Tài liệu hướng dẫn thí nghiệm vi hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường nguyễn thị sơn, trần lệ minh

Nội dung tài liệu được viết nhằm củng cố phần lý thuyết của hai môn học: - Hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường - Ví sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường đồng thời cung cấp c

PG S T S NGUYỄN T H Ị SƠN - TH S TRẦN LỆ M IN H

TÀI LIỆU THÍ NGHIỆM

VI - HÓA SINH ỨNG DỤNG

TRONG CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG

NHÀ XUẤT BẢN BÁCH KHOA - HÀ NỘI

Mã số: 285-2008/CXB/03-57/BKHN

LỜI MỞ ĐẦU

“Tài liệu thi nghiệm Vì - Hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường” được biên soạn phù hợp với nội dung môn học tương ứng trong chương trình khung được Bộ Giáo dục và Đào tạo thông qua cho ngành Kỹ thuật môi trường Tài liệu được sử dụng trong hướng dẫn thực hành cho sinh viên đại học và học viên cao học ngành kỹ thuật môi trường.

1 Tài liệu được biên soạn gồm 4 phần cơ bàn

2 Thí nghiệm Hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường

3 Thí nghiệm Vi sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường

4 Thí nghiệm chuyên đề Xử lý sinh học nước thải

Phụ lục giới thiệu một số dụng cụ, thiết bị cần thiết phục vụ cho các thí nghiệm trên (hiện có tại Viện Khoa học và công nghệ môi trường - Trường Đại học Bách khoa Hà Nội).

Nội dung tài liệu được viết nhằm củng cố phần lý thuyết của hai môn học:

- Hóa sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường

- Ví sinh ứng dụng trong công nghệ môi trường đồng thời cung cấp cho sinh viên một số kỹ năng thực hành trong nghiên cứu về vi sinh vật cũng như phương pháp phân tích một số chỉ tiêu sinh học quan trọng trong xử lý và đánh giá chất lượng môi trường.

Phần thí nghiệm chuyên đề giúp sinh viên bước đầu làm quen với các phương pháp xử lý sinh học Trên cơ sở vận hành, phân tích và tính toán các thông

số kỹ thuât thu được, sinh viên có thể đánh giá cũng như xử lý các sự cô phát sinh trong quá trình vận hành hệ thống xử lý sinh học nước thải.

Chúng tôi hy vọng cuốn sách này cũng có thể dùng làm tài liệu tham khảo bổ ích cho công tác đào tạo và nghiên cứu trong lĩnh vực công nghệ sinh học môi trường cũng như cho các cán bộ kỹ thuật các ngành liên quan.

Do được biên soạn lần đầu, cuốn tài liệu không tránh khỏi còn những thiếu sót Chúng tôi rất mong nhận được ý kiến đóng góp của bạn đọc và đồng nghiệp để bổ sung và chinh sửa khi tài liệu được tái bản.

Các tác giả

3

1.1.1 Đặc trưng và một số Enzym được ứng dụng trong công nghệ môi trường

I/Những đặc trưng của Enzym từ vi sinh vật

Hệ Enzym cùa vi sinh vật rất đa dạng, phong phú Từ vi sinh vật có thể thu nhiều Enzym khác nhau, trong đó có những Enzym chi cỏ ở vi sinh vật như zenlulaza, razemaza.

- Enzym từ vi sinh vật có hoạt lực cao hon các Enzym tưong tự ỏ' động vật

và thực vật.

- Vi sinh vật nhạy cảm với môi trường nên khi thay đổi điều kiện sống hoặc tác động bằng các yếu tố khác nhau, có thể thay đổi hệ Enzym và hoạt lực Enzym cùa chúng Nhờ vậy có thể tạo được các Enzym theo yêu cầu với hoạt lực cao.

- So với các sinh vật khác, vi sinh vật phát triển nhanh hơn, tuy kích thước nhỏ nhưng hiệu suất sinh tổng hợp Enzym và tỷ lệ Enzym trong tế bào tương đối lớn nên hiệu suất thu hòi Enzym cao, quy trình sản xuất đơn giản.

- Nguyên liệu sử dụng nuôi cấy vi sinh vật để thu Enzym rất rẻ tiền, dễ kiếm, thường là các loại phụ phàm, phế liệu Do đó, giá thành Enzym từ vi sinh vật thấp hơn nhiều so với Enzym nguồn gốc động, thực vật.

4

2 /Một số Enzym được ứng dụng rộng rãi trong công nghệ môi trường a/ Enzym Amylaza

chung chỉ một nhóm gồm các Enzym có khả năng xúc tác thuỷ phân tinh bột thành dextrin, đường maltoza và glucoza như a - amylaza, ß - amylaza, glucoamylaza, dextrinaza

- Amylaza có trong một số nấm mốc:

Nấm men có khả năng tổng hợp Amylaza:

Vi khuẩn có khả năng tổng hợp Amylaza:

Proteaza có ở vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm mốc:

+ Bacillus: Bac subtilis, Bac thermophilus

+ Clostridium: d o s t, perfringen, Clost histolyticum

-Nấm mốc:

+ Aspergillus: Asp oryzae, Asp fumigatus, Asp flavus

+ Penicillum: Pen janthinellum

Proteaza có trong thực vật (promelin ở quả dứa, papain ở quà đu đủ xanh ), trong động vật (tụy tạng, dạ dày ).

5

c / Enzym Pectinaza

Pectin là thành phần chính của lóp gian bào có chức năng kết dính các tế bào tạo thành mô thực vật.

Pectin thực chất là axit Polygalacturonic đirợc tạo thành nhờ liên kết a - 1,4

metyl hóa Khi số lượng các gốc cacboxyl được metyl hóa vượt quá 75%, pectin trở nên bền, không tan được gọi là Protopectin.

Enzym thủy phân pectin thực chất gồm 2 nhóm: Enzym thủy phân liên kết este (Esteraza) chuyển Pectin không tan thành pectin tan và Enzym thủy phân liên kết a 1 , 4 - glycozit (Depolymeraza) thủy phân pectin tan thành axit

D - Galacturonic.

Enzym Pectinaza có ý nghĩa rất lớn trong công nghệ môi trường, đặc biệt trong xử lý chất thải rắn (sinh hoạt và công nghiệp) có nguồn gốc thực vật như vỏ quả, cuống rau, chất thải nông nghiệp (thân, lá, vỏ hạt ), chúng phân hủy pectin, giải phóng Xenllulo, giúp quá trình chuyển hóa Xenllulo và quá trình vô cơ hóa xác thực vật xảy ra nhanh hơn.

Pectinaza chỉ có ở vi sinh vật, nhất là Protopectinaza Hoạt lực Enzym Pectinaza có thể được xác định bằng phương pháp đồng (Cu) pectat.

Vi sinh vật có khả năng tổng họp Pectinaza gồm nhiều loài nấm sợi và vi khuẩn Môt số loài ký sinh ở thực vật, chúng phân giải pectin, phá hủy mô thực vật

vật cỏ thể xâm nhập vào khối rác thải thực vật trong quá trình thu gom, vận chuyển lầm thay đổi tính chất cơ lý của rác, gây khó khăn cho phân loại và xử lý rác.

Một số chủng điển hình có hoạt lực Pectinaza:

Fusarium soỉani

Bacillus polymyxa\ một số chủng Pseudomorm (Pseud fluorescens), nhiều vi

Clost felsineun).

6

thuỷ phân zenluloza thành đường glucoza.

Zenlulaza có trong xạ khuẩn, nấm mốc và vi khuẩn:

Nấm mốc: Trichodenna reesei Tri lignoran, Fusarium lini, Fus solani

Xạ khuẩn: Streptomyces flagrogrisens

Vi khuẩn: Clost thermicillum, Cellulomonas sp, Bacillus thermospoza spc.

