Nghiên cứu nhân dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Kiên Cường NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA VIRUS G

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Kiên Cường

NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ

Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA

VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

Phạm Kiên Cường

NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ

Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA

VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM

Chuyên ngành: Hóa sinh học

Mã số: 62 42 01 16

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 GS.TS Phan Tuấn Nghĩa

2 PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh

Hà Nội, 2015

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu mà tôi đã th ực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS Phan Tuấn Nghĩa và PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh Các số liê ̣u, kết quả nêu trong luâ ̣n án là trung thực và chư a từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

NCS Phạm Kiên Cường

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS Phan Tuấn Nghĩa, PGS.TS Nguyễn Thi ̣ Vân Anh , những người thầy đã tận tình dìu dắt, hướng dẫn, động viên khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình làm luận án nghiên cứu sinh

Tôi xin chân thành cảm ơn đến toàn thể quý thầy, cô trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Cấp ủy thủ trưởng Viện Công nghệ mới, Viện Khoa học và Công nghệ Quân

sự, các anh chị bạn bè đồng nghiệp trong Viện Công nghệ mới, các thành viên trong nhóm nghiên cứu Phòng Protein tái tổ hợp và Phòng Sinh học nano và ứng dụng, thuộc Phòng Thí nghi ệm trọng điểm Công nghê ̣ Enzym

và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Tôi xin gửi lời cảm ơn đ ến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học , Ban Chủ nhiệm Khoa Sinh học va ̀ các Phòng ch ức năng của Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiê ̣n cho tôi h ọc tập, hoàn thành các thủ tục cần thiết của một nghiên cứu sinh

Tôi xin chân thành cám ơn đến TS Đặng Thị Lụa, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I và TS Trần Thị Tuyết Hoa, Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp và chia sẻ thông tin trong quá trình thử ng hiê ̣m ứng dụng thực tế sản phẩm của đề tài luận án

Luận án đã được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của đề tài thuộc chương trình Trọng điểm cấp nhà nước do Bộ Khoa học và Công nghệ tài trợ, mã số KC.04.09/11-15 và bản thân tôi cũng đã được hỗ trợ kính phí làm thực nghiệm với

tư cách là một nghiên cứu sinh của đề tài

Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới bố, mẹ, vợ, con, gia đình, những người đã luôn bên tôi, cổ vũ, động viên và tạo điều kiê ̣n thuận lợi nhất cho tôi có thời gian học tập, nghiên cứu và hoa ̀ n thành luận án

NCS Phạm Kiên Cường

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC 1

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 3

DANH MỤC BẢNG 7

DANH MỤC HÌNH 8

MỞ ĐẦU 11

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 14

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM 14

1.1.1 Vị trí phân loại của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm 14

1.1.2 Cấu trúc của WSSV 16

1.1.3 Hệ gen của WSSV 22

1.1.4 Bệnh đốm trắng do WSSV gây ra ở tôm 28

1.1.5 Chẩn đoán WSSV 32

1.2 NGHIÊN CỨU TẠO VACCINE DỰA TRÊN KHÁNG NGUYÊN VỎ WSSV 34

1.2.1 Một số biện pháp phòng chống WSSV 34

1.2.2 Protein VP28 và nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSV 40

1.2.3 Các protein bề mặt khác và nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSV 46

1.3 BÀO TỬ B subtilis VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TẠO VACCINE 48

1.3.1 Bào tử B subtilis và đặc tính hình thành bào tử 48

1.3.2 Một số protein bề mặt của B subtilis 50

1.3.3 Biểu hiện protein ngoại lai trên bề mặt bào tử 52

2.1 NGUYÊN LIỆU 54

2.1.1 Mẫu tôm thử nghiệm 54

2.1.2 Các hoá chất và nguyên vật liệu 54

2.2 MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ 56

2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 56

2.3.1 Thu nhận virus gây bệnh đốm trắng từ mẫu tôm nhiễm bệnh 56

2.3.2 Nuôi cấy tạo bào tử B subtilis 56

2.3.3 Tách chiết, định lượng DNA 57

2.3.4 Nhân dòng, biểu hiện VP28 trong E coli và B subtilis 60

2.3.5 Phát hiện, định lượng và tinh sạch VP28 64

2.3.6 Thử nghiệm khả năng phòng WSSV của bào tử B subtilis tái tổ hợp 68

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 72

3.1 NHÂN DÕNG, XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ VÀ MỘT SỐ ĐẶC TRƯNG CỦA GEN vp28 TỪ CÁC MẪU WSSV THU NHẬN Ở VIỆT NAM 72

3.1.1 Nhân bản đoa ̣n gen mã hóa VP28 bằng PCR 72

3.1.2 Nhân dòng gen mã hóa VP28 vào vector pGEM-T 74

3.1.3 Xác định trình tự và nghiên cứu tính đa hình của gen mã hóa VP28 75

3.2 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA VP28 79

3.2.1 Biểu hiện VP28 bằng hệ thống vector pET28b trong E coli 79

3.2.2 Biểu hiện VP28 dạng dung hợp với protein CotB trên bề mặt bào tử B subtilis 84

3.3 KHẢ NĂNG PHÕNG BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG CỦA BÀO TỬ B subtilis BIỂU HIỆN VP28 TRÊN BỀ MẶT 99

3.3.1 Sự tồn tại của bào tử B subtilis biểu hiện VP28 trong ruột tôm thẻ chân trắng 99

3.3.2 Khả năng kích thích miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng của bào tử B subtilis biểu hiện VP28 102

3.3.3 Đánh giá khả năng bảo hộ trên tôm thẻ chân trắng của bào tử tái tổ hợp 105

KẾT LUẬN 114

KIẾN NGHỊ 114

DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN 115

TÀI LIỆU THAM KHẢO 116

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate

BSA Albumin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin)

Cm Chloramphenicol

dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate

DSM Môi trường tạo bào tử Difco (Difco Sporulation medium)

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

GST Glutathione S-transferase

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

kDa Kilodalton

LB Luria Bertani

NBT p- nitro blue tetrazolium chloride

PAGE Điện di gel polyacrylaminde (Polyarylamide Gel Electrophoresis) PBS Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline)

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)

PVDF Polyvinylidere Fluoride

SDS Sodium Dodecyl Sulphate

GST Glutathione S-transferase

TSA Tryptic Soy Agar

TTFC Phân đoạn đầu C của độc tố uốn ván (C- terminal fragment of the

tetanus toxin) WSSV Virus gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus)

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1: Tên gọi của virus gây bệnh đốm trắng qua từng giai đoạn 15

Bảng 1.2: Các gen mã hóa protein cấu trúc của WSSV 26

Bảng 1.3: Một số giáp xác nhiễm bệnh đốm trắng 30

Bảng 1.4: Các chiến lược vaccine chống WSSV để bảo vệ tôm 46

Bảng 1.5: Một số protein trong lớp áo bào tử vi khuẩn B subtilis 51

Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi sử du ̣ng trong nghiên cứu nhân bản và biểu hiê ̣n gen vp28 55

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR 59

Bảng 2.3: Thành phần phản ứng Real-time PCR 60

Bảng 2.4: Thành phần gel cô và gel tách acrylamide trong SDS-PAGE 66

Bảng 3 1: Các mẫu tôm nhiễm WSSV thu nhận từ các địa điểm khác nhau 72

Bảng 3.2: Một số sai khác về trình tự nucleotide và acid amin của VP28 thu nhận tại Việt Nam so với trình tự đã công bố (AY168644) 78

Bảng 3.3: Sự hình thành sinh khối bào tử B subtilis tái tổ hợp trên một số môi trường khác nhau 95

Bảng 3.4: Sự hình thành bào tử tái tổ hợp trên môi trường DSM ở các thời gian khác nhau 96

Bảng 3.5: Độ sống vi khuẩn ở mẫu thức ăn trộn bào tử B subtilis biểu hiện VP28 100

Bảng 3.6: Số copy trong từng dung dịch WSSV 107

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Vị trí của WSSV trong cây phát sinh chủng loại [124] 16

Hình 1.2: Cấu trúc của virion WSSV dưới kính hiển vi điện tử [54] 17

Hình 1.3: Hình ảnh mô ruột của tôm (Procambarus clarkii) sau 48 giờ lây nhiễm WSSV dưới kính hiển vi điện tử 17

Hình 1.4: Vị trí các protein cấu trúc chính của WSSV [97] 18

Hình 1.5: Cấu trúc liên kết màng của VP19, VP24, VP26, VP28 và VP51A [21] 19

Hình 1.6: Mô hình 3D phức hợp protein vỏ xuyên màng [21] 19

Hình 1.7: Mô hình tổ chức hệ gen trên DNA vòng sợi đôi của WSSV-CN 23

Hình 1.8: Bản gel SDS-PAGE 12% nhuộm Coomassie Brilliant Blue (CBB) của protein vỏ WSSV (EP) và protein lõi nucleocapsid (NP) [120] 25

