TUYỂN CHỌN một số CHỦNG VI SINH vật có KHẢ NĂNG PHẢN NITRATE CAO PHÂN lập từ các đầm NUÔI tôm VEN BIỂN đồ sơn

trờng đại học hải phòngviện sinh nông họ và tên: Vũ THị VâN ANH Ngày sinh: 05/04/1993 Lớp: Kỹ s nuôi trồng Thuỷ sản Khoá K12 TUYểN CHọN MộT Số CHủNG VI SINH VậT Có KHả NĂNG PHảN NITRAT

trờng đại học hải phòng

viện sinh nông

họ và tên: Vũ THị VâN ANH Ngày sinh: 05/04/1993 Lớp: Kỹ s nuôi trồng Thuỷ sản Khoá K12

TUYểN CHọN MộT Số CHủNG VI SINH VậT

Có KHả NĂNG PHảN NITRATE CAO PHâN LậP

Từ CáC ĐầM NUÔI TÔM VEN BIểN Đồ SƠN

Chuyên ngành: Nuôi trồng thuỷ sản

Hải Phòng, năm 2015

trờng đại học hải phòng

viện sinh nông

họ và tên: Vũ THị VâN ANH Ngày sinh: 05/04/1993 Lớp: Kỹ s nuôi trồng Thuỷ sản Khoá K12

TUYểN CHọN MộT Số CHủNG VI SINH VậT

Có KHả NĂNG PHảN NITRATE CAO PHâN LậP

Từ CáC ĐầM NUÔI TÔM VEN BIểN Đồ SƠN

Chuyên ngành: Nuôi trồng thuỷ sản

Ngời hớng dẫn khoa học: TS Đào Thị ánh Tuyết

Hải Phòng, năm 2015

LỜI CẢM ƠN

Trước tiờn, em muốn gửi lời cảm ơn sõu sắc nhất đến Tiến sĩ Đỗ MạnhHào, Ts Đào Thị Ánh Tuyết những người đó tận tỡnh hướng dẫn em trongsuốt quỏ trỡnh thực hiện khúa luận tốt nghiệp

Em xin bày tỏ lời cảm ơn sõu sắc đến những thầy cụ giỏo đó giảng dạy

em trong bốn năm qua, những kiến thức mà em nhận được trờn giảng đườngđại học sẽ là hành trang giỳp em vững bước trong tương lai

Em cũng muốn gửi lời cảm ơn đến các anh chị và tại Trạm nghiên cứubiển Đồ Sơn đã giúp đỡ và cho em những lời khuyên bổ ích về chuyên môntrong quá trình nghiên cứu

Cuối cùng, em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tất cả bạn bè, và đặcbiệt là cha mẹ và anh trai, những người luôn kịp thời động viên và giúp đỡ emvượt qua những khó khăn trong cuộc sống

Hải Phòng, ngày 28 tháng 5 năm 2015

Sinh viên

Vũ Thị Vân Anh

M C L CỤC LỤC ỤC LỤC

PHẦN 1: MỞ ĐẦU i

1.1 LÝ DO LỰA CHỌN ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI 2

1.2.1 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN 3

2.1 TỔNG QUAN VỀ HOẠT ĐỘNG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN 3

2.1.1 Hoạt động nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam 3

2.1.2 Ô nhiễm nitơ vô cơ trong môi trường nước nuôi trồng thủy sản 5

2.2 CHU TRÌNH CHUYỂN HÓA NITƠ SINH HỌC TRONG NƯỚC 7

2.2.1 Quá trình amon hóa chất hữu cơ 8

2.2.2 Quá trình đồng hóa nitơ 9

2.2.3 Quá trình nitrate hóa 9

2.2.4 Quá trình khử nitrate hóa 10

2.2.4.1 Vi khuẩn phản nitrate hóa 11

2.2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình phản nitrate hóa 13

2.2.4.3 Ứng dụng của quá trình phản nitrate hóa trong xử lý môi trường 15

2.2.5 Quá trình cố định nitơ phân tử 17

2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI 17

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC 18

PHẦN 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

3.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 20

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20

3.2.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 20

3.2.1 Dụng cụ và hóa chất nghiên cứu: 20

3.2.1.1 Dụng cụ nghiên cứu 20

3.2.1.2 Hóa chất, thuốc thử và môi trường sử dụng 21

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

3.3.1 Phương pháp thu mẫu 22

3.3.2 Phương pháp đo nhanh các thông số môi trường 23

3.3.3 Phương pháp làm giàu, phân lập, thuần khiết và giữ giống vi

khuẩn 23

3.3.3.1 Phương pháp làm giàu 23

3.3.3.2 Phương pháp phân lập 23

3.3.3.3 Phương pháp thuần khiết vi khuẩn bằng phương pháp cấy ria 3 pha 23

3.3.3.4 Giữ giống vi khuẩn 24

3.3.5 Phương pháp phân loại 25

3.3.5.1 Cách làm tiêu bản sống 25

3.3.5.2 Làm tiêu bản nhuộm màu đơn giản 25

3.3.5.3 Phương pháp nhuộm Gram 25

3.3.5.4 Phương pháp xác định nội bào tử của vi khuẩn 26

3.3.5.5 Xác định khả năng sinh indol 26

3.3.6 Phương pháp xác định tiềm năng xử lý NO3 - của vi khuẩn phản nitrate hóa 27

3.3.6.1 Phương pháp xác định nồng độ NO3 trong dung dịch - 27

3.3.6.2 Xác định tiềm năng xử lý NO 3 - trong các điều kiện nhiệt độ khác nhau 28

3.3.6.3 Xác định tiềm năng xử lý NO 3 trong các điều kiện độ muối khác -nhau 28

3.3.6.4 Xác định tiềm năng xử lý NO 3 - trong các điều kiện độ pH khác nhau

28

3.3.7 Phương pháp xử lý số liệu 29

PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30

4.1.ĐẶC ĐIỂM MÔI TRƯỜNG TỰ NHIÊN KHU VỰC NGHIÊN CỨU

30

4.2 PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, NGHIÊN CỨU SƠ BỘ VỀ MỘT SỔ CHỦNG VI KHUẨN PHẢN NITRATE HÓA CÓ HOẠT TÍNH CAO 31

4.2.1 Phân lập vi khuẩn phản nitrate hóa 31

4.2.2 Xác định khả năng phản nitrate hóa của các chủng phân lập được

33

4.3 NGHIÊN CỨU SƠ BỘ ĐẶC ĐIỂM TẾ BÀO, PHÂN LOẠI CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ HOẠT TÍNH CAO 35

4.3.1 Đặc điểm tế bào của các chủng vi khuẩn được lựa chọn 35

4.3.2 Kết quả phân loại sơ bộ các chủng vi khuẩn được chọn 36

4.3.2.1 Chủng CR 15.01 36

4.3.2.2 Chủng BĐ15.04 37

4.4 NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YÊU TỐ MÔI TRƯỜNG NỀN ĐẾN KHẢ NĂNG PHẢN NITRATE HÓA CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN NGHIÊN CỨU 38

4.4 1 Hoạt tính phản nitrate hóa trong điều kiện độ muối khác nhau 38

3.2.2 Hoạt tính phản nitrat hóa trong điều kiện nhiệt độ khác nhau 41

4.3.3 Hoạt tính phản nitrate hóa trong điều kiện pH khác nhau 43

4.4 Thảo luận 44

KẾT LUẬN VÀ KHUYẾN NGHỊ 46

1 KẾT LUẬN 46

2 KHUYẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 48

Tiếng Việt 48

Tiếng Anh 49

PHỤ LỤC 50

Phụ lục 1 Một số thuốc thử thường dùng 50

Phụ lục 2 Các môi trường 51

Phụ lục 3 Một số hình ảnh 52

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT 52

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1: Diện tích mặt nước, sản lương nuôi tôm nước mặn lợ .4

