ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Phạm Kiên Cường NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA VIRUS G
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Phạm Kiên Cường
NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ
Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA
VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
Trang 2ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Phạm Kiên Cường
NHÂN DÕNG VÀ BIỂU HIỆN TRÊN BỀ MẶT BÀO TỬ
Bacillus subtilis GEN MÃ HÓA KHÁNG NGUYÊN VP28 CỦA
VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM
Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 01 16
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1 GS.TS Phan Tuấn Nghĩa
2 PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh
Trang 3LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu mà tôi đã th ực hiện dưới sự hướng dẫn của GS.TS Phan Tuấn Nghĩa và PGS.TS Nguyễn Thị Vân Anh Các số liê ̣u, kết quả nêu trong luâ ̣n án là trung thực và chư a từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác
NCS Phạm Kiên Cường
Trang 4LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến GS.TS
dắt, hướng dẫn, động viên khích lệ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình làm luận án nghiên cứu sinh
Tôi xin chân thành cảm ơn đến toàn thể quý thầy, cô trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu
Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi của Cấp ủy thủ trưởng Viện Công nghệ mới, Viện Khoa học và Công nghệ Quân
sự, các anh chị bạn bè đồng nghiệp trong Viện Công nghệ mới, các thành viên trong nhóm nghiên cứu Phòng Protein tái tổ hợp và Phòng Sinh học nano và ứng dụng, thuộc Phòng Thí nghi ệm trọng điểm Công nghê ̣ Enzym
và Protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên
Tôi xin gửi lời cảm ơn đ ến Ban Giám hiệu, Phòng Sau Đại học , Ban Chủ
nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiê ̣n cho tôi h ọc tập, hoàn thành các thủ tục cần thiết của một nghiên cứu sinh
Tôi xin chân thành cám ơn đến TS Đặng Thị Lụa, Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản I và TS Trần Thị Tuyết Hoa, Khoa Thủy sản Trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ, cung cấp và chia sẻ thông tin trong quá trình thử ng hiê ̣m ứng dụng thực tế sản phẩm của đề tài luận án
Luận án đã được thực hiện với sự tài trợ kinh phí của đề tài thuộc chương trình Trọng điểm cấp nhà nước do Bộ Khoa học và Công nghệ tài trợ, mã số KC.04.09/11-15 và bản thân tôi cũng đã được hỗ trợ kính phí làm thực nghiệm với
tư cách là một nghiên cứu sinh của đề tài
Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn tới bố, mẹ, vợ, con, gia đình, những người đã luôn bên tôi, cổ vũ, động viên và tạo điều kiê ̣n thuận lợi nhất cho tôi có thời
NCS Phạm Kiên Cường
Trang 5MỤC LỤC
Trang MỤC LỤC 1 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT 3 DANH MỤC BẢNG 8 DANH MỤC HÌNH Error! Bookmark not defined
MỞ ĐẦU Error! Bookmark not defined CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU Error! Bookmark not defined 1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS GÂY BỆNH ĐỐM TRẮNG Ở TÔM Error!
Bookmark not defined
1.1.1 Vị trí phân loại của virus gây bệnh đốm trắng ở tômError! Bookmark not
defined
1.1.2 Cấu trúc của WSSV Error! Bookmark not defined 1.1.3 Hệ gen của WSSV Error! Bookmark not defined 1.1.4 Bệnh đốm trắng do WSSV gây ra ở tôm Error! Bookmark not defined 1.1.5 Chẩn đoán WSSV Error! Bookmark not defined
1.2 NGHIÊN CỨU TẠO VACCINE DỰA TRÊN KHÁNG NGUYÊN VỎ WSSV
Error! Bookmark not defined 1.2.1 Một số biện pháp phòng chống WSSV Error! Bookmark not defined 1.2.2 Protein VP28 và nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSVError! Bookmark not
defined
1.2.3 Các protein bề mặt khác và nghiên cứu tạo vaccine phòng WSSV Error!
Bookmark not defined
1.3 BÀO TỬ B subtilis VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN NGOẠI LAI TRÊN BỀ MẶT
BÀO TỬ TRONG NGHIÊN CỨU TẠO VACCINEError! Bookmark not defined
1.3.1 Bào tử B subtilis và đặc tính hình thành bào tửError! Bookmark not defined
Trang 61.3.3 Biểu hiện protein ngoại lai trên bề mặt bào tử Error! Bookmark not defined 2.1 NGUYÊN LIỆU Error! Bookmark not defined 2.1.1 Mẫu tôm thử nghiệm Error! Bookmark not defined 2.1.2 Các hoá chất và nguyên vật liệu Error! Bookmark not defined 2.2 MÁY MÓC VÀ TRANG THIẾT BỊ Error! Bookmark not defined 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.3.1 Thu nhận virus gây bệnh đốm trắng từ mẫu tôm nhiễm bệnh Error!