Hình 1.9: Tôm sú bị bệnh đốm trắng, dưới vỏ đầu ngực thấy rõ các đốm trắng [6].28 Hình 1.10: Sơ đồ của hệ thống miễn dịch ở tôm [98] 35

Hình 1.11: Cơ chế kích thích miễn dịch không đặc hiệu của tôm khi bị kích thích bởi β-glucan [3] 36

Hình 1.12: Cấu trúc không gian của protein VP28 [97] 42

Hình 1.13: Hình dạng ngoài của nội bào tử B subtilis [27] 48

Hình 1.14: Cấu tạo nội bào tử B subtilis [27] 49

Hình 1.15: Mô hình bi ểu hiện protein ngoa ̣i trên b ề mặt bào tử B subtilis sử dụng protein của lớp áo bào tử Protein dung hợp gồm phần màu xanh dương là protein chuyên chở và phần màu hồng là một protein ngoại lai [74] 52

Hình 3.1: Nhân bản vp28 bằng PCR từ các mẫu tôm nhiễm WSSV ở các địa điểm 73 Hình 3.2: Điện di gel agarose sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của vp28 trong các thể biến nạp sử dụng cặp mồi pGEM Fw/Rv và cặp mồi VP28.1 Fw/Rv 74

Hình 3.3: So sánh mức độ tương đồng giữa trình tự nucleotide của gen vp28 từ các mẫu WSSV thu thâ ̣p được và trình tự vp28 Việt Nam đã công bố trước đây (AY168644) 77

Hình 3.4: Điện di gel agarose sản phẩm cắt vector biểu hiện và vector nhân dòng

mang gen vp28 bằng enzyme giới hạn sau khi tinh sạch 80

Hình 3.5: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự có mặt của gen vp28 trong các khuẩn lạc 80

Hình 3.6: SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra biểu hiện VP28 ở E coli 81

Hình 3.7: SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra độ tinh sạch của VP28 83

Hình 3.8: Điện di sản phẩm cắt giới hạn pDG364-cotB-gst-sep, pDG364-cotB, pGEM-vp28 với hai cặp enzyme EcoRI và HindIII 86

Hình 3.9A: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra các khuẩn la ̣c t ừ đĩa thạch biến nạp sản phẩm gắn của gen mã hóa VP28 và pDG364-cotB bằng cặp mồi vp 28, cotB và pDG364 87

Hình 3.9B: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra các khuẩn la ̣c t ừ đĩa thạch biến nạp sản phẩm gắn của gen mã hóa VP28 và pDG364-cotB-GST bằng cặp mồi pDG 364 và vp28 88

Hình 3.10: Kiểm tra sự có mặt của gen dung hợp trong DNA hệ gen B subtilis 89

Hình 3.11: Kiểm tra sự có mặt của gen cotB-vp28 trong hệ gen của B subtilis 90

Hình 3.12: Bào tử quan sát dưới kính hiển vi 91

Hình 3.13: SDS-PAGE (A) và thẩm tách miễn dịch (B) kiểm tra sự biểu hiện VP28 trên bào tử B subtilis 92

Hình 3.14: Ảnh chụp phân tích miễn dịch huỳnh quang kiểm tra biểu hiện CotB-VP28 và CotB-GST-VP28 trên bề mặt bào tử B subtilis 94

Hình 3.15: Mức độ bền nhiệt của bào tử tái tổ hợp 96

Hình 3.16: Mức độ bền với muối của bào tử tái tổ hợp 97

Hình 3.17: Mức độ bền với pH của bào tử tái tổ hợp 98

Hình 3.18: Thức ăn của tôm thẻ chân trắng sau khi trộn bào tử B subtilis dạng dại PY79 và dạng tái tổ hợp cotB-VP28 hay cotB-GST-VP28 99

Hình 3.19: Sự tồn tại của bào tử B subtilis biểu hiện VP28 trong ruột tôm thẻ chân

trắng 100 Hình 3.20: Hoạt độ phenoloxidase (PO) trong di ̣ch chiết cơ tim c ủa tôm thẻ chân trắng ăn bào tử tái tổ hợp 103 Hình 3.21: Hoạt độ enzyme SOD trong mô thịt của tôm thẻ chân trắng 104 Hình 3.22: Đồ thị tín hiệu quang phản ánh số copy sản phẩm PCR nhân bản từ các mẫu DNA tinh sạch từ các mẫu tôm nghi nhiễm đốm trắng sau các chu kỳ 106 Hình 3.23: Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ WSSV (copy/ml)

và chu kỳ ngưỡng, với E = 97.2%, R2 = 0.991 106 Hình 3.24: Tỷ lệ chết tích lũy của các lô tôm khi cảm nhiễm với WSSV ở nồng khác nhau là 2,6x105

, 2,6x104, 2,6x103 và 2,6x102 copy/ml 108 Hình 3.25: Tỷ lệ chết tích lũy của các lô tôm khi cảm nhiễm với WSSV ở nồng độ khác nhau là 2,6 x 104

, 1,3 x 104, 0,65 x 104 và 0,3 x 104 copy/ml 109 Hình 3.26: Tỷ lệ chết tích lũy của các lô tôm khi đánh giá khả năng bảo hộ của bào

tử tái tổ hợp 110

MỞ ĐẦU

1 Tính cấp thiết của đề tài

Nuôi tôm ở Việt Nam đã phát triển mạnh trong những năm gần đây và trở thành một ngành kinh tế quan trọng Diện tích nuôi tôm cả nước tăng từ 324,1 hecta năm 2000 lên đến 652.612 hecta vào cuối năm 2013 Chỉ tính 6 tháng đầu năm 2014

cả nước đã thả nuôi 638.422,7 hecta với sản lượng thu hoạch đạt 258.730 tấn trong

đó tôm sú là 113.309 tấn và tôm thẻ chân trắng là 149.507 tấn, đạt giá trị xuất khẩu đạt 1,7 tỷ USD, tăng 54,7% so với cùng kỳ năm 2013

Tuy nhiên, ngành nuôi trồng tôm thường xuyên gặp khó khăn về việc kiểm soát các dịch bệnh, trong đó virus gây bệnh đốm trắng (white spot syndrome virus - WSSV) là một trong những tác nhân gây bệnh chính ở tôm Tôm mỗi khi bị nhiễm WSSV thì gần như 100% bị chết sau đó một đến vài tuần Bệnh đốm trắng có tỷ lệ lây lan nhanh, cho nên khó có thể lường hết các thiệt hại mỗi khi có dịch Năm

2013, dịch bệnh đốm trắng trên tôm đã xuất hiện tại 280 xã của 94 huyện thuộc 28 tỉnh, thành phố trong phạm vi cả nước Tổng diện tích nuôi bị bệnh là 12.259 ha Theo báo cáo của Cục Thú y, từ đầu năm 2014 đến 20/7/2014, thiệt hại về nuôi trồng thủy sản là rất lớn, khoảng 25.000 ha diện tích nuôi tôm bị thiệt hại tại 232 xã,

của 60 huyện trực thuộc 19 tỉnh, thành phố trực thuộc Trung ương

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã được tiến hành để tìm ra giải pháp chống lại WSSV nhưng kết quả thu được còn hạn chế, phần lớn là do chưa hiểu biết rõ về cơ chế lây nhiễm, nhân lên của virus trong tôm và hệ thống đáp ứng miễn dịch của tôm chống lại virus này Một hướng nghiên cứu được nhiều nhà khoa học trên thế giới hướng đến là tạo các vaccine dựa trên protein cấu trúc kháng nguyên vỏ của WSSV như các protein VP28, VP26 của WSSV để kích thích đáp ứng miễn dịch ở tôm chống lại bệnh đốm trắng VP28 là một loại protein vỏ chính của WSSV được mã

hóa bởi gen wsv421 và có khối lượng phân tử khoảng 27,5 kDa, đóng vai trò chủ

đạo giúp virus gắn đặc hiệu lên tế bào tôm, là bước khởi đầu cho quá trình lây nhiễm Chính vì vậy, VP28 là protein được lựa chọn để tạo kháng thể chẩn đoán WSSV cũng như tạo vaccine cho tôm phòng bệnh đốm trắng Tuy nhiên, những kết

quả nghiên cứu tạo vaccine phòng bệnh đốm trắng do WSSV cũng chỉ mới dừng lại

ở mức thử nghiệm nhỏ lẻ, chưa tạo được một vaccine chính thức, hiệu quả

Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu nhân

dòng và biểu hiện trên bề mặt bào tử Bacillus subtilis gen mã hóa kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm” để tạo ra bào tử Bacillus subtilis biểu

hiện kháng nguyên VP28 của virus gây bệnh đốm trắng làm cơ sở cho việc sản xuất vaccine dạng probiotic bền nhiệt giúp phòng bệnh virus đốm trắng trên tôm