Bảng 2.3 Một số đặc điểm chọn lọc của các đại diện điển hình thuộc .12

nhóm phản nitrate hóa [8] .12

Bảng 4.1: Các yếu tố thủy lý tại khu vưc thu mẫu .30

Bảng 4.2 Các yếu tố thủy hóa tại khu vưc thu mẫu .31

Bảng 4.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của 15 chủng thu được .32

Bảng 4.5 Biến động hàm lượng N-NO3- trong môi trường nuôi cấy .34

Bảng 4.6 Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các chủng vi khuẩn được chọn36 Bảng 4.7 Nồng độ NO3 còn lại trong môi trường nuôi cấy tại các độ muối -khác nhau của chủng CR 15.01 .39

Bảng4.8 Nồng độ NO 3 - còn lại trong môi trường nuôi cấy tại các độ muối khác nhau của chủng BĐ 15.04 .39

Bảng 4.9 Nồng độ NO3 còn lại trong môi trường nuôi cấy tại các độ muối -khác nhau của chủng CR 15.001 .40

Bảng 4.10 Nồng độ NO3- còn lại trong môi trường nuôi cấy .41

tại các nhiệt độ khác nhau của chủng BĐ 15.04 .41

Bảng 4.11 Nồng độ NO3- còn lại trong môi trường nuôi cấy .42

tại các nhiệt độ khác nhau của chủng CR 15.01 .42

Bảng 4.12 Nồng độ NO3- còn lại trong môi trường nuôi cấy .42

tại các nhiệt độ khác nhau của chủng CR 15.001 .42

Bảng 4.13 Nồng độ NO3- còn lại trong môi trường nuôi cấy tại các pH khác nhau của chủng BĐ15.04 .43

Bảng 4.14 Nồng độ NO3- còn lại trong môi trường nuôi cấy .43

tại các nhiệt độ khác nhau của chủng CR15.01 .43

Bảng 4.15 Nồng độ NO3- còn lại trong môi trường nuôi cấy .44

tại các nhiệt độ khác nhau của chủng CR 15.001 .44

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Giá trị sản xuất thủy sản từ hoạt động NTTS qua các năm .3

Hình 2.2: Chu trình chuyển hóa nitơ trong nước .7

Hình 3.1 Quy trình thực nghiệm nghiên cứu vi khuẩn phản nitrate hóa 22

Hình 4.1 Hiển vi tế bào của chủng Bacillus .37

Hình 4.2 Hiển vi tế bào chủng BĐ 15.04 .37

Hình 4.3 Hiển vi tế bào chủng CR 15.001 .38

Hình 4.4 Tương quan giữ tốc độ chuyển hóa nitrate và độ muối của các chủng sinh vật nghiên cứu .40

PHẦN 1: MỞ ĐẦU

1.1 LÝ DO LỰA CHỌN ĐỀ TÀI

Việt Nam là một nước giáp biển với đường bờ biển dài hơn 3260 kmvới nhiều vũng vịnh, đầm phá ven biển, rất thuận lợi cho việc NTTS Trongnhững năm gần đây, ngành nuôi trồng và đánh bắt thủy hải sản phát triển rấtmạnh mẽ và đóng góp vào sự tăng trưởng kinh tế của đất nước Theobáo cáo tháng 12/2012 của bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, sảnlượng nuôi trồng thủy sản cả năm 2012 ước đạt 3112 nghìn tấn, tăng 6,2%

so với cùng kỳ năm 2011 với 2 ngành nuôi trồng chủ yếu là cá tra vàtômNhiều năm qua, nghề nuôi tôm ở nước ta phát triển rất mạnh không những

về qui mô mà còn về sự đa dạng hóa các mô hình nuôi, khi diện tích nuôingày càng mở rộng thì người nuôi phải đối đầu với những trở ngại mới, đó là

ô nhiễm môi trường và dịch bệnh Trong quá trình nuôi trồng, tại các đầmnuôi thủy sản nước lợ, các chất ô nhiễm vô cơ thường được tích lũy với hàmlượng cao do phân hủy nguồn thức ăn dư thừa và có bài tiết trực tiếp từ tôm,chúng gây ô nhiễm môi trường và gây bệnh cho sinh vật nuôi

Do vậy, việc nghiên cứu đưa ra các giải pháp nhằm kiểm soát nồng

độ các chất ô nhiễm nitơ vô cơ không chỉ là điều kiện tiên quyết ảnh hưởngđến năng suất và sản lượng nuôi trồng mà còn góp phần giảm thiểu tácđộng tiêu cực của nguồn nước thải thủy sản đến nguồn sinh thái ven biển.Trong lĩnh vực sản xuất, để có được nguồn nước đáp ứng được yêu cầu trongsản xuất giống, người ta dùng các loại hóa chất như: Chlorine, thuốc tím để

xử lý, tuy nhiên việc sử dụng hóa chất xử lý nước sẽ không tránh khỏi tìnhtrạng ô nhiễm môi trường, hơn nữa việc sử dụng hóa chất sẽ làm ảnh hưởngđến hệ vi sinh vật trong môi trường nước

Vì vậy, xu hướng hiện nay nhiều nơi sử dụng các vi sinh vật hữu íchnhằm cải thiện chất lượng nước và hạn chế được các nhóm vi khuẩn gây bệnhtrong hệ thống Các nhóm vi sinh vật có khả năng tự làm sạch ngày càng được

nghiên cứu nhiều, Nếu các kĩ thuật sử dụng vi sinh vật để chuyển NH 4+thành NO3-, NO2- đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể thì việc chuyển hóanhững sản phẩm độc hại đó thành N2 trong quá trình phản nitrate hóa còngặp nhiều khó khăn

Chính vì lý do đó em tiến hành nghiên cứu đề tài “ Tuyển chọn một số

chủng vi sinh vật có khả năng phản nitrate cao phân lập từ các đầm nuôi tôm ven biển Đồ Sơn ”.

1.2 MỤC TIÊU VÀ NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI

1.2.1 MỤC TIÊU ĐỀ TÀI

Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn bản địa có khả năng nitrate hóa cao đượcphân lập từ các khu vực nuôi tôm ven biển Đồ Sơn- Hải Phòng

1.2.2 NỘI DUNG CỦA ĐỀ TÀI

- Phân lập, tuyển chọn một số chủng vi sinh vậtphản nitrate hóa cao từcác đầm nuôi tôm ven biển Đồ Sơn – Hải Phòng

- Nhận dạng vi khuẩn có khả năng phản nitrate cao đã được phân lập

- Đánh giá hoạt tính xử lý chất ô nhiễm nitơ NO3- trong đầm nuôi nước lợven biển của vi khuẩn phản nitrate hóa trong các điều kiện sinh thái khác nhau

