năng sinh trưởng phát triển mạnh nên còn tạo

thuận lợi rất nhiều cho việc sản xuất laccase ở quy mô lớn phục vụ trong công nghiệp

và đời sống

Trong những năm gần đây, laccase được ứng dụng phổ biến trên nhiều lĩnh vựckhác nhau như tẩy trắng bột giấy, tẩy màu thuốc nhuộm vải, ứng dụng trong chế biếnthực phẩm thông qua việc đưa vào các quy trình xử lý sinh học (A.Kunamneni và cộng

sự, 2007) Laccase còn được sử dụng trong tổng hợp chất hữu cơ, xử lý các nguồnnước thải bị ô nhiễm bằng việc loại bỏ các hợp chất phenol, ứng dụng trong việc xử lý

phụ phẩm của sản phẩm nông nghiệp để tạo nguyên liệu cho các quá trình khác Phổứng dụng của laccase được mở rộng bằng việc kết hợp laccase với các mediator -chấttrung gian- làm chúng có khả năng oxy hóa những hợp chất không có bản chất phenol(non-phenol).

Cùng với những ứng dụng quan trọng mà enzyme laccase mang lại đồng thờigóp phần mở rộng việc sử dụng enzyme trong thực tế sản xuất của nước ta đặc biệt làđối với các quá trình xử lý nước thải công nghiệp, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:

“Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase”.

Nội dung thực hiện:

 Phân lập và làm thuần các chủng nấm mốc từ các mẫu gỗ, lá mục trong tự nhiên

 Sàng lọc các chủng nấm mốc có hoạt tính laccase

 Xác định đặc điểm hình thái của các chủng có hoạt tính cao

 Khảo sát điều kiện nuôi (thời gian, nhiệt độ, pH)

 Khảo sát một số ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi đến khả năng sinhtổng hợp laccase

 Khảo sát một số đặc tính của enzyme (nhiệt độ tối ưu, độ bền nhiệt, pH tối ưu,

độ bền pH)

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Laccase

Laccase (E.C.1.10.3.2) thuộc nhóm enzyme oxidase, cụ thể là polyphenoloxidase Trong phân tử có chứa 4 nguyên tử đồng có khả năng oxy hóa cơ chất sửdụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử

Phổ cơ chất của laccase rất đa dạng bao gồm: diphenol, polyphenol, các dẫnxuất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, dioxin và cả các hợp chất vô cơ nhưiot

Các loại enzyme laccase tách chiết từ các nguồn khác nhau rất khác nhau vềmức độ glycosyl hóa, khối lượng phân tử và tính chất động học (Laura và LeenaKiiskinen, 2005)

2.2 Các nguồn thu laccase

2.2.1 Laccase vi sinh vật

Laccase là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, ở vi sinh vật chúng được tìm

thấy chủ yếu là ở nấm và ở một số ít vi khuẩn như Azospirillum lipoferum, Bacillus

subtilis, Streptomyces lavendulae, S.cyaneus và Marinomonas mediterranea

(A.Kunamneni và cộng sự, 2007)

Năm 1896, laccase được chứng minh có mặt ở nấm lần đầu tiên bởi Bertrand

và Laborde (C.F.Thurston, 1994) Ở nấm, Laccase đã được phân lập từAscomyceteous, Deuteromyceteous và nấm Basidiomyceteous Trong đó Ascomycetes

và Deuteromycetes chưa có các chứng minh rõ ràng về sự phân hủy lignin nhiều nhưcác nấm mục trắng Basidiomyceteous (A.Kunamneni và cộng sự, 2008)

Hoạt tính của laccase thể hiện ở khả năng phân hủy lignin và chúng được tìmthấy nhiều trong các chủng nấm Hiện nay, các nấm mục trắng là đối tượng phân hủylignin hiệu quả nhất và cũng là đối tượng nghiên cứu rộng rãi nhất Đã có hơn 100 loạilaccase được tinh chế từ nấm mốc và xác định được các đặc tính xúc tác và các đặctính sinh hóa đặc hiệu của chúng Một số chủng nấm mốc có hoạt tính laccase cao

được biết đến như: Botrytis cinere (Marbach và cộng sự, 1984), Melanocarpus

albomyces (Laura và L.Kiiskinen, 2005), Coriolus hirsutus (Kojima và cộng sự, 1990), Coriolus versicolor (Iimura và cộng sự, 1992), Phlebia radiate (Saloheimo và cộng sự,

1991)

Các mức độ phân hủy lignin khác nhau của laccase đối với các nguồn nguyênliệu có thành phần gỗ khác nhau phụ thuộc vào điều kiện môi trường và các loài visinh vật (nấm) Đến nay chưa có được chứng minh cụ thể về cơ chế duy nhất để đạtđược quá trình phân hủy hoặc loại bỏ lignin mà mỗi enzyme thu được từ các vi sinhvật khác nhau có cơ chế hoạt động khác nhau Ở thực vật, laccase ảnh hưởng tới sựhóa gỗ, trong khi ở nấm laccase còn liên quan đến nhiều quá trình tế bào, bao gồm cảloại bỏ các hợp chất lignin, hình thành bào tử, sản xuất sắc tố, sự hình thành quả thể vàgây bệnh ở thực vật Chỉ có một vài trong số các chức năng này đã được chứng minhbằng thực nghiệm (A.Kunamneni và cộng sự, 2007)