2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

- Nhân dòng, xác định được trình tự và một số đặc trưng của gen VP28 từ các mẫu WSSV thu nhận được ở các địa bàn nuôi tôm chủ yếu của Việt Nam

- Tạo được chủng B subtilis tái tổ hợp biểu hiện gen mã hóa protein kháng nguyên VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử

- Bước đầu đánh giá được khả năng phòng bệnh đốm trắng trên tôm thẻ chân

trắng của bào tử B subtilis biểu hiện VP28 trên bề mặt

3 Đối tượng và nội dung nghiên cứu của đề tài

Đối tượng nghiên cứu của đề tài:

Gen mã hóa protein VP28 của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

- Nhân dòng, xác định trình tự và một số đặc trưng của gen vp28 từ các mẫu

WSSV thu nhận được ở Việt Nam

- Nghiên cứu biểu hiện gen vp28 trên bề mặt bào tử B subtilis

- Nghiên cứu thử nghiệm khả năng phòng bệnh đốm trắng trên tôm thẻ chân

trắng khi cho tôm ăn thức ăn trộn bào tử B subtilis biểu hiện VP28

4 Địa điểm thực hiện đề tài

Các nghiên cứu của luận án được thực hiện chủ yếu tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

Phần thử nghiệm khả năng bảo hộ tôm thẻ chân trắng phòng bệnh virus đốm trắng được thực hiện tại Phòng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein với sự hỗ trợ, hợp tác của Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản I

5 Đóng góp mới của đề tài

- Đã xác định trình tự và một số đặc trưng của gen vp28 từ các mẫu WSSV

thu nhận được ở Việt Nam và phát hiện ra 5 sự sai khác về nucleotide (A125G, A183G, A226G, A403G, T517C) so với trình tự gen đã công bố (AY168644) Trong số các sai khác về nucleotide, có 4 sai khác dẫn đến sự sai khác về acid amin

- Đã tạo được chế phẩm bào tử B subtilis tái tổ hợp với sự biểu hiện gen mã hóa protein VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử B subtilis dưới dạng các cấu trúc

protein dung hợp CotB-VP28 và CotB-GST-VP28, trong đó, CotB là protein vỏ của

B subtilis và GST (Glutathione S Transferase) là protein trung gian nhằm hạn chế

cản trở không gian đối với VP28

- Đã tối ưu được điều kiện thu nhận bào tử tái tổ hợp B subtilis biểu hiện tốt

kháng nguyên VP28 của WSSV trên bề mặt bào tử và nghiên cứu các tính chất của

bào tử tái tổ hợp B subtilis CotB-GST-VP28 trong một số điều kiện môi trường

khác nhau

- Đã đánh giá được sự tăng ho ạt độ của các enzyme phenoloxidase (PO), superoxide dismutase (SOD) có liên quan đến đáp ứng miễn dịch của tôm và đánh giá khả năng phòng bệnh đốm trắng trên tôm thẻ chân trắng với mức bảo hô ̣ trên

70% của bào tử B subtilis biểu hiện VP28 trên bề mặt

6 Ứng dụng thực tiễn của đề tài

- Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để tạo chế phẩm probiotic dạng bào

tử B subtilis tái tổ hợp bền nhiệt, biểu hiện VP28 trên bền mặt, có khả năng tăng

cường miễn dịch và bảo vệ tôm khỏi nhiễm bệnh đốm trắng, giúp góp phần kiểm soát dịch bệnh trên tôm

- Thành công của đề tài sẽ là tiền đề cho việc phát triển các vaccine tái tổ hợp

dạng bào tử B subtilis tái tổ hợp có khả năng phòng bệnh do các vi sinh vật khác

gây ra ở tôm

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM

1.1.1 Vị trí phân loại của virus gây bệnh đốm trắng ở tôm

Dịch bệnh đốm trắng bùng phát được công bố đầu tiên tại trang trại nuôi tôm

P japonicus ở Nhật Bản vào năm 1993 [41, 71] Sau đó, có nhiều báo cáo về sự

bùng phát của căn bệnh do virus với các tên gọi khác nhau nhưng đều có những dấu hiệu tương tự gây ra bởi virus hình que đến từ các nơi khác nhau ở châu Á (Bảng 1.1) Cho đến nay, bệnh đốm trắng đã xuất hiện ở các hầu hết các nước nuôi tôm trên thế giới Ở Việt Nam hầu hết các tỉnh nuôi tôm đều bị nhiễm mầm bệnh đốm trắng

Ban đầu, tác nhân gây bệnh được miêu tả là một virus gây bệnh có vỏ, hình

dạng giống bacilli, gọi là RV - PJ (virus có nhân hình que của P japonicus), sau đó

tác nhân này được định danh lại thành virus Penaeid có DNA hình que [41] Virus gây chết các tế bào da và tế bào máu của tôm được coi là nhân tố gây bùng phát dịch bệnh ở tôm tại Trung Quốc vào năm 1993 - 1994 [15] Một năm sau đó, virus chính thức được gọi là baculovirus gây ảnh hưởng đến hệ thống biểu bì và ngoại bì trên cơ sở phân tích các đặc điểm hình thái và thông tin về mô bệnh học của chúng [116] Virus này được phân loại vào cùng nhóm với baculovirus, virus gây bệnh đỏ, virus gây bệnh đốm trắng Đến nay, virus này được gọi phổ biến là WSSV Vào năm 1995, các nhà khoa học đề xuất rằng dựa trên hình thái, kích thước, vị trí lắp ráp, bệnh học phân tử và thành phần nucleic acid, WSSV cần được xếp vào phân họ

Nudibaculovirinae, họ Baculoviridae, với tên chính thức là PmNOBII, giống như

baculovirus thứ 2 không có lỗ hổng được tìm thấy ở trên một giống tôm sú [117] Trong cùng năm này, một chủng khác đã được phân lập và được coi là virus mới tìm thấy, gọi là PmNOBIII [131] Các nghiên cứu dựa trên gen mã hóa cho enzyme

ribonucleotide reductase (rr1 và rr2), trình từ DNA vp26 và vp28, cùng với việc

phát hiện các promoter của gene WSSV rr không đƣợc tìm thấy ở các virus

baculovirus [103-105] và phân tích về nguồn gốc loài khi so sánh gen protein kinase của WSSV với protein kinase của một số virus và sinh vật nhân chuẩn cuối cùng đã tách WSSV ra khỏi baculovirus

Bảng 1.1: Tên gọi của virus gây bệnh đốm trắng qua từng giai đoạn

Hypodermal and hematopoietic necrosis

Shrimp explosive epidermic disease (SEED) Trung Quốc [15]

Systemic ectodermal and mesodermal

Penaeus monodon non-occluded Baculovirus II

Penaeus monodon non- occluded Baculovirus

Penaeid rod- shaped DNA virus (PRDV) Nhật Bản [41]

White spot baculovirus (WSBV) Đài Loan [63]

Yellow head disease-like virus Đài Loan [111]

White spot syndrome baculovirus (WSSB) Thái Lan [30]

White spot syndrome virus (WSSV) Đài Loan [65]

Ngoài ra, dẫn liê ̣u giải trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen WSSV cho thấy nhiều gen không giống gen của virus nào khác trong họ Baculoviridae [107, 123] Sự khác biệt về genome và phổ vật chủ rộng của WSSV chứng tỏ virus này là đại diện cho một họ mới [32, 104] Gần đây nhất, tại Hội nghị Virus học Quốc tế lần thứ 12,