PHẦN 2: TỔNG QUAN

2.1 TỔNG QUAN VỀ HOẠT ĐỘNG NUÔI TRỒNG THỦY SẢN

2.1.1 Hoạt động nuôi trồng thủy sản ở Việt Nam

Việt Nam thuộc nước có đường bờ biển lớn trong các quốc gia giápbiển và có truyền thống lâu đời trong việc đánh bắt và nuôi trồng thủy hảisản(NTTS) Truyền thống này bắt đầu từ việc nuôi cá trong ao nước tĩnh đượchình thành do việc đào ao, lấy đất làm nhà, qua nhiều thế kỉ NTTS được pháttriển, cho tới khi độc lập, phong trào ao cá Bác Hồ Chính từ các việc làm tựnhiên có tính truyền thống đã thúc đẩy ngành NTTS ngày càng phát triểnmạnh mẽ Cho đến nay, ở đâu có mặt nước là ở đó người dân triển khai hoạtđộng NTTS, đặc biệt, vùng đồng bằng Nam bộ và ven biển miền Trung cóhoạt động này phát triển nhất.Ngày nay, hoạt động NTTS góp phần khôngnhỏ vào xóa đói giảm nghèo và phát triển kinh tế đất nước Theo báo cáothống kê tháng 12/2012 của tổng cục thống kê, tổng giá trị NTTS chiếm hơn5% trong GDP của cả nước Ngành NTTS ngày càng phát triển, giá trị sảnxuất ngày càng tăng Giá trị sản xuất thủy sản của ngành NTTS từ năm 2003tới năm 2012 được thể hiện ở biểu đồ sau :

Hình 2.1 Giá trị sản xuất thủy sản từ hoạt động NTTS qua các năm

Theo báo cáo kết quả sản xuất thủy sản năm 2012 của Tổng cục Thủysản Việt Nam, sản lượng NTTS năm 2012 là 3,273 nghìn tấn, tăng 108,99%

so với năm 2011 với sản lượng tôm nước lợ là 488 tấn, cá tra là 1,244 nghìntấn Diện tích NTTS tăng 115% so với năm 2011 với 1,214 nghìn ha [11]

Nhận thấy tiềm năng của ngành NTTS, Nhà nước đã đầu tư cho nghiêncứu, phát triển, nâng cấp cơ sở hạ tầng của ngành nuôi trồng Chính vì thế,ngành NTTS ở nước ta có những tiến bộ vượt bậc, đóng góp vào tổng kimngạch xuất khẩu cho nước ta, góp phẩn giải quyết công ăn việc làm cho hàngnghìn lao động Diện tích nuôi ngày càng được mở rộng, mô hình nuôi ngàycàng cải tiến, đặc biệt là NTTS nước mặn và nước lợ Trong đó con tôm sú vàtôm thẻ chân trắng là đối tượng nuôi tương đối phổ biến, đặc biệt là các tỉnhphía Nam và một số tỉnh ven biển phía Bắc trong mấy năm gần đây Cùng vớithời gian, diện tích nuôi tôm ở nước ta tăng lên nhanh chóng từ 454,9 ha năm

2001 tăng lên 633,4ha năm 2007, nhưng hai năm 2008 và 2009, diện tích nuôitôm đã giảm xuống so với năm 2007 [11]

Bảng 2.1: Diện tích mặt nước, sản lương nuôi tôm nước mặn lợ

2009 Diện tích

Nguồn tổng cục thống kê 2010 [12]

Trong những năm gần đây, cũng như các nước trên thế giới và khu vựckhi nghề nuôi tôm phát triển đặc biệt là phát triển với tốc độ ồ ạt, không theo

qui hoạch thì vấn đề phá vỡ môi trường sinh thái, gây ô nhiễm môi trườngnuôi và bùng nổ dịch bệnh sẽ không thể tránh khỏi Dịch bệnh không những

đã làm thiệt hại lớn về kinh tế mà còn làm ảnh hưởng lớn tới phong trào nuôitôm trong cả nước Trong đó hai loại dịch bệnh do virus và vi khuẩn gây ra rấtphổ biến và nguy hiểm Cho đến nay chưa có một loại hoá dược nào có thể trịđược bệnh virus và chúng có thể làm cho tôm chết hàng loạt trong một thờigian ngắn[10]

Điều này đặt ra cho ngành thủy sản những vấn đề cấp bách trong việcquản lí, phát triển ngành NTTS nước ta cũng như tìm ra các biện pháp bảo vệmôi trường một các hiệu quả nhất

2.1.2 Ô nhiễm nitơ vô cơ trong môi trường nước nuôi trồng thủy sản

Tại Việt Nam đang tồn tại các hình thức nuôi trồng thủy sản đó là nuôiquảng canh, nuôi bán thâm canh, nuôi thâm canh[7]

Hình thức nuôi quảng canh là hình thức nuôi chỉ dựa vào thức ăn có sẵntrong môi trường nuôi, mật độ nuôi thường thấp, năng suất thấp Để có sảnlượng lớn cần diện tích ao nuôi lớn Nuôi cá ruộng là điển hình cho hình thứcnày Hình thức này ít gây ô nhiễm môi trường[7]

Hình thức nuôi bán thâm canh là hình thức nuôi bón phân để phát triểnthức ăn tự nhiên hay cho ăn thêm thức ăn bổ sung có chất lượng thấp, thức ăn

tự nhiên vẫn đóng vai trò quan trọng Mật độ thả nuôi cao hơn do điều kiệndinh dưỡng được cải thiện nên năng suất cũng cao hơn;Ví dụ các ao nuôi cá.Hình thức này bắt đầu xuất hiện ô nhiễm môi trường nước[7]

Hình thức nuôi thâm canh chủ yếu dựa vào thức ăn cung cấp thêm, thức

ăn thường có chất lượng cao (thức ăn viên, thức ăn đầy đủ) Mật độ thảthường rất cao và năng suất cao; Ví dụ: nuôi cá lồng Sự gia tăng thâm canhthường gây ra mức độ ô nhiễm cao hơn rất nhiều so với hai hình thức quảngcanh và bán thâm canh Cụ thể nó làm giảm DO của nước và tích lũy nhiềuamoni trong nước Bệnh dịch trong hình thức này cũng xuất hiện nhiều hơnhai hình thức kia [7]

Trong loại hình nuôi tôm thâm canh và nuôi công nghiêp trên cát, mộtlượng lớn thức ăn, phân vô cơ, phân hữu cơ được đưa vào đầm nuôi nhằmtăng năng suất sản phẩm Hiệu quả sử dụng của các thành phần bổ sung nàythường khá thấp, ví dụ: lượng thức ăn đưa vào chỉ được hấp thụ khoảng 25 –30% Lượng chất hữu cơ không được hấp thụ này tích tụ trong nước làm cho visinh vật chuyển hóa chậm chạp khiến nước đục, hôi thối do hàm lượng NH4+,

NO3-, NO2-, H2S vượt quá giới hạn cho phép Cứ 1kg thức ăn có thể sinh ra0,28 kg CO2, 0,03 kg N-NH4, 0,3 kg TSS và tiêu tốn 0,2 kg ôxy ( theo Colt

1986 ) Theo ước tính của Dierberg & Kattisimkul (1996), tổng lượng chất thảisinh ra trong mỗi hecta sau một vụ nuôi được ước tính có thể đạt 321 kg phốtpho tổng, 668 kg nitơ tổng và 215.000 kg tổng chất rắn lơ lửng Hầu hết cáckhu vực nuôi tôm công nghiệp đều không có hệ thống xử lý các chất ô nhiễm,nguồn chất thải từ đầm nuôi thường được thải trực tiếp ra môi trường xungquanh dẫn đến nhiều hệ sinh thái ven biển bị suy thoái nghiêm trọng

Các chất ô nhiễm nitơ vô cơ (TAN, N-NO2 và N-NO3) cũng được tíchluỹ dần trong quá trình nuôi do sự bài tiết trực tiếp từ đối tượng nuôi, phânhuỷ thức ăn dư thừa hay sẵn có từ nguồn nước cấp vào đã nhiễm các hợp chấtnitơ TAN và nitrite là độc tố đối với các đối tượng nuôi, bởi nó có thể gây rahiệu ứng cấp tính và kinh niên dẫn đến giảm khả năng đề kháng bệnh và sinhtrưởng của vật nuôi Nitrate không gây độc trực tiếp đối với vật nuôi nhưng

sự có mặt của nitrate với nồng độ cao sẽ kích thích sự nở hoa của tảo, có thểảnh hưởng đến sự sinh trưởng của vật nuôi như cá chình (Kamstra và van derHeul, 1998), mực (Hyrayama, 1996), cá hồi (Berka và cs., 1981) và tôm(Muir và cs., 1991)