Laccase chủ yếu được biết đến là một enzyme ngoại bào nhưng cũng có nhữngtài liệu chứng minh về sự xuất hiện của laccase nội bào của nấm mục trắng Trong đólaccase nội bào có chức năng như một tiền thân cho laccase ngoại bào và không có sựkhác biệt giữa hai loại laccase này

Laccase nấm có khả năng khử oxy hóa cao hơn so với laccase vi khuẩn hoặcthực vật (lên đến 800 mV), và các quá trình diễn ra trong tự nhiên của chúng có khảnăng ứng dụng quan trọng trong công nghệ sinh học

Như vậy, laccase thu được từ nấm mốc có liên quan đến sự phân hủy ligninhoặc trong việc loại bỏ các phenol có khả năng gây độc hại phát sinh trong quá trìnhsuy thoái lignin Ngoài ra, có giả thuyết cho rằng laccase nấm còn tham gia vào sựtổng hợp của melanins dihydroxynaphthalene, sắc tố sẫm polyme do sinh vật sản xuấtchống lại áp lực môi trường hay trong tạo hình nấm do xúc tác cho sự hình thành cácsắc tố ngoại bào (A.Kunamneni và cộng sự, 2007)

2.2.2 Laccase từ thực vật

Yoshida lần đầu tiên mô tả về laccase thực vật vào năm 1883 khi ông lấy nó từ

dịch tiết của cây gỗ lacquer Rhus vernicifera (C.F.Thurston, 1994).

Sau đó, laccase được thu nhận từ bắp cải, củ cải, củ cải đường, táo, măng tây,khoai tây, quả lê và các loại rau quả khác Sự xuất hiện của laccase ở thực vật bậc cao

có rất nhiều hạn chế hơn so với nấm mốc (A.Kunamneni và cộng sự, 2007)

2.3 Cấu tạo của laccase

2.3.1 Khối lượng phân tử

Phân tử laccase thường là monomeric protein, chỉ một số là oligomeric protein,

có khối lượng phân tử dao động trong khoảng 60 – 90 kDa

Phần lớn laccase của nấm có bản chất là glycoprotein với hàm lượngcarbonhydrate chiếm khoảng 10 – 25% (K.Piontek và cộng sự, 2002)

Có nhiều công bố chỉ ra rằng mỗi loài nấm mốc riêng biệt có thể cho nhiều loại

isozym (Bảng 1) Sự thay đổi điều kiện trong quá trình nuôi cấy sinh tổng hợp laccase

có thể cho những isozym khác nhau của cùng một chủng nấm mốc (Bollag vàLeonowicz, 1984)

Bảng 1 Khối lượng phân tử và số lượng isozym laccase từ một số chủng nấm mốc

(Marièlle Bar, 2001)

isozym

Khối lượng phân tử (kda) Tài liệu tham khảo

Podospora anserina 3 70/80/390 Thurston, 1994

Agaricus bisporus 2 65/100 Perry và cộng sự, 1993

Pleurotus ostreatus 3 54/59/57 Palmieri và cộng sự, 1997;

Phanerochaete

Rhizoctonia solani 4 50-100 Wahleitner và cộng sự, 1996

Pleurotus ostreatus RK 36 1 67 Giardina và cộng sự, 1999

Ceriporiopsis

Pycnoporus cinnabarinus 1 81 Eggert và cộng sự, 1996

Pycnoporus cinnabarinus 1 63 Schliephake và cộng sự, 2000

Trametes villosa 1 63 Yaver và cộng sự, 1996

2.3.2 Cấu trúc không gian

Tất cả laccase đều giống nhau về cấu trúc trung tâm xúc tác với 4 nguyên tửđồng Những nguyên tử đồng này được chia thành 3 nhóm: loại 1 (T1), loại 2 (T2) vàloại 3 (T3), chúng khác nhau về tính chất hấp thụ ánh sáng và thế điện tử Các nguyên

tử đồng T1 và T2 có tính chất hấp phụ điện tử và tạo thành phổ điện tử mạnh, trongkhi cặp nguyên tử đồng T3 không tạo phổ hấp thụ điện tử, và có thể được hoạt hóa khiliên kết với anion mạnh (Sergio Riva, 2006)

Phân tử laccase thông thường bao gồm 3 tiểu phần (vùng) chính A, B, C cókhối lượng tương đối bằng nhau, cả ba phần đều có vai trò trong quá trình xúc tác củalaccase Vị trí liên kết với cơ chất nằm ở khe giữa vùng B và C, trung tâm một nguyên

tử đồng nằm ở vùng C và trung tâm ba nguyên tử đồng nằm ở bề mặt chung của vùng

A và C Trung tâm đồng một nguyên tử chỉ chứa 1 nguyên tử đồng T1, liên kết vớimột đoạn peptide có 2 gốc histidine và 1 gốc cystein Liên kết giữa nguyên tử đồng T1với nguyên tử S của cystein là liên kết đồng hóa trị bền và hấp thụ ánh sáng ở bướcsóng 600 nm, tạo cho laccase có màu xanh nước biển đặc trưng Trung tâm đồng 3nguyên tử có nguyên tử đồng T2 và cặp nguyên tử đồng T3 Nguyên tử đồng T2 liênkết với 2 gốc histidine bảo thủ trong khi các nguyên tử đồng T3 thì tạo liên kết với 6

gốc histidine bảo thủ (Laura và Leena Kiiskinen, 2005) (Hình 1 và Hình 2)