Nhờ có hệ Enzym rất phong phú của vi sinh vật, các chất hữu Cơ dưới dạng protein, gluxit, pectin và cả zenlulo được chuyển hoá, góp phần ổn định chu trinh tuần hoàn vật chất trong tự nhiên, đồng thòi góp phần làm sạch môi trường.

Các Enzym nói trên có vai trò rất lớn trong xử lý yểm - hiếu khí các chất thải rắn, nước thải giàu chất hữu cơ.

1.1.2 Phương pháp nuôi cấy thu chế phẩm Enzym

Các vi sinh vật được sử dụng để thu Enzym gồm nhiều loại nấm mốc, nấm men, vi khuẩn và xạ khuẩn bằng phương pháp nuôi bề mặt hoặc nuôi chìm.

Như trên đã trình bày, nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp Enzym, thậm chí có những vi sinh vật có khả năng tổng hợp các Enzym khác nhau trong các môi trường có cơ chất khác nhau.

Để thu được Enzym từ vi sinh vật cần tiến hành nuôi cấy chúng Hầu hết các vi sinh vật sinh tổng hợp Enzym trong điều kiện có oxy Vì vậy, về nguyên tắc có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật thu Enzym là:

7

a) Nguyên tắc: Tạo môi trường có bề mặt riêng lớn (có độ xốp cao) và đủ dinh dưỡng cho hệ sợi của nấm phát triển và sinh tổng hợp Enzym.

b) Nguyên liệu và yêu cầu đổi với môi trường sinh tổng hợp Enzym Một trong những yếu tố ảnh hưởng quyết định đến sự sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng sinh tổng hợp Enzym của vi sinh vật chính ià thành phần môi trường Môi trường dinh dưỡng phải đảm bào có đủ các thành phần

K và trong một số trường hợp còn có cả một số nguyên tố vi lượng hoặc các chất kích thích sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym như axit amin, các bazo pyrin (Adenin, Guanin), bazo Pyrimidin (Timin, Xytozin ).

Trong thực tế, môi trường nuôi cấy bề mặt có thể là môi trường tự nhiên hoặc môi trường bán tổng hợp.

Nguyên liệu cơ bản để pha chế môi trường nuôi bề mặt là cám gạo, cám lúa

N, mà còn chứa nhiều nguyên tố khoáng đa, vi lượng và các yếu tố sinh trưởng cần thiết cho sự phát triển và sinh tổng họp Enzym như các axit amin, Vitamin Trong nuôi cấy vi sinh vật tổng họp, mỗi Enzym cần một tác nhân điều hòa sinh tổng họp khác nhau, đặc biệt là các chất câm ứng, ví dụ để thu Amylaza cần tinh bột, dextrin; thu Proteaza là peptit, protein; Pectinaza là Hydratpectic, protopectin và Xenllulaza là Xenllulo, CMC (Cacboxyl Metyl Cenllulo)

Trong thực tế sản xuất, để giảm giá thành sản phẩm, nguyên liệu thường được sử dụng là bột ngô, gelatin, bột carot, củ cải và bột giấy hay CMC Trong những trường hợp cần thiết có thể bổ sung nguồn nitơ dưới dạng hữu cơ (bột khô lạc, khô đậu tương, sữa bột ) hay vô cơ như Amonsunphat

của nhiều hợp chất rất quan trọng trong trao đổi chất của vi sinh vật như các Nucleotit, Protein, Lipit phức tạp và các Vitamin có thể bổ sung thêm dưới

Một nguyên liệu không thể thiếu được trong nuôi cấy bề mặt là vật liệu làm tăng độ xốp, tăng bề mặt tiếp xúc cho môi trường Nhờ vậy, oxy của không khí khuyểch tán tốt vào môi trường giúp cho hệ sợi của nấm, xạ khuẩn phát triển tốt, đồng nhất trong môi trường, nâng cao hiệu quà sinh tổng họp Enzym.

8

c) Các bước tiến hành làm môi trường

Phối trộn nguyên liệu:

Thành phần môi trường nuôi bề mặt gồm:

+ Cám gạo: 35 - 40%

+ Trấu: 40 - 50%

+ N guyên liệu cảm ứng: 10%

(bột ngô: 10 %, gelatin: 10 %, khô lạc: 5 %, CMC: 5 %, bột carot: 5%)

- Môi trường dinh dưỡng cần có độ ẩm khoảng 65% Để tạo độ ẩm, có thể sử dụng nước cất (trong phòng thí nghiệm), nước máy (trong sản xuất đại trà) bô sung vào môi trường và trộn đều.

- Môi trường cần được khử trùng trong nồi áp lực ở áp suất 1 atm trong thời gian 30 phút.

Trường hợp cần bổ sung các chất kích thích sinh trưởng dạng hữu cơ như

atm trong 15 phút, sau đó bổ sung vào môi trường.

- Sau khử trùng, môi trường được để nguội đến nhiệt độ thưòng.

d) Cấy và nuôi vi sinh vật

- Canh trường giống phải là canh trường thuần khiết có thể ở dạng rắn hoặc lỏng.

- Với nấm mốc và xạ khuẩn, canh trường thường dùng là bào tử được pha

- Sau khi cấy, canh trường nuôi được trộn đều Nếu nuôi quy mô lớn, môi trưòng được phân phối vào các khay hoặc dàn nuôi với lóp dày không quá 5 cm.

- Thời gian nuôi cấy thường từ 36 - 48 giờ tùy thuộc thời gian tạo Enzym cùa mỗi loài vi sinh vật.

1 0 - 1 4 giờ đầu, bào tử trương nỏ' và nảy mầm, nhiệt độ môi trường nuôi ít

hấp giải phóng năng lượng và nước làm cho nhiệt độ và độ ẩm môi trường tăng Nếu lớp môi trường dày cần được đảo trộn và làm thoáng khí để cung cấp oxy và giải nhiệt Quá trình này cũng làm cho độ ẩm môi trường giảm, canh trường tơi, xốp.

Chế phẩm Enzym thô thu được có hệ sợi phát triển mạnh, đồng đều, tránh để bào tử phát triển Nếu nấm mốc quá già, hoạt lực Enzym giảm rõ rệt.

9

Chế phẩm thô có thể được sấy khô ở nhiệt độ 43 - 45°c đến độ ẩm 8 - 12%

để bảo quản và sử dụng.

e) Tinh chế Enzym

Để thu chế phẩm Enzym dạng tinh khiết hơn, chế phẩm Enzym tươi (hoặc khô) được nghiền nhỏ để phá võ' cấu trúc sợi nấm giải phóng Enzym Enzym được chiết trong môi trường nước với pH xác định bằng dung dịch đệm tương ứng với mỗi loại Enzym tinh chế có thể ở dạng lỏng hoặc dạng bột sau khi được làm khô.

Phương pháp nuôi bề mặt có ưu điểm lớn là hoạt lực Enzym cao, công nghệ đơn giản, có thể tự động hóa, dễ triển khai ở quy mô lớn; yêu cầu năng lượng thấp, thiết bị đơn giản, nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm nên làm giảm giá thành sản phẩm Sản phẩm dễ bảo quản và vận chuyển, phù hợp trong xử lý các chất thải rắn giàu chất hữu cơ Tuy nhiên, chế phẩm Enzym từ nuôi cấy bề mặt có độ tinh khiết thấp hơn nuôi cấy chìm.

Nuôi cấy nấm mốc thu chế phẩm Enzym Amylaza và Proteaza bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt

a) Chuẩn bị mồi trường

- 1 Og trấu

- 2g bột ngô (cho môi trường thu chế phẩm Enzym Amylaza)

- 2g gelatin (cho môi trường thu chế phẩm Enzym Proteaza) + Trộn đều, chuyển hỗn hợp vào bình tam giác 250 ml, bổ sung nước cất đến độ ẩm 60 — 65% Nút bông.

+ Để nguội đến nhiệt độ phòng.