WSSV đã được xếp vào chi Whispovirus thuộc họ virus mới là Nimaviridae (Hình

WSSV có dạng hình que với chiều dài 240-380 nm và đường kính 70-159 nm, kích thước trung bình của nucleocapsid là 80 x 350 nm và có phần phụ giống như đuôi ở cuối các virion [130] Một số hạt virus khác còn chứa đuôi ở đầu cuối [116, 131] Lớp vỏ kéo dài có thể tạo nên cấu trúc dạng đuôi dài, chiều dài 270-310 nm [29] Nucleocapsid trần có dạng hình que, kích thước khoảng 330-350 nm × 58-67

nm, thường dài hơn và mảnh hơn hạt virus hoàn chỉnh [131] Nucleocapsid có hình thái phân mảnh, bao gồm các mảnh xếp vuông góc với trục thẳng đứng của chúng Một nucleocapsid thông thường chứa khoảng 14-19 phân mảnh Thực chất, các phân mảnh này có cấu trúc hình vòng, do đó nucleocapsid được tạo thành do một chuỗi các cấu trúc vòng xếp chồng lên nhau [131] Mỗi phân mảnh (hoặc vòng) được tạo thành từ hai hàng song song, mỗi hàng gồm từ 12-14 tiểu đơn vị hình cầu, mỗi tiểu đơn vị có đường kính khoảng 8-10 nm Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, đôi khi còn bắt gặp những nucleocapsid to hơn và có hình trứng với vỏ ngoài phân

mảnh tách biệt [29, 30] Cấu trúc bề mặt khác nhau của các nucleocapsid có hình dạng khác nhau (hình que, hình trứng…) và cho thấy rằng chính sự sắp xếp của các tiểu phần hình cầu quyết định đến hình dạng tổng thể của nucleocapsid

Nhìn theo chiều dọc, các thể virus có vỏ bao bọc hình trụ hoặc elip (Hình 1.2); theo chiều ngang, chúng có hình ngũ giác hoặc lục giác (Hình 1.3) [30, 116] Một thể virus được đóng gói hoàn chỉnh có kích thước 275-335 nm × 116-138 nm, trong khi một capsid có kích thước 246-296 nm × 75-93 nm, lớp vỏ dày khoảng 7-9

nm [112]

Hình 1.2: Cấu trúc của virion WSSV dưới kính hiển vi điện tử [54]

(a) Cấu trúc của một thể virus WSSV đầy đủ với phần phụ giống đuôi

(b) Cấu trúc của một nucleocapsid hình trụ

(c) Mô hình cấu trúc các lớp của một thể virus WSSV bao gồm: lớp vỏ ngoài, lớp vỏ capsid, lõi nucleocapsid và những protein cấu tạo chính

Hình 1.3: Hình ảnh mô ruột của tôm (Procambarus clarkii) sau 48 giờ lây

nhiễm WSSV dưới kính hiển vi điện tử

a: Các thể virus sắp xếp theo dạng tinh thể nằm bao quanh nhân b: Các thể virus

tập trung xung quanh cấu trúc hình que dài (LRS) trong nhân [55]

Hầu hết các protein cấu trúc của WSSV đều là các protein vỏ và chúng đóng vai trò quan trọng trong việc bám dính, xâm nhập và đóng gói của virus [22] Vỏ của virus WSSV bao gồm ít nhất 35 loại protein khác nhau [61] Trong số các protein cấu trúc của WSSV đã đƣợc xác định, có 4 protein cấu trúc chính là VP28 (28 kDa), VP26 (26 kDa), VP24 (24 kDa) và VP19 (19 kDa) Hai protein VP26 và VP24 liên kết với nucleocapsid, còn hai protein VP28 và VP19 liên kết với lớp vỏ

và là hai protein cấu trúc chủ yếu nhất, chiếm khoảng 60% các protein vỏ (Hình 1.4) [97, 103]

Hình 1.4: Vị trí các protein cấu trúc chính của WSSV [97]

Các protein vỏ của WSSV có quan hệ mật thiết với nhau Trong mô hình phức hợp protein vỏ, 3 protein xuyên màng VP19, VP28 và VP51A đều có vùng tiếp xúc lớn trên bề mặt của virus (Hình 1.5) Chính những vùng này sẽ đóng vai trò quan trọng trong quá trình lây nhiễm của virus bằng cách liên kết với thụ thể tế bào vật

chủ hoặc thúc đẩy quá trình dung hợp tế bào [17, 80]

Trong suốt quá trình xâm nhiễm của WSSV, có một số protein tham gia gắn vào thụ thể trên tế bào tôm Vì vậy, rất có khả năng phức hợp protein vỏ đã đƣợc xác định (Hình 1.6) sẽ hoạt động nhƣ một phức hệ lây nhiễm (infectome) đóng vai trò gắn bám và giúp virus xâm nhập vào tế bào tôm [21] Trong đó, VP28 và VP26 đƣợc đƣợc xem là quan trọng nhất

Hình 1.5: Cấu trúc liên kết màng của VP19, VP24, VP26, VP28 và VP51A [21]

Hình 1.6: Mô hình 3D phức hợp protein vỏ xuyên màng [21]

VP28, được mã hóa bởi gene wsv421, là một potein vỏ đóng vai trò rất quan

trọng trong những bước đầu tiên của quá trình nhiễm WSSV vào tôm [107] Các nhà khoa học đã giả định rằng VP28 có thể góp phần quan trọng để nhận biết các thụ thể bề mặt tế bào tôm do một số vị trí glycosyl hóa tiềm năng [102] Tuy nhiên, điều này chưa được chứng minh Các nghiên cứu về vai trò của VP28 trong quá trình xâm nhập của virus vào tế bào vật chủ sử du ̣ng kháng thể kháng VP 28 cho thấy protein này liên quan đến sự xâm nhập mang tính hệ thống của WSSV ở tôm [106, 108] Những nghiên cứu sau này của Robalino và tập thể [82] đã chứng minh rằng hoạt tính trung hòa WSSV này thực ra là do các chất ức chế không đặc hiệu có trong huyết thanh của thỏ được sử dụng trong các nghiên cứu ban đầu Sự tương tác của VP28 với protein màng của tế bào máu ở tôm đã được chứng minh Có ít nhất 3 protein màng có thể tương tác với protein VP28 tái tổ hợp, và một trong số đó là

protein Rab7 của tôm [90]

VP26, được hóa bởi gene wsv311, có liên kết với nucleocapsid [107] và phần

khung đọc mở (ORF) của nó cũng là một protein vỏ của WSSV [126] Protein này nằm trên khoảng trống giữa lớp vỏ và nucleocapsid, đóng vai trò như một protein liên kết Có thể là đầu N của protein VP26 (vùng kỵ nước mạnh) gắn vào lớp vỏ trong khi đầu C (chứa trình tự ưa nước) thì gắn vào nucleocapsid Hơn nữa, VP26

có khả năng gắn với actin hoặc các protein liên kết với actin Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng cả VP28 và VP26 đều tạo thành các cấu trúc trimer gắn trong vỏ của virus và có thể có chức năng quan trọng trong việc tương tác khi xâm nhập giữa màng vỏ virus và các thụ thể tế bào vật chủ

Cho tới nay, có ít nhất 6 loại protein vỏ (VP31, VP36A, VP36B, VP110, VP187 và VP281) của WSSV được chứng minh là có chứa motif RGD đóng vai trò tín hiệu gắn vào tế bào vật chủ, trong đó đặc trưng của motif RGD (Arg-Gly-Asp) được coi là có liên quan đến việc gắn vào bề mặt tế bào WSSV vào trong tế bào vật chủ có thể bắt đầu bằng việc trình tự protein gắn vào bề mặt và thụ thể virus, như integrin được biểu hiện trong tế bào đích Tuy nhiên, các peptide tổng hợp có chứa motif RGD lại không ức chế quá trình lây nhiễm của WSSV, chứng tỏ rằng integrin

của vật chủ tế bào không được nhận biết đầy đủ bởi WSSV như là một thụ thể tiềm năng để xâm nhập vào vật chủ, và do vậy WSSV có thể sử dụng các thụ thể khác ngoài intergrin để xâm nhập vào tế bào [47]

Khi toàn bô ̣ genome của WSSV được giải trình tự, gen wsv001 mã hóa cho

protein giống collagen (WSSV-CLP) hay còn có tên là VP1684 đã được xác định

Sự có mặt của collagen trong virus hiếm khi được đề cập Trong nghiên cứu của Li

và tập thể [57], WSSV-CLP được tinh sạch và xử lý với N - glycopeptidase F để xác định mức đô ̣ glycosyl hóa Sự giảm khối lượng phân tử của nó đã được quan sát

và cho thấy protein bị glycosyl hóa đầu N Kết quả này khá đặc biệt vì sự cải biến sau dịch mã chưa từng được phát hiện ở bất kỳ protein nào của WSSV [57]