Hình 2: Trung tâm hoạt động của laccase

2.4 Đặc tính của laccase

2.4.1 Các chất ức chế hoạt tính laccase

Các chất ức chế của laccase thường là các ion nhỏ như azide, cyanide, fluoride.Các ion này sẽ liên kết vào trung tâm đồng 3 nguyên tử và cản trở các dòng điện tử điđến các nguyên tử này

Các chất ức chế laccase khác là ethylene diamine tetra-acetic acid (EDTA), acidbéo, tropolone, acid kojic và acid coumaric, nhưng chúng chỉ có tác dụng ức chế ởnồng độ cao

Các hợp chất chứa sulfhydryl như L-cystein, dithiothreitol và thioglycolic acidcũng được coi là các chất ức chế laccase (A.Kunamneni và cộng sự, 2007)

2.4.2 Tính đặc hiệu cơ chất

Tính đặc hiệu cơ chất của laccase thường rất thấp bởi laccase có phổ cơ chấtgiống với tyrosinase Nhưng laccase có hoạt tính ortho và para-diphenol trong khityrosinase chỉ có hoạt tính o-diphenol Chính vì vậy, chỉ có tyrosinase có hoạt tínhcresolase (oxy hóa L-tyrosine) và chỉ có laccase có khả năng oxy hoá syringaldazine

Hình 3: Quá trình oxy hóa syringaldazine thành dạng quinone tương ứng bởi

laccase.

(Marièlle Bar, 2001)

Bên cạnh đó, tính đặc hiệu cơ chất thấp còn thể hiện ở dải cơ chất rộng củalaccase Năm 1994, Thuston cho rằng hydroquynon, catechol, guacicol và 2,6-dimethoxyphenol (DMP) đều là những cơ chất tốt cho laccase Para-phenylenediamin

là cơ chất thông dụng và syringaldazine là cơ chất duy nhất chỉ dành cho laccase vìvậy laccase có thể oxy hoá cả các polyphenol methoxy và rất nhiều các hợp chất khác

Sự phù hợp của các cơ chất đối với laccase quyết định bởi hai nhân tố chính.Thứ nhất là sự phù hợp giữa cơ chất và nguyên tử đồng T1, thứ hai là sự phụ thuộc vào

sự chênh lệch giữa thế oxy-hóa khử giữa cơ chất và enzyme Các đại lượng này phụthuộc cấu trúc hóa học của cơ chất (Laura và Leena Kiiskinen, 2005)

2.4.3 Nhiệt độ và pH tối ưu

Nhiệt độ bền của laccase dao động đáng kể, phụ thuộc vào nguồn gốc của visinh vật Nhìn chung, laccase bền ở 30 – 500C và nhanh chóng mất hoạt tính ở nhiệt độtrên 600C (A.Kunamneni và cộng sự, 2008)

Laccase bền nhiệt nhất được phân lập chủ yếu từ các loài thuộc prokaryote Ví

dụ, thời gian bán hủy của laccase phân lập từ Streptomyces lavendulae là 100 phút ở

700C (Suzuki và cộng sự, 2003) và của protein cotA từ loài Bacillus subtilis là 112

phút ở 800C (Hullo và cộng sự, 2001) Thời gian bán hủy của laccase có nguồn gốc

nấm thường là nhỏ hơn 1 giờ ở 700C và dưới 10 phút ở 800C (Couto và Toca-Herrera,2009)

Laccase hoạt động tối thích trong khoảng pH 4 – 6 đối với cơ chất phenolic.Khi tăng pH sang vùng trung tính hoặc vùng kiềm thì hoạt tính của laccase bị giảm,nguyên nhân do anion nhỏ là ion hydroxide đã ức chế laccase Mặt khác, tăng pH cònlàm giảm thế oxy hóa khử của các cơ chất phenolic do đó cơ chất phenolic dễ bị oxyhóa bởi laccase hơn Do vậy, hoạt tính laccase ở các pH khác nhau là kết quả của haitác dụng đối lập của pH là sự tăng chênh lệch thế oxy hóa khử laccase – cơ chất và tácdụng ức chế trung tâm đồng ba nguyên tử của ion hydroxide

Đối với các cơ chất không phải phenolic như ABTS (2,2'-azino-bis ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) thì phản ứng oxy hóa không liên quan đến sựvận chuyển ion và do đó pH tối thích nằm trong khoảng 2 – 3 Ngược lại, tính bền của

3-laccase cao nhất trong khoảng pH kiềm nằm trong khoảng 8 – 9 (A.Kunamneni vàcộng sự, 2007).

2.4.4 Km và Vmax

Hoạt tính xúc tác của enzyme được đặc trưng bởi hằng số Michaelis -Menten(Km) Km đặc trưng cho ái lực của enzyme với cơ chất, Km có trị số càng nhỏ thì áilực của enzyme với cơ chất càng lớn, nghĩa là vận tốc của phản ứng do enzyme xúc táccàng lớn

Hằng số này của laccase dao động trong một giới hạn khá rộng, trong khoảng 2– 500 μM phụ thuộc vào nguồn gốc enzyme và cơ chất (A.I Yaropolov và cộng sự,1994)

Giá trị Km thấp nhất đối với cơ chất là syringaldazine (một dạng dimer của hai phân tử2,6-dimethoxyphenol liên kết với nhau bằng cầu nối azide)

Nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phản ứng enzyme càng lớn Vận tốc đạtcực đại (Vmax) khi toàn bộ enzyme liên kết với cơ chất, thông thường giá trị Vmaxcủa laccase thay đổi trong khoảng 50 – 300 m/s tùy thuộc vào nguồn laccase(A.Kunamneni và cộng sự, 2007)

Có thể thấy rõ sự khác nhau của Vmax ở những laccase khác nhau khi sử dụng

cùng một cơ chất (Bảng 2)

Bảng 2: Một vài đặc tính của laccase từ một số chủng nấm

(Galhaup và cộng sự, 2002; Heinzkill và cộng sự, 1998; Bulter cộng sự, 2003)

Cơ chất K m

(µM) (phút V max -1 ) pI Chủng Tài liệu tham khảo

23 30 32 41 45 50,6 52 55

41400 1090 198 - - 620 - - -

2,6 4,0 3,3;

3,6 - 3,5 - - - 3,7

Trametes pubescens

LAP2

Coprinus cinereus Lcc1

Trametes trogii POXL3 Panaeolus sphinctrinus Coprinus friesii Trichophyton rubrum Panaeolus papilionaceus Rhizoctonia solani Lcc4 Pycnoporus

cinnabarinus Lac1 Trametes villosa Lcc1 Pleurotus ostreatus

Galhaup và cộng sự, 2002

Schneider và cộng sự, 1999

Garzillo và cộng sự, 1998

Heinzkill và cộng sự, 1998

Heinzkill và cộng sự, 1998

Jung và cộng sự, 2002 Heinzkill và cộng sự, 1998

Xu và cộng sự, 1996 Record và cộng sự, 2002

Xu cộng sự, 1996 Palmieri cộng sự, 1997

58 90 106 120 190 280 290 380 2500

2700 350000 1000 - - 57000 790 - 74000

3,5 6,7 - 4,0 5,1 2,9 - - 3,6

POXC

Myceliophthora thermophila Lcc1 Streptomyces cyaneus Pleurotus sajor-caju

Lac4

Martins cộng sự, 2002 Palmieri cộng sự, 1997 Chefetz cộng sự, 1998 Palmieri cộng sự, 1997 Bulter cộng sự, 2003 Arias cộng sự, 2003 Soden cộng sự, 2002

72 96 100 120 410 230 740 2100

24000 - - 58000 109 430 - 21000

-5,6 2,6 5,1 4,0 3,6 3,3;

3,6 2,9 4,0 6,7

Gaeumannomyces graminis LAC2 Trametes pubescens

LAP2

Chaetomium thermophilum Botrytis cinerea Pleurotus sajor-caju

Soden cộng sự, 2002 Garzillo cộng sự, 1998 Palmieri cộng sự, 1997 Palmieri cộng sự, 1997 Palmieri cộng sự, 1997

Guaiacol 66

36 400 510 1200 3100 5120

6800 10800 - - 150 - 115

3,6 2,6 5,1 5,6 2,9 4,0 3,3;

3,9 6 26 26

2100 3000 16800 180 200

3,5 2,6 4,0 -

-Myceliophthora thermophila Lcc1 Trametes villosa Lcc1 Trametes pubescens

LAP2

Coprinus cinereus Lcc1 Bacillus subtilis CotA Rhizoctonia solani Lcc4

Bulter cộng sự, 2003

Xu cộng sự, 1996 Galhaup cộng sự, 2002 Schneider cộng sự, 1999 Martins cộng sự, 2002

Xu cộng sự, 1996 Chefetz cộng sự, 1998 Palmieri cộng sự, 1997

28 34 20 130 140 280

- 23000 28000 - 35000

5,1 2,9 6,7 4,0 3,6

-Chaetomium thermophilum Pleurotus ostreatus

- : không xác định

2.4.5 Các isozyme

Một loài sinh vật có thể có nhiều dạng isozyme của laccase, các dạng isozymenày khác nhau về trình tự acid amine và một số tính chất về động học xúc tác Nấmmốc có thể tạo ra nhiều dạng isozyme laccase khác nhau cả về mức độ glycosyl hóa và

cả thành phần các gốc carbonhydrate Trametes versicolor có 5 dạng isozyme chỉ khác

nhau về thành phần carbonhydrate, thành phần carbonhydrate của chúng thay đổi từ 10– 45% so với khối lượng của thành phần protein (M Heinzkill và cộng sự, 1998)

Các isozyme có thể khác nhau đáng kể trong sự ổn định của chúng, pH tối ưu,nhiệt độ và mối quan hệ đối với các cơ chất khác nhau Hơn nữa, các isozyme khácnhau có thể điều chỉnh vai trò khác nhau trong sinh lý học của các loài khác nhau hoặctrong cùng một loài trong điều kiện khác nhau (A Michniewicz và cộng sự, 2006)

2.5 Cơ chế xúc tác của laccase

Laccase là enzyme oxy hóa khử có khả năng oxy hóa diphenol và các hợp chất

có liên quan, sử dụng oxy phân tử làm chất nhận điện tử

Thế oxy hóa khử của laccase dao động trong khoảng 0,4 đến 0,8 V (A.I.Yaropolov và cộng sự, 1994) Cơ chất khử bị mất một điện tử nhờ xúc tác laccasethường tạo thành một gốc tự do, gốc tự do không bền này tiếp tục bị oxy hóa nhờ xúctác bởi chính laccase đó hoặc tiếp tục các phản ứng không cần xúc tác enzyme nhưhydrate hóa, phân ly hoặc polymer hóa (A.Kunamneni và cộng sự, 2007)