Cấy Iml dịch chứa bào tử của nấm mốc:

2/ Phương pháp nuôi chìm

Phương pháp nuôi chìm thường được sử dụng với các tác nhân như nấm men, vi khuẩn tổng hợp Enzym ngoại bào Cũng có thể sử dụng nấm mốc, xạ khuẩn để thu hệ sợi chứa Enzym nội bào.

10

a) Nguyên tắc: Vi sinh vật sinh trưởng, phát triển và tổng hợp Enzym trong môi trường lỏng được cấp khí và trong điều kiện vô trùng.

b) Môi trường nuôi cấy

Khác với nuôi cấy bề mặt, môi trường nuôi cấy chìm thường là môi trường bán tổng hợp Nguyên liệu cho nuôi cấy chìm thường ở dạng hòa tan hoặc huyền phù.

Nguồn nitơ hữu cơ thường sử dụng là nước chiết ngô, nước chiết nấm men Nguồn nitơ vô cơ và các nguyên tố khoáng được sử dụng như ở phương pháp nuôi bề mặt Các tác nhân cảm ứng thường được sử dụng ở dạng tinh khiết hơn như tinh bột hồ hóa, tinh bột tan, pepton, casein, C M C ,

pH của môi trường được điều chỉnh cho phù hợp với mỗi loại Enzym và mỗi loài vi sinh vật.

c) Các bước tiến hành

Các cấu tử của môi trường được hòa vào nước và được đưa vào thiết bị

Sau khử trùng, môi trường được chuyển sang thiết bị nuôi cấy Trong nhiều trường họp, để tránh nhiễm trùng, ngưòi ta thường kết hợp khử trùng trực tiếp trong thiết bị nuôi cấy.

d) Cấy và nuôi vi sinh vật thu Enzym

Môi trường được làm nguội đến nhiệt độ cần thiết (28 - 30°C) thì cấy vi

30°c, thời gian nuôi 36 - 48 giờ.

Không khí được cấp liên tục trong quá trình nuôi cấy Để tránh tạo bọt thái quá có thể bổ sung vào môi trường một chút dầu phá bọt hoặc axit oleic đã khử trùng.

Thiết bị khuấy làm việc liên tục để tạo độ đồng nhất, giúp cho Enzym khuyếch tán tốt vào môi trường.

Trong nuôi cấy chìm, Enzym tạo thành trong suốt quá trinh phát triển cùa vi sinh vật dạng ngoại bào được khuyếch tán vào môi trường Lượng Enzym trong té bào chỉ chiếm 10 - 15% Vì vậy, chỉ cần ly tâm hoặc lọc tách sinh khối là thu được dung dịch chứa Enzym.

Cá biệt có một số nấm mốc sinh tổng hợp Enzym nội bào (Glucooxydaza

trường hợp này, chỉ cần tách lấy sinh khối (sợi nâm), sau đó nghiên phá võ' tê bào đe chiết Enzym như đối với canh trường bề mặt.

Phương pháp nuôi chìm có thể áp dụng trong phòng thí nghiệm với bình tam giác và máy lắc hoặc với thiểt bị nuôi hiểu khí quy mô nhỏ, pilot như thiết

bị Bio - stat Ở quy mô công nghiệp, có các thiết bị lên men hiếu khí với các dung tích khác nhau.

Phương pháp nuôi chìm hiện đại hơn (dễ tự động hóa ở quy mô lớn) và cho chế phẩm Enzym tinh khiết hơn Phương pháp này phải được tiến hành trong điều kiện vô trùng nghiêm ngặt nên thu được chế phẩm tinh khiết, hoạt lực cao hơn Tuy nhiên, đó cũng là khó khăn không nhỏ trong quá trình nuôi Vì lý do nào đó như thiết bị không thật kín, thiết bị không hoàn toàn vô trùng có thể dẫn đến nhiễm tạp khuẩn toàn bộ môi trường, quá trình bị ngừng hhoàn toàn.

Nuôi cấy nấm men thu che phẩm glucoamylaza bằng phương pháp nuôi cấy chìm

a) Chuẩn bị môi trường

- Lấy 50 ml môi trường lỏng vào bình tam giác 250 ml để nuôi cấy Endomycopsis Nút bong.

- Lấy ra để nguội đến nhiệt độ phòng.

b) Cấy nấm men

Cấy 5 ml canh trường nấm men Endomycopsis.

1.1.3 Xác định hoạt lực Enzym

I/Định tính hoạt lực Enzym

a) Nguyên tắc: Định tính hoạt lực Enzym dựa trên kết quả đánh giá nhanh hiệu lực xúc tác chuyển hóa cơ chất của Enzym thông qua diện tích vòng thủy phân hoặc phản ứng hóa học (tạo màu) của sản phẩm với chất chỉ thị.

b) Phương pháp tiến hành

Đ ể định tính hoạt lực Enzym, vi sinh vật thường được nuôi cấy trên môi trường thạch vói cơ chất tương ứng Sau một thòi gian nuôi nhất định (24 - 36 giờ), thử phản ứng với chất chỉ thị thích hợp.

Enzym Amylaza: với môi trường chứa tinh bột chỉ thị là dung dịch Iot hoặc dung dịch Lugol (chứa lot).

Enzym Xenllulaza: với môi trường chứa CMC, chỉ thị là dung dịch Iot Enzym Proteaza: với môi trường chứa Gelatin hoặc sữa bột Hoạt lực Protein là vòng dịch hóa Gelatin hoặc làm mất màu đặc trưng của sữa bột.

12

Hoạt lực của Enzym Amylaza và Xenllulaza thể hiện qua độ lớn của đường kính vùng mất màu với Iot xung quanh khuẩn lạc Cũng có thể định tính hoạt lực Amylaza của chế phẩm thô bằng cách thực hiện phản ứng giữa dịch chiết Enzym với dung dịch tinh bột tạo 1% rồi thử phản ứng với dung dịch Iot Phản ứng cho màu xanh đen là hoạt lực rất yếu, màu nâu đỏ thể hiện có hoạt lực ct - amylaza Phản ứng mất màu vói lot là có hoạt lực Maltaza và Glucoamylaza, mất màu

Phưong pháp định tính có ưu điểm lón là có thể phát hiện nhanh sự hiện diện của Enzym nhưng chưa cho phép đánh giá chính xác hoạt lực của Enzym.

Chuân bị môi trường cho định tính Enzym

+ Enzym Amylaza: Môi trường Shapec tinh bột

+ Enzym Proteaza: Môi trường gelatin

+ Enzym Zenlulaza: Môi trường Hutchison

Gieo cấy và nuôi VSVsinh tòng hợp Enzym

Nhận xét và đảnh giá kết quà

tinh bột, gelatin.

- Đo đường kính của khuẩn lạc.

- Đo vòng thủy phân và đánh giá khả năng sinh tổng hợp Enzym của các vi sinh vật:

+ Độ lớn của đường kính vòng thủy phân tinh bột

+ Độ lớn của đường kính vòng thủy phân gelatin

+ Độ lớn của đường kính vòng thủy phân CMC

2 /Định lượng hoạt lực Enzym Glucoamylaza

Amylaza là tên chỉ nhóm enzym có khả năng phân cắt các liên kết glycozit trong mạch tinh bột Chúng gồm:

+ a-amylaza (Enzym dịch hóa) phân cắt các liên kết a-1,4 - glycosit trong mạch tinh bột tạo sản phẩm là các Dextrin.

+ ß-amylaza (hay maltoza) phân cắt liên kết a -1,4 - glycosit trong mạch amyloza tạo maltoza ß -amylaza thủy phân amylopectin tạo maltoza và dextrin giới hạn.

13

+ Glucoamylaza (y- amylaza) phân cắt liên kết a -1,4 - glycosit trong mạch amyloza thành glucoza và thủy phân amylopectin thành glucoza và dextrin giới hạn.

hạn hoặc trong mạch Amylopectin

toàn thành glucoza.