Các protein cấu tạo nên nucleocapsid ít được biết đến hơn so với các protein

vỏ virus VP15, sản phẩm mã hóa bởi gene wsv214 là một trong những protein chính nằm ở nucleocapsid wsv214 mã hóa cho chuỗi peptide gồm 80 acid amin,

bao gồm các amino acid cơ bản (44,2%) và serine (24,6%) Đặc tính này cũng giống như một số protein gắn DNA khác [114, 127] VP15 có khả năng gắn với DNA sợi kép một cách không đặc hiệu, nhưng có xu hướng lớn là gắn vào DNA siêu xoắn,

có chức năng chính trong việc gói genome của WSSV trong nucleocapsid Các phân

tử protein VP15 tương tác lẫn nhau nhưng không tương tác với các protein cấu trúc khác của hạt virus [114]

VP35 là một protein khác của nucleocapsid Các nghiên cứu thực nghiệm cho thấy rằng đầu N của VP35 chứa 2 nhóm bao gồm 4 acid amin tiềm năng (KRKR từ

vị trí 24 đến 27 và KRPR từ vị trí 53 đến 56) kết hợp với một số tín hiệu hướng nhân đã được xác định đặc tính chi tiết Sự phân bổ của VP35 cho thấy rằng nó nhắm đến đích là nhân Khi 4 acid amin cơ bản của các motif này được thay bằng AAAA, thì protein đột biến chỉ có ở trong tế bào chất, chứng tỏ chức năng của nó như một tín hiệu hướng nhân của WSSV [23]

Một trong những đặc tính độc đáo trong genome WSSV là sự tồn tại của gen

wsv360, với một trình tự khổng lồ dài 18.234 bp mã hóa cho protein VP664 gồm

6077 gốc acid amin, nằm ở trên nucleocapsid, và phân bổ theo lớp phù hợp với đặc

tính của các tiểu đơn vị xếp chồng lên nhau Giống như trong các protein cấu trúc khác của WSSV, phân tích VP664 bằng kỹ thuật RT-PCR cho thấy rằng đoạn này được phiên mã 12 giờ sau khi xâm nhập Điều này chứng tỏ protein VP664 có thể đóng góp vào quá trình đóng gói và phát sinh hình thái của thể virus [54] Ngoài chức năng này, VP664 được xem là protein cấu trúc của virus lớn nhất đã từng được nghiên cứu [54] Gần đây VP51 và VP76 được biết đến như là những thành phần cấu trúc nhỏ liên kết với nucleocapsid virus [118], tuy vậy chức năng của 2 loại protein là gì thì vẫn chưa được làm rõ

1.1.3 Hệ gen của WSSV

Genome của WSSV là sợi DNA kép, dạng vòng có kích thước khoảng 300

kb (Hình 1.7) Những mẫu WSSV phân lập được ở Trung Quốc (WSSV-CN, Accession No AF332093), Thái Lan (WSSV-TH, Accession No AF369029), và Đài Loan (WSSV-TW, Accession No.AF440570) đã được giải trình tự và có kích thước lần lượt là 305 kb, 297 kb và 307 kb Tổng hàm lượng G+C trong genome của WSSV chiếm khoảng 41%, 2 loại nucleotide này phân bố rải rác trong genome của virus [107, 123] Các trình tự của các mẫu (WSSV-CN, WSSV-TH, WSSV-TW) đều chứa gen đặc trưng hoặc hệ thống mã khung đọc mở riêng, nhưng các nhóm nghiên cứu về whispovirus ICTV đã quyết định chọn chủng virus phân lập được tại Trung Quốc, WSSV-CN là chủng điển hình

Hình 1.7: Mô hình tổ chức hệ gen trên DNA vòng sợi đôi của WSSV-CN

bao gồm những vị trí và chiều phiên mã tương ứng với các gen Điểm bắt đầu G (GGATCC) của phân đoạn BamHI lớn nhất được quy định là vị trí 1 [55]

Hầu hết trình tự genome của WSSV là tương đồng và có khoảng 3% genome chứa các trình tự lặp lại Những trình tự lặp lại này được xếp vào 9 vùng tương đồng, phân bố trong khắp genome và chủ yếu tập trung ở vùng đa gen Những vùng tương đồng có chứa 47 đoạn lặp lại nhỏ bao gồm cả lặp lại trực tiếp, lặp lại ngược không điển hình và các đoạn lặp lại song song nhưng ngược chiều không hoàn toàn Mặc dù cấu trúc của các vùng tương đồng của WSSV là tương tự như vùng tương đồng ở các baculovirus nhưng chức năng của các vùng này ở WSSV vẫn chưa được

xác định Tuy nhiên, trong thí nghiệm in vitro, có ít nhất một loại protein của

WSSV, WSV021 là sản phẩm của gen sớm có khả năng bám vào các vùng tương đồng này [128]

Phân tích trình tự WSSV cho thấy genome của nó có tổng số 531 khung đọc

mở (ORF), chứa ít nhất 60 codon trong genome của chủng WSSV-CN (Hình 1.7)

Có khoảng 1/3 trong số đó (181 ORF) là không chồng gối lên nhau Khoảng 80% trong số 181 ORF này có chứa các vị trí polyA (ATAAA) ở cuối ORF Kích thước của các protein được mã hóa bởi bộ khung đọc mở này được ước tính khoảng 60 đến 6077 acid amin Chỉ có khoảng 45% ORF không chồng gối mã hóa cho protein hoặc motif đã biết (> 20% acid amin được xác định) [123] Ngược lại, một số ORF của WSSV mã hóa cho các protein có độ tương đồng cao (tới 40% hoặc hơn) do đó những ORF này có thể được xếp chung vào một họ gen Tổng số 27 ORF có thể được phân loại vào 10 họ gen WSSV và có thể coi rằng những họ gen này xuất phát

từ sự sao chép DNA trong hệ gen WSSV [106]

Khi so sánh trình tự genome hoàn chỉnh của CN, SSV-TH và

WSSV-TW người ta đã xác định được 5 loại đô ̣t biến:

1 Mất đoạn lớn 13 kb trong genome WSSV-TH khi so sánh với genome của WSSV-CN và WSSV-TW

2 Vùng đột biến khoảng 750 bp trong genome của WSSV-TH

3 Trình tự gen nhảy với kích thước khoảng 1337 bp chỉ xuất hiện trong mẫu WSSV-TW

4 Thay đổi về số lượng các phân đoạn lặp lại trong vùng tương đồng và lặp lại trực tiếp

5 Đột biến một nucleotide, bao gồm thêm nucleotide hoặc mất [67]

Ở WSSV-CN, vùng tương ứng với vị trí mất đoạn 13 kb ở WSSV-TH có chứa

13 ORF Những đột biến trong vùng này là nguyên nhân gây nên tính độc khác nhau ở các chủng WSSV khác nhau [51] Do đó, mặc dù những vùng này không quan trọng đối với sự tồn tại của WSSV nhưng chúng có thể liên quan đến các chất gây độc Ngoài ra chúng còn mã hóa cho một loại nucleocapsid protein VP35, có

thể là protein của nucleocapsid không thiết yếu vì nó không xuất hiện ở chủng WSSV-TH [23]

Việc kết hợp dẫn liệu trình tự genome của WSSV và các phân tích về protein giúp xác định các protein cấu trúc trở nên dễ dàng hơn Nhờ đó mà đã có ít nhất 40 protein cấu trúc của WSSV được xác định, chúng có kích thước từ 68 tới

6077 acid amin (Bảng 1.2) Khi phân tích protein bằng SDS-PAGE gradient, hơn

30 băng protein có thể nhận biết, trong đó có các protein chính như VP664, VP28, VP26, VP24, VP19 và VP15 (Hình 1.8) Tuy nhiên, chức năng của các protein cấu trúc vẫn chưa được biết mô ̣t cách đầy đủ

Hình 1.8: Bản gel SDS-PAGE 12% nhuộm Coomassie Brilliant Blue (CBB) của

protein vỏ WSSV (EP) và protein lõi nucleocapsid (NP) [120]

Bảng 1.2: Các gen mã hóa protein cấu trúc của WSSV [55]

1.1.4 Bệnh đốm trắng do WSSV gây ra ở tôm

Hội chứng đốm trắng xuất hiện ở nhiều động vật giáp xác (trong đó có tôm) Ở tôm, bệnh có thể xuất hiện từ giai đoạn tôm giống đến tôm trưởng thành Mức độ nhiễm bệnh phụ thuộc vào tuổi tôm và các yếu tố môi trường như: nhiệt độ,

độ mặn, các bệnh do vi khuẩn, ô nhiễm môi trường Bệnh đốm trắng có thể lây truyền theo chiều dọc tức là từ bố mẹ truyền sang tôm con Hoặc bệnh lây truyền theo chiều ngang tức là lây lan trực tiếp từ nước qua các vết thương tổn, qua các tế bào biểu mô che phủ trên mang hay qua niêm mạc ống tiêu hóa khi tôm ăn giáp xác nhỏ có mang bệnh [6]