Trung tâm nguyên tử đồng một nguyên tử (T1) là nơi diễn ra phản ứng oxy hóa

cơ chất Cơ chất chuyển một điện tử cho nguyên tử đồng T1, biến nguyên tử đồng T1(Cu2+) trở thành dạng Cu+, hình thành phân tử laccase có cả 4 nguyên tử đồng đều ở

trạng thái khử (Cu+,) Một chu kỳ xúc tác liên quan đến sự vận chuyển đồng thời 4electron từ nguyên tử đồng T1 sang cụm nguyên tử đồng T2/T3 qua cầu tripeptide bảothủ His-Cys-His Phân tử oxy sau đó oxy hóa laccase dạng khử, tạo thành hợp chất

trung gian peroxy, và cuối cùng bị khử thành nước (Hình 4)

Ngoài ra cơ chế xúc tác của laccase có thể xảy ra theo một trong các cơ chế sau

Cơ chế đơn giản nhất có thể diễn ra khi các cơ chất bị oxy hóa trực tiếp bởi trung tâmhoạt động do 4 nguyên tử đồng đảm nhiệm Tuy nhiên, các phần tử cơ chất thường cócấu tạo cồng kềnh hoặc có thế khử quá lớn, vì vậy chúng không thể tiếp cận đượctrung tâm phản ứng của phân tử laccase Trong trường hợp này cần một hợp chất hóahọc trung gian Hợp chất hóa học này có thể tiếp xúc với trung tâm phản ứng củalaccase và bị laccase oxy hóa thành dạng gốc tự do Sau đó hợp chất hóa học trunggian ở dạng oxy hoá nhận một điện tử của cơ chất và trở thành khử, tiếp tục tham giavào chu kỳ xúc tác Ngược lại, laccase sau khi cho hợp chất hóa học trung gian mộtđiện tử thì trở thành dạng khử̉ và sau đó bị oxy hoá thành dạng oxy hoá và tiếp tục

tham gia vào chu kỳ xúc tác tiếp theo (Hình 5) Các hợp chất hóa học trung gian

thường phù hợp cho laccase là Hydroxyanthranillic acid (HAA), 2,2'-azino-bis ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid (ABTS), N-hydroxybenzo-trialzone (HBT), N-hydroxyphtaimide (HPI), violuric acid (VLA) v.v Sự tham gia của hợp chất hóa họctrung gian đã làm tăng phổ cơ chất xúc tác và tính không đặc hiệu cơ chất của laccase(S Riva, 2006)

3-Hình 4: Cơ chế xúc tác của laccase

(R Bourbonnais và cộng

sự, 1995)

2.6 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp laccase

2.6.1 Nguồn cacbon

Các nguồn carbon trong môi trường đóng một vai trò quan trọng trong sản xuấtenzyme ligninolytic Mansur và cộng sự (1997) đã chỉ ra rằng fructose giúp tăng sự

sản xuất laccase của Basidiomycete sp I-62 gấp 100 lần.

Trametes versicolor là loài sản xuất laccase tuyệt vời trong quá trình lên men

của vỏ quýt Glucose và cellobiose được sử dụng một cách hiệu quả và nhanh chóng

bởi Trametes pubescens với các hoạt động laccase cao (N Mikiashvili và cộng sự

(2006)

Tương tự như vậy, việc thay đổi cellulose tinh thể hoặc xylan bởi cellobiose

giúp tăng hoạt động sản xuất laccase của Cerrena unicolor gấp 21-70 lần tương ứng.

Trong môi trường với các nguồn carbon tốt nhất (trái quýt và mùn cưa vỏ nho), cả

Pleurotus eryngii và P ostreatus dòng 493, cho thấy các hoạt động sản xuất laccase

cao nhất Glucose cho thấy tiềm năng cao nhất để sản xuất laccase (C Galhaup vàcộng sự, 2002)

Hình 5: Các kiểu xúc tác của laccase (a): Chu kỳ xúc tác không có sự tham gia của các hợp chất hóa học trung gian (b); (c): Chu kỳ xúc tác với sự tham gia của các hợp chất hóa học trung gian.

(S Riva, 2006)

2.6.2 Nguồn nitơ

Trong nấm mục trắng hệ thống ligninolytic chủ yếu là được kích hoạt trong giaiđoạn chuyển hóa thứ cấp của nấm và thường được kích hoạt bởi sự suy giảm nguồnnitơ Monteiro và De Carvalho (1998) đã đưa ra báo cáo về hoạt động sản xuất laccasecao với quy trình sản xuất bán liên tục trong bình rung bằng cách sử dụng một tỷ lệcarbon trên nito thấp (7,8 g/g) Buswell và cộng sự (1996) thấy rằng laccase đã đượcsản xuất ở các nồng độ nitơ cao, mặc dù người ta vẫn thừa nhận rằng một tỷ lệ carbontrên nitơ cao là cần thiết cho sản xuất laccase Laccase cũng được sản xuất trước khinấm được trồng ở chất nền với nồng độ nitơ cao và những thay đổi này không phảnánh sự khác biệt về sinh khối Elisashvili và cộng sự (2009) quan sát thấy sự hoạt động

của laccase cao nhất trong C unicolor Ibb 62 trong môi trường với sulfat amoni là

nguồn nitơ D'Souza-Ticlo và cộng sự (2006) cho thấy nguồn nitơ hữu cơ được xácđịnh rõ như axit glutamic và glycine thì tốt hơn trong sản xuất laccase