Amy laza nói chung và Glucoamylaza nói riêng là những Enzym được ứng dụng rộng rãi trong thực tế, đặc biệt trong công nghệ thực phẩm, trong sản xuất rượu, bia, nước giải khát, trong sản xuất dextrin, đường glucoza Trong công nghệ môi trường, các vi sinh vật có hoạt lực Amylaza được sử dụng trong

xử lý chất thải rắn, nước thải chứa tinh bột.

a) Định nghĩa và nguyên tắc xác định

lượng enzym cần thiết xúc tác thủy phân tinh bột tạo thành 1 mg Glucoza trong thời gian 1 giờ ỏ' điều kiện tiêu chuẩn (môi trường đệm axetat với pH = 4,7 và nhiệt độ 30°C).

- Độ hoạt động (hoạt lực) của Enzym là đại lượng biểu thị khả năng xúc tác chuyển hóa cơ chất của mồi Enzym.

- Nguyên tắc định lượng: Dựa trên khả năng thủy phân tinh bột tạo thành đường glucoza của Enzym Glucoamylaza Lượng glucoza tạo thành được định lượng bằng phương pháp L uff - School cải tiến.

b) Các bước tiến hành

* Thu Enzym từ canh trường Vi sinh vật

Thu Enzym từ canh trường nuôi cấy bề mặt nam mốc Asp awamori hoặc Asp usami:

- Nghiền nhỏ chế phẩm Enzym.

- Cân 5 g chế phẩm đã nghiền nhỏ rồi chuyển vào bình định mức 50 ml.

- Thêm 5 ml dung dịch đệm axetat, định mức bằng nước cất đến vạch.

- Lọc lấy dịch chiết bằng giấy lọc băng vàng thu chế phẩm Enzym tinh khiết.

Thu Enzym từ canh trtrờng nuôi cấy chìm nấm men Endomycopsis:

Lấy 10 ml canh trường nuôi nấm men Endomycopsis ly tâm ở vận tốc

5000 vòng/phút trong thời gian 5 phút để loại sinh khối nấm men.

14

Phần dịch thu được có chứa Glucoamylaza ngoại bào của Endomycopsis.

* Xác định hoạt tực Enzym

Thủy phân tinh bột bằng chế phẩm Enzym thu được:

- Cho vào bình tam giác 100ml:

+ 1 ml dịch chiết Enzym.

+ 2 ml dung dịch đệm axetat pH = 4,7.

- Đặt bình vào thiết bị ổn nhiệt Thực hiện quá trình xúc tác thủy phân

- Định tính hoạt lực Amylaza: thử phản ứng với lốt sau 3 phút, 5 phút, 15 phút

- Lấy mẫu sau 1 giờ và định lượng đường khử.

- Song song tiến hành thí nghiệm kiểm chứng trong cùng điều kiện (đun sôi dịch chiết để vô hoạt Enzym).

- Định lượng Glucoza tạo thành bằng phương pháp Luff- School cải tiến.

* Tinh hoạt lực Enzym

Từ lượng Thiosunfat tiêu tốn trong phân tích, tính được lượng Glucoza tạo thành và hoạt độ Enzym Glucoamylaza theo biểu thức:

Held {a h ) -/ 3 J , ứv HđG/g

m.t

b: thể tích NCI 2S2O3 0, IN chuán mau thủy phân, mỉ

3,3: đương lượng đường khử tính theo Na 2S2Ỡ3 (1 ml

f: hệ sổ pha loãng m: lượng Enzym xúc tác phản img (tính tương ímg với mẫu khi chuẩn đường khử), gam

t: thời gian phản ímg, giờ

3 /Xác định hoạt lực Proteaza theo Anson

Enzym Proteaza là nhóm Enzym xúc tác cho quá trình phân cắt liên kết peptit trong các mạch peptit hoặc protein (polypeptit) nhò' phản ứng thuỷ phân theo cơ chế:

15

sử dụng trong xử lý hoặc hỗ trợ xử lý phân giải các chất thải rắn, nước thải giàu protein như chất thải từ thuộc da, chế biến thủy sản, phế liệu hoặc phụ phẩm nông nghiệp giàu protein (khô lạc, khô đậu tương, khô bông .).

Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh Proteaza

- Các vi khuẩn:

+ Bacillus subtilis, Bac thermophilus\ Bac mesentericus

+ Clotridium perfriugens, Clost histolitium.

+ Pseudomonas aeruginoza.

- Các Nấm mốc:

+ Aspergillus oryzae, Asp fumicatus, Asp flavus.

+ Penicillium ganthinellum, Perl Chrysogenum.

Proteaza từ vi sinh vật tồn tại dưới dạng: Proteaza axit tính, trung tính và kiềm tính.

Nguyên tắc xác định hoạt độ Proteaza theo Anson: Enzym Proteaza có khả năng thuỷ phân Protein (Gelatin, Casein, H em oglobin ) tạo thành axit amin Lượng axit amin tạo thành trong phản ứng thủy phân được xác định bằng phản ứng tạo màu với thuốc thử Folin.

16

Dựa vào thang chuẩn của Tyrozin để tính lượng axit amin thu được nhờ phản ứng thủy phân.

+ TCA (Triclo - axetat) 0,3M

2/ Thu Enzym Proteaza từ chế phẩm Enzym thô

+ Cân 2g chế phẩm thu được đã nghiền nhỏ rồi chuyển vào bình định mức 50 ml.

+ Thêm 5 ml dung dịch đệm vạn năng 0,1M, pH = 5,5 và định mức đến vạch

+ Lọc thu dịch chiết Enzym.

3/ Thực hiện phản ứng xúc tác thủy phân Protein

+ Cho vào bình tam giác 100 ml: 2 ml dịch chiết Enzym 2 ml dung dịch

+ Cho con từ vào bình phản ứng và đặt vào thiết bị điều nhiệt cỏ khuấy từ.

+ Để đình chỉ phản ứng, thêm 4 ml TCA 0,3M để kết tủa protein dư và các sản phẩm thủy phân phân tử lượng lớn.

+ Lọc thu dịch thủy phân.

Song song tiến hành thí nghiệm kiểm chứng trong cùng điều kiện

+ Cho vào bình tam giác 100 mi:

2 ml dịch chiết Enzym

4 ml TCA 0,3M, khuấy đều trong 10 phút

Thêm 2 ml Gelatin 2%, khuấy đều và để 20 phút

17

4/ Dvmg đường chuẩn Tyrozin

Từ dung dịch Tyrozin chuẩn (1 jj.mol/ml), chuẩn bị dãy mẫu chuẩn có hàm lượng Tyrozin từ 0 - 0,3 pmol theo bảng sau:

+ Lấy 1 ml của mỗi nồng độ chuẩn và lần lưọt cho vào từng ống nghiệm.

1 ml thuốc thử Folin, lắc đều.

+ Đ o cường độ màu của hỗn hợp bằng máy so màu quang điện ở bước

+ Dựng đường chuẩn từ kết quả đo được với trục hoành là hàm lượng Tyrozin và trục tung là mật độ quang.

5/ Định lượng axit amin có trong mẫu thủy phân và tính hoạt độ Proteaza + Lấy 1 ml sản phẩm thủy phân (dịch lọc) cho vào ống nghiệm.

1 ml thuốc thử Folin, lắc đều.

Hoạt độ Proteaza (HđP) của chế phẩm được tính bằng biểu thức:

HdP = ỉ ^ - , đ v/g

t.m

trong đó:

HdP: hoạt độ Proteaza của chế phẩm Enzym, đơn vị/g

D: số pmol Tyrozin tương ứng với hiệu sổ hiệu số giá trị mật độ quang đo được của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng

t: thời gian phản íeng, phút

m: lượng chế phẩm dùng cho phản ứng xúc tác, g

f: độ pha loãng của dịch chiết Enzym trong hỗn hợp phản ứng xúc tác

( f - 4).

18

1.2 ĐỊNH LƯỢNG ĐƯỜNG KHỬ THEO LUFF - SCHOOL CÀI TIÉN

1) Nguyên tắc

dư được định lượng gián tiếp bằng KI trong môi trường axit mạnh.

