Nghiên cứu tạo dòng, biểu hiện và thu nhận hIGF 1 (human insulin like growth factor 1) từ escherichia coli

hIGF-1 có vai trò kích thích sự tăng trưởng và phát triển của hầu hết các loại tế bào trong cơ thể đặc biệt là các tế bào cơ - xương, tế bào gan, tế bào thần kinh, tế bào da, tế bào tạo

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

DƯƠNG LONG DUY

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG, BIỂU HIỆN VÀ THU NHẬN hIGF-1 (HUMAN INSULIN LIKE

GROWTH FACTOR 1) TÁI TỔ HỢP TỪ E coli

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐẶNG THỊ PHƯƠNG THẢO

Thành Phố Hồ Chí Minh – Năm 2012

Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến GS.TS Trần

Linh Thước, người thầy đã luôn tạo điều kiện tốt nhất cho em học tập và hoàn thành luận văn này

Em chân thành cảm ơn TS Đặng Thị Phương Thảo, cô là người đã luôn

động viên, quan tâm giúp đỡ và định hướng cho em trong suốt quá trình nghiên cứu cũng như trong cuộc sống

Chân thành cảm ơn chị Phương Hiếu và anh Văn Đức đã dìu dắt em trong những ngày đầu bước chân vào lab A

Xin cảm ơn chị Kim Hằng và chị Mỹ Trinh đã chỉ bảo và giúp đỡ em rất nhiều trong thời gian vừa qua

Cảm ơn tất cả các anh chị và các bạn ở BM CNSH Phân tử & Môi trường, PTN CNSH Phân Tử A đã luôn bên mình, cùng chia sẻ những niềm vui, nỗi buồn trong những ngày tháng làm việc tại Lab A

Và trên hết, con xin cảm ơn mẹ và anh chị đã luôn quan tâm, chăm sóc và tạo mọi điều kiện cho việc học của con Gia đình sẽ mãi là niềm tự hào, là động lực

để con vươn tới thành công

Một lần nữa, xin cảm ơn tất cả mọi người!

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9/2012

Dương Long Duy

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH ii

LỜI MỞ ĐẦU 1

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Nhân tố tăng trưởng hIGF-1 4

1.1.1 Giới thiệu 4

1.1.2 Đặc điểm gene mã hóa và cấu trúc phân tử protein hIGF-1 4

1.1.3 Đặc điểm hoạt động của hIGF-1 5

1.1.4 Chức năng của hIGF-1 trong cơ thể sống 7

1.1.5 Các hướng ứng dụng hIGF-1 8

1.1.5.1 Điều trị bệnh IGFD 8

1.1.5.2 Điều trị một số bệnh khác 9

1.1.5.3 Ứng dụng khác của hIGF-1 10

1.1.6 Tình hình nghiên cứu sản xuất hIGF-1 trên thế giới và ở Việt Nam 11

1.2 Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp trên Escherichia coli 13

1.3 Tái gấp cuộn in vitro protein thu nhận từ thể vùi biểu hiện trong tế bào E coli 14

1.4 Tinh chế thu nhận protein tái tổ hợp 17

1.5 Thử nghiệm hoạt tính sinh học hIGF-1 in vitro 18

PHẦN II: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP 21

2.1 Vật liệu 22

2.1.1 Dụng cụ và thiết bị 22

2.1.2 Hóa chất và môi trường 23

2.1.3 Nguyên vật liệu 28

2.2 Phương pháp 30

2.2.1 Thu nhận gene higf-1 từ phIGF1 bằng phản ứng PCR 32

2.2.2 Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b 34

2.2.3 Tạo dòng tế bào E coli DH5α mang vector tái tổ hợp pET22b-higf1 37

2.2.4 Tạo dòng tế bào E coli Origami(DE3) mang vector pET22b-higf1 40

2.2.5 Cảm ứng biểu hiện protein hIGF-1 ở E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 40

2.2.6 Tinh chế thu nhận hIGF-1 44

2.2.7 Kiểm tra hoạt tính protein hIGF-1 thu nhận được 45

PHẦN III: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 43

3.1 Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b 48

3.1.1 Thu nhận gene higf-1 và chuẩn bị vector pET-22b 49

3.1.2 Tạo dòng E coli DH5α mang vector tái tổ hợp pET22b-higf1 50

3.2 Tạo dòng tế bào E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 55

3.3 Cảm ứng biểu hiện protein hIGF-1 57

3.3.1 Phân tích sự biểu hiện protein hIGF-1 trong tế bào chất E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 bằng Tricine SDS-PAGE 57

3.3.2 Khẳng định sự biểu hiện hIGF-1 bằng Western blot .58

3.4 Tinh chế thu nhận và kiểm tra hoạt tính protein hIGF-1 .59

PHẦN IV: KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ 64

1 Kết luận 65

2 Đề nghị 65

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66

PHỤ LỤC 70

DNA Deoxyribose Nucleic Acid

dH2O distilled water (nước cất)

dNTP deoxyNucleotide TriPhosphate

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylene Diamine TetraAcetic acid

EMEA European Medicines Agency

FDA Food and Drug Administration

FPLC Fast Performance Liquid Chromatography

IPTG IsoPropyl-β-D-Thio-Galactoside

hIGF-1 human Insulin-like Growth Factor

IGFBP Insulin-Like Growth Factor Binding Protein

LB Môi trường Luria-Bertani

MCS Multiple Cloning Site

PBST Phosphate Buffered Saline Tween

PCR Polymerase Chain Reaction

RNA Ribose Nucleic Acid

RNase Enzyme thuỷ giải RNA

SDS Sodium Dodecyl Sulphate

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate–Polyacrylamide Gel

Electrophoresis

DANH MỤC CÁC BẢNG VÀ HÌNH

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Kết quả đo nồng độ plasmid pET-22b 50

Bảng 3.2 Lượng hIGF-1 trong các phân đoạn tinh chế 62

DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phân tử của hIGF-1 5

Hình 1.2 Các con đường truyền tín hiệu trong tế bào được kích hoạt bởi hIGF-1 6

Hình 1.3 Một số sản phẩm rhIGF-1 trên thị trường 12

Hình 1.4 Các phương pháp sắc ký được sử dụng để tinh chế protein 17

Hình 1.5 Nguyên tắc chung của phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro 18