Tôm bị nhiễm bệnh thường có những dấu hiệu đặc trưng như: xuất hiện nhiều đốm trắng ở dưới vỏ ở vùng mang và đốt cuối thân (Hình 1.9), đôi khi toàn thân tôm có màu đỏ, hồng, nhợt nhạt, bỏ ăn, bơi vật vờ không định hướng, bơi lên mặt nước hoặc dạt vào bờ Khi xâm nhập vào tôm, WSSV cư trú ở nhiều bộ phận của tôm như mô dạ dày, mang, trứng, mắt, chân bơi… Các virus này nhân lên rất nhanh làm tôm nhiễm bệnh nặng và sau đó tiếp tục phát tán ra môi trường bên ngoài, gây bệnh cho cả đàn tôm có trong ao Tôm nhiễm WSSV thường phát bệnh

và chết vào khoảng 45-60 ngày sau khi thả nuôi, 3-10 ngày sau khi xuất hiện các đốm trắng, tôm chết hàng loạt và tỷ lệ chết của tôm nhiễm WSSV là 100% [6, 60]

Hình 1.9: Tôm sú bị bệnh đốm trắng, dưới vỏ đầu ngực thấy rõ các đốm trắng

[6]

Trong những năm gần đây bệnh đốm trắng thường xuyên xuất hiện trong các khu vực nuôi tôm ven biển ở Việt Nam Tại hầu hết các tỉnh, khi bị nhiễm bệnh đốm trắng, tôm chết hàng loạt và gây tổn thất lớn Thời gian xuất hiện bệnh thường

là vào mùa Xuân và đầu Hè khi nhiệt độ trong ngày biến thiên quá lớn (> 5oC) gây sốc cho tôm Năm 2001, theo điều tra của Bùi Quang Tề và tập thể trên 483 hộ nuôi tôm sú thuộc 23 huyện của 8 tỉnh ven biển phía Bắc (Quảng Ninh, Hải Phòng, Thái Bình, Nam Định, Ninh Bình, Thanh Hoá, Nghệ An, Hà Tĩnh) thì có các bể nuôi tôm của 166 hộ (34,37%) đã bị nhiễm bệnh đốm trắng và tôm chết Tôm sú nuôi sau 1-2 tháng thường dễ bị nhiễm bệnh đốm trắng và chết hàng loạt [6] Trong đầu năm

2010, tại Thanh Hóa, bệnh đốm trắng bùng phát trên cánh đồng nuôi tôm sú rộng

183 ha, gây thiệt hại 7,2 tỉ đồng Trong năm 2010, bệnh đốm trắng cũng đã tràn lan khắp các tỉnh như Hà Tĩnh, Nghệ An và Thanh Hóa, gây thiệt hại nghiêm trọng cho các hộ nuôi tôm Đầu năm 2011, bệnh đốm trắng đã gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến năng suất tôm nuôi ở các tỉnh Bến Tre, Trà Vinh, Sóc Trăng, Cà Mau, Kiên Giang ven biển Đồng bằng sông Cửu Long [8]

Bệnh đốm trắng xuất hiện ở nhiều động vật giáp xác tự nhiên như các loài tôm

he, tôm nước ngọt, cua, tôm hùm, chân chèo và ấu trùng côn trùng (Bảng 1.3) do đó bệnh lây lan rất nhanh trong các đầm nuôi tôm

Bệnh đốm trắng lây truyền theo chiều ngang là chính Virus lây từ các giáp xác khác (tôm cua, chân chèo) nhiễm bệnh đốm trắng từ môi trường bên ngoài ao hoặc ngay trong ao nuôi tôm Các con tôm khoẻ, khi tiếp xúc với tôm bị bệnh đốm trắng, dẫn đến bệnh lây lan càng nhanh hơn Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bị bệnh đốm trắng từ ao này và mang theo các mẩu thức ăn thừa vào các ao nuôi khác Bệnh đốm trắng không có khả năng lây truyền qua đường thẳng, tức là các noãn bào (trứng) phát hiện chúng nhiễm virus đốm trắng thì chúng không chín (thành thục) được Nhưng trong quá trình đẻ trứng của tôm mẹ có thể thải ra các virus đốm trắng từ trong buồng trứng của chúng, do đó ấu trùng tôm dễ dàng nhiễm virus ngay từ giai đoạn sớm

WSSV có phạm vi vật chủ rộng, nhanh chóng phổ biến trên toàn thế giới và gây thiệt hại lớn Vì vậy, đã có nhiều nghiên cứu tập trung để ngăn chặn và kiểm soát WSSV, các kết quả nghiên cứu này đã cung cấp nhiều thông tin về cơ chế phân

tử của quá trình lây nhiễm và nhân lên của virus Bằng phương pháp gây nhiễm WSSV qua đường miệng cho tôm, cho thấy trong giai đoạn đầu của quá trình lây nhiễm, virus đốm trắng xâm nhập vào dạ dày, mang, biểu bì, những mô liên kết của gan tụy Ở giai đoạn sau đó là cơ quan bạch huyết, tuyến anten, mô cơ, mô tạo máu, tim, đoạn ruột sau và một số phần của ruột giữa Hệ thần kinh và những cặp mắt

kép chỉ bị nhiễm ở giai đoạn cuối [1]

Bảng 1.3: Một số giáp xác nhiễm bệnh đốm trắng [35]

Vật nuôi

Nhiễm tự nhiên (N)/

nhiễm thực nghiệm (E)

truyền nhiễm của tôm

sú

penaeus monodon

H

&

E

Kính HVĐT

In situ PCR

Nghiên cứu xây dựng mô hình thực nghiệm chuẩn gây bệnh đốm trắng trên tôm sú của Nguyễn Văn Hảo và tập thể [4] cho thấy, khi nhiễm virus đốm trắng cho tôm bằng cách tiêm vào cơ, sau 12 giờ, cơ quan đầu tiên cho thấy sự có mặt của virus là tim, sau đó là tuyến anten, thực quản, dạ dày, mang và biểu mô dưới vỏ (12-

21 giờ sau khi nhiễm), tiếp đến là mô liên kết, gan (21-24 giờ sau khi tiêm) và cuối cùng là ruột giữa, các cơ quan có nguồn gốc là trung bì như mô tạo máu, lympho Các cơ quan đích của virus đốm trắng là mang, biểu mô, dưới vỏ, thực quản, dạ dày, tuyến anten, cơ quan lympho và mô tạo máu Cũng đã có một số nghiên cứu về đặc trưng bộ gen và hình thái virus gây bệnh đốm trắng phân lập tại các vùng Hà Nội, Long An, Kiên Giang và Cà Mau của Nguyễn Viết Dũng và tập thể [2] và kết quả cho thấy chủng virus có nguồn gốc từ một ổ dịch ở Long An có kích thước 60x350 nm và trình tự vật liệu di truyền vùng OPF75, 94 và 125 rất khác biệt về số lần lặp lại của các tiểu đơn vị so với chủng WSSV phân lập từ Cà Mau, Kiên Giang

Đỗ Thị Thanh Hương và tập thể [25, 26] cũng đã công bố một số kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường và hóa chất đến thay đổi sinh lý, sinh hóa của

tôm sú (Penaeus monodon), tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei) và tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii), và trao đổi chất của các loài tôm này

Nghiên cứu cho thấy ở độ mặn 0‰ và 15‰ khối lượng cơ thể của tôm tăng lên tương ứng là 2,6 và 2,3 lần khối lượng cơ thể tôm ban đầu sau 4 tháng thả nuôi Trong khi các nhóm nuôi ở độ mặn 25‰ tăng trưởng thấp, tỷ lệ tử vong cao và một tần số lột xác thấp hơn đáng kể Kết quả cho thấy tôm càng xanh có thể được nuôi trong nước lợ lên đến 15‰ Trần Thị Tuyết Hoa [100] đã ứng dụng phương pháp PCR-genotyping (ORF94) để phát hiện các chủng WSSV gây bệnh đốm trắng trên tôm sú Tuy nhiên, cho đến nay, cơ chế xâm nhập và nhân lên trong tế bào tôm của WSSV vẫn chưa được hiểu một cách kỹ lưỡng

là kỹ thuật chẩn đoán nhanh, nhạy và có tính đặc hiệu cao Kỹ thuật này đã được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và phát triển, đồng thời đưa ra các cải tiến mới như: Nested PCR, Semi - Nested PCR, Real-time PCR Hiện nay quy trình Nested PCR của Lo và tập thể [63] là được sử dụng phổ biến trong chẩn đoán WSSV Trong quy trình này, các tác giả sử dụng các cặp mồi 146Fl: 5' ACT ACT AAC TTC AGC CTA TCT AG 3' (mồi xuôi), 146Rl: 5' TAA TGC GGG TGT AAT GTT CTT ACG