- Đậy bình tam giác bằng phễu thuỷ tính Đặt bình lên bếp đun sôi nhẹ trong 2 phút (tính từ khi xuất hiện bọt khí đầu tiên) Sau khi đun sôi, nhấc bình

ra khỏi bếp, để nguội đến nhiệt độ phòng Dung dịch hỗn hợp vẫn còn màu xanh đặc trưng của Sunphat đồng và xuất hiện kết tủa màu đỏ của oxyt đồng I

19

- Nếu sau khi đun, không thấy kết tủa oxyt đồng I (CU2O) màu đỏ thì cần tăng lượng mẫu, giảm lượng nước cất.

4) Tính kết quả

ỵ = ( a - b ) f 3,3 100Q^mg/1

trong đó:

X: đường khử, mg/ỉ a: thế tích N aXiOỉ 0, IN chuẩn mẫu trắng, mỉ b: thế tích NdìSĩOì 0, IX chuẩn mầu phản tích, ml V: thể tích mẫu phân tích, ml

F: hệ so pha loãng (nếu có) 3,3: đương lượng đường khử tính theo Na 2S2Ũ3

1.3 ĐỊNH LƯỢNG N1TƠ AMIN BẢNG PHƯƠNG PHÁP LOWRY

N itơ am in là thành phần không thể thiếu được trong cấu trúc của axit amin, peptit và protein.

N itơ am in có trong các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật, thực vật và

trường lỏng Trong phân giải hiếu khí, xử lý nitơ amin đòi hỏi lượng oxy cho quá trình oxy hóa rất lớn.

Quá trình phân giải nitơ amin là quá trình rất quan trọng trong xử lý nước thải, chất thải rắn giàu axit am in và protein.

ỉ/Nguyên tắc định lượng nitơ amìn bằng phương pháp Lowry

Cường độ màu của hỗn họp phản ứng được đo bằng mật độ quang ở bước sóng X = 750 nm.

Hàm lượng nitơ min được tính dựa vào đường chuẩn của protein tinh khiết với thuốc thử Folin.

b/ Hoá chất

- Dung dịch protein chuẩn có nồng độ 0,1 mg/ml.

chuẩn 0 Img/ml (ml)

0 0.3 0.5 1 1,5 2 2,5 3 H20 (ml) 4 3.7 3,5 3 2.5 2 1,5 1

- Thêm vào mỗi ống nghiệm:

+ Sau 10 phút, thêm 0,2 ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên 30 phút.

- Dựng đồ thị chuẩn từ kết quả đo được:

+ Trục tung biểu thị mật độ quang (ABS),

+ Trục hoành biểu thị lượng Protein (mg).

21

b/ Xác định lượng protein có trong mẫu cần phân tích

mg/ml

- Lấy vào ống nghiệm 4 ml dung dịch mẫu cần phân tích

- Thêm vào ống nghiệm:

+ Sau 10 phút, thêm 0,2 ml thuốc thử Folin, lắc đều, để yên 30 phút.

- Màu vàng của hỗn hợp sẽ chuyển sang màu xanh da trời và đạt cường

độ màu cực đại sau 30 phút.

- Lượng Protein của mẫu phân tích được tra theo đường chuẩn.

1.4 ĐỊNH LƯỢNG TỎNG NITƠ BÀNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL

imin (- NH - ) được gọi là nitơ hữu cơ Nitơ hữu cơ gồm nitơ trong axit amin, amin, amit, imit, các peptit và protein.

Phương pháp Kjeldahl được sử dụng để xác định N ở trạng thái oxi hoá - 3, bao gồm cả nitơ hữu cơ và nitơ amon.

22

1.4.1 Nguyên tắc định lượng và các yêu cầu

1/ Nguyên tắc: Trong môi trường axit đặc (H2SO4) và có mặt hỗn hợp

2/ Lấy mẫu và bảo quản

Mầu cần được phân tích càng sớm càng tốt Thời gian lưu mẫu tốt nhất không quá một ngày và tránh để mẫu hấp thụ amoniac từ môi trường Có thể sử dung bình polyetylen hoặc bình thủy tinh để đựng mẫu.

đặc tới pH = 2 và bảo quản ở 4°c.

3 / Những điều cần lưu ý

amoni trong quá trình phá mẫu tạo thành N 20 và gây tổn thất nitơ amon Nitrat cũng có thể bị khử thành amoni khi mẫu cỏ chứa nhiều chất hữu cơ ở trạng thái oxi hoá thấp và gây sai số dương.

Các muối vô cơ cũng có thể ảnh hưởng tới kết quà do có thể ảnh hưởng

Khi mẫu có hàm lượng muối và chất rắn cao, nhiệt độ của dung dịch hỗn

Dung dịch NaOH 40%: hoà tan 400 g NaOH phân tích bằng nước cất

- Chỉ thị Taxiro: trộn 100-ml dung dịch metyl đỏ (0,2 gam metyl đỏ trong 100

ml cồn 95°) với 50 ml dung dịch metyl xanh (0,1 g metyl xanh trong 50 mi cồn 95°).

Thêm 10 ml dung dịch chỉ thị hỗn hợp rồi pha loãng thành 1 lít.

- D ung dịch HC1 tiêu chuẩn: 0,1 mol/1 Chuẩn bị từ dung dịch HC1 đặc (d = 1, 18 g /c m 3) hoặc pha từ ống chuẩn.

- Dung dịch HC1 tiêu chuẩn 0,02 mol/1 Pha loãng từ dung dịch chuẩn 0,1

Chuẩn bị nước cất không amoni: có thể sử dụng 1 trong 2 phương pháp sau:

- Cho nước đã cất (2 lần) chảy qua cột nhựa cationit axit mạnh và chứa nước thu được trong bình thuỷ tinh có nút nhám Thêm vào bình 10 g cationit cùng loại cho mỗi lít nước.

cất và cất lại trong máy hoàn toàn bằng thuỷ tinh Bỏ 50 ml nước hứng đầu tiên

và chứa nước vào bình thuỷ tinh có nút nhám Thêm khoảng 10 g cationit axit mạnh cho mồi lít nước thu được.

2 / Các bước tiến hành

Thể tích mẫu được lấy theo hàm lượng nitơ:

Nồng độ nitơ Kjeldahl (mg/l) Thể tích mẫu cần lấy (ml)

Cho đến 10 250

1 0 - 2 0 100

2 0 - 5 0 50

5 0 - 100 25

V ô cơ hóa mẫu phân tích:

+ Lấy thể tích mẫu thích hợp cho vào bình Kjeldahl, thêm 10 ml axit

Thiết bị phá mẫu (DK 6, DK8S, DK 20 ) trong hệ thiết bị phân tích Nitơ tự động hoặc bán tự động VELP được trang bị hệ thống tách và hấp thụ khí ô nhiễm.

- Chưng cất và hấp thụ NH3:

Chuẩn bị bình hấp thụ: Lấy 50 ml dung dịch axit boric, thêm vài giọt chỉ thị vào bình hứng của máy chưng cất Lưu ý: đầu mút của ống dẫn ra từ sinh hàn phải nhúng ngập vào dung dịch Trong bình hứng xảy ra quá trình phân ly

hạt đá bọt, lắp bình vào máy chưng cất.

+ Thêm 3 giọt chi thị phenolphtaiein.

+ Thêm 50 ml dung dịch NaOH vào bình chưng và khoá phễu nhanh để

phải có màu hồng (để đảm bảo dư xút).

+ Chạy nước làm lạnh và đun nóng bình cất.

+ Dừng cẩt khi đã thu được khoảng 200 ml ở bình hứng Kiểm tra 1 vài giọt cuối cùng bằng 1 - 2 giọt thuốc thử Nessler, nếu vẫn có màu vàng thì quá trình cất chưa kết thúc.

- Định phân Nitơ:

cho đến khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu xanh tím.

+ Có thể chuẩn độ bằng dung dịch HC1 0, IN đối với mẫu có nồng độ nitơ cao.