Hình 2.1 Cấu trúc plasmid pET-22b 28

Hình 2.2 Thang chuẩn protein và DNA 29

Hình 2.3 Chương trình PCR 33

Hình 3.1 Quy trình tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b 48

Hình 3.2 Thu nhận gene higf-1 49

Hình 3.3 Kết quả biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E coli DH5α 51

Hình 3.4 Kết quả kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 52

Hình 3.5 Sơ đồ vị trí chèn gene higf-1 và vị trí bắt cặp của các mồi trên vector pET22b-higf1 53

Hình 3.6 Kết quả kiểm tra plasmid pET22b-higf1 bằng phản ứng PCR với cặp mồi T7 pro/T7 ter và cặp mồi 5’-NdeI-higf1 /T7 ter 54

Hình 3.7 Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 vào tế bào E coli Origami(DE3) 56

Hình 3.8 Kết quả PCR khuẩn lạc E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1 với cặp mồi T7 pro/T7 ter 56

Hình 3.9 Kết quả kiểm tra sự biểu hiện protein hIGF-1 bằng điện di Tricine-SDS-PAGE 58

Hình 3.11 Sắc ký đồ tinh chế thu nhận hIGF-1 bằng sắc ký trao đổi cation 60 Hình 3.12 Kết quả phân tích Tricine SDS-PAGE các phân đoạn protein thu nhận

từ quá trình tinh chế sắc ký trao đổi cation 61

Hình 3.13 Kết quả phân tích độ tinh sạch của mẫu trước và sau tinh chế bằng

phần mềm Quantity One (Biorad, Hoa Kỳ) 62

Hình 3.14 Ảnh hưởng của hIGF-1 sau tinh chế lên khả năng tăng sinh của dòng tế

bào MCF-7 63

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Lời mở đầu

LỜI MỞ ĐẦU

hIGF-1 hay còn gọi là somatomedin C là một protein hormone được tạo ra chủ yếu ở gan nhờ sự kích thích của hormone tăng trưởng GH (Growth Hormone) hIGF-1 có vai trò kích thích sự tăng trưởng và phát triển của hầu hết các loại tế bào trong cơ thể đặc biệt là các tế bào cơ - xương, tế bào gan, tế bào thần kinh, tế bào

da, tế bào tạo máu … Bên cạnh đó hIGF-1 còn giúp cân bằng các chu trình chuyển hoá protein, lipid, carbohydrate cùng nhiều loại hormone và các hợp chất sinh học khác Sự thiếu hụt hIGF-1 ở trẻ gây ra bệnh IGFD (Insulin-like growth factor 1 deficiency) Trẻ bị mắc bệnh IGFD bị lùn hơn so với trẻ bình thường và phát triển không cân đối trong khi lượng GH bình thường Nguyên nhân có thể là do đột biến gene mã hóa cho hIGF-1 hoặc thụ thể của GH không đáp ứng được với GH…Do đó

để đảm bảo cho trẻ thiếu hụt hIGF-1 có khả năng phát triển bình thường thì việc phục hồi lượng hIGF-1 trong máu về mức bình thường là hết sức cần thiết Hiện nay không có phương thuốc chữa trị hiệu quả cho những bệnh nhân mắc bệnh IGFD

ở giai đoạn muộn, cách tốt nhất để chữa trị IGFD là phát hiện sớm bệnh nhân mắc bệnh và tiêm bổ sung đủ lượng hIGF-1 cần thiết bằng cách sử dụng rhIGF-1 Vào năm 2005 các sản phẩm hIGF-1 tái tổ hợp gồm Increlex (Tercia) và Iplex (Insmed)

đã được FDA (Food & Drug Administration – Cơ quan Quản lý thuốc và thực phẩm, Hoa Kỳ) chấp nhận sử dụng là thuốc để điều trị trẻ bị lùn do thiếu hụt hIGF-

1 Trong những năm qua các cơ quan có chức năng đã cho phép trẻ em có tầm vóc nhỏ, lùn được điều trị với rhIGF-1 ngày càng tăng lên

Một số nghiên cứu gần đây cho thấy hIGF-1 có tác dụng tích cực trong việc điều trị một số bệnh thần kinh, suy tim, tổn thương do bỏng, bệnh xơ cứng cột bên teo cơ, đái tháo đường loại 1, 2 và làm giảm lượng mỡ trong cơ thể hIGF-1 còn được sử dụng trong công nghệ mỹ phẩm làm đẹp da và sử dụng cho các vận động viên thể dục thể thao để tăng lượng cơ bắp cũng như tăng cường các quá trình đồng hóa giúp tăng cường thể lực Ngoài ra, đang có rất nhiều nghiên cứu đang được tiến hành để làm rõ hơn vai trò và khả năng ứng dụng của hIGF-1

Luận văn Thạc sĩ Sinh học Lời mở đầu

Tại Việt Nam các sản phẩm hIGF-1 chủ yếu được nhập về từ nước ngoài với giá thành cao Việc nghiên cứu tìm ra một quy trình sản xuất protein với hiệu suất cao, đơn giản và rẻ tiền nhằm sản xuất sản lượng lớn hIGF-1 giá rẻ phục vụ cho việc điều trị bệnh cũng như phục vụ các nghiên cứu ứng dụng trong nước là hết sức cần thiết Do đó, Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử và Môi trường, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh đã tiến hành nghiên cứu sản xuất protein hIGF-1 bằng công nghệ DNA tái tổ hợp Trong khuôn khổ chương trình nghiên cứu, luận văn này được thực hiện nhằm: “Nghiên cứu tạo dòng, biểu hiện và thu nhận hIGF-1 (human insulin-like growth factor 1) từ

Escherichia coli” Luận văn bao gồm các nội dung chính như sau:

1 Tạo dòng gene higf-1 vào plasmid pET-22b

2 Tạo chủng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1

3 Tạo chủng tế bào E coli Origami(DE3) mang vector tái tổ hợp

pET22b-higf1

4 Cảm ứng biểu hiện và thu nhận thể vùi có chứa hIGF-1 từ chủng E coli Origami(DE3)/pET22b-higf1

5 Hòa tan thể vùi và tái gấp cuộn hIGF-1

6 Tinh chế thu nhận hIGF-1 sau khi tái gấp cuộn

7 Kiểm tra hoạt tính hIGF-1 thu nhận được

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Nhân tố tăng trưởng hIGF-1 (human Insulin-like growth factor 1)

1.1.1 Giới thiệu

Trong quá trình tăng trưởng và phát triển của cơ thể từ giai đoạn thai nhi đến lúc trưởng thành luôn chịu sự chi phối của nhiều loại hormone khác nhau Trong đó đóng vai trò quan trọng nhất là nhóm các hormone điều hòa tăng trưởng bao gồm GHRH, GH, IGF-1,…Các hormone điều hòa tăng trưởng có vai trò quan trọng và quyết định đối với giai đoạn phát triển từ trẻ nhỏ sang giai đoạn trưởng thành thông qua việc kích thích thúc đẩy quá trình trao đổi chất, tăng cường các quá trình tổng hợp đặc biệt là tổng hợp hệ cơ-xương; đồng thời kiểm soát quá trình tăng trưởng ở một giới hạn nhất định để tạo ra một cơ thể phát triển cân đối hài hòa Một trong những nhóm hormone điều hòa tăng trưởng quan trọng đó là nhóm hormone tăng trưởng insulin-like growth factors (IGFs)

IGFs là họ protein hormone có trình tự amino acid tương đồng với proinsulin khoảng 50% bao gồm IGF-1 và IGF-2 (hay còn gọi là somatomedin C và somatomedin A) [9] Trình tự amino acid của IGF-1 và IGF-2 có độ tương đồng khoảng 70% và có độ bảo tồn cao giữa các loài [16] IGFs có vai trò kích thích tăng sinh hầu hết các loại tế bào, tham gia vào các quá trình trao đổi chất quan trọng của

cơ thể [2, 16-17] IGF-2 có vai trò kích thích tăng sinh và phát triển cơ thể chủ yếu

ở giai đoạn thai nhi trong khi đó IGF-1 lại có vai trò kích thích thúc đẩy sự tăng trưởng ở trẻ mới lớn và tham gia vào các quá trình biến dưỡng ở người trưởng thành [16] Vì IGF-2 có vai trò chủ yếu trong giai đoạn thai nhi và ít có vai trò quan trọng trong giai đoạn trưởng thành nên nhiều nghiên cứu chỉ tập trung chủ yếu vào IGF-1 Cho đến nay, vai trò và chức năng IGF-1 ngày càng được làm sáng tỏ, nhiều nghiên cứu ứng dụng IGF-1 đã và đang mang lại hiệu quả trong trị liệu và nhiều ứng dụng quan trọng khác [1, 15]

1.1.2 Đặc điểm gene mã hóa và cấu trúc phân tử protein hIGF-1

Protein hIGF-1 được mã hóa bởi gene dài 90kb, gồm 6 đoạn exon nằm trên cánh dài của NST số 12 [13] Gene này được biểu hiện ở nhiều mô trưởng thành, nhưng chủ yếu ở gan Sự biểu hiện hIGF-1 được điều hòa bởi hormone tăng trưởng

GH, insulin và điều kiện dinh dưỡng [2, 7]

Phân tử hIGF-1 chỉ có một chuỗi polypeptide dài 70 amino acid với 3 cầu nối disulfide nội phân tử ở các vị trí Cys6-Cys48, Cys18-Cys61 và Cys47-Cys52 Trọng lượng phân tử 7649 Da, với bốn vùng chức năng A, B, C và D Trong đó vùng A, B và C tương đồng với vùng A, B và C trên phân tử proinsulin [9] Không giống như phân tử insulin, vùng C của hIGF-1 không được loại bỏ mà còn tham gia một phần vào vùng cấu trúc hoạt động [9]

Cấu trúc hIGF-1 có 3 xoắn alpha, trong đó xoắn alpha Gly8-Cys18 thuộc vùng chức năng B, xoắn alpha Ile43-Cys47 và Leu54-Glu58 đều thuộc trong vùng chức năng A Hai vùng chức năng A và B liên kết với nhau bởi ba cầu nối disulfide, có vai trò nhận diện thụ thể IGF1R (insulin-like growth factor 1 receptor) [9]

Hình 1.1 (A): Cấu trúc phân tử hIGF-1 (B): Cấu trúc không gian ba chiều

của hIGF1, các vùng chức năng được phân biệt bằng màu sắc; Đỏ: vùng B; xanh: vùng C; cam: vùng A; vàng: vùng D [2, 9]

1.1.3 Đặc điểm hoạt động của hIGF-1

Trong quá trình phát triển bình thường của cơ thể, tuyến yên được kích thích sản xuất GH, GH tác động lên các tế bào gan tổng hợp hIGF-1 và đi vào máu đến các mô đích để thực hiện chức năng [2] hIGF-1 được sản xuất mạnh ở giai đoạn trẻ mới lớn và dậy thì, giảm dần khi về già Trong máu, hIGF-1 chủ yếu tồn tại dưới dạng liên kết với 6 loại protein chuyên biệt IGFBPs (insulin-like growth factor binding protein) (IGFBP1-6), trong đó IGFBP-3 chiếm tỉ lệ cao nhất Có đến trên 90% hIGF1 tạo thành phức hợp với IGFBP-3 và tiểu đơn vị ALS (acid labile subunit), một peptide với trọng lượng phân tử 85 kDa, được sản xuất ở gan [16] Sự

liên kết của 3 thành phần trên tạo thành một cấu trúc ổn định giúp kéo dài thời gian tồn tại hIGF-1 trong cơ thể đồng thời bất hoạt chức năng của hIGF-1 nhằm ngăn chặn tác dụng hạ đường huyết không mong muốn [16] hIGF-1 chỉ hoạt động khi tồn tại dưới dạng tự do, khi đến cơ quan đích, dưới tác động của một số nhân tố, quá trình ly giải phức hợp IGFBP-ALS-hIGF-1 xảy ra và phóng thích hIGF-1 để liên kết với thụ thể IGF1R trên bề mặt tế bào đích và thực hiện chức năng [7, 10] Giống như hIGF-1, IGFBPs cũng được tổng hợp phần lớn ở gan và ở một số mô, cơ quan khác Trong một số trường hợp nhất định, các IGFBPs còn có khả năng tác động hỗ trợ hIGF-1 gắn lên thụ thể IGF1R [9]