Bookmark not defined
2.3.2 Nuôi cấy tạo bào tử B subtilis Error! Bookmark not defined
2.3.3 Tách chiết, định lượng DNA Error! Bookmark not defined
2.3.4 Nhân dòng, biểu hiện VP28 trong E coli và B subtilisError! Bookmark not
defined
2.3.5 Phát hiện, định lượng và tinh sạch VP28 Error! Bookmark not defined
2.3.6 Thử nghiệm khả năng phòng WSSV của bào tử B subtilis tái tổ hợp Error!
Bookmark not defined
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Error! Bookmark not defined
3.1 NHÂN DÕNG, XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ VÀ MỘT SỐ ĐẶC TRƯNG CỦA
GEN vp28 TỪ CÁC MẪU WSSV THU NHẬN Ở VIỆT NAMError! Bookmark
not defined
3.1.1 Nhân bản đoa ̣n gen mã hóa VP28 bằng PCR Error! Bookmark not defined
3.1.2 Nhân dòng gen mã hóa VP28 vào vector pGEM-TError! Bookmark not
defined
3.1.3 Xác định trình tự và nghiên cứu tính đa hình của gen mã hóa VP28 Error!
Bookmark not defined
3.2 NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA VP28Error! Bookmark not
defined
3.2.1 Biểu hiện VP28 bằng hệ thống vector pET28b trong E coli Error!
Bookmark not defined
Trang 73.2.2 Biểu hiện VP28 dạng dung hợp với protein CotB trên bề mặt bào tử B
subtilis Error! Bookmark not defined
3.3 KHẢ NĂNG PHÕNG BỆNH ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM THẺ CHÂN
TRẮNG CỦA BÀO TỬ B subtilis BIỂU HIỆN VP28 TRÊN BỀ MẶT Error!
Bookmark not defined
3.3.1 Sự tồn tại của bào tử B subtilis biểu hiện VP28 trong ruột tôm thẻ chân trắng
Error! Bookmark not defined
3.3.2 Khả năng kích thích miễn dịch trên tôm thẻ chân trắng của bào tử B subtilis
biểu hiện VP28 Error! Bookmark not defined 3.3.3 Đánh giá khả năng bảo hộ trên tôm thẻ chân trắng của bào tử tái tổ hợpError!
Bookmark not defined
KẾT LUẬN Error! Bookmark not defined KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined
DANH MỤC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN ĐẾN
LUẬN ÁN Error! Bookmark not defined
TÀI LIỆU THAM KHẢO 9
Trang 8DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
BSA Albumin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin)
Cm Chloramphenicol
dNTP Deoxyribonucleoside triphosphate
DSM Môi trường tạo bào tử Difco (Difco Sporulation medium)
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid
GST Glutathione S-transferase
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
kDa Kilodalton
LB Luria Bertani
NBT p- nitro blue tetrazolium chloride
PAGE Điện di gel polyacrylaminde (Polyarylamide Gel Electrophoresis) PBS Muối chứa đệm phosphate (Phosphate Buffered Saline)
PCR Phản ứng chuỗi polymerase (Polymerase Chain Reaction)
PVDF Polyvinylidere Fluoride
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
GST Glutathione S-transferase
TSA Tryptic Soy Agar
TTFC Phân đoạn đầu C của độc tố uốn ván (C- terminal fragment of the
tetanus toxin) WSSV Virus gây bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Virus)
Trang 9DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Tên gọi của virus gây bệnh đốm trắng qua từng giai đoạn Error!
Bookmark not defined
Bảng 1.2: Các gen mã hóa protein cấu trúc của WSSV Error! Bookmark not
Bảng 2.1: Trình tự các cặp mồi sử du ̣ng trong nghiên cứu nhân bản và biểu hiê ̣n gen
vp28 Error! Bookmark not defined
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR Error! Bookmark not defined Bảng 2.3: Thành phần phản ứng Real-time PCR Error! Bookmark not defined Bảng 2.4: Thành phần gel cô và gel tách acrylamide trong SDS-PAGE Error!