B 0 2' + H+ -> H B 02

Bộ chưng cất và chuẩn độ tự động (UDK 126, UDK 132, UDK 142, .)

có hệ thống chưng cất tự động an toàn và độ tín cậy cao Hệ thống có thể dễ dàng kểt nối với chuẩn độ tự động và cho kết quả trực tiếp Các thông số của quá trình chưng cất và chuẩn độ tự động được cài đặt chương trình.

Lặp lại quá trình đối với mẫu trắng, trong đỏ mẫu thử được thay bằng nước cất không chứa amoni.

25

V0: thể tích mau lẩy phân tích, mỉ;

V ị : thể tích HCl tiêu chuẩn dùng để chuân độ mau, ml;

v2: thể tích HCỈ tiêu chuẩn dùng đế chuẩn độ mẫu trang, ml:

Cua'- nồng độ axit HCl chuẩn dùng để chuẩn độ, mol/l;

14,01: khối lượng nguyên từ của nitơ.

Lưu ý:

ra, vì vậy cần tiến hành vô cơ hoá mẫu trong tủ hút hoặc phải lắp đặt bộ phận

1.5 ĐỊNH LƯỢNG TÓNG PHOTPHO BẰNG PHƯƠNG PHÁP TRÁC QUANG

I 5.1 Nguyên tắc yêu cẩu lấy mẫu

1/ Nguyên tắc

Định lượng tổng Photpho bằng phương pháp trắc quang dựa trên phản ứng tạo phức antimony photphomolipdat giữa octophotphat với molipdat va antimony trong môi trường axit.

Khử phức antimony photphomolipdat bằng axit ascobic thành phức molipden có màu xanh đậm Đ o độ chiết quang của dung dịch sẽ xác định được nồng độ octophotphat.

Trước khi phân tích, toàn bộ photpho hữu cơ và vô co trong mẫu được chuyển về dạng octophotphat.

26

2 /Lẩy mẫu và báo quản mẫu

- Xử lý và bảo quản mẫu:

Lọc mẫu:

+ Mầu dùng để xác định photphat hoà tan, phải lọc ngay sau khi lấy mẫu + Màng lọc có cỡ lỗ 0,45 pm được rửa bằng 200 ml nước ấm để loại bỏ photphat trên giấy lọc.

+ Lọc mẫu qua màng đã xử lý, bỏ 10 ml mẫu lọc đầu tiên và thu phần còn lại vào lọ thuỷ tinh sạch, khô.

Bảo quản mẫu:

thời gian không quá 4 giò' sau khi lấy mẫu.

+ Đối với mẫu xác định tổng P: thêm 1 ml HC1 đậm đặc/1 lít mẫu, bảo quản lạnh trưóc khi phân tích.

- Dung dịch H2SO4 5 N (A): Pha loãng 70 ml H2SO4 đậm đặc bằng nước cất và định mức tới 500 ml.

và định mức tới 500 ml bằng nước cất Bảo quản dung dịch trong chai sẫm màu.

- Dung dịch Kali antimon tartrat 2,743 g/1 (C): hoà tan 1,3715 g

dung dịch trong chai sẫm màu.

- Dung dịch axit ascorbic 0,1 M (D): hoà tan 1,76 g axit ascorbic trong

- Dung dịch hỗn họp (E): trộn 50 ml dung dịch A, 15 ml dung dịch B, 5 m!

Lim ỷ: Đe các dung dịch trên đạt đến nhiệt độ phòng trước khi trộn Neu dung dịch hỗn hợp đục, lắc đều và để yên vài phút đến khi trong trước khi dùng 2/ Thiết bị

3 / Chú ỷ

photphat, gây sai số dương Ở nồng độ Asen là 0,1 mg/l bắt đầu có ảnh hưởng tới việc xác định photphat.

- Nồng độ Fe3+ > 15 ppm sẽ cản trở đến quá trình khử tạo thành màu xanh, nểu nồng độ lên đến 30 ppm thì màu xanh không xuất hiện.

định mức 50 ml lần lượt các dung dịch theo chỉ dẫn ờ bàng sau:

28

Mầu Thế tích.

1 2 3 4 5 6 7 8 Dung dịch

Photphat chuẩn

0 1 2 4 6 8 12 16 Tác nhân khứ (E) 8 8 8 8 8 8 8 8 Nước cất 42 41 40 38 36 34 30 26 Lượng p (pg) 0 2.5 5 10 15 20 30 40

Dựng đường chuẩn quan hệ giữa mật độ quang (ABS) và lượng photpho

2 / Tiến hành phân tích

- Lấy 100 ml mẫu đã lắc đều.

- Làm lạnh và thêm khoảng 20 ml nước cất, 1 giọt phenolphthalein, sau

đó trung hoà bằng NaOH IN đến màu hồng nhạt Định mức đến 100 ml, lọc bỏ cặn (nếu có).

- Hút thể tích mẫu vào bình định mức 50 mi sao cho nồng độ photpho

bằng nước cất tới vạch Để yên 10 phút.

- Song song tiến hành với mẫu trắng, trong đó phần mẫu thử được thay bằng nước cất.

Đối với mẫu có độ đục và độ màu cao, cần hiệu chỉnh bằng cách sử dụng mẫu trắng, thêm tất cả các tác nhân trừ (C) và (D) Độ hấp thụ của dung dịch này phải được trừ đi trong phần tính toán.

X = — , mg/l V

trong đó:

X: hàm lượng p cỏ trong mau phân tích, mg/l m: lượng p có trong bình tương ứng với thể tích đã hút, jug V: thể tích mẫu lẩy trong phân tích, ml

1.6 ĐỊNH LƯỢNG LIPIT BẰNG SOXHLET

hóa học, lipit là este của axit béo no hoặc không no với rượu đcm hoặc đa chức Các axit béo no có công thức chung CnH2nC>2 như axit Palmitic C16H32O2,

Rượu đơn chức, rượu mạch thẳng phân tử lượng lợn, mạch vòng như Cholestérol Estradiol, Testosterol và đa chức như Glyxerin.

Lipit tồn tại dưới hai dạng:

- Lipit đơn giản:

+ Các Sterit (sáp): liên kết este giữa rượu phân tử lượng lớn với axit béo + Các Steroit: liên kết giữa Sterol và axit béo

- Lipit phức tạp: gồm Lipoprotein, Glycolipit

Photpholipit và các lipit phức tạp đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc cùa các mô liên kết ở cơ thể động vật.

Lipit không tan trong nước, chúng có phân tử lượng rất lớn, đặc biệt là các lipit phức tạp nên rất khó phân hủy, kể cả phân hủy hiếu khí nhờ các vi sinh vật có hoạt lực Lipaza.

Dầu mỡ động thực vật có trong chất thài rắn, nước thải sinh hoạt, một số loại nước thải công nghiệp nhờ nước thải lò mổ, chế biến thủy hải sản, chế biến thịt, sữa, các hạt có dầu

V iệc phân tích, xác định hàm lượng lipit trong nước thải và chẩt thải rẳn

có ý nghĩa quan trọng để quyết định phương án công nghệ trong tiền xử lý và trong quá trình xử lý các chất thải Phương pháp phổ biến để định lượng dầu

mỡ động thực vật là phương pháp Soxhlet.

30

1.6.1 Nguyên tắc

- Dựa vào khả năng dễ tan của Lipit trong dung môi hữu cơ như etanol, benzen, metanol, clorofooc, toluen, diclometan, axeton, (Dung môi yêu cầu

có nhiệt độ sôi thấp, trọng lượng nhỏ).

- Lipit được định lượng trên cơ sở xác định khối lượng mẫu phân tích trước và sau khi chiết lipit bằng dung môi hữu cơ.

Một số vìtamin và tạp chất tan trong chất béo cũng được chiết cùng với lipit nhưng trong đa số trường hợp là không đáng kể.