2.6.3 Nhiệt độ

Người ta đã nhận thấy rằng nhiệt độ tối ưu cho quá trình sản xuất laccase là25°C trong điều kiện có ánh sáng, nhưng để sản xuất laccase khi nuôi cấy và được ủtrong bóng tối thì nhiệt độ cần thiết phải là 30°C Nhìn chung, nấm được nuôi ở nhiệt

độ từ 25°C - 30°C để sản xuất laccase là điều kiện tối ưu Khi nuôi ở nhiệt độ cao hơn30°C hoạt động của các enzym sẽ bị giảm (M.I Rezende và cộng sự, 2005)

xuất laccase bởi một chủng mới được cô lập của T.modesta.

2.7 Ứng dụng của laccase

2.7.1 Ứng dụng trong công nghiệp

Phương pháp oxy hóa sinh học nhờ enzyme được xem là phương pháp khảquan có thể thay thế các phương pháp oxy hóa hóa học do chúng rất thân thiện với môitrường và đặc biệt là do phản ứng bởi enzyme thường rất đặc hiệu và có hiệu suất cao

Laccase là một trong các loại enzyme oxy hóa được ứng dụng khá phổ biếntrong các ngành công nghiệp do chúng có phổ cơ chất rộng và sử dụng chất nhận điện

tử cuối cùng là oxy phân tử chứ không phải cần các chất nhận điện tử đắt tiền khácnhư NAD(P)+

Laccase được sử dụng trong một số ngành như công nghiệp hóa mỹ phẩm, hóathực phẩm, dược phẩm v.v… (Andrea Zille, 2005)

Laccase còn đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình loại bỏ các hợp chấtlignin và tẩy trắng bột giấy Quá trình tẩy trắng giấy được áp dụng rộng rãi trong côngnghiệp nghiền bột giấy để loại bỏ các gốc lignin trong bột giấy Các gốc này là nguyênnhân làm cho bột giấy có màu nâu và được loại bỏ mà ít tốn kém bằng cách dùng cácchất tẩy trắng như chlorine và các oxid chlorine Quá trình tẩy trắng tạo ra dịch lỏng cómàu nâu đen chứa các sản phẩm bị chlorin hoá độc và có khả năng gây đột biến gâynguy hiểm đối với môi trường Peroxidase và laccase có tác dụng tích cực trong việc

xử lý dịch lỏng sau quá trình tẩy nói trên và dạng cố định của các loại enzyme nàytrong mọi trường hợp đều hiệu quả hơn so với dạng tự do (T.P.Ruggaber và J.W.Talley, 2006)

Việc sử dụng laccase để sản xuất và xử lý đồ uống và là cảm biến sinh học đốivới việc đánh giá hàm lượng phenol hoặc các enzym khác trong nước ép trái cây cũngđược đề xuất

2.7.2 Ứng dụng trong xử lý ô nhiễm môi trường

Laccase có tiềm năng cao trong công nghệ nano sinh học để tạo các biosensor

có độ nhạy cao Ngoài ra còn được sử dụng trong phân hủy các hợp chấtlignincellulose và xử lý các chất ô nhiễm khó phân hủy

Laccase rất hữu hiệu trong việc tham gia xúc tác phân hủy các chất độc thôngqua quá trình oxy hóa đặc biệt là các chất phức tạp, không tan

Laccase có thể tham gia phân hủy các hợp chất phenol là chất thải của các quátrình sản xuất khác nhau như hóa dầu, sản xuất các hợp chất hữu cơ v.v Laccase được

cố định trên các vật liệu mang và hệ thống xúc tác laccase - mediator tỏ ra hiệu quảtrong việc chuyển hóa các chất ô nhiễm chứa phenol và các hợp chất dẫn xuất clophenol khác như các hợp chất hydrocarbon thơm đa nhân (polycyclic aromatichydrocarbon – PAH), polychlorinated biphenyl (PCB) từ ngành công nghiệp dầu mỏ,thuốc nổ 2,4,6-trinitrotoluen (TNT) trong ngành khai khoáng, quân sự, thuốc trừ sâu(Dichloro Diphenyl Trichloroethane - DDT, Hexacyclohexan - HCH v.v.), thuốc diệt

cỏ hóa học (2,4,5- Trichlorophenoxyacetic acid - 2,4,5-T; 2,4-Dichlorophenoxyaceticacid - 2,4- D v.v.) dùng trong nông nghiệp (T.P.Ruggaber và J.W Talley, 2006)

Laccase từ nấm mục trắng cũng được sử dụng để ôxi hóa anken, cacbazol, ethylcarbazole fluorene và dibenzothiophene với sự hiện diện của HBT và ABTS như

N-là hợp chất trung gian (P.M.L Niku và L Viikari, 2000) Isoxaflutole N-là một loại thuốcdiệt cỏ được tích tụ trong đất và thực vật với chất gây độc là diketonitrile, hình thứchoạt động của thuốc diệt cỏ Laccase có thể chuyển đổi các diketonitrile thành axit.Việc nghiên cứu hệ thống laccase phân giải trong xử lý sinh học của đa vònghydrocarbon thơm (PAHs) cũng đã được đề cập đến ở nhiều báo cáo (C Mougin vàcộng sự, 2000)