Bookmark not defined
Bảng 3 1: Các mẫu tôm nhiễm WSSV thu nhận từ các địa điểm khác nhau Error!
Bookmark not defined
Bảng 3.2: Một số sai khác về trình tự nucleotide và acid amin của VP28 thu nhận tại
Việt Nam so với trình tự đã công bố (AY168644) Error! Bookmark not defined
Bảng 3.3: Sự hình thành sinh khối bào tử B subtilis tái tổ hợp trên một số môi
trường khác nhau Error! Bookmark not defined
Bảng 3.4: Sự hình thành bào tử tái tổ hợp trên môi trường DSM ở các thời gian
khác nhau Error! Bookmark not defined
Bảng 3.5: Độ sống vi khuẩn ở mẫu thức ăn trộn bào tử B subtilis biểu hiện VP28
Error! Bookmark not defined Bảng 3.6: Số copy trong từng dung dịch WSSV Error! Bookmark not defined
Trang 10
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I Tiếng Việt
1 Đoàn Văn Cường, Phạm Thị Tuyết Anh, Ngô Xuân Tuyến, Nguyễn Văn Hảo (2007), "Xác định quá trình phát sinh bệnh của virus gây hội chứng đốm trắng",
Tuyển tập nghề các sông Cửu Long, pp 265-278
2 Nguyễn Viết Dũng, Ngô Xuân Tuyến, Phạm Võ Ngọc Ánh , Trương Hồng Việt, Nguyễn Văn Hảo (2007), "Đặc trưng bộ gen và hình thái của virus gây hội
chứng đốm trắng trên tôm sú nuôi Penaeus monodon phân lập tại Việt Nam",
Tạp chí Viện nghiên cứu nuôi trông thủy sản II, pp 222- 230
3.Huỳnh Trường Giang, Vũ Ngọc Öt, Trương Quốc Phú (2011), "Sử dụng chiết suất
β-Glucan từ rong biển để tăng sức đề kháng của tôm biển: Tổng quan", Kỷ yếu
Hội nghị Khoa học thủy sản lần 4, pp 103-113
4 Nguyễn Văn Hảo, Lâm Trâm Anh, Phạm Thị Tuyết Anh, Đoàn Văn Cường, Ngô Xuân Tiến, Nguyễn Thị Hiền (2007), "Xây Dựng mô hình gây bệnh thực
nghiệm chuẩn đối với bệnh đốm trắng trên tôm sú Penaeus monodon", Tuyển
tập nghề các sông Cửu Long, pp 257-264
5 Trần Thị Minh Tâm (1999), "Bệnh thường gặp ở tôm phương pháp chẩn đoán và
phòng trị" Nhà xuất bản Nông nghiệp 126 trang
6 Bùi Quang Tề (2003), Bệnh của tôm nuôi và biện pháp phòng trị, Nhà xuất bản
Nông Nghiệp, Thành Phố Hồ Chí Minh 184 trang
7 Đỗ Thị Thảo; Đỗ Thị Phương; Đỗ Khắc Hiếu; Hà Thị Thu; Đinh Thương Vân; Đinh duy Kháng; Lê Trần Bình (2008), "Tạo dòng tế bào lai sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 của virus gây bệnh đốm trắng trên
tôm sú", Tạp chí Công nghệ Sinh học 2, 203-208
8 Tổng cục thủy sản (2010), Báo cáo về thành tựu thủy sản năm 2010 và phương
hướng hoạt động năm 2011, Hà Nội 23 trang
9 Phan Thị Phượng Trang, Nguyễn Đức Hoàng, Trần Linh Thước (2003),
"Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ VP28 của virus gây hội
Trang 11chứng đốm trắng WSSV trên sú trong E coli", Tạp chí Công nghệ Sinh
học 1, pp 47-55
II Tiếng Anh
10 Amparyup P., Charoensapsri W., Tassanakajon A (2009), "Two prophenoloxidases are important for the survival of Vibrio harveyi challenged
shrimp Penaeus monodon", Developmental and Comparative Immunology 33,
pp 247-256
11 Balasubramanian G., Sarathi M., Venkatesan C., Thomas J., Sahul-Hameed A
S (2008), "Oral administration of antiviral plant extract of Cynodon dactylon
on a large scale production against white spot syndrome virus (WSSV) in
Penaeus monodon", Aquaculture 279, pp 2–5
12 Bradford (1976) "A dye binding assay for protein" Analytical Biochemistry 72,
pp 248-254
13 Braunig P., Rosa R D D., Caroline C H S H., Borsa M., Stoco P H., Edmundo E C C G., Pinto A R (2011), "Molecular cloning and recombinant expression of the VP28 carboxyl-terminal hydrophilic region from a brazilian