1.6.2 Hóa chất và thiết bi

- Dung môi hữu cơ: Etanol

- Máy chiết Soxhlet

Hệ thống tự động Soxtherm (S 306 AK/S 306 A) được thể hiện trên hình 11.1 Hệ thống này đơn giản và tiết kiệm thời gian so với máy Soxhlet truyền thống (Hình II.2).

Hình 1.1 Hệ thống tự động Soxtherm

1 Van tháo dung môi

2 Cốc chiết bằng thủy tinh, 54x130 ram

1.6.3 Các bước tiến hành

- Chuẩn bị cốc chiết: Cốc chiết (2)

làm nguội đến nhiệt độ phòng trong bình hút

ẩm và cân trên cân phân tích (mi, g).

- Các bước tiến hành:

+ Cân khoảng 5 gam mẫu cần phân

tích (m g) cho vào ống chiết Mầu có thể

được làm khô nếu cần thiết.

+ Đặt ống chiết vào cốc chiết và thêm

khoảng 140 ml dung môi vào cốc chiết (2).

Đối với hệ thống Soxtherm, quá trinh

chiết được cài đặt bởi chương trình và gồm

5 giai đoạn để đảm bảo mẫu đư ợ c chiết

hoàn toàn Quá trinh này được thực hiện tự

động hoàn toàn và đặc biệt hiệu quả để

phân tích chất béo và phần bã còn lại.

Hình 1.2 Máy chiết Soxlet truyền thống

Hình 1.3 Ọuá trình chiết nhờ hệ thống Soxtherm

Giai đoạn ỉ: Mầu được đặt ngập hoàn toàn trong dung môi đang sôi và chất béo được tách khỏi mẫu (hình 11.3.a).

Giai đoạn 2: Dung môi bay hơi đi lên, được làm lạnh ngưng tụ lại và chảy vào ổng chiết Khi mức dung môi bắt đầu thấp hơn ống chiết đựng mẫu thì mẫu được chiết (hình 11.3.b).

32

Giai đoạn 3: Chất béo được chiết và gom bởi dung môi ngưng tụ (hình II.3.C).

Giai đoạn 4: Phần dung môi thừa được chưng cất và gom trong thùng chứa để tái sử dụng (hình II.3.d).

Giai đoạn 5: Cốc chiết được tự động nâng khỏi bếp (hình II.3.e).

Nước làm lạnh và bếp đun nóng được tắt sau 5 giai đoạn.

lượng không đổi (ít nhất 1 giờ), giữ trong bình hút ẩm, làm nguội đến nhiệt độ

Tính kết quả:

m

Trong đó:

X: Hàm lượng chất béo có trong mẫu phán tích, %

mr khối lượng cốc khi chưa chiết lipit, g mỉ: khối lượng cốc sau khi chiết lipit, g m: lượng mẫu lẩy để phân tích (khoảng 5g)

33

PHẢN II

VI SINH ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ

MÔI TRƯỜNG

11.1 PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

11.1.1 Môi trường dinh dưỡng

1/ Yêu cầu đối với môi trường dinh dưỡng

Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp thức ăn cần thiết cho sự tồn tại và phát triển của vi sinh vật Đây là yểu tố đầu tiên quan trọng, thậm chí quyết định sự thành công trong nghiên cứu về Vi sinh vật.

Trong dinh dưỡng, các loài vi sinh vật đều cần một số nguyên tố hóa học

sinh vật có khà năng hấp thụ, nhu cầu dinh dưỡng cũng như cơ chể trao đổi chất khác nhau Vì vậy, không có môi trường dinh dưỡng nào là vạn năng Tùy mục đích thí nghiệm, tùy chủng loại vi sinh vật mà cung cấp một môi trường cần thiết thích hợp để chúng phát triển.

Các vi sinh vật tự dưỡng cacbon có khả năng sử dụng cacbon dưới dạng

chúng được gọi là nhóm vi sinh vật dinh dưỡng vô cơ Chúng gồm các vi sinh vật có sắc tố như tảo, vi khuẩn lưu huỳnh đồng hóa cacbon bằng năng lượng mặt trời (tự dưỡng quang năng ) Một số vi sinh vật khác không có sắc tố như

vi khuẩn nitrit, nitrat hóa thực hiện quá trình đồng hóa cacbon nhờ năng lượng hóa năng từ các quá trình oxy hóa.

Khác với các vi sinh vật tự dưỡng, các vi sinh vật dị dưỡng cacbon cần môi trường chứa các hợp chất cacbon dưới dạng các chất hữu cơ như axit hữu

cơ, rượu, hydratcacbon hoặc hydrocacbua.

Tuy nhiên, các môi trường dinh dưỡng đều phải đáp ứng được những yêu cầu sau:

34

- Cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng cho vi sinh vật, trong đó chù yếu là

lượng (Mo, Co, Zn, Cu ), các chất kích thích sinh trưởng (axit amin, vitamin ) trong trường họp cần thiết.

- Môi trường dinh dưỡng cần có pH thích họp (các loại nấm ưa môi trường axit nhẹ, vi khuẩn ưa kiềm hoặc trung tính, tảo ưa môi trường kiềm ) Có thể điều

Khi khử trùng, pH của môi trường có thể thay đổi Vì vậy, cần kiểm tra lại pH của môi trường sau khi khử trùng và điều chỉnh lại khi cần thiết.

- Môi trường cần có độ ầm, độ nhót và áp suất thẩm thấu thích hợp.

- Môi trường phải đảm bảo tuyệt đối vô trùng Phương pháp khử trùng thông dụng đối với các loại môi trường dinh dưỡng là dùng hơi nước bão hòa ở nhiệt độ cao và áp suất lớn hơn áp suất của khí quyển bằng cách sử dụng nồi hấp áp lực (xem phần các thiết bị).

Thiết bị làm việc dựa trên nguyên tắc: nhiệt độ của hơi nước tăng khi áp suất tăng Sự tương quan giữa áp suất và nhiệt độ cùa hơi nước được thể hiện trong bảng II 1.

Bảng II.1 Nhiệt độ cùa hơi nước bão hòa ở áp suất khác nhau

Chú ỷ:

- Thời gian và nhiệt độ khử trùng phụ thuộc vào thành phần môi trường Các chất hữu cơ dễ bị biến tính do nhiệt như axit amin, vitamin, các loại đường khử, dịch chiết nấm men, sữa cần được khử trùng ở 0,5 atm Các chất kích thích sinh trưởng như axit amin, vitam in nên được khử trùng riêng ở chế độ thích hợp và bổ sung vào môi trường sau khi đã khử trùng.

- Khi môi trường có phản ứng kiềm hoặc axit, khi khử trùng sẽ xuất hiện kết tủa, các sản phẩm caramen hóa và bị biển tính trở nên không hoặc khó hấp thụ đổi với vi sinh vật Để trảnh hiện tượng này, môi trường để nuôi cấy vi sinh vật ưa axit hoặc kiềm nên khử trùng ở pH trung tính, sau đó kiềm hóa hoặc axit hóa môi trường bằng dung dịch tương ứng đã vô trùng.

- Trước khi sử dụng, cần kiểm tra độ tinh khiết của môi trường bằng cách để

đục, có váng hoặc xuất hiện khuẩn lạc lạ thì cần loại bỏ.

2 / Phân loại môi trường

Vi sinh vật là nhỏm sinh vật gồm nhiều chủng loại vô cùng đa dạng, phong phú Mỗi loài, thậm chí mỗi chủng lại có nhu cầu dinh dưỡng rất khác nhau Vì vậy, môi trường để nuôi cẩy giữ giống và nghiên cứu chúng cũng rất

đa dạng và khác biệt.

Có thể phân biệt các loại môi trường theo nhiều cách khác nhau:

a) Phăn loại theo thành phần:

Căn cứ vào nguồn nguyên liệu để chế tạo môi trường người ta phân biệt:

Môi trường tự nhiên: được chế tạo từ nguyên liệu tự nhiên có nguồn gốc động thực vật (canh thang thịt, nước ép khoai tây, carot, nước malt, nước chiết đất, nước suối khoáng ) Môi trường tự nhiên có thành phần không xác định, thường được sử dụng nuôi cấy, giữ giống và phân lập vi sinh vật.