A 3' (mồi ngược), 146F2: 5' GTA ACT GCC CCT TCC ATC TCC A 3' (mồi xuôi),

và 146R2:5'TACGGCAGCTGCTGCACCTTGT 3' (mồi ngược) Với độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao kết hợp với khả năng phát hiện và định lượng đồng thời, Real-time PCR được xem như một phương pháp rất có ý nghĩa trong việc xác định chính xác mức độ nhiễm mầm bệnh, đặc biệt là bệnh đốm trắng trên tôm Tuy nhiên phương pháp PCR và hóa mô miễn dịch đều là những phương pháp chỉ có thể được thực hiện trong các phòng thí nghiệm được trang bị hiện đại và mất nhiều thời gian do phải trải qua nhiều công đoạn như nghiền, tách DNA từ mẫu, thời gian cho phản ứng PCR (riêng phương pháp hóa mô miễn dịch phải mất tới 3-4 ngày) Nhằm khắc phục nhược điểm của hai phương pháp nói trên, những dạng que thử nhanh WSSV theo nguyên lý của phương pháp miễn dịch đã được ra đời sử dụng kháng thể đơn dòng kháng lại một số protein vỏ như VP19, VP28 để phát hiện sớm virus gây bệnh [87, 94] Với phương pháp mới này, người nuôi tôm có thể tự thực hiện xét nghiệm mầm bệnh WSSV ngay tại nơi chọn mua con giống hoặc kiểm tra mầm bệnh WSSV tại ao nuôi khi tôm có các dấu hiệu bất thường Việc xét nghiệm thực hiện đơn giản

và không đòi hỏi trang thiết bị Mẫu tôm cần xét nghiệm sẽ được nghiền trong một ống nhỏ có chứa dung dịch cần thiết, sau đó một ít dịch nghiền được hút và cho vào một đầu que thử rồi chờ vài phút để xem kết quả Hiện những que thử WSSV dạng này đã có bán ở Việt Nam Tuy vậy, trong thực tế, một số trường hợp sử dụng que thử này có thể cho kết quả dương tính giả

1.2 NGHIÊN CỨU TẠO VACCINE DỰA TRÊN KHÁNG NGUYÊN VỎ WSSV

1.2.1 Một số biện pháp phòng chống WSSV

1.2.1.1 Đáp ứng miễn dịch chống lại WSSV của tôm

Hệ thống miễn dịch của các động vật không xương sống còn khá sơ khai và ít được nghiên cứu Chúng chỉ mới có hệ miễn dịch tự nhiên còn gọi là miễn dịch bẩm sinh [37] Tuy nhiên, có nhiều cơ chế miễn dịch sử dụng bởi động vật không xương sống có khả năng chống lại các tác nhân gây bệnh như: vi khuẩn, nấm và virus Miễn dịch tự nhiên của tôm được kích hoạt khi nhận ra tác nhân gây bệnh liên quan đến mô hình phân tử (PAMPs) thông qua các thụ thể đặc hiệu (PRRS) Bước nhận dạng này trực tiếp hoặc gián tiếp gây nên nhiều cơ chế bảo vệ khác nhau ở tôm một cách phức tạp để loại bỏ các tác nhân gây bệnh [88, 89] Các đáp ứng miễn dịch tế bào bao gồm sự thực bào, hình thành hạch, đóng gói và chết theo chương trình, trong khi phản ứng miễn dịch dịch thể bao gồm hệ thống prophenoloxidase, đông máu, những peptide kháng khuẩn, lectin, Dscam, con đường Toll và IMD [98] Đáp ứng miễn dịch tế bào của động vật không xương sống được thực hiện bởi các tế bào máu (hemocyte) có mặt trong máu (hemolymph) của hệ tuần hoàn mở của tôm Ba loại tế bào máu chính có thể được xác định trong hầu hết các loài giáp xác là các tế bào hyalin, các tế bào dạng bán hạt và các tế bào dạng hạt Mỗi tế bào tham gia các sự kiện khác nhau như sự thực bào, chết theo chương trình, đóng gói

và hình thành hạch, sửa chữa vết thương và đông máu Bên cạnh sự tham gia của nó trong phản ứng của tế bào, các tế bào máu còn cung cấp các peptide kháng khuẩn khác nhau, lectin, chất ức chế proteinase và opsonin hóa như các peroxinectin protein kết dính tế bào [18]

Tác dụng chống virus của hemocyanin là đáp ứng miễn dịch bẩm sinh quan trọng chống lại WSSV do nó có khả năng làm chậm lại sự lây nhiễm và nhân lên của WSSV Tuy nhiên, miễn dịch dịch thể của tôm chủ yếu bao gồm hệ thống hoạt hóa prophenoloxidase (proPO) có vai trò điều khiển quá trình melanin hóa tác nhân gây bệnh và các mô bị xâm hại, sự dính kết, sự thực bào, chết theo chương trình cũng như việc sản sinh các peptide kháng virus, các thành phần gốc tự do oxy hóa

trung gian (ROI) và nitrơ hóa trung gian (RNI) [10, 46, 115] Hình 1.10 là tóm tắt

về hệ miễn dịch của tôm [98]

Hình 1.10: Sơ đồ của hệ thống miễn dịch ở tôm [98]

Sự đáp ứng miễn dịch ở tôm được thực hiện chính bởi các tế bào tạo máu chuyên hóa như thực bào, quá trình phong tỏa và sự sản sinh các peptide kháng khuẩn hay hoạt hóa phenoloxidase Tế bào bạch cầu của giáp xác được chia thành 2 loại: bạch cầu không hạt (hyaline cell) và bạch cầu có hạt (granular cell) Đối với bạch cầu có hạt, trước hết khi bị kích thích bởi β-glucan, quá trình tiêu giảm hạt (degranulation) sẽ xảy ra, từ đó dẫn đến sự phóng thích một số enzyme miễn dịch bao gồm prophenoloxidase (proPO), serine proteinase, peroxinectin (PX), và α2-macroglobulin (α2-M) [19] Tiếp theo, với sự xúc tác của serine proteinase (SP) giống trypsin được biết có vai trò kích hoạt hệ thống proPO (proPO-activating (PPA) không hoạt động chuyển thành phenoloxidase (PO) hoạt động PO là một enzyme chứa ion Cu2+, xúc tác tiếp theo 2 quá trình o-hydroxyl hoá monophenol và oxy hoá diphenol thành quinine Chức năng quan trọng của PO là chuyển hợp chất tyrosine thành dihydroxyphenylalanine (DOPA) cũng như là DOPA-quinone, sau

đó quinone sẽ được trùng hợp thành melanine Trong suốt quá trình melanin hóa, melanin sẽ bao lấy vi khuẩn hay vật lạ và phóng thích ra ngoài lớp vỏ cutin Cơ chế này cũng giống như cơ chế miễn dịch của côn trùng, sắc tố melanin sẽ tích tụ trên

vỏ giáp của giáp xác, đó cũng là bằng chứng của quá trình bị tổn thương

Song song với quá trình melanin hóa, các peptide kháng khuẩn bao gồm crustin, các yếu tố kháng lipopolysaccharide, penaeidin, lectin và lysozyme… cũng được tiết ra bởi bạch cầu có hạt để tiêu diệt mầm bệnh (Hình 1.11) Các nghiên cứu

đã chỉ ra rằng các β-glucan kích thích quá trình melanin hóa và quá trình thực bào thông qua sự nhận biết bởi các protein đặc biệt là PRPs (specific pattern-recognition proteins): LGBP (lipopolysaccharide và β-1,3-glucan-binding protein) và βGBP (β-glucan-binding protein) trên tế bào bạch cầu (Hình 1.11) [3, 52]

Hình 1.11: Cơ chế kích thích miễn dịch không đặc hiệu của tôm khi bị kích

thích bởi β-glucan [3]

Ở tế bào bạch cầu có hạt sẽ xảy ra quá trình melanin hóa để bao lấy tác nhân gây bệnh và phóng thích ra ngoài lớp vỏ cutin; còn ở tế bào bạch cầu không hạt sẽ xảy ra quá trình thực bào Trong quá trình thực bào này sẽ sinh ra các dạng oxy phản ứng bao gồm : gốc superoxide (O2.-), gốc hydroxyl (.OH) và peroxide hydro (H2O2) để tiêu diệt tác nhân gây bệnh, từ đó làm tăng hoạt tính của superoxide dismutase (SOD) nhằm cân bằng chuyển hóa các gốc tự do sang dạng không gây độc cho cơ thể tôm (Hình 1.11) [52] Nhiều nghiên cứu đã cho thấy khả năng làm tăng miễn dịch của tôm thông qua việc tăng hoạt độ của superoxide dismutase khi tôm được kích thích miễn dịch bởi β-glucan và hợp chất polysaccharide chứa lưu huỳnh [96]