Hình 1.2 Các con đường truyền tín hiệu trong tế bào được kích hoạt bởi hIGF-1

IGF1R là thụ thể của hIGF-1 thuộc họ Tyrosine kinase, có cấu trúc tương đồng với thụ thể insulin IGF1R gồm 2 tiểu đơn vị α nằm ngoài tế bào và 2 tiểu đơn

vị β xuyên màng tế bào IGF1R hoạt động ở dạng dimer hóa tạo thành phức hợp α2β2 [9, 16] Khi hIGF-1 gắn vào tiểu phần α sẽ kích hoạt quá trình phosphoryl hóa gốc tyrosine nằm trên tiểu đơn vị β ở bên trong tế bào Sự phosphoryl hóa tyrosine dẫn đến kích hoạt một loạt các con đường truyền tín hiệu tiếp theo bao gồm sự tăng cường biểu hiện các gene liên quan đến chu trình tế bào như cyclin D1 và D2 làm cho tế bào bước sang giai đoạn phân bào và tăng sinh; đồng thời kích hoạt các con

đường tín hiệu AKT/protein kinase B, MAPK làm ngăn chặn quá trình apoptosis của tế bào; ngoài ra còn hoạt hóa một loạt các quá trình khác nhau tùy thuộc vào loại tế bào đích tác động như tăng tăng cường biểu hiện các protein liên quan đến quá trình tạo cơ ở tế bào cơ, kích thích quá trình tạo xương ở các tế bào xương, điều hòa quá trình tạo cytokine ở các tế bào thuộc hệ miễn dịch,…[17]

Cho đến nay, vai trò của hIGF-1 vẫn chưa được hiểu biết đầy đủ và nhiều nghiên cứu đang được tiến hành để làm sáng tỏ thêm Dựa trên sự hiểu biết và vai trò của hIGF-1 đối với từng loại tế bào từ đó có thể đưa ra những ứng dụng có ý nghĩa to lớn trong việc điều trị một số bệnh quan trọng

1.1.4 Chức năng hIGF-1 trong cơ thể sống

hIGF-1 có vai trò kích thích tăng sinh hầu hết các loại tế bào thông qua việc thúc đẩy sự phát triển tế bào từ phase G2 đến phase M đưa tế bào đến giai đoạn phân bào trong chu trình tế bào Bên cạnh đó, hIGF-1 còn kích thích tổng hợp DNA, ức chế quá trình apoptosis, tham gia vào các quá trình trao đổi chất của cơ thể, làm tăng hấp thu amino acid, giảm phân hủy protein, kích thích hấp thu glucose

và tổng hợp glycogen góp phần giúp hạ đường huyết Ngoài ra hIGF-1 còn thúc đẩy quá trình phân giải acid béo thành năng lượng cần thiết cho cơ thể, làm giảm acid

béo dư thừa, chất béo trung tính, và lượng cholesterol trong máu [17, 22]

Trong giai đoạn phát triển bình thường của trẻ, khi bước sang giai đoạn dậy thì, hàng loạt các biến đổi xảy ra trong đó có quá trình phát triển của hệ cơ xương thúc đẩy sự gia tăng kích thước và tầm vóc của cơ thể [7] Tuy nhiên để kích thích

hệ cơ xương phát triển cần phải có sự tham gia của các hormone quan trọng trong

đó có hIGF-1 Nếu cơ thể không sản xuất đủ lượng hIGF-1 trong giai đoạn này thì trẻ phát triển không bình thường và bị lùn Hội chứng này được gọi là IGFD (insulin-like growth factor 1 deficiency) [4] Những nghiên cứu trên chuột đột biến trên gene mã hóa cho IGF-1 cho thấy trọng lượng nặng hơn 30% so với bình thường Đối với các động vật thiếu gene mã hóa cho IGF-1, trọng lượng cũng giảm

rõ rệt, một số trường hợp đã chết ngay sau khi sinh Những trường hợp sống sót vẫn tiếp tục thể hiện sự tăng trưởng chậm, ốm yếu [19]

Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi tác nhân lạ xâm nhập có liên quan đến tương tác của các tế bào hệ miễn dịch với hIGF-1 hIGF-

1 làm tăng cường sản xuất nhanh các đại thực bào, nội độc tố để bảo vệ vật chủ chống lại tác nhân lạ một cách nhanh nhất, hiệu quả nhất Năm 1992, Timsit đã chứng minh hIGF-1 có tác dụng kích thích tổng hợp DNA và tăng sinh các tế bào biểu mô tuyến ức, cơ quan quan trọng của hệ miễn dịch [28] hIGF-1 giúp hồi phục

và phát triển chức năng tuyến ức, đồng thời tạo nhiều tế bào T, đẩy nhanh quá trình tạo kháng thể trong cơ thể [12, 28] Bên cạnh đó hIGF-1 còn có vai trò cân bằng hormone cho cơ thể, sự hiện diện hIGF-1 kiểm soát quá trình sản xuất GH Tùy vào nồng độ mà hIGF-1 sẽ cho tín hiệu ức chế hay kích thích tiết GH từ tuyến yên [2]

1.1.5 Các hướng ứng dụng hIGF-1

1.1.5.1 Điều trị bệnh IGFD

Bệnh IGFD (insulin-like growth factor 1 deficiency) là tình trạng cơ thể sản xuất không đủ lượng protein hIGF-1 để đáp ứng nhu cầu cần thiết cho quá trình tăng trưởng và phát triển của cơ thể Nếu kết quả kiểm tra nồng độ hIGF-1 < 15μg/l hoặc nồng độ IGFBP-3 < 400μg/l thì cơ thể đang thiếu protein hIGF-1 và cần phải được xem xét để điều trị kịp thời [4] Nguyên nhân thiếu hụt hIGF-1 có thể là do [7]:

- Những yếu tố có liên quan tới sự suy giảm tín hiệu của thụ thể hormone GH,

từ đó làm giảm sự tổng hợp hIGF-1

- Thiếu hụt GH nghiêm trọng do suy tuyến yên, hoặc các bệnh liên quan đến vùng dưới đồi

- Do đột biến của các nhân tố trong con đường truyền tín hiệu của GH

- Do gene mã hóa cho GH bị phá hủy hoặc kháng thể trung hòa GH

- Hoạt động bất thường của thụ thể GH

- Sự phá hủy hay đột biến trong cấu trúc gene mã hóa hIGF-1 cũng làm thiếu hụt hIGF-1

- Tình trạng tuổi tác, dinh dưỡng, các bệnh về gan cũng góp phần ảnh hưởng đến lượng hIGF-1 trong cơ thể

Triệu chứng của bệnh IGFD cho thấy cơ thể có biểu hiện tích tụ chất béo dư thừa, giảm độ vững chắc của xương, giảm quá trình tổng hợp amino acid, mất cân bằng nội tiết, tăng nguy cơ rối loạn chuyển hóa chất dinh dưỡng, thiếu chất dinh dưỡng dẫn đến tình trạng chậm tuổi dậy thì, cơ thể lùn bất thường, phát triển không cân đối Ngoài ra thiếu hụt hIGF-1 có thể trở nên bị điếc, kém trí tuệ và chậm hiểu biết [4]

Trước đây người ta cho rằng sự thiếu hụt hIGF-1 là do thiếu hụt hormone GH

Do đó, trẻ em mắc bệnh IGFD đã được điều trị với hormone rhGH Tuy nhiên, một

số thử nghiệm khác đo lường sự hiện diện của hormone hGH và hIGF-1 của trẻ mắc bệnh chỉ cho thấy mức độ thấp bất thường của hIGF-1 Như vậy đối với trẻ thiếu hụt hIGF-1 do thiếu hụt GH thì có thể sử dụng GH tái tổ hợp để điều trị cho kết quả tốt Nhưng trong một số trường hợp khi cung cấp hormone tăng trưởng cho cơ thể nhưng vẫn không chữa được bệnh và nồng độ hIGF-1 vẫn không được phục hồi Để điều trị những trường hợp này chỉ có thể bổ sung vào cơ thể một lượng hIGF-1 đã thiếu để bù đắp cho lượng hIGF-1 thiếu hụt Hiện tại không có phương thuốc hữu hiệu nào để chữa trị các bệnh nhân bị IGFD ở giai đoạn muộn Do đó, phương thức hiệu quả nhất đó là chẩn đoán sớm bệnh IGFD và tiêm bổ sung cho đủ lượng hIGF-

1 Lượng hIGF-1 sử dụng cho điều trị chủ yếu là hIGF-1 tái tổ hợp [1]

1.1.5.2 Điều trị một số bệnh khác

Ngoài việc sử dụng hIGF-1 để điều trị bệnh IGFD thì hiện nay người ta còn hướng đến việc dùng hIGF-1 để chữa bệnh tiểu đường, bệnh tim, bệnh Alzheimer (AD), bệnh xơ cứng cột bên teo cơ (ALS - Amyotrophic Lateral Sclerosis), lão hóa…[6, 15]

Các tác dụng kích thích đáng kể của hIGF-1 trên sự hấp thụ glucose của tế bào

có vai trò quan trọng trong chữa bệnh tiểu đường ở người hIGF-1 liên kết với thụ thể insulin nhỏ hơn rất nhiều so với insulin nhưng trên thực tế nó vẫn có tác dụng hạ đường huyết Với những hiểu biết về hIGF-1, các nhà khoa học đã tiến hành thử nghiệm sử dụng hIGF-1 trên bệnh nhân tiểu đường trong một thời gian xác định và

đã đưa ra kết luận rằng hIGF-1 có thể kiểm soát làm giảm lượng glucose trong máu

mà không có các tác dụng phụ Như vậy hIGF-1 cho chúng ta thêm một loại thuốc

có thể điều trị bệnh tiểu đường [6] Tuy nhiên, hIGF-1 có tác dụng làm tăng sinh tế bào nếu sử dụng liều cao quá có thể dẫn đến nguy cơ gây ung thư

hIGF-1 còn được sử dụng trong điều trị bệnh mất trí nhớ Khi cơ thể mắc bệnh

AD thì lượng protein hIGF-1 và thụ thể IGFR giảm rõ rệt Thử nghiệm trên chuột

có gene mã hóa cho IGF-1 bị phá hủy cho thấy sự sớm tích lũy protein amyloid beta (Aβ) trong não Amyloid beta là một chuỗi liên kết peptide của 36-43 amino acid, tạo thành màng bao phủ trong mạch máu não làm tổn thương mạch máu não và tế bào thần kinh Điều đó nói lên rằng hIGF-1 có thể giảm mức độ tích tụ của protein amyloid beta trong não và hIGF-1 có nhiều tiềm năng trong chữa bệnh AD [6] Một số nghiên cứu gần đây cho thấy hIGF-1 có thể sử dụng trong điều trị bệnh suy tim Suy tim là tình trạng cơ tim ngày càng yếu đi và không thể bơm đủ máu để

đi nuôi các cơ quan trong cơ thể, không đưa được máu thiếu oxi về tim nên máu bị

ứ lại gây tình trạng phù nề, mệt mỏi, khó thở hGF-1 có thể kích thích tăng trưởng

cơ tim bằng cách tăng sự hấp thu amino acid, tổng hợp protein, ngăn ngừa quá trình apoptosis của tế bào cơ tim Điều khiển tăng lượng canxi trong tế bào để tăng hoạt động co bóp cơ tim Mở rộng mạch máu, tăng lượng oxi và các chất dinh dưỡng đến từng phần của cơ thể bằng cách kích hoạt làm tăng oxide nitric (NO) [8]

hIGF-1 còn góp phần quan trọng trong quá trình tổng hợp, kích thích tăng sinh

tế bào xương, tế bào cơ, nguyên bào sợi ở da, giúp tăng mật độ tế bào xương làm xương vững chắc, tăng khả năng phục hồi, mau chóng chữa lành vết thương ở các vùng da và tăng khối lượng cơ Vì vậy hIGF-1 được đề xuất cho liệu pháp chữa bệnh loãng xương, bệnh teo cơ, điều trị các tổn thương ngoài da [6] Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng hIGF-1 có vai trò làm chậm quá trình thoái hóa cơ ở bệnh xơ cứng cột bên theo cơ (ALS) và vai trò của hIGF-1 đối với bệnh này vẫn đang được tiếp tục nghiên cứu [23]