Môi trường tự nhiên thưòng có một sổ thành phần dễ bị biến tính: axit amin, vitamin, đường khử Vì vậy, cần khử trùng ở chế độ thích hợp.

Ví dụ:

+ Môi trường canh thang thịt - pepton: 1 atm trong 20 - 30 phút;

+ Môi trường malt: 0,5 atm trong 20 - 30 phút;

+ MÔI trường dịch chiết nấm men: 0,5 atm trong 20 - 30 phút;

+ Môi trường nước ép carot, khoai tây: 1 atm trong 30 phút.

36

- Mỏi trường tông hợp: được pha chế từ hóa chất, thành phần môi trường được xác định cụ thể.

Nguyên liệu chứa c , N, p và các khoáng khác được hòa tan trong nước máy và khi không cần thiết thì không cần bổ sung thêm các nguyên tố vi lượng.

- Môi trường bán tong hợp: là loại trung gian giữa 2 loại trên Môi trường bán tổng hợp được chế từ hóa chất (các loại đường, muối chứa nitơ, photpho ) và các nguyên liệu tự nhiên chưa biết chính xác thành phần như dịch chiết nấm men, dịch thủy phân casein, cao ngô chúng được bổ sung chủ yếu làm nguồn bổ sung vi lượng, vitamin, aminoaxit và các chất kích thích sinh trưởng khác.

b) Phân loại theo mục đích sử dụng, môi trường dinh dưỡng gồm

- Môi trường cơ sờ (đa năng): thích hợp cho nhiều loại vi sinh vật như môi trường thạch mạch nha, thạch thịt pepton, môi trường Shacpec

- Môi trường riêng biệt: chỉ thích hợp cho một loài nhất định, không chứa chất ức chế hoặc kìm hãm các vi sinh vật phát triển Tính riêng biệt thường được đáp ứng qua thành phần dinh dưỡng đặc thù (nguồn cacbon, nitơ, độ pH hoặc các chất bổ sung khác).

- Môi trường phân lập và tuyên chọn: chỉ thích hợp cho một loài nhất định, đồng thời ức chế sự phát triển của các loài khác như những chất có độc tính mà chỉ vi sinh vật này chịu được.

Ví dụ: Môi trường Endo có chứa Fuchsin kiềm và Natrisunphit ức chế mạnh các vi khuẩn Gram (+) Như vậy, có thể tách được các vi khuẩn Gram (-) như E coli, Shalmonella

- Môi trường xác định và chắn đoán: Môi trường được bổ sung một số hóa chất chỉ thị đặc thù cho phép phát hiện một cách khá chính xác đặc điểm của một loài nào đó nhờ phản ứng của môi trường như sự đổi màu, sự tạo thành các chất khí đặc trưng Một số chất chi thị điển hình như đỏ trung tính (5 ppm), đỏ phenol (50 ppm).

- Môi trường chi thị: được sử dụng trong phân lập, định tên trong nghiên cứu tính chất sinh lý, sinh hóa, di truyền và phân loại vi sinh vật.

c) Phản loại theo tính chất lý học

Theo tính chất lý học, môi trường dinh dưỡng được chia thành 3 loại:

37

- Môi trường dịch thể: là môi trường dung dịch dưới dạng lỏng: nguyên liệu được hòa tan trong nước.

Môi trường dịch thể được sử dụng để nghiên cứu đặc tính sinh lý, sinh hóa, đặc tính nuôi cấy, quá trình trao đổi chất của vi sinh vật.

- Môi trường đặc: là môi trường lỏng được bổ sung thêm các tác nhân đông đặc ở nhiệt độ cao như thạch (agar agar), gelatin.

Môi trường đặc được dùng đề phân lập định lượng, xác định đặc tính nuôi cấy, giữ giống vi sinh vật

+ Thạch (agar agar) được sản xuất từ tào biển thuộc họ Hồng tảo (chủ yếu là Gelidium) Bản chất hóa học của agar là Polysaccarit được tạo thành chủ yếu từ D- galactoza và 3,6-anhydrogalactoza Hầu hết các vi sinh vật không cỏ khả năng

Agar có phản ứng trung tính và không làm thay đổi pH của môi trường Đáng chú ý là agar bền trong môi trường trung tính, axit nhẹ, kiềm nhẹ Tuy nhiên, ở môi trường axit pH < 5,5 agar sẽ bị phân hủy một phần trong quá trình khử trùng ở nhiệt độ cao dẫn đến khả năng tạo gel kém Môi trường sẽ bị nhão sau nhiều lần thanh trùng.

Đ ể tránh hiện tượng này, khi cần nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường có tính axit, agar cần được khử trùng riêng, sau đó bổ sung vào môi trường đã được khử trùng.

+ Gelatin (có bản chất là protein) được sản xuất từ da động vật Gelatin

vật ưa ẩm Mặt khác, gelatin còn dễ bị thủy phân bởi Enzym Proteaza Vì vậy, gelatin được sử dụng chù yếu để phát hiện hoạt lực Proteaza của vi sinh vật Gelatin thường được bổ sung với nồng độ 10 - 15%, pH = 6,8 - 7,0 Môi trường có chứa Gelatin được khử trùng ở 0,5 atm trong 15 phút.

- Môi tntòmg rẳn: là môi trường bán tổng hợp được chế từ một số nguyên liệu tự nhiên như cám, trấu, bột ngô, bột xenllulo, khô lạc, khô bông , có thể bổ sung thêm nguồn nitơ, photpho và khoáng khác bằng hóa chất khi cần thiết Môi trường rắn được sử dụng trong phòng thí nghiệm, trong công nghiệp

để nuôi cấy vi sinh vật thu chế phẩm sinh học.

3 / Một số môi trường thông dụng được sử dụng trong công nghệ môi trường a) Cách chế một sổ nguyên liệu để pha chế môi trường dinh dưỡng

Canh thang thịt: Dùng nuôi cấy các vi khuẩn dị dưỡng.

38

500 g thịt thăn bò tươi nghiền nhỏ, thêm vào 1 lít nuớc, giữ ở nhiệt độ 50°c trong thời gian 1 giờ, khuấy thường xuyên, sau đó đun soi trong 3 - 5 phút, lọc qua giây lọc và định mức đến 1 lít.

Dịch chiết nấm men

Dịch chiết nấm men được sử dụng nuôi cấy nhiều nhóm vi sinh vật khác nhau, đặc biệt môi trường nuôi cấy các loại nấm có nguồn nitơ là dịch chiết nấm men sẽ hạn chế đáng kể khả năng bị nhiễm khuẩn.

Nguyên liệu để thu dịch chiết có thể là nấm men bia dưới dạng men lỏng, men ép hoặc nấm men khô.

amin và peptit; có thể cô đặc thành cao nấm men hoặc sấy khô thành bột.

Có thể kiểm tra bằng cảm quan: nước chiết có màu và mùi đặc trưng như nước mắm từ cá.

Nước chiết malt

Để tránh vón cục, hỗn hợp được khuấy liên tục, sau đó, nâng nhiệt độ lên

55 - 58°c và giữ đến khi đường hóa hoàn toàn (mất màu với iot) Lọc qua giấy lọc thu được dịch chiết malt.

Dịch chiết được sử dụng làm môi trường mạch nha trong nuôi cấy, giữ giống và phân lập hầu hết các loại nấm, đặc biệt là nấm men Kiểm tra nồng độ đường bằng tỷ trọng kế Balling (B), hoặc hàm lượng chất khô bằng khúc xạ kế cầm tay.

Nồng độ đường trong nước nha thưòng đạt 16 - 18°B Hàm lượng chất khô có thể đạt 18 - 20%.

Khử trùng nước nha ở 0,5 atm trong 20 - 30 phút trước khi bảo quản.