Bên cạnh đó laccase có thể được áp dụng để khắc phục và cải tạo đất có chứacác chất gây ô nhiễm phenolic cũng như các hệ thống khác bị ô nhiễm do phạm vi cơchất khá rộng của laccase

Laccase kết hợp với manganese peroxidase từ nấm trắng Dichomitus squalens cũng cho những kết quả rất khả quan để phân giải lignin Đặc biệt, laccase có thể oxy hoá các hợp chất phenol thành các gốc anion tự do tương ứng có khả năng phản ứng cao do đó Laccase còn được sử dụng để xử lý các hợp chất Clo hoặc phenol trong

nước thải của các chế biến sản phẩm chứa cellulose Trong trường hợp này khi laccasekết hợp với manganese peroxidase cố định cho hiệu quả đáng kể Người ta đã sử dụnghai enzyme này cố định trên màng siêu lọc polysulphone để loại bỏ các hydrocarbonvòng thơm trong nước ô nhiễm bởi dầu mỏ (T.P.Ruggaber và J.W Talley, 2006)

PHẦN III VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh vật – Bộ môn sinh học phân

tử và công nghệ vi sinh – Khoa công nghệ sinh học – Trường Đại học Nông Nghiệp

1 Cổ Loa – Đông Anh

2 Yên Thường – Yên Viên

3 Yên Lâm – Yên Định - Thanh Hóa

Thiết bị: đĩa petri, ống nghiệm, bình định mức, bình trụ, bình tam giác, ống

fancol, que cấy, lamen, lam kính, đèn cồn, buồng cấy vi sinh vật, tủ sấy, nồi hấp vôtrùng, máy lắc ấm, máy đo OD, cân phân tích, cân kỹ thuật, máy đo pH, máy vontex,máy khuấy từ, máy làm đá, tủ ổn nhiệt, máy li tâm, kính hiển vi quang học, tủ lạnh, bể

 C.Ty CP Kỹ Thuật Và Sinh Học Ứng Dụng Việt Nam TAB

1 Syringaldazine 99% HSX : Sigma

2 ABTS, diammonium salt HSX: BioBasic

3 Tannic acid HSX: BioBasic

 C.Ty TNHH Thiết Bị Y Tế, Vật Tư Khoa Học Kỹ Thuật Hồng Hà

1 ZnCl2 HSX: China

2 Asparagine HSX: BDH

3.3.3 Môi trường

Thành phần các loại môi trường được sử dụng trong quá trình thực hiện đề tài

 Môi trường phân lập: Môi trường PDA

Sử dụng môi trường PDA tổng số HSX: DIFCO (Mỹ)

1 Khoai tây (nước luộc từ) 200g

Các môi trường đều được hấp vô trùng ở điều kiện áp suất 1.4 atm, nhiệt độ

121 o C trong thời gian 20 phút.

3.4.1.2 Phương pháp giữ giống

Các chủng nấm mốc sau khi đã làm thuần được cấy trên môi trường giữ giốngtheo phương pháp giữ giống trên thạch nghiêng (Nguyễn Lân Dũng, dịch 1983)

Dùng que cấy vô trùng lần lượt cấy mỗi chủng nấm vào một ống thạch nghiêngtheo đường zich zac Các ống nghiệm được đặt trong tủ ổn nhiệt ở nhiệt độ 300C trong

từ 5 - 7 ngày, khi thấy đã xuất hiện khuẩn lạc thì chuyển ống nghiệm vào tủ lạnh giữgiống ở 40C

3.4.1.3 Phương pháp nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm mốc

Tiến hành quan sát trực tiếp chủng nấm mốc trên môi trường PDA bằng mắtthường và quan sát dưới kính hiển vi quang học

 Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng nấm mốc trên môi trường PDA:

 Khả năng phát triển của khuẩn lạc

 Màu sắc khuẩn lạc

 Hình dạng khuẩn lạc

 Bề mặt khuẩn lạc

 Đo kích thước khuẩn lạc

 Quan sát một số chỉ tiêu của các chủng nấm mốc dưới kính hiển vi quang học:

 Phương pháp này được tiến hành để quan sát đặc điểm sợi nấm, sự hìnhthành bào tử và đặc điểm của bào tử nấm Sử dụng thuốc nhuộm Fuchsin kiềm

để nhuộm sợi nấm rồi quan sát với độ phóng đại 400 lần và 1000 lần (NguyễnThị Minh Đức, 2001)

3.4.2 Phương pháp hóa sinh – Phương pháp xác định hoạt tính laccase

3.4.2.1 Phương pháp thử định tính

a Thử định tính với cơ chất là axit tannic

Sử dụng cơ chất là axit tannic để thử định tính về khả năng tổng hợp các loạienzyme phân giải lignin của các chủng nấm mốc đã phân lập được Cấy chuyển cácchủng nấm mốc đã phân lập được thành từng điểm trên bề mặt môi trường PDA có bổ

sung axit tannic với nồng độ 0.5% Các chủng sau khi cấy được nuôi ở 300C trong thờigian từ 6 – 8 ngày Quan sát theo dõi sự phát triển của nấm và sự thay đổi màu sắc củakhu vực môi trường nuôi xung quanh khuẩn lạc Nếu môi truờng quanh khuẩn lạcchuyển sang màu nâu hoặc nâu đen chứng tỏ có sự phân huỷ axit tannic của enzyme(J.M.Harkin và John R.OBST, 1973)

b Thử định tính với cơ chất là Syringaldazine

Các chủng sau khi đã thử và có kết quả dương tính trên cơ chất là axit tannic sẽđược chọn để tiếp tục thử với syringaldazine Nhỏ trực tiếp dung dịch syringaldazine1mM lên khuẩn lạc của các chủng nuôi đã chọn, ủ trong bóng tối từ 3 – 5 phút rồi tiếnhành quan sát Nếu dung dịch syringaldazine sau khi ủ chuyển từ màu vàng sang màuhồng chứng tỏ chủng nấm mốc đó có hoạt tính laccase (D Faure và cộng sự, 1994)