Để đánh giá đáp ứng miễn dịch ở tôm, người ta đã đánh giá hoạt độ một số enzyme trong hemolymph có liên quan đến đáp ứng miễn dịch bao gồm phenoloxidase (PO), superoxide dismutase (SOD), hay nitric oxide synthase cảm ứng (iNOS) [34, 86]

1.2.1.2 Các kết quả nghiên cứu về phòng chống WSSV

Vì chưa có một phương pháp nào điều trị hiệu quả bệnh đốm trắng nên về

mă ̣t lâu dài thì chỉ có c ác phương pháp phòng bê ̣nh được phát triển nhằm kiểm soát đươ ̣c di ̣ch bê ̣nh cho từng giai đoa ̣n sinh trư ởng của tôm Thực tế nuôi tôm cho thấy trong giai đoạn ương trứng , viê ̣c thau rửa trứng và ấu trùng nên kết hợp với Iodiphor và dòng nước chảy là một kỹ thuật để loại bỏ sạch WSSV khỏi thế h ệ con sau này Tại những trang trại nuôi tôm , viê ̣c sàng lo ̣c hâ ̣u ấu trùng bi ̣ nhiễm WSSV trước khi cung cấp cho các trang tra ̣i , nên tránh làm vào mùa la ̣nh và nê n sử du ̣ng các phương pháp sinh học để kiểm soát chất lượng nước và hệ thống nuôi Bệnh dịch có thể trở nên trầm trọng hơn bởi các yếu tố như thay đổi độ mặn và nhiệt đột ngô ̣t [55]

Theo nghiên cứu của Jiravanichpaisal và tập thể [48], trong điều kiện thử

nghiệm, tôm càng P leniusculus không bị chết khi cảm nhiễm WSSV ở nhiệt độ 4

và 12oC, nhưng khi tăng nhiệt độ lên (22oC), 100% số tôm này chết sau 12 ngày Đáng chú ý là các loài nhiễm WSSV được giữ ở nhiệt độ 22oC trong vòng 5 ngày,

sau đó chia các mẫu ra nuôi ở nhiệt độ 22oC, 16oC, và 12oC Tỉ lệ chết của tôm càng nhiễm WSSV ở 22oC là 100% sau 3 ngày, còn ở 16oC và 12oC để có 100% tôm bị nhiễm WSSV thì mất tương ứng 20 và 35 ngày Khi ở giai đoạn cấp tính, sự tăng nhiệt độ nước dẫn đến tiến triển bệnh nhanh hơn và gây ra chết tôm nhiễm WSSV [48] Sự thay đổi nhiệt độ như vậy có thể giúp cho người nuôi tôm có thêm thời gian để quản lý thu hoạch khẩn cấp

Việc sử dụng các chế phẩm sinh học có thể giúp tăng cường sức khỏe của tôm bằng cách ngăn cản sự xâm nhập của mầm bệnh và kích thích đáp ứng của hệ thống miễn dịch Một đề xuất khác để tăng cường hệ thống miễn dịch của tôm là sử

dụng β-1,3/1,6-glucan Tôm sú P monodon ở, giai đoạn sau ấu trùng và con trưởng

thành khi được cho ăn thức ăn chứa β-1,3-glucan và được tiếp xúc với WSSV có thể sống đến 120 ngày, còn tất cả tôm đối chứng chết sau 4 ngày [20]

Một số sản phẩm nguồn gốc tự nhiên được thông báo là có khả năng kích thích hệ thống miễn dịch để ngăn cản sự nhiễm virus Một số thực vật có khả năng chống lại virus và chúng đã được sử dụng để điều trị các động vật (trong đó có tôm) nhiễm virus Các nghiên cứu chủ yếu sử dụng dịch chiết thực vật để bảo vệ tôm chống lại sự nhiễm WSSV Trong số các nghiên cứu gần đây, dịch chiết methanol

của 5 loài thực vật có nguồn gốc Ấn Độ (Cỏ gà (Cynodon dactylon), Bầu nâu (Aegle

marmelos), Rễ gió (Tinosporacordifolia), Picrorhiza kurooa và Nhọ nồi (Eclipta alba)) đã được trộn với tỉ lệ bằng nhau làm thức ăn cho tôm bị nhiễm WSSV bằng

cách tiêm thực nghiệm Sau 20 ngày, sự sống của các sinh vật được cung cấp thức

ăn có dịch chiết thực vật có tỉ lệ cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng dùng thức

ăn không có dịch chiết [24] Trong nghiên cứu sàng lọc hoạt tính kháng virus chống lại WSSV, 20 loài thực vật Ấn Độ đã được thử, trong số đó, 5 dịch chiết thực vật

(Bầu nâu (Aegle marmelos), Cỏ gà (Cynodon dactylon), Ngũ sắc (Lantana camara), Mướp đắng (Momordica charantia), Diệp hạ châu (Phyllanthus amarus)) cho hoạt tính chống virus Dịch chiết dạng nước của C dactylon cho thấy hoạt tính kháng

WSSV mạnh nhất do không quan sát được trường hợp chết nào cho đến khi kết thúc thí nghiệm ở ngày thứ 30 [11] Cuối cùng hoạt tính kháng virus của thực vật Ấn Độ

cây Đậu dầu (Pongamia pinnata) chống lại WSSV đã được báo cáo và tỉ lệ sống sót

lên đến 80% sau 15 ngày khi tôm đối chứng chết sau 6 ngày Hơn nữa, 3 phân đoạn sắc ký chính đã thu được từ dịch chiết ethnol của lá cây Đậu dầu đã được trộn vào thức ăn và thí nghiệm với tôm được tiếp xúc với WSSV, được cho ăn 3 bữa/ngày và phân đoạn 2 cho thấy tỉ lệ sống sót hơn 50% sau 6 ngày so với phân đoạn 1 và 3 Phân tích chi tiết phân đoạn 2 xác định hợp chất kháng virus như bis (2-methylheptyl) phthalate [79] Hợp chất này cũng đã phát hiện ở các thực vật khác nhưng trước đó chưa được coi là chất kháng virus

Sự phát triển vaccine giúp phòng bệnh đốm trắng do WSSV hoặc các tác nhân gây bệnh ở tôm không đươ ̣c quan tâm nhiều vì bản thân tôm chưa có hệ thống miễn dịch ghi nhớ Ngoài ra các hiểu biết về bệnh học ở tôm cũng còn hạn chế Tuy nhiên, sự có mặt của đáp ứng miễn dịch chống lại WSSV đã được phát hiện trong

tôm P japonicus Venegas và tập thể [110] đã chứng minh sự tồn tại của đáp ứng gần như miễn dịch ở P japonicus đã bị lây nhiễm WSSV một cách tự nhiên và cả

trong thử nghiệm Trong nghiên cứu này, những con tôm sống sót vượt qua dịch bệnh đốm trắng tự nhiên được tái cảm nhiễm với WSSV sau 4 tháng và kết quả là tỷ

lệ sống sót lên đến khoảng 94% [110] Trong nghiên cứu theo sau đó, những con tôm sống sót khi thử nghiệm với WSSV có khả năng kháng lại WSSV khi tái lây nhiễm ở tuần thứ 3 và thứ 4, khả năng đề kháng tiếp tục tăng lên đến tháng thứ hai

Từ những kết quả đó, người ta cho rằng các nhân tố trung hòa có mặt trong huyết thanh của những con tôm sống sót tham gia vào khả năng đề kháng chống lại WSSV [119] Những kết quả này cũng thúc đẩy các nhà khoa học nghiên cứu về khả năng tạo vaccine giúp tôm chống lại WSSV [110], mặc dầu cũng có những ý kiến không đồng tình về viê ̣c sử du ̣ng thuâ ̣t ngữ “vaccine” cho tôm khi mà chúng không có khả năng sinh ra kháng thể kháng la ̣i tác nhân gây bê ̣nh Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy sự kháng virus được phát triển bởi các sinh vật sống sót là do một thành phần trung hòa WSSV ở trong plasma của tôm [119] và cho rằng đáp ứng miễn dịch thích nghi có thể tồn tại ở tôm Tuy nhiên, bản chất của các nhân tố như thế này cần phải được điều tra thêm