Việc lạm dụng các chất kháng sinh, chất bảo vệ thực vật làm cho nước

ao đầm chứa nhiều thành phần độc hại Với mật độ vi sinh vật hữu ích thấpdẫn đến khả năng tự làm sạch của các ao đầm này là rất khó Bên cạnh đó,việc gia tăng quá mức diện tích nuôi trồng và quy hoạch bừa bãi, hầu hết cáckhu vực nuôi tôm công nghiệp đều không có hệ thống xử lý chất các chất ô

nhiễm, nguồn chất thải từ đầm nuôi thường bị thải trực tiếp ra môi trườngxung quanh làm cho nguy cơ lan truyền ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng tới

hệ sinh thái tự nhiên và phát sinh dịch bệnh

NO3- là một chỉ tiêu quan trọng trong đánh giá chất lượng nước Tuy

NO3- không ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe của các loại tôm, cá nuôi trongnước nhưng nếu ở một hàm lượng cao, nó sẽ gây hại cho hệ sinh thái ao đầm

và ảnh hưởng tới chất lượng và sản lượng nuôi trồng Nếu có một lượng lớn

NO3- trong nước sẽ gây ra hiện tượng phú dưỡng, trước hết nó làm tăngcường sinh trưởng và phát triển của tảo và vi sinh vật phù du làm giảm độtruyền sáng của ánh sáng mặt trời, ngăn cản quá trình quang hợp trong các lớpnước phía dưới Mặt khác, khi tảo và sinh vật phù du chết đi sẽ bị các vi sinhvật khác phân hủy tạo NH4+ Oxy hòa tan trong nước bị các vi sinh vật hiếukhí sử dụng hết gây quá trình phân hủy kỵ khí làm nước bị ô nhiễm trầmtrọng [6]

Vì vậy, cần phải chú ý đến vấn đề ô nhiễm nitơ trong các ao đầm NTTS

để cho năng suất nuôi trồng đạt hiệu quả cao nhất

2.2 CHU TRÌNH CHUYỂN HÓA NITƠ SINH HỌC TRONG NƯỚC

Chu trình nitơ trong nước là một vòng tuần hoàn quan trọng nhất đốivới cuộc sống thủy sinh bởi nitơ là nguyên tố chính cấu thành các hợp chấthữu cơ quan trọng của sự sống như protein và axit nucleic Đây là cơ sở lýluận của việc sử dụng các loại vi khuẩn nitrat hóa và phản nitrat hóa để xử lý

ô nhiễm nitơ trong nước thải

Hình 2.2: Chu trình chuyển hóa nitơ trong nước

Trong môi trường tự nhiên, nitơ tồn tại ở các dạng khác nhau, từ nitơphân tử ở dạng khí tới các hợp chất hữu cơ phức tạp như protein, axit amin

có trong cơ thể sinh vật Trong ao đầm NTTS, nitơ ở dạng hợp chất, trongthức ăn, sản phẩm bài tiết và xác chết của tôm, cá và bị phân hủy thành NH3hoặc NH4+ bởi vi khuẩn amon hóa Quá trình đó còn gọi là sự khoáng hóa chấthữu cơ vì qua đó nitơ hữu cơ được chuyển thành nitơ khoáng Sau đó dạng

NH4+ được chuyển thành dạng NO3- bởi vi khuẩn nitrate hóa Các hợp chấtnitrat được chuyển thành dạng nitơ phân tử thông qua quá trình phản nitrathóa Khí nitơ được cố định lại trong tế bào vi khuẩn và tế bào thực vật (rongtảo) rồi thành nitơ hữu cơ bởi nhóm vi khuẩn cố định đạm Nhờ có vi sinh vật

mà sự tồn tại của nitơ ở các trạng thái oxy hóa khác nhau được cân bằng mộtcách có chủ động để giúp cho hệ thống sinh thái được duy trì ổn định và cóthể thích ứng được với những thay đổi của môi trường xung quanh

Vài thập niên trước đây, các nhà khoa học mới chỉ phát hiện ra một sốnhóm vi sinh vật tham gia vào chu trình nitơ như nhóm phản nitrate hóa,nhóm cố định nitơ, nhóm nitrate hóa, ammonium hóa Nhưng trong nhữngnăm gần đây nhờ tiến bộ trong lĩnh vực sinh học phân tử và các kĩ thuật nuôicấy vi sinh vật hiện đại ,các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều con đườngchuyển hóa nitơ mới và nhiều nhóm vi sinh vật mới cũng được phát hiện,

2.2.1 Quá trình amon hóa chất hữu cơ

Quá trình amon hóa là quá trình phân giải protein và các hợp chất hữu

cơ khác có chứa nitơ thành amoniac Các vi sinh vật có khả năng amon hóabao gồm nhiều loại sinh bào tử hoặc không sinh bào tử, có khả năng sử dụngnhiều nguồn vật chất khác nhau Ngoài ra còn nhiều loại xạ khuẩn và nấmkhuẩn ty

Các vi sinh vật này có khả năng tiết enzym phân giải protein vào môitrường, thủy phân thành các amino axit Khi đó chúng dùng các amino axitnày trong quá trình đồng hóa và dị hóa Các sản phẩm đặc trưng của quá trìnhnày là NH3 và H2S

Vi khuẩn tham gia có thể là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí Trong điềukiện hiếu khí, hợp chất hữu cơ được phân giải bởi các loài trong giống

Bacillus và Pseudomonas, các đại diện trong họ Enterobacteriace, các xạ

khuẩn và nấm khuẩn ty Trong điều kiện kỵ khí là các loài trong giống

Clostridium Trong điều kiện thiếu khí, quá trình amon hóa được thực hiện

bởi các vi khuẩn, trực khuẩn kỵ khí tùy nghi

2.2.2 Quá trình đồng hóa nitơ

Các loại thực vật và vi sinh vật (dị dưỡng, tự dưỡng) đồng hóa amoni(NH4+) và nitrat (NO3-) cho hoạt động sinh trưởng và phát triển của chúng nhờvào hệ enzym Đặc biệt là sự tham gia của enzym nitrat reductaza

Sự đồng hóa nitrat này giúp giảm thiểu một phần ô nhiễm (NH4+) vànitrat (NO3-) trong nước

2.2.3 Quá trình nitrate hóa

Nitrate hóa là quá trình chuyển đổi từ amoni (NH4+) thành nitrate (NO3)dưới tác dụng của vi sinh vật Trước hết, NH4+ được chuyển hóa thành nitrite(NO2-) bởi vi khuẩn Nitrosomonas, sau đó vi khuẩn Nitrobacter sử dụng

enzym nitrit oxidaza để chuyển hóa NO2- thành NO3- Quá trình nitrate hóabao gồm 2 giai đoạn được thực hiện bởi hai giống vi khuẩn có quan hệ mậtthiết với nhau và phân bố rộng rãi trong tự nhiên

Giai đoạn nitrite hóa: chuyển hóa NH4+ thành NO2- bởi nhóm vi khuẩnnitrite hóa

NH4+ + 3/2 O2 → NO2- + 2H+ + H2O + 275 KJ

Vi khuẩn tham gia mạnh nhất trong quá trình nitrite hóa là vi khuẩn hóa

vô cơ tự dưỡng, hiếu khí bắt buộc Khi chúng chuyển hóa NH4+ thành N2- sẽsinh ra năng lượng và năng lượng này sẽ được các vi khuẩn nitrite hóa sửdụng cho các hoạt động sống của mình Trong tự nhiên vi khuẩn nitrite hóa

hiện diện rất nhiều: Nitrosococcuseanus, Nitrosococcus, Nitrosomonas sp,

Nitrosopira sp, Nitrosocystis, Nitrosolobus… Trong số đó chi Nitrosomonas

và đặc biệt là Nitrosomonas europaea được nghiên cứu nhiều nhất Chúng là

những vi khuẩn hình bầu dục , nhỏ bé, không có khả năng sinh bào tử , cótiêm mao khá dài, có khả năng tích lũy nhiều chất nhầy quanh tế bào Điều

kiện tối ưu cho sự phát triển của Nitrosomonas là nhiệt độ khoảng 28 – 30oC,

pH = 7,0 – 8,6 Cơ chất ôxy hoá của Nitrosomonas là ammonia, ure, guanin

và chúng không sử dụng cơ chất hữu cơ làm nguồn ôxy hoá

Giai đoạn nitrate hóa: Chuyển NO2- thành NO3- bởi nhóm vi khuẩnnitrate hóa

NO2- + ½ O2 → NO3Các vi khuẩn tham gia vào quá trình nitrate hóa là vi khuẩn hóa vô cơ

-tự dưỡng, vi khuẩn nitrate hóa thường gặp như: Nitrobacter vinogradskii,

Nitrobacter agilis, Nitrospina gracili, Nitrococcus mobilis.

Quá trình nitrate hóa đóng vai trò quan trọng trong tự nhiên, nó giúploại bỏ chất độc amon trong môi trường từ đó giảm thiểu ảnh hưởng tới sứckhỏe của sinh vật

2.2.4 Quá trình khử nitrate hóa

Trong tự nhiên có hai loại khử nitrate:

- Quá trình đồng hoá (ammonia hoá nitrate) tức là quá trình khử nitrate

thành ammonia, quá trình này xảy ra ở một số vi khuẩn như Bacillus, E coli,

Aerobacter

- Quá trình dị hoá (phản nitrate hoá) là quá trình ngược lại với quá trình

các vi khuẩn khử nitrate, có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí nhưng đặc biệtmạnh trong điều kiện thiếu oxy Oxy được tách ra từ nitrite và nitrate đượcdùng để oxy hóa chất hữu cơ Quá trình này sẽ kèm theo giải phóng nitơ tự dođược ở dạng khí bay vào khí quyển Quá trình phản nitrate hoá giúp chuyểnhoá nitrate thành dạng khí, làm giảm sự tích tụ hàm lượng nitrate trong nước,

là giai đoạn cuối cùng khép kín chu trình nitơ [15]

Hai quá trình khử nitrate này có chung giai đoạn đầu

Quá trình khử NO3- thành khí N2 là quá trình phản nitrate hoàn toàn.Mức độ ôxy hoá của các hợp chất trung gian trong quá trình phản nitrate hoánhư sau:

Bảng 2.2 Dạng oxi hóa của các hợp chất nitơ

2.2.4.1 Vi khuẩn phản nitrate hóa

Tất cả vi khuẩn phản nitrate hóa là hiếu khí hoặc hiếu khí tùy tiện và cóchuỗi hô hấp hoàn chỉnh Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên như đất,nước và các loại phân bón Vi khuẩn này gồm một số đại diện như:

Pseudomonas, Alcaligenes, Azospirillum, Rhodopseudomonas, Pripionibacterium, Achromobacter, Micrococcus, Paracoccus denitrificans, Paracoccus halodenitrificans, Bacillus licheniformic, Bacillus azotofomat [8].

Một số đặc điểm của vi khuẩn phản nitrate hóa được trình bày trongbảng 2.3:

Bảng 2.3 Một số đặc điểm chọn lọc của các đại diện điển hình thuộc

nhóm phản nitrate hóa [8]

Giống/ loài vi

khuẩn

Đặc điểm hình thái và hình thức chuyển động

Tỷ lệ G +

X %

Môi trường sống

Hình que, > 1 tiêm mao 69,5 Đất, bùn

Azospirillum Hình cong, chuyển động

Hình que, 1 tiêm mao 65 – 71 Đất, bùn

Bên cạnh những vi khuẩn tự dưỡng nêu trên còn có các vi khuẩn dị

dưỡng như Thiobacillus denitrificans hoặc tự dưỡng không bắt buộc Nhóm

vi khuẩn khử nitrate hóa hô hấp kỵ khí tuỳ tiện Trong môi trường đủ oxy, các

vi khuẩn phản nitrate hóa này sẽ oxy hóa các hợp chất hữu cơ giống như vikhuẩn hiếu khí bình thường, trong môi trường thiếu oxy chúng mới khử nitrat

Đặc biệt chú ý tới một số vi khuẩn như Alcaligenes, Escherichia,

Aeromonas, Enterobacter, Baclillus, Flavobacterium, Nocardia, Spirillum, Staphylococcus, Vibrio chúng chỉ chuyển hóa NO3- thành NO2- gây độc chonguồn sử dụng [1]

Ngoài ra nitrate và nitrite thường tồn dưới dạng muối của các kim loạikiềm (Na, K) và kiềm thổ (Mg, Ca) Trong quá trình phân giải các muối kali,

natri, canxi sẽ tạo thành các muối cacbonat và kiềm Vì thế, quá trình phảnnitrate hoá thường kèm theo sự kiềm hoá môi trường.

2.2.4.2 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình phản nitrate hóa

a Ảnh hưởng của DO

Oxy điều chỉnh quá trình phản nitrate hóa theo 2 cách [140] Cách thứnhất, nó gây áp lực lên gen nitrogen reductaza Theo một nghiên cứu trên vi

khuẩn Pseudomonas stutzeri chỉ ra rằng những gen trên bị DO gây áp lực khi

nồng độ của nó lớn hơn 2.5 – 5mg O2/l (Theo Korner – Zumft,1989) Các điềuchỉnh thứ hai là ngăn cản hoạt động các enzym của quá trình này khi mà nồng

độ DO lớn hơn 0.1mg O2/l (Theo Tiedje, 1988; Rittmann – Langeland, 1985)

Trên thực tế, quá trình phản nitrate hóa xảy ta khi nồng độ oxy cạn kiệt

và nitrate trở thành nguồn oxy chính cho vi sinh vật [139] Quá trình này xảy

ra trong điều kiện thiếu khí, khi mà nồng độ oxy hóa tan nhỏ hơn 0.5 mg/l, lýtưởng nhất là 0.2 mg/l Khi mà vi khuẩn phá vỡ một phần NO3- để giành thêm

O2, NO3- sẽ chuyển thành N2O và N2 N2 trong nước có nồng độ thấp, nó thoát

ra ngoài không khí Thứ tự ưu tiên trong việc sử dụng nguồn oxy là sử dụngoxy tự do trước, rồi mới đến oxy trong nitrate (nếu trong môi trường có cả hainguồn) Do N2 là thành phần chính trong không khí nên việc giải thoát này sẽkhông làm ảnh hưởng tới môi trường

Quá trình phản nitrate hóa được nâng cao khi các vi khuẩn phản nitratehóa ở tại các màng sinh học (biofilm), nơi mà nồng độ oxy thấp trong mộtlượng nước cần xử lý lớn [140] Nồng độ DO quá thấp hoặc quá cao của cóthể dẫn đến tích lũy các sản phẩm trung gian như NO2-, NO, N2O mà NO và