3.4.2.2 Phương pháp xác định hoạt độ laccase (Ride, 1980)

 Định nghĩa: Một đơn vị hoạt độ laccase là lượng enzyme cần thiết để tạo thành

1 μM sản phẩm từ syringaldazine trong thời gian 1 phút, ở điều kiện nhiệt độ là 300C,

Phản ứng xảy ra sau khi cho syringaldazine vào hỗn hợp và giữ ổn định ở nhiệt

độ 300 C trong 10 phút, tiến hành đo OD

Laccase

c Công thức tính

Trong đó:

U: Hoạt độ enzyme (U/ml)

0.001: Hệ số thay đổi ở buớc sóng A530nm/phút trên 1 đơn vị của laccase ở điềukiện pH 6.5, 300C trong 3 ml hỗn hợp phản ứng

đo OD ở bước sóng 530nm theo thành phần phản ứng được mô tả trong Bảng 3, từ đó tính hoạt độ enzyme laccase của từng chủng (E) theo công thức ở mục c phần 3.4.2.2.

Phần sinh khối tế bào được làm khô trong tủ sấy ở nhiệt độ 800C trong 15 giờ rồi cântrọng lượng khô (m)

Đánh giá khả năng tổng hợp enzyme để chọn chủng có hoạt tính laccase caodựa trên 2 chỉ số:

o E càng cao thì khả năng sinh enzyme càng nhiều

o Tỷ lệ E/m lớn cho thấy khả năng tổng hợp enzyme cao

Kết quả đánh giá khả năng tổng hợp enzyme laccase của các chủng nấm mốc sẽ được dùng để chọn ra chủng có hoạt tính laccase cao nhất sử dụng cho quá trình tiến hành các nghiên cứu tiếp theo sau đây.

3.4.3 Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng nấm mốc phân lập được

Chủng giống nấm mốc được nuôi lắc trong môi truờng Basal, pH = 5, điều kiệnnhiệt độ 300C Mỗi ngày tiến hành thu toàn bộ dịch nuôi của 1 bình đem quay ly tâm,

U =

(Δ A530nm/phútTN – Δ A530nm/phút ĐC) x (df)

0.001 x VE

giữ lại phần sinh khối tế bào rồi sấy khô, xác định trọng lượng khô của chủng nấmmốc trong 7 ngày nuôi (Nguyễn Lân Dũng và cộng sự, 2000).

3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố môi trường lên khả năng sinh tổng hợp enzyme laccase của chủng nấm

3.4.4.1 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme.

Tiến hành nuôi lỏng lắc trong 7 ngày đối với chủng nấm mốc được chọn trongmôi trường Basal Thường xuyên mỗi ngày hút dịch nuôi đem quay ly tâm, lấy dịch để

đo OD ở bước sóng 530nm nhằm xác định hoạt độ laccase theo từng ngày nuôi Dựavào kết quả thu được để xác định thời gian thích hợp cho sự sinh tổng hợp laccase củachủng nuôi

3.4.4.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy lên khả năng sinh tổng hợp enzyme

Sử dụng môi trường sinh tổng hợp enzyme tiến hành nuôi lỏng lắc chủng nấm

đã chọn ở các ngưỡng nhiệt độ 260C, 300C, 340C, 380C Đo OD ở bước sóng 530nm tạithời điểm nuôi thuận lợi nhằm xác định hoạt độ enzyme để chọn nhiệt độ nuôi phù hợpcho quá trình tổng hợp laccase của chủng nuôi

3.4.4.3 Ảnh hưởng của pH môi trường lên khả năng sinh tổng hợp enzyme

Chủng nấm mốc được nuôi ở nhiệt độ nuôi thích hợp trong môi trường Basalvới các mức pH môi trường thay đổi: 4, 4.5, 5, 6, 7

Tại thời điểm nuôi thuận lợi, tiến hành đo OD ở bước sóng 530nm, xác địnhhoạt độ enzyme để chọn pH môi trường phù hợp nhất cho quá trình sinh laccase củachủng nuôi

3.4.4.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon và nitơ lên khả năng sinh tổng hợp enzyme

Để nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn carbon và nitơ khác nhau, chủngnghiên cứu được nuôi trong môi trường Basal với thành phần carbon trong môi trường(glucose) được thay thế bằng malt extract, saccarose và maltose Nguồn nitơ làasparagine được thay bằng pepton, cao nấm men, (NH4)2SO4, NH4NO3

Dịch nuôi lắc ở điều kiện nhiệt độ và pH môi trường thích hợp được thu và tiếnhành đo OD ở bước sóng 530 nm, xác định hoạt độ enzyme để chọn ra nguồn carbon

và nitơ thích hợp nhất cho quá trình tổng hợp enzyme laccase của chủng nuôi