white spot syndrome virus isolate", Brazilian Archives of Biology and
15 Cai S., Huang J., Wang C., Song X., Sun X., Yu J (1995), "Epidemiological
studies on explosive epidemic disease of prawn 1994-1994", Journal of
Fisheries China 19, pp 112-117
16 Caipang C M., Verjan N., Ooi E L., Kondo H., Hirono I., Aoki T., Kiyono H.,
Yuki Y (2008), "Enhanced survival of shrimp, Penaeus (Marsupenaeus)
japonicus from white spot syndrome disease after oral administration of
Trang 12recombinant VP28 expressed in Brevibacillus brevis", Fish and Shellfish
18 Cerenius L., Lee B L., Soderhall K (2008), "The proPO-system: pros
and cons for its role in invertebrate immunity", Trends in Immunology
29, pp 263-271
19 Cerenius L., Soderhall K (2004), "The prophenoloxidase-activating system in
invertebrates", Immunological Reviews 198, pp 116-126
20 Chang C F., Su M S., Chen H Y., Lo C F., Kou G H., Liao I C (1999),
"Effect of dietary b-1,3-glucan on resistance to white spot syndrome virus
(WSSV) in postlarval and juvenile Penaeus monodon", Diseases of Aquatic
Organisms 36, pp 163–168
21 Chang Y S., Liu W J., Lee C C., Chou T L., Lee Y T., Wu T S., Huang J Y., Huang W T., Lee T L., Kou G H., Wang A H., Lo C F (2010), "A 3D model of the membrane protein complex formed by the white spot syndrome
virus structural proteins", PloS One 5, pp 10718-10728
22 Chazal N., Gerlier D (2003), "Virus entry, assembly, budding, and membrane
rafts", Microbiology and Molecular Miology Reviews 67, pp 226-237
23 Chen L L., Leu J H., Huang C J., Chou C M., Chen S M., Wang C H., Lo C F., Kou G H (2002), "Identification of a nucleocapsid protein (VP35) gene of shrimp white spot syndrome virus and characterization of the motif important
for targeting VP35 to the nuclei of transfected insect cells", Virology 293, pp
44-53
24 Citarasu T., Sivaram V., Immanuel G., Rout N., Murugan V (2006), "Influence
of selected Indian immunostimulant herbs against white spot syndrome virus
Trang 13haematological, biochemical and immunological changes", Fish and Shellfish
Immunology 21, pp 372-384
25 Do T T H., Jasmani S., Jayasankar V., Wilder M (2010), "Na/K-ATPase
activity and osmo-ionic regulation in adult whiteleg shrimp Litopenaeus
vannamei exposed to low salinities", Aquaculture 304, pp 88-94
26 Do T T H., Wang T., Bayley M., Phuong T N (2010), "Osmoregulation,
growth and moulting cycles of the giant freshwater prawn (Macrobrachium
rosenbergii) at different salinities", Aquaculture 41, pp 135-143
27 Driks A (1999), "Bacillus subtilis spore coat", Microbiology and Molecular
Biology Reviews 63, pp 1-20
28 Duc L H., Cutting S M (2003), "Bacterial spores as heat stable vaccine
vehicles", Expert Opinion on Biological Therapy 3, pp 1263-1270
29 Durand D., Lightner D V., Nunan L M., Redman R M., Mari J., Bonami J R (1996), "Application of gene probes as diagnostic tools for White Spot
Baculovirus (WSBV) of Penaeid shrimp", Diseases of Aquatic Organisms 27,
pp 59–66
30 Durand S., Lightner D V., Redman R M., J.R J R B (1997), "Ultrastructure
and morphogenesis of white spot syndrome baculovirus (WSSV)", Diseases of
32 Flegel T W (1997), "Major viral diseases of the black tiger prawn (Penaeus
monodon) in Thailand", World Journal of Microbiology and Biotechnology 13,
pp 433–442
34 Fu L L., Shuai J B., Xu Z R., Li J R., Li W F (2010), "Immune responses of