N2O là 2 khí gây hiệu ứng nhà kính Khi nồng độ quá thấp, sẽ cản trở việc vậnchuyển điện tử tới các enzym, khi nồng độ oxy quá cao sẽ dẫn tới ức chếenzym nitrite reductaza và nitrous oxit reductaza trước khi enzym nitratereductaza bị ức chế

b Ảnh hưởng của pH

pH tối ưu cho quá trình phản nitrate hóa khoảng giữa 7,0 – 8,5 do ở pH

này sự hình thành NO2- chiếm ưu thế, NO2- rất nhạy cảm với các enzym phângiải nên nhanh chóng chuyển thành NO và N2O, sau đó tạo thành N2 Trongnước có pH < 6, sự tích lũy NO xảy ra đồng thời với sự xuất hiện NO2- vàđặc biệt khi nồng độ NO3-cao, điều này xảy ra do sự phân hủy sinh học NO2-không xảy ra ở pH thấp

Sự ảnh hưởng pH có thể mô tả bằng phương trình sau:

CH3COOH + 8/5 NO3-+ 4/5 H2O → 4/5 N2 + 2H2CO3 + 8/5 OH

-4H2 + 8/5 NO3- → 4/5 N2 + 8/5 OH- + 16/5 H2OTrong đó, axetat và H2 là nguồn cung cấp electron cho vi khuẩn phảnnitrate hóa dị dưỡng và tự dưỡng.Trong cả 2 trường hợp, lượng NO3- đưa vàomôi trường tăng bao nhiêu thì độ kiềm của nước tăng bấy nhiêu.Vì vậy,sự

phản nitrat hóa thường kèm theo sự kiềm hóa môi trường [8, 13,149,10 ]

c Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Một khía cạnh quan trọng khác của quá trình phản nitrate hóa đó là yêucầu về nguồn cacbon Sự có mặt của nó điều kiển các phản ứng trong quátrình phản nitrate hóa CH3COOH là nguồn cung cấp electron và là nguồncung cấp cacbon.Những nguồn cacbon dồi dào cho vi sinh vật bao gồm:methanol, axetat, glucozo, ethanol Trong đó, methanol (CH3OH) tương đối rẻ

tiền nên nó được sử dụng rộng rãi [1 40 ]

Trên thực tế, trong một hệ thống xử lý nước thải, nguồn cacbon hữu

cơ cung cấp bởi chính bản thân nước thải chưa qua xử lý hoặc là nguồn

cacbon phụ [1 40 ]

d Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng lên tỷ lệ phát triển của hệ vi sinh vật tham gia vào quátrình phản nitrate hóa Quá trình này có thể xảy ra trong khoảng từ 5 – 60ºC Khinhiệt độ tăng, tốc độ phản ứng tăng và đạt cực đại ở khoảng 60 - 70ºC, sau đógiảm xuống nhanh chóng Khi nhiệt độ xuống thấp hơn 5ºC, tốc độ phản nitrat

hóa cũng giảm nhanh và dừng lại hoàn toàn ở mức 0 – 2ºC [8, 139 ]

2.2.4.3 Ứng dụng của quá trình phản nitrate hóa trong xử lý môi trường

Quá trình phản nitrate hóa có thể xảy ra trong điều kiện hiếu khí, nhưngđặc biệt mạnh trong điều kiện thiếu oxy Các vi khuẩn phản nitrate hóa là tácnhân có hại cho sản xuất nông nghiệp vì nó làm mất một lượng lớn chất đạm

vô cơ ở dạng NO3- dành cho cây trồng Tuy nhiên nó lại là tác nhân quantrọng trong xử lý nước thải đặc biệt cho nuôi trồng thủy sản vì chúng loại

bỏnguồn nitơ liên kết độc hại khỏi môi trường sinh thái [1 40 ]

Bổ sung vi sinh vật (chế phẩm sinh học) có chức năng nitrate hóa trongđầm nuôi thuỷ sản nước lợ là một trong các giải pháp xử lý chất ô nhiễm nitơ

vô cơ trong thủy vực Giải pháp này sử dụng các chủng vi khuẩn phản nitratehoá có hoạt tính sinh học cao đã được phân lập và làm giầu từ tự nhiên (chếphẩm sinh học) để bổ sung vào môi trường nước các đầm nuôi nhằm tăng khảnăng tự loại bỏ các chất ô nhiễm TAN, N-NO2 và N-NO3 Hàng loạt các côngtrình nghiên cứu cũng đã được công bố đều cho thấy việc sử dụng các chủng

vi khuẩn phản nitrate hoá trong nuôi tôm công nghiệp sẽ làm giảm các chấthữu cơ, tăng tỉ lệ sống cho tôm, ức chế sự phát triển của các loài Vibrio phátquang, làm ổn định sự phát triển của tảo (Moriarty, 1998; Jameson, 2003; Philip, 2006 , )

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều chế phẩm sinh học đã được nghiêncứu, sản xuất và thương mại hoá, còn ở Việt Nam, hiện nay có nhiều loại chếphẩm sinh học khác nhau dùng trong xử lý nước nuôi thuỷ sản đang được lưuhành trên thị trường Tuy nhiên, hầu hết các chế phẩm sinh học đang đượcngười tiêu dùng trong nước ưa chuộng đều có nguồn gốc xuất xứ nước ngoài.Chất lượng của chế phẩm vẫn chưa được kiểm chứng kỹ lưỡng, giá thành sảnphẩm vẫn còn cao Theo Stephenson và Stephenson (1992), các chế phẩmchứa các chủng vi khuẩn ngoại lai nhiều khi không phát huy hiệu quả xử lýcác chất ô nhiễm do các chủng vi khuẩn ngoại lai thường không thích ứngđược với điều kiện môi trường bản địa Hơn nữa, việc cấy vi khuẩn ngoại laivào đầm nuôi có thể tác động tiêu cực đến khu hệ vi sinh vật bản địa, phá vỡ

sự cân bằng tự nhiên của khu hệ sinh vật trong đầm nuôi và môi trường sinh

thái xung quanh Do đó, nghiên cứu sản xuất các chế phẩm sinh học là cácchủng vi sinh vật được tuyển chọn từ chính các đầm nuôi thuỷ sản ven biểnnước ta là hết sức cần thiết Các chế phẩm này sẽ có hiệu quả xử lý chất ônhiễm ổn định hơn và không gây ra các tác động tiêu cực đến khu hệ vi sinhvật bản địa, không phá vỡ sự cân bằng tự nhiên của khu hệ sinh vật bản địa.Hơn nữa, các tổ chức, công ty trong nước làm chủ được công nghệ sản xuấtcác chế phẩm sinh học sẽ góp phần làm giảm giá thành sản phẩm, tạo thêmcông ăn việc làm cho người lao động

Khác với giải pháp tăng cường sinh học, giải pháp kích thích sinh học(Biostimulation) là việc thay đổi điều kiện môi trường theo hướng kích thíchkhả năng loại bỏ các chất ô nhiễm nitơ của vi sinh vật bản địa Giải pháp côngnghệ xử lý chất ô nhiễm dựa vào nguyên lý kích thích sinh học đã được nghiêncứu và phát triển lần đầu tiên vào xử lý chất ô nhiễm dầu trong các sự cố tràndần ven biển vào năm 1998 bởi Venose Đối với lĩnh vực nuôi trồng thuỷ sảnnước lợ, gần đây đã có một số công nghệ được phát triển dựa trên nguyên lýkích thích sinh học như nghiên cứu của Viện Nuôi trồng thuỷ sản nước lợ,TháiLan đã triển khai mô hình nuôi sinh thái để không phá vỡ các nhóm vi khuẩnhữu ích như nitrate hoá và phản nitrate hoá Tuy nhiên, việc nghiên cứu và pháttriển các công nghệ dựa trên nguyên lý kích thích sinh học vẫn còn khá mới

mẻ, cần phải có nhiều nghiên cứu hơn, đặc biệt là nghiên cứu các cơ sở khoahọc để có thể đưa ra được các giải pháp công nghệ thích hợp

Quá trình phản nitrate cũng được ứng dụng trong công nghệ lọc sinh học,

hệ thống hoàn lưu đã được nghiên cứu và phát triển để đưa vào nuôi thuỷ sản,đặc biệt ứng dụng vào ương nuôi giống thuỷ sản Nước thải sau khi đi qua hệthống xử lý bao gồm bể phản ứng nitratê và phản nitrate hoá, amonium, nitrite

và nitrate sẽ bị loại bỏ và nồng độ giảm xuống giới hạn cho phép và được tái

sử dụng lại nguồn nước để nuôi trồng thuỷ sản (van Riji và cs., 2005; Tal vàcs., 2009) Công nghệ này cho phép nuôi thuỷ sản nước lợ, nước mặn ngaytrong đất liền, có thể nuôi với mật độ cao mà không bị ô nhiễm hay bệnh,

không làm ô nhiễm môi trường xung quanh Biện pháp này cho kết quả khátốt ở quy mô phòng thí nghiệm nhưng khi triển khai ứng dụng vào thực tiễnlại gặp nhiều khó khăn từ việc lắp đặt đến việc hoạt động và duy trì hệ thống,việc dùng công nghệ này sẽ làm cho chi phí canh tác tăng cao do đó khôngthích hợp với điều kiện của hầu hết các nước đang phát triển đối với các đốitượng nuôi có giá trị kinh tế không cao

2.2.5 Quá trình cố định nitơ phân tử

Việc giảm thiểu nitơ phân tử bằng con đường hóa học thường đắt vàtốn năng lượng lớn Một số sinh vật có khả năng chuyển NO3-thành N2 hoặc

N2O nhờ enzym nitrogenaza Quá trình này gọi là quá trình cố định nitơ phân

tử Việc cố định này được thực hiện nhờ một số vi khuẩn như cố định đạm

như Azotobacter, Azomonas, Rhiborium…

Quá trình cố định nitơ phân tử được ứng dụng nhiều trong việc cải tạođất, thông qua việc sử dụng các chế phẩm sinh học, phân vi sinh Đôi khi vikhuẩn cố định đạm được đưa vào trong việc xử lý nước thải công nghiệp nhưnước thải dầu oliu…Nhờ sự cân bằng của các quá trình trên mà chu trình nitơtrong nước được đảm bảo, hệ sinh thái được duy trì Nếu một trong những quátrình trên bị ức chế hay xảy ra quá mạnh đều ảnh hưởng tới sự cân bằng này

2.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI

Năm 1983, Curtis đã tiến hành nghiên cứu so sánh khả năng khử nitrate

của ba loài vi khuẩn Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas aeruginosa,

Pseudomonas paracoccus mặc dù 3 loài vi khuẩn này đều làm giảm nitrate

tạo ra nitơ, nhưng tốc độ tích lũy số lượng các chất trung gian của chúng khácnhau Sản phẩm sinh ra của quá trình khử nitrate của 3 loài vi khuẩn có sự

khác biệt rõ ràng: Vi khuẩn P stutzeri khử nitrate sản phẩm khí sinh ra duy

nhất là N2, P aeruginosa và P paracoccus khử nitrate sản phẩm sinh ra là

khí NO2 Vi khuẩn P.stutzeri và P Paracoccus khử nitrate làm giảm nhanh

nồng độ NO3-, NO2, NO2 và vi khuẩn này có thể tăng trưởng trong môitrường kỵ khí khi có sự hiện diện của NO2 trong môi trường

Những nghiên cứu tiếp theo của Holmes (1986) và Rosello & cs (1991)

đã phân lập được tổng cộng 49 dòng P stutzeri Chúng được phân lập từ

cácmẫu bệnh lý, bùn biển và trong hệ thống nước thải

Su & cs (2001) tiến hành so sánh sự khử nitrite ở điều kiện hiếu khí,

dưới bầu khí quyển có mức oxy cao của Thiosphaera pantotropha ATCC

35512 và P stutzeri SU2 Chúng đã được phân lập từ bùn hoạt tính trong hệ

thống xử lý nước thải từ trại chăn nuôi heo theo quy trình của Thái Lan

Cùng lúc đó Lee & cs (2002) nghiên cứu về đặc điểm phân tử của quần

xã vi khuẩn trong mẫu bùn hoạt tính loại thải nitrate với việc sử dụng phươngpháp dựa trên 16S rDNA Bài báo cáo cũng đã mô tả một vài đặc tính của một

số chủng từ CR-I (high-nitrate-removing activated sludge) và CR-II nitrate-removing activated sludge) Đa số thuộc lớp Gammaproteobacteria và

(low-là vi khuẩn gram (-), có hình que như P putida, P stutzeri, P azotoformans

2.4 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƯỚC

Hiện nay ở Việt Nam cũng có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn khử đạm

P stutzeri: Phan Trường Khanh (2007), thực hiện đề tài “Phân lập vi khuẩn Pseudomonas stutzeri trong đất đồng bằng sông Cửu Long và ứng dụng xử lý

ammonia trong nước ở điều kiện phòng thí nghiệm” Tác giả đã phân lập

được 20 dòng vi khuẩn Pseudomonas từ các mẫu đất phù sa, phèn, mặn ở ĐBSCL và nhận diện được một dòng P stutzeri bằng cặp mồi đặc trưng 16S

rDNA Bước đầu khảo sát khả năng khử đạm trong nước ao nuôi tôm bịnhiễm ammonia

Nguyễn Trần Hải Bằng (2008), dùng cặp mồi đặc hiệu nosZ2F-nosZ2R

và cd1-nirF-cd1-nirR đã nhận diện được 6 dòng Pseudomonas stutzeri có

chứa gen nosZ, và 8 dòng có chứa gen cd1-nir

Tô Thị Lài (2008), ở qui mô phòng thí nghiệm cho thấy các dòng vi

khuẩn P stutzeri phân lập từ môi trường nuôi cá tra đều có khả năng xử lý

ammonia hiệu quả

Viện nghiên cứu và phát triển công nghệ sinh học- Trường Đại HọcCần Thơ (2006) đã thực hiện: phân lập và nhận diện vi khuẩn khử đạm

Pseudomonas stutzeri từ đất và trong các ao nuôi thủy sản.

PHẦN 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

- Nhóm vi khuẩn phản nitrate hoá trong trầm tích và nước

- Hoạt tính khử nitrate hoá của vi khuẩn bản địa trong trầm tích và nước

3.1.2 Thời gian, địa điểm nghiên cứu:

- Thời gian nghiên cứu:1/2015 đến 5/2015

3.2.VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

3.2.1 Dụng cụ và hóa chất nghiên cứu:

3.2.1.1 Dụng cụ nghiên cứu

- Đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que gạt thủy tinh, bình tam giác, lamkính, lamen, ống eppendorf, bọc nylon và chai đựng mẫu bùn và mẫu nước, -Nồi hấp khử trùng (Đài Loan)

- Tủ lạnh (Nhật Bản)

- Tủ nuôi (Nhật Bản và Đức)

- Tủ cấy vi sinh (Việt Nam)

- Cân điện tử Adam ( Anh)

- Máy đo oxy ( YSI – 58, Mỹ)

- Máy đo pH 704, Metrom ( Đức)

- Máy đo độ muối (Nhật Bản)

- Kính hiển vi Olimpus (Nhật)

- Máy đo quang phổ ( Nhật))

- Tủ khử trùng khô ( Đức)

- Pipet Hirchman Đức và Nexty-Watson (Nhật Bản)

3.2.1.2 Hóa chất, thuốc thử và môi trường sử dụng

a.Hóa chất

Các hóa chất có độ tinh khiết cao, một số hóa chất nhập ngoạiđược sử dụng trong thiết kế tốt nghiệp này Các hóa chất thường dùng làcao nấm men (Đức), pepton (Trung Quốc)

b.Một số thuốc thử sử dụng

- Thuốc thử Diphenylamin để xác định NO3 - [4]

- Dung dịch Lugol để nhuộm tiêu bản đơn giản

- Dung dịch lục Malachit để nhuộm bào tử

- Dung dịch Safranin

- Dung dịch tím kết tinh để nhuộm Gram

- Thuốc thử Kovac để xác định indol

-Thuốc cắn màu Iodin mordant

c Môi trường sử dụng

- Môi trường nuôi cấy, phân lập, giữ giống vi khuẩn phản nitrate hóa

- Môi trường xác định hoạt tính của vi khuẩn phản nitrate hóa

3.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Các chủng vi khuẩn phản nitrate hóa được phân lập từ các đầm NTTStại Cống Rộc và đền Bà Đế tại Đồ Sơn - Hải Phòng theo quy trình sau:

Thu mẫu

Làm giàu vi khuẩn

Phân lập vi sinh vật khử đạm trên môi trường chọn lọc

(môi trường dịch thể nitrate-glucoza)

Làm thuần vi sinh vật phản nitrate hóa

(môi trường thạch nitrate-glucoza)

Xác định chủng có hoạt tính phản nitrate hóa mạnh nhất

- Xác định khả năng sinh khí trong ống Durham

- Xác định khả năng khử nitrate

Phân loại các chủng đã lựa chọn

và giữ giống

Thử hoạt tính phản nitrate hóa với một

số yếu tố môi trường

Hình3 13 Quy trình thực nghiệm nghiên cứu vi khuẩn phản nitrate hóa

3.3.1 Phương pháp thu mẫu

Tại mỗi khu vực thu mẫu, tiến hành thu mẫu ở 3 vi trí khác nhau Thumẫu nước bằng dụng cụ thu mẫu nước chuyên dụng (Bathomet) Ở mỗi vị tríthu mẫu lấy nước ở tầng mặt khoảng từ 0-30 cm Đối với mẫu nước dùng đểphân tích các thông số thủy hóa thì đựng trong chai nhựa Mẫu nước dùng đểphân tích vi sinh vật thì được đựng trong chai thủy tinh dung tích 100ml đãđược khử trùng Tất cả các chai đều được khi nhãn và bảo quản trong điềukiện lạnh (4oC) và phân tích trong 24 giờ

Dụng cụ thu mẫu (cuốc thu mẫu, thìa inox tách mẫu) và lọ thủy tinhđựng mẫu phải được khủ trùng trước khi đi thu mẫu và bảo quản vô trùngtrong quá trình lấy mẫu Dùng thìa inox lấy khoảng 100g lớp trầm tích bề mặt(khoảng 6cm) và chuyển vô trùng vào lọ đựng mẫu đã ghi rõ nhãn và nhanhchóng cho vào hộp giữ lạnh (4 oC) và chuyển về phòng thí nghiệm xử lý trongvòng 1h.

3.3.2 Phương pháp đo nhanh các thông số môi trường

- Nhiệt độ nước: được đo bằng nhiệt kế thủy ngân

- pH được đo bằng máy đo pH (704, Metrohm, Đức)

- Độ mặn( S%o) được đo bằng khúc xạ cầm tay (Atogo, Nhật Bản)

- DO được đo bằng máy đo oxy ( YSI-58, Mỹ)

3.3.3 Phương pháp làm giàu, phân lập, thuần khiết và giữ giống vi

khuẩn

3.3.3.1 Phương pháp làm giàu

Mẫu lấy về được đưa vào bình tam giác có chứa 250 ml môi trườngnuôi cấy Bình mẫu sau đó được bọc giấy bạc Nuôi trong điều kiện thiếu ánhsáng trong vòng 1 tuần

3.3.3.2 Phương pháp phân lập

Sử dụng bình mẫu chứa vi khuẩn đã được làm giàu Dùng pipet vôtrùng lấy 50 µl dung dịch ở các nồng độ thích hợp nhỏ lên mặt đĩa thạch môitrường phản nitrate hóa Dùng que cấy thủy tinh vô trùng dàn đều trên bề mặt

thạch Nuôi cấy ở 30ºC trong tủ ấm [2]

3.3.3.3 Phương pháp thuần khiết vi khuẩn bằng phương pháp cấy ria 3 pha

Các khuẩn lạc phát triển riêng rẽ trên môi trường phân lập được cấytruyền sang môi trường thạch nghiêng tương ứng trong các bình mẫu, sau

đó làm sạch và thuần khiết lại như sau:

Lấy một ít tế bào vào một góc đĩa thạch chấm nhẹ để loại bớt tế bàomột lần nữa Từ điểm này đẩy nhẹ đầu que cấy lướt nhanh trên mặt thạch theo

đường zích zắc thứ nhất, ria đường thứ 2 có chiều khác với đường ban đầu.Đậy nắp đĩa Khử trùng que cấy, làm nguội, bắt đầu từ một cạnh của đườngzích zắc thứ 2, ria cấy đường zích zắc thứ 3 có chiều khác với đường 1 và thứ

2 trên khoảng trống còn lại Đậy nắp đĩa Khử trùng que cấy trước khi cắmvào giá

Nuôi trong tủ ấm khoảng 2-3 ngày ở nhiệt độ 300C

Kết quả thu được các khuẩn lạc riêng rẽ, cấy truyền các khuẩn lạc đó

vào ống thạch nghiêng [3]

3.3.3.4 Giữ giống vi khuẩn

Phương pháp cấy truyền định kỳ: Các giống vi khuẩn thuần chủngtrong các ống nghiệm thạch nghiêng ( có môi trường agar phân lập vi khuẩnphản nitrate) được giữ ở nhiệt độ 4 – 10ºC trong tủ lạnh Mỗi tháng một lần

cấy truyền định kỳ sang môi trường mới [2]

Phương pháp giữ giống trong glixerin: Vi khuẩn được nuôi cấy trongcác đĩa petri trên môi trường thạch trong 3 ngày Sau đó tạo dịch huyền phùbằng nước muối sinh lý, chuyển các tế bào vi khuẩn sang glyxerin vô trùngvới nồng độ cuối cùng của glixerin là 50% Giữ trong lọ đậy kín ở -20ºC

[1 51 ]

3.3.4 Xác định khả năng sinh khí N 2 nhờ ống Durham

Môi trường dịch thể nuôi cấy vi khuẩn phản nitrate hóa bổ sungNaNO3 2,6 mg/l Rót môi trường vào ống nghiệm có chứa ống Durham Khửtrùng ở 121oC, 1.0 atm trong 30 phút, để nguội Cấy vi khuẩn vào từng ốngnghiệm của Đức có nút xoáy Sau 2 – 3 ngày nếu hình thành khí trong ốngDurham thì cho kết quả dương tính (có khả năng phản nitrate hóa), nếu không

có khí cho kết quả âm tính (không có khả năng phản nitrate hóa) [1]