1.1.5.3 Ứng dụng khác của hIGF-1

Trong thể dục thể thao, các vận động viên trên thế giới thường hay sử dụng các sản phẩm rhIGF-1 để tăng khối lượng cơ, cải thiện hiệu quả luyện tập hIGF-1 thúc đẩy sự tăng trưởng cơ bắp, kích thích sự giảm mỡ, giúp thân hình trở nên săn chắc, thể lực cường tráng, thúc đẩy chữa lành các vết thương Trong quá trình luyện

tập đòi hỏi cơ thể phải sử dụng năng lượng, sự hiện diện hIGF-1 làm tăng quá trình oxy hóa chất béo, glycogen để cung cấp nguồn năng lượng cần thiết cho cơ thể đồng thời tăng hiệu quả hấp thu glucose hIGF-1 còn kích thích cơ tim hoạt động điều hòa lưu thông máu mang oxi đến các tế bào, giúp các vận động viên khỏe mạnh hơn, tăng hiệu quả tập luyện

hIGF-1 còn được sử dụng trong công nghệ thẫm mỹ và làm đẹp Với sự tăng thêm của tuổi tác, lượng collagen giảm thiểu, khiến cho làn da xuất hiện nhiều vết nhăn và trở nên thô ráp hIGF-1 làm tăng nhanh tốc độ tổng hợp các nguyên bào sợi, tổng hợp collagen giúp làn da hồng hào, mịn màng và mất dần vết nhăn hIGF-

1 thúc đẩy quá trình phân giải chất béo không cần thiết cho cơ thể Tác dụng này làm giảm đi phần lớn lượng mỡ thừa ở phần bụng, hông và bắp tay… hIGF-1 thường được bổ sung vào kem dưỡng da

1.1.6 Tình hình nghiên cứu sản xuất hIGF-1 trên thế giới và ở Việt Nam

hIGF-1 đã được sản xuất từ lâu trên thế giới chủ yếu bằng công nghệ sản xuất

protein tái tổ hợp trên hệ thống tế bào chủ E coli [3] và nấm men [29] là chủ yếu

Đáng chú ý là vào tháng 08 năm 2005, FDA đã chấp nhận cho các sản phẩm

rhIGF-1 thương mại là Increlex của hãng dược phẩm Tercia (Hoa Kỳ) sử dụng để điều trị IGFD trên người Đến tháng 12 năm 2005, FDA cũng chấp thuận cho sản phẩm Iplex (phối trộn giữa rhIGF-1 và IGFBP-3) của hãng Insmed (Hoa Kỳ) sử dụng để điều trị IGFD [1] Một hướng triển vọng mới đang mở ra cho thị trường hIGF-1 tái

tổ hợp Vào năm 2007, cơ quan kiểm tra sản phẩm y tế (EMEA) của châu âu cũng

đã đồng ý cho phép sử dụng hIGF-1 tái tổ hợp để điều trị IGFD [32] Đến năm

2009, FDA đã chấp nhận cho việc sử dụng IPLEX để nghiên cứu điều trị bệnh xơ cứng cột bên teo cơ [33] Trong những năm qua các cơ quan có chức năng đã cho phép trẻ em có tầm vóc nhỏ, lùn được điều trị với rhIGF1 ngày càng tăng lên Một

số sản phẩm rhIGF-1 chủ yếu trên thế giới gồm:

- Increlex (mecasermin) là sản phẩm hIGF-1 tái tổ hợp được sản xuất trên hệ

thống tế bào E coli bởi công ty Tercia (Hoa kỳ) Increlex là dạng thuốc tiêm được

bán ở dạng lọ tiêm nhiều lần gồm 10mg và 40mg rhIGF-1 Giá bán Increlex lọ 40mg trên thị trường Hoa Kỳ là 562,5 USD [34]

- Iplex (mecasermin rinfabate) là sản phẩm gồm hIGF-1 tái tổ hợp và

IGFBP-3 tái tổ hợp với tỉ lệ phối trộn 1:1 được sản xuất trên hệ thống E coli bởi công ty

Insmed (Hoa Kỳ) Sản phẩm kết hợp này giúp tăng thời gian tồn tại hIGF-1 trong máu sau khi tiêm đồng thời làm giảm tác dụng phụ của hIGF-1 IPLEX được bán dưới dạng liều tiêm một lần 36mg/0,6ml Giá bán Iplex trên thị trường Hoa Kỳ là

90 USD/liều [31]

- Hiện nay trên thị trường còn có loại sản phẩm hIGF-1 tái tổ hợp đã được biến đổi cấu trúc với tên gọi là IGF-1 Long R3 Trình tự hIGF-1 đã được thay thế glutamine ở vị trí thứ 3 thành arginine đồng thời dung hợp thêm chuỗi 13 amino acid ở đầu N Kết quả của sự biến đổi này là phân tử hIGF-1 không thể gắn được vào các IGFBPs và do đó hoạt tính của hIGF-1 không bị kìm hãm và tăng lên một cách đáng kể Sản phẩm này chủ yếu sử dụng cho nghiên cứu mà không được sự chấp thuận cho việc sử dụng điều trị vì lý do không kiểm soát được tác dụng của hIGF-1 IGF-1 Long R3 được bán trên thị trường thế giới với giá dao động từ 300-

500 USD/ 1mg [36]

- Ngoài ra còn một loạt các sản phẩm hIGF-1 không sử dụng cho điều trị nhưng được sử dụng cho nghiên cứu của các hãng hóa chất và công nghệ sinh học như Sigma, R&D system,… với giá thành khá cao

Hình 1.3 Một số sản phẩm rhIGF-1 trên thị trường

Tại Việt Nam, hIGF-1 vẫn chưa được biết đến nhiều và tiềm năng ứng dụng của hIGF-1 là rất lớn Hiện nay trên thị trường Việt Nam cũng đã xuất hiện một số sản phẩm rhIGF-1 dưới dạng thực phẩm chức năng Sản phẩm kết hợp IGF-1 và Vigorex dạng dịch phun 30ml/lọ được sản xuất bởi công ty Megalife (Hoa Kỳ) có giá bán 4.600.000VNĐ tại Việt Nam [35] Giá thành như vậy còn khá cao so với

mặt bằng chung thu nhập của người dân Việt Nam Do đó việc nghiên cứu quy trình sản xuất lượng lớn hIGF-1 với giá rẻ nhằm đáp ứng nhu cầu điều trị và nghiên cứu trong nước là việc hết sức cần thiết

1.2 Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp trên hệ thống E coli

Với nhu cầu ngày càng tăng cao đối với các protein sử dụng trong trị liệu và nghiên cứu, đặc biệt là các protein có nguồn gốc từ động vật hữu nhũ thì lượng tách chiết thu nhận từ cơ thể sinh vật rất thấp với giá thành rất cao Do đó yêu cầu đặt ra làm thế nào để thu nhận một lượng lớn protein mục tiêu với giá thành rẻ Để giải quyết vấn đề này, công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp ra đời và cho đến nay đã đem lại những thành tựu hết sức to lớn Hàng loạt các sản phẩm protein tái tổ hợp

đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp và đem lại doanh thu lên đến hàng tỉ USD/năm Công nghệ sản xuất protein tái tổ hợp là sự vận dụng thành công kỹ thuật di truyền, thao tác gene và các hiểu biết về sinh học tế bào Một trong những

hệ thống tế bào chủ biểu hiện thành công protein tái tổ hợp và cho đến nay vẫn

được sử dụng phổ biến đó là hệ thống tế bào chủ E coli Hệ thống tế bào chủ E coli

được sử dụng phổ biến tại vì nó có những ưu điểm sau [18]:

- E coli có hệ thống di truyền đơn giản và đã được biết rõ, thuận lợi cho việc

biến đổi gen nhằm tạo ra các chủng tế bào đột biến phục vụ sản xuất protein tái tổ hợp được dễ dàng

- E coli là hệ thống tế bào chủ an toàn khi sử dụng Chúng được tìm thấy

trong tự nhiên ở cả người và động vật

- E coli có tốc độ tăng trưởng rất nhanh nếu so với các hệ thống tế bào chủ

khác, với thời gian một thế hệ khoảng 20 phút Tốc độ tăng trưởng nhanh cũng đồng nghĩa với tốc độ sản xuất tốt hơn khi đưa vào lên men

- Hệ thống E coli có khả năng dung nạp gene ngoại lai thông qua plasmid tái

tổ hợp, tồn tại khá ổn định Việc nuôi cấy E coli khá dễ dàng với môi trường đơn

giản và rẻ tiền Sản lượng protein tái tổ hợp tạo ra cao, có thể lên đến 50% lượng protein của tế bào

Các chủng E coli thường sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp là BL21 và

K12 cùng các dẫn xuất của chúng Ưu điểm hơn so với chủng K12, các chủng BL21

khiếm khuyết hai protease ompt và lon, nhờ vậy làm giảm sự phân hủy các protein mục tiêu Ngoài ra các dẫn xuất BL21 được thiết kế di truyền để có được những đặc tính mong muốn như chủng đột biến recA giúp tăng cường tính ổn định của plasmid

mục tiêu, chủng đột biến trxB/gor giúp tăng cường khả năng hình thành cầu nối

disulfide (Novagen Origami và AD949), chủng đột biến lacY tạo khả năng biểu hiện protein ở các mức biểu hiện khác nhau (Novagen Tuner) [26]… Tùy thuộc vào hệ thống vector được sử dụng mà từ các chủng chủ này có thể được biến đổi di truyền để tạo thành nhiều dẫn xuất khác nhau phù hợp với vector được sử dụng

Chẳng hạn như chủng tế bào E coli BL21(DE3) là chủng BL21 có mang gene mã

hóa cho T7 RNA polymerase là enzyme phiên mã của T7 promoter Chủng này được sử dụng cho các hệ thống vetor biểu hiện gene dưới sự kiểm soát của T7 promoter [5] Dựa vào đặc điểm gene và cấu trúc protein ngoại lai muốn biểu hiện

và hệ thống vector biểu hiện được sử dụng mà lựa chọn chủng chủ E coli cho thích

1.3 Tái gấp cuộn in vitro protein thu nhận từ thể vùi biểu hiện trong tế bào E

coli [20-21]

Đã có nhiều chiến lược được sử dụng để làm tăng khả năng tan và có hoạt tính

của protein mục tiêu biểu hiện trong E coli như biểu hiện ở nhiệt độ thấp, điều kiện

stress, sử dụng hệ thống promoter cho phép biểu hiện ở mức độ vừa phải, đồng biểu hiện các chaperone phân tử như scPDI, DsbA, GroES/EL… nhằm hỗ trợ quá trình gấp cuộn đúng của protein mục tiêu Tuy nhiên các phương pháp này vẫn còn một

số giới hạn như lượng protein có hoạt tính thu được ít, ảnh hưởng đến sức sống của

tế bào chủ, protein tan trong tế bào chất gây khó khăn cho quá trình tinh chế thu nhận Do đó, hướng thu nhận protein từ thể vùi vẫn được ưa chuộng do sản lượng protein mục tiêu thu được cao có thể lên đến 50% lượng protein tổng số của tế bào,

thể vùi không tan và không bị tác động của các protease nội bào, độ tinh sạch protein thu được từ thể vùi lên đến trên 70% Do thể vùi không tan và đa số các protein của tế bào chủ ở dạng tan nên có thể loại bỏ lượng lớn protein tạp chỉ qua một bước ly tâm Mặt khác một số protein biểu hiện ở dạng tan lại gây độc cho tế bào chủ Sau khi thu nhận được thể vùi thì vấn đề đặt ra là làm sao thu nhận được protein mục tiêu có hoạt tính sinh học Để giải quyết vấn đề này, phương pháp tái gấp cuộn (refolding) ra đời để đưa protein mục tiêu trở về cấu hình đúng và có hoạt tính Kể từ khi sự tạo thành thể vùi được phát hiện, một số lượng lớn quy trình tái gấp cuộn cho những loại protein khác nhau đã ra đời và được phát triển

Sau quá trình nuôi cấy, tế bào chủ E coli được thu nhận để tiến hành phá tế

bào và thu nhận thể vùi Có thể phá tế bào bằng nhiều phương pháp khác nhau nhưng chủ yếu là bằng sóng siêu âm hoặc bằng áp suất Thể vùi được thu nhận từ dịch phá tế bào bằng phương pháp ly tâm Thể vùi được xử lý với Dnase để loại bỏ DNA nhiễm sắc thể, xử lý với các chất tẩy như Triton-X100 ở nồng độ khoảng 2%

để hoà tan lipid và các protein màng (đặc biệt là các protease gắn màng), sự hiện diện của muối ở nồng độ cao như NaCl 0.5-1.5M giúp hoà tan các protein tạp trong thể vùi

Trước khi tái gấp cuộn, thể vùi cần dược hoà tan để tạo ra những chuỗi polypeptide riêng lẻ bằng các chất biến tính mạnh như guanidine hydrochloride (GdnHCl), urea Một số phương pháp hòa tan thể vùi sử dụng chất biến tính ở nồng

độ thấp kết hợp với pH thấp hoặc pH cao cũng cho kết quả khả quan hoặc có thể sử dụng áp suất để đánh tan thể vùi Sau quá trình hòa tan thể vùi, protein mục tiêu được chuyển sang quá trình tái gấp cuộn bằng nhiều phương pháp khác nhau

Do thể vùi được hòa tan trong dung dịch có nồng độ chất biến tính cao nên cần phải giảm nồng độ chất biến tính đến mức tối thiểu để có thể vừa hạn chế tối đa sự kết tụ protein mà vẫn cho phép các protein tái gấp cuộn được Phương pháp phổ biến nhất là pha loãng protein mục tiêu trong một thể tích lớn dung dịch tái gấp cuộn Cần phải khuấy trộn tốt trong quá trình pha loãng nhằm hạn chế tương tác liên phân tử và sự kết tụ protein mục tiêu Quá trình tái gấp cuộn protein mục tiêu diễn ra trong dung dịch tái gấp cuộn Cần phải kiểm soát những yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tái gấp cuộn như:

- Nồng độ protein mục tiêu tối ưu cho quá trình tái gấp cuộn Đây là yếu tố quan trọng cần được xác định dựa vào thực nghiệm đối với từng loại protein Vì quá trình tái gấp cuộn thường xảy ra ở nồng độ protein mục tiêu thấp nên cần phải có thêm những bước cô mẫu để tăng nồng độ protein mục tiêu để phục vụ cho các bước tinh chế thu nhận tiếp theo

- Nhiệt độ tối ưu cho quá trình tái gấp cuộn Nhìn chung đối với nhiều loại protein thì nhiệt độ thấp làm tăng hiệu quả tái gấp cuộn và làm giảm sự kết tụ protein mục tiêu bởi vì nhiệt độ thấp làm giảm tốc độ tái gấp cuộn cũng như làm giảm tương tác kị nước trong đó khi nhiệt độ cao làm tăng tốc độ kết tụ

- Đối với tái gấp cuộn các protein có cầu nối disulfide, sự hiện diện của hệ thống oxy hóa-khử là hết sức cần thiết cho việc tạo thành cầu nối disulfide giữa hai gốc cysteine Việc lựa chọn cặp oxy hóa-khử cũng đóng vai trò quyết định Một trong những cặp oxy hóa-khử thường được sử dụng phổ biến là GSSG/GSH Tuy nhiên trong một số trường hợp, các cặp oxy hóa-khử nhỏ hơn như cystein/cystine lại cho hiệu quả tốt hơn như trong trường hợp tái gấp cuộn proinsulin

- Sự kết cụm protein trong quá trình tái gấp cuộn cũng là một vấn đề đáng lưu

ý Để ngăn chặn sự kết cụm, người ta thường sử dụng các hợp chất hóa học có trọng lượng phân tử nhỏ Chất thường được sử dụng phổ biến đó là L-arginine, có giả thuyết cho rằng L-arginine làm mất ổn định các cấu trúc trung gian của protein mục tiêu và không ảnh hưởng đến cấu trúc gấp cuộn đúng Ngoài ra còn có các chất biến tính như urea, GdnHCl; các chất tẩy như SDS, Triton X-100…; các chất hoạt động

bề mặt như Tween 20 cũng được bổ sung vào dung dịch tái gấp cuộn để hạn chế sự kết cụm protein

- pH tối ưu cho quá trình tái gấp cuộn của từng loại protein Đối với trường hợp protein có cầu nối disulfide thì pH kiềm là cần thiết cho quá trình hình thành và tái sắp xếp cầu nối disulfide pH dao động cũng làm ảnh hưởng đến hiệu quả tái gấp cuộn Do đó để duy trì pH tối ưu người ta thưởng bổ sung vào dung dịch tái gấp cuộn các hệ đệm pH như Tris-HCl cho pH kiềm hoặc hệ đệm acetate cho pH acid Tóm lại, để tái gấp cuộn thành công cần phải hiểu rõ cấu trúc phân tử protein mục tiêu do mỗi protein đều có cấu trúc và đặc điểm riêng biệt Từ đó tiến hành

khảo sát và tối ưu hóa các thông số của quá trình tái gấp cuộn để đem lại hiệu suất tái gấp cuộn cao nhất

1.4 Tinh chế thu nhận protein tái tổ hợp [11]

Sau khi tái gấp cuộn thành công protein tái tổ hợp in vitro vấn đề tiếp theo cần

được giải quyết đó là làm thế nào để thu nhận được protein mục tiêu với độ tinh sạch cao nhất có thể mà vẫn giữ được hoạt tính sinh học Đây là bước hết sức quan trọng vì nó giữ vai trò quyết định đối với sản phẩm protein tái tổ hợp, đặc