Tài liệu Tách dòng phân tử và xây dựng thư viện hệ gen pdf

các phân t ADN tái t h p mang cácử ổ ợ

phân đo n ADN mang ngu n g c khácạ ồ ố

nhau Các phân t ADN tái t h p m iử ổ ợ ớ

“dung h p” m i (protein lai) mang cácợ ớ

trình t axit amin t các protein có ngu nự ừ ồ

g c khác nhau Hi n nay, các k thu tố ệ ỹ ậ

tách dòng phân t (bao g m c PCR) đãử ồ ả

tr thành các công c thi t y u trongở ụ ế ế

nghiên c u v s đi u hòa và bi u hi nứ ề ự ề ể ệ

c a các gen và h gen các loài sinh v tủ ệ ở ậ khác nhau

Quá trình tách dòng ADN và t o nên cácạphân t ADN tái t h p đi n hìnhử ổ ợ ể

thường liên quan đ n vi c s d ng cácế ệ ử ụvéct là trình t mang thông tin đi uơ ự ề

khi n ho t đ ng nhân lên (khu ch đ i)ể ạ ộ ế ạ và/ho c bi u hi n trong t bào c a phânặ ể ệ ế ủ

t ADN tái t h p mang đo n ADN càiử ổ ợ ạ(đo n trình t đạ ự ược phân l p) bao g mậ ồ trình t gen đự ược quan tâm nghiên c u.ứ Các “công c ” chính đ t o nên các phânụ ể ạ

t ADN tái t h p là các enzym gi i h nử ổ ợ ớ ạ giúp c t các phân t ADN t i các v tríắ ử ạ ị xác đ nh và các enzym n i cho phép ghépị ố

n i các phân đo n ADN có ngu n g cố ạ ồ ố

khác nhau v i nhau B ng vi c t o nênớ ằ ệ ạcác phân t ADN tái t h p có th tử ổ ợ ể ự

nh n lên trong t bào ch , m t đo nậ ế ủ ộ ạ

ADN cài xác đ nh nào đó có th đị ể ượ c

phân l p, tinh s ch và nhân lên thànhậ ạ

t p h p các phân t ADN lai ch a cácậ ợ ử ứ

đo n cài xu t phát t m t h gen c nạ ấ ừ ộ ệ ầ

được thi t l p đ ph c v cho vi cế ậ ể ụ ụ ệ

nghiên c u, phân tích m t h gen Thôngứ ộ ệ

thường m t th vi n h gen độ ư ệ ệ ược thi tế

l p b ng vi c s d ng chung cùng m tậ ằ ệ ử ụ ộ

lo i véct mang các phân đo n ADN càiạ ơ ạkhác nhau Chúng ta s th y b ng cáchẽ ấ ằnào các phân đo n ADN đ c hi u có thạ ặ ệ ể

được xác đ nh và phân l p t các thị ậ ừ ư

vi n h gen.ệ ệ

Tách dòng ADN trong các véct plasmitơ

Sau khi m t phân đo n ADN độ ạ ượ ắ c c t

kh i m t phân t ADN có kích thỏ ộ ử ướ c

l n h n b ng enzym gi i h n, phânớ ơ ằ ớ ạ

đo n ADN đó c n đạ ầ ược “cài” vào m tộ véct đ có th nhân lên Hay nói cáchơ ể ểkhác là m t phân đo n ADN c n độ ạ ầ ượ ccài vào m t phân t ADN th hai (véct )ộ ử ứ ơ

đ có th nhân lên để ể ược trong t bàoế

ch nh đã nói trên Cho đ n nay, tủ ư ở ế ế bào ch đủ ượ ử ục s d ng r ng rãi nh t độ ấ ể nhân lên các đo n ADN trong công nghạ ệ ADN tái t h p là vi khu nổ ợ ẩ

E coli

Các véct ADN đi n hình thơ ể ường có 3

t h p (mang đo n ADN cài) v i các tổ ợ ạ ớ ế bào không mang véct tái t h p.ơ ổ ợ

3) Có v trí c t c a m t ho c nhi uị ắ ủ ộ ặ ề

enzym gi i h n khác nhau Đây chính làớ ạ

v trí cài c a phân đo n ADN c n táchị ủ ạ ầdòng vào véct ơ

Véct tách dòng ph bi n nh t là cácơ ổ ế ấ

phân t ADN s i kép, m ch vòng kíchử ợ ạ

thước nh (kho ng 3 kb) đỏ ả ược g i làọ

các plasmit Các véct này ph n l n cóơ ầ ớngu n g c t các loài vi khu n và m tồ ố ừ ẩ ộ

s t các sinh v t nhân chu n đ n bàoố ừ ậ ẩ ơ

(n m men) Trong nhi u trấ ề ường h p, cácợphân t ADN này trong t nhiên đã mangử ự

s n các gen mã hóa tính kháng ch tẵ ấ

kháng sinh Nh v y, các plasmid trongư ậ

t nhiên đã có s n hai thu c tính là: khự ẵ ộ ả năng t sao chép trong t bào ch và cóự ế ủtrình t d u chu n ch n l c Ngoài ra,ự ấ ẩ ọ ọ

các véct plasmit còn m t u đi m n aơ ộ ư ể ữ

là chúng có th đ ng th i t n t i nhi uể ồ ờ ồ ạ ề

b n sao trong t bào Đi u này có thả ế ề ể

giúp khu ch đ i và phân l p đế ạ ậ ược m tộ

s lố ượng l n m t phân đo n ADN nàoớ ộ ạ

đó t m t qu n th t bào nh ừ ộ ầ ể ế ỏ

Trước đây, m t s véct plasmit ch cóộ ố ơ ỉ

m t v trí c t c a enzym gi i h n duyộ ị ắ ủ ớ ạ

nh t Cùng v i th i gian, c u trúc c aấ ớ ờ ấ ủ

các véct plasmit đơ ượ ả ếc c i ti n theo

hướng c t b b t các trình t không c nắ ỏ ớ ự ầ thi t và g n thêm vào đo n trình t cóế ắ ạ ự

th để ượ ắ ằc c t b ng nhi u lo i enzymề ạ

gi i h n khác nhau V trí trên véctớ ạ ị ơ

mang đo n trình t nh v y đạ ự ư ậ ược g i làọ

v trí đa tách dòng (polycloning site) Cóị

nh ng v trí đa tách dòng hi n nay cóữ ị ệ

kích thước ng n nh ng có th đắ ư ể ượ ắ c c t

b i trên 20 lo i enzym gi i h n khácở ạ ớ ạ

nhau Nh đ c tính này, m t véct cóờ ặ ộ ơ

th để ược dùng đ tách dòng nhi u phânể ề

đo n ADN có ngu n g c khác nhau.ạ ồ ố

Trên c s các nguyên t c tơ ở ắ ương t ,ự

ngoài véct plasmit, hi n nay ngơ ệ ười ta đãphát tri n để ược nhi u lo i véct khácề ạ ơ

nhau có ngu n g c phag , ho c lai gi aồ ố ơ ặ ữ

vi khu n - phag (nh phagemid, cosmidẩ ơ ưP), ho c có ngu n g c t n m men (víặ ồ ố ừ ấ

d : YAC).ụ

Vi c cài m t phân đo n ADN vào m tệ ộ ạ ộ véct thơ ường là m t công vi c tộ ệ ươ ng

đ i đ n gi n Ngố ơ ả ười ta thường s d ngử ụ cùng m t lo i enzym gi i h n đ c tộ ạ ớ ạ ể ắ

véct và đo n ADN cài Ch ng h n nhơ ạ ẳ ạ ư

m i (phân t ADN tái t h p) ch cònớ ử ổ ợ ỉ

thi u hai liên k t phosphodieste duy nh tế ế ấ còn l i m i m ch Hai liên k t này sạ ở ỗ ạ ế ẽ

được “hàn” kín nh s d ng enzymờ ử ụ

ADN ligase trong s có m t c a ATP.ự ặ ủ

Đ h n ch kh năng g n k t l i c aể ạ ế ả ắ ế ạ ủ hai đ u dính c a chính véct (vì hai đ uầ ủ ơ ầ dính này có trình t b tr ) sau khi đự ổ ợ ượ c

c t b i enzym gi i h n, ngắ ở ớ ạ ười ta thườ ngcho lượng ADN cài d th a so v i véctư ừ ớ ơ

đ ph n l n các véct sau khi g n l i làể ầ ớ ơ ắ ạcác véct tái t h p mang các đo n ADNơ ổ ợ ạcài

M t s lo i véct không nh ng choộ ố ạ ơ ữ

phép phân l p và tinh s ch đậ ạ ược m tộ

phân đo n gen nào đó, mà còn có thạ ể

đi u hòa s bi u hi n c a gen n mề ự ể ệ ủ ằ

trong phân đo n ADN cài Nh ng véctạ ữ ơ

nh v y đư ậ ược g i là các véct bi uọ ơ ể

hi n Các véct này thệ ơ ường ph i ch aả ứ trình t promoter n m ngự ằ ược dòng sát

v i v trí cài gen N u vùng mã hóa c aớ ị ế ủ gen (không ch a promoter) đứ ược g nắ

vào véct theo đúng chi u khung đ cơ ề ọ

c a gen, thì gen cài s đủ ẽ ược phiên mã

thành mARN và d ch mã thành proteinị

trong t bào ch Các véct bi u hi nế ủ ơ ể ệ

thường đượ ử ục s d ng đ bi u hi n cácể ể ệgen đ t bi n ho c các gen lai đ ti nộ ế ặ ể ế

hành phân tích ch c năng c a chúng.ứ ủ

Chúng cũng có th để ược dùng đ s nể ả

xu t m t lấ ộ ượng l n m t lo i protein nàoớ ộ ạ

đó v n không thu đố ược hi u su t tệ ấ ươ ng

t b ng các con đự ằ ường t nhiên Ngoàiự

ra, các promoter trong các véct bi uơ ể

hi n có th đệ ể ượ ực l a ch n sao cho sọ ự

bi u hi n c a gen cài có th để ệ ủ ể ược đi uề hòa b ng vi c b sung m t h p ch tằ ệ ổ ộ ợ ấ

đ n gi n vào môi trơ ả ường nuôi c y (nhấ ư

m t lo i độ ạ ường ho c axit amin ch ngặ ẳ

h n) Vi c có th đi u khi n ch đ ngạ ệ ể ề ể ủ ộ

s bi u hi n c a m t gen nào đó có ýự ể ệ ủ ộ

nghĩa quan tr ng, đ c bi t đ i v i cácọ ặ ệ ố ớ

gen gây đ c.ộ

Bi n n p các véct ADN vào t bào chế ạ ơ ế ủ

Bi n n p là quá trình đó m t c thế ạ ở ộ ơ ể

ch có th ti p nh n m t phân t ADNủ ể ế ậ ộ ửngo i lai t môi trạ ừ ường bên ngoài M tộ

s vi khu n (trong đó không có E coli)ố ẩ

có kh năng bi n n p t nhiên đả ế ạ ự ược g iọ

là các vi khu n kh bi n di truy n Viẩ ả ế ề

khu n E coli có th tr nên kh bi nẩ ể ở ả ế

khi được x lý v i ion Ca2+ M c dù cử ớ ặ ơ

gen d u chu n mã hóa tính kháng ch tấ ẩ ấ kháng sinh đó đ ch n l c để ọ ọ ược các thể mang plasmid tái t h p Các t bàoổ ợ ế

mang véct tái t h p có th sinh trơ ổ ợ ể ưở ngtrong môi trường ch a ch t kháng sinh,ứ ấtrong khi các t bào khác thì không.ế

Thông thường quá trình bi n n p cóế ạ

hi u su t không cao Ch có m t t lệ ấ ỉ ộ ỉ ệ

nh các t bào đỏ ế ược x lý bi n n p cóử ế ạ

th ti p nh n để ế ậ ược plasmid tái t h p.ổ ợ

Nh ng, chính hi u qu bi n n p th pư ệ ả ế ạ ấ giúp h u h t các t bào mang véct táiầ ế ế ơ

t h p thổ ợ ường ch ti p nh n m tỉ ế ậ ộ

plasmid duy nh t Thu c tính này giúpấ ộ

cho các t bào bi n n p và dòng t bàoế ế ạ ế

do chúng sinh ra (do phân chia tr c phân)ự

ch mang m t véct ADN tái t h p duyỉ ộ ơ ổ ợ

nh t và cho phép các nhà nghiên c u thấ ứ ể phân l p và tinh s ch đậ ạ ược các gen ho cặ

ho c s n ph m c a các gen riêng r tặ ả ẩ ủ ẽ ừ

h n h p bi n n p mang c các phân tỗ ợ ế ạ ả ử ADN khác

Thi t l p th vi n h genế ậ ư ệ ệ

untitled_500_28Đ i v iố ớ các h gen đ n gi n, kệ ơ ả ỹ thu t tách dòng thậ ườ ngkhá đ n gi n Ch ng h nơ ả ẳ ạ

nh v i h gen m t sư ớ ệ ộ ố virut có kích thướ c

kho ng 10 kb, ngả ười ta có

th tr c ti p tách chi tể ự ế ế ADN, c t chúng b ngắ ằ enzym gi i h n r i ti nớ ạ ồ ế hành phân tích đi n di Các phân đo nệ ạ

ADN tách bi t trên gel đi n di đệ ệ ượ ắ c c t

kh i gel, tinh s ch r i cài vào các véct ỏ ạ ồ ơ

Trong khi đó, đ i v i các h gen ph cố ớ ệ ứ

t p, kích thạ ướ ớc l n (nh h gen ngư ệ ườ i),

vi c c t ADN t ng s b ng enzym gi iệ ắ ổ ố ằ ớ

h n r i phân tích đi n di thạ ồ ệ ường d nẫ

đ n s hình thành m t d i băng đi n diế ự ộ ả ệliên t c do có s phân b liên t c c aụ ự ố ụ ủ

các phân đo n ADN đạ ượ ắc c t gi i h nớ ạ

ch khác nhau m t ho c m t vàiỉ ộ ặ ộ

nucleotit Vì v y, đ đ n gi n hóa quyậ ể ơ ảtrình tách dòng nh ng h gen này,ở ữ ệ

người ta thường ti n hành bi n n p toànế ế ạ

b các phân đo n ADN (thu độ ạ ược sau

khi c t b ng enzym gi i h n) vào véctắ ằ ớ ạ ơ tách dòng r i bi n n p t t c chúng vàoồ ế ạ ấ ả

t bào ch , sau đó m i phân l p cácế ủ ớ ậ

dòng t bào mang véct tái t h p có cácế ơ ổ ợ

đo n cài ADN khác nhau T p h p cácạ ậ ợdòng t bào nh v y đế ư ậ ược g i là thọ ư

vi n h gen Nh v y, th vi n h genệ ệ ư ậ ư ệ ệ

là t p h p các dòng t bào mang cácậ ợ ế

véct tái t h p ch a các đo n ADN càiơ ổ ợ ứ ạkhác nhau có cùng ngu n g c (cùng hồ ố ệ gen).

untitled_500_28Đ thi t l p m t thể ế ậ ộ ư

vi n gen, h gen c a t bào đích (ch ngệ ệ ủ ế ẳ

h n ADN h gen ngạ ệ ười) đượ ắ ằ c c t b ngenzym gi i h n đ t o ra các phân đo nớ ạ ể ạ ạ ADN có kích thước trung bình mong

mu n Kích thố ước các phân đo n (đo nạ ạ cài) có th dao đ ng t 100 bp đ n trên 1ể ộ ừ ế

Mb (đ i v i các phân đo n ADN kíchố ớ ạ

thướ ấ ớc r t l n, phân t ADN thử ườ ng

đượ ắc c t không hoàn toàn b ng m tằ ộ

enzym gi i h n) Các phân đo n ADNớ ạ ạ

c t gi i h n sau đó đắ ớ ạ ược “tr n” v i m tộ ớ ộ

lo i véct phù h p (trạ ơ ợ ước đó đượ ắ c c t

b i cùng lo i enzym gi i h n) và ADNở ạ ớ ạligase K t qu c a bế ả ủ ước này s t o raẽ ạ

m t t p h p các véct mang các đo nộ ậ ợ ơ ạ

ADN cài khác nhau.

mong mu n, thì th vi n h gen ch t raố ư ệ ệ ỉ ỏ

hi u qu đ i v i h gen ch ch a m tệ ả ố ớ ệ ỉ ứ ộ

ph n tầ ương đ i nh các vùng không mãố ỏhóa Đ i v i các h gen ph c t p h n,ố ớ ệ ứ ạ ơ

th vi n h gen không phù h p cho vi cư ệ ệ ợ ệ tìm ra phân đo n mang gen mong mu nạ ố

b i vì ph n l n các dòng trong th vi nở ầ ớ ư ệ mang các đo n cài thu c các vùng khôngạ ộ

tiên thay vì b t đ u t ADN, ngắ ầ ừ ười ta

phiên mã ngược trình t mARN thànhự

trình t ADN phiên b n (cADN) Quáự ả

trình này được g i là quá trình phiên mãọ

ngược và được th c hi n nh m tự ệ ờ ộ

enzym ADN polymerase đ c bi t làặ ệ

reverse transcriptase

Enzym này có kh năng t ng h p ADNả ổ ợ

b t ngu n t phân t ARN m ch đ nắ ồ ừ ử ạ ơ làm khuôn ban đ u Khi có m t enzymầ ặ

reverse transcriptase, các trình t mARNự

được phiên mã ngược thành các phân tử ADN s i kép, và nh ng phân t này cóợ ữ ử

th để ược g n vào các véct ắ ơ

Đ có th phân l p để ể ậ ược các đo n càiạ

riêng r t th vi n h gen, các t bàoẽ ừ ư ệ ệ ế

E coli được ti n hành bi n n p v i t tế ế ạ ớ ấ

c các phân đo n trong th vi n M iả ạ ư ệ ỗ

m t t bào bi n n p thộ ế ế ạ ường ch mangỉ

duy nh t m t véct mang đo n càiấ ộ ơ ạ

ADN Vì v y, khi các t bào nhân lên sauậ ế

đó chúng s s t o ra nhi u dòng t bào,ẽ ẽ ạ ề ế

m i dòng ch a nhi u b n sao c a m tỗ ứ ề ả ủ ộ phân đo n trong th vi n cADN Khu nạ ư ệ ẩ

l c đạ ượ ạc t o ra t các t bào mang cácừ ếtrình t ADN mong mu n có th đự ố ể ượ cphân l p và t đó thu l i ADN Có m tậ ừ ạ ộ

s cách đ xác đ nh các dòng t bào đãố ể ị ếmang gen bi n n p Ch ng h n phế ạ ẳ ạ ươ ngpháp được nêu dưới đây s d ng cácử ụ

m u dò ARN và /ho c ADN đ xác đ nhẫ ặ ể ị các qu n th t bào mang m t đo nầ ể ế ộ ạ

khác nhau được mang b i cùng m t lo iở ộ ạ véct tách dòng Sau khi véct đơ ơ ượ c

bi n n p vào m t ch ng vi khu n phùế ạ ộ ủ ẩ

h p, các t bào vi khu n đợ ế ẩ ượ ấc c y trên

b m t đĩa petri ch a môi trề ặ ứ ường bán

r n ch a agar M i t bào sau đó s phátắ ứ ỗ ế ẽtri n lên thành m t khu n l c riêng r ,ể ộ ẩ ạ ẽ

và các t bào trong cùng m t khu n l cế ộ ẩ ạ

đ u mang cùng lo i véct và đo n genề ạ ơ ạcài gi ng nhau.ố

Trong k thu t lai khu n l c, ngỹ ậ ẩ ạ ười ta

cũng có th s d ng lo i màng lai để ử ụ ạ ượ cdùng trong các phương pháp th m táchẩSouthern và Northern đ thu h i để ồ ượ c

m t lộ ượng “v t” ADN đ cho s k tế ủ ự ế

c p v i m u dò đây, ngặ ớ ẫ ở ười ta s dùngẽmàng lai ép lên b m t đĩa nuôi c yề ặ ấ

ch a khu n l c và in hình chúng lênứ ẩ ạ

màng lai (cùng v i ADN c a chúng) saoớ ủcho v trí c a các dòng t bào trên màngị ủ ếlai tương ng v i các v trí khu n l cứ ớ ị ẩ ạ

c a chúng trên đĩa petri (theo nguyên t củ ắ

“đóng d u”) Đi u này đ m b o choấ ề ả ả

vi c khi chúng ta xác đ nh đệ ị ược m t vộ ị trí trên màng lai có k t qu “dế ả ương tính”

và vi c b t c p v i m u dò thì chúng taệ ắ ặ ớ ẫ

s xác đ nh đẽ ị ượ ươc t ng ng khu n l cứ ẩ ạ mang dòng t bào ch a véct tái t h pế ứ ơ ổ ợ mang đo n gen cài mong mu n.ạ ố

Màng lai được đem lai v i m u dò nhớ ẫ ư sau: người ta ti n hành x lý màng laiế ử

sao cho màng t bào v ra và các phân tế ỡ ử ADN thoát ra ngoài g n lên màng lai t iắ ạ chính v trí t bào c a chúng Các màngị ế ủlai sau đó đượ ủ ớc v i các m u dò đẫ ượ cđánh d u t trấ ừ ước trong các đi u ki nề ệ

gi ng nh khi ti n hành các k thu tố ư ế ỹ ậ

th m tách Northern hay Southern.ẩ

Trong công ngh ADN tái t h p, ngoàiệ ổ ợcác véct plasmit có ngu n g c viơ ồ ố

khu n, ngẩ ười ta còn có th s d ngể ử ụ

véct có ngu n g c virutơ ồ ố

(bacteriophage), ho c t các sinh v t b cặ ừ ậ ậ cao h n nh nhi m s c th nhân t oơ ư ễ ắ ể ạ

n m men (YAC), hay nhi m s c thấ ễ ắ ể

nhân t o có ngu n g c vi khu n (BAC),ạ ồ ố ẩ

ho c m t s véct lai gi a chúng (vd:ặ ộ ố ơ ữ

cosmid, P) Trong các véct có ngu nơ ồ

g c bacteriophage, phage l đố ượ ử ụ c s d ng

ph bi n ADN c a virut này đổ ế ủ ượ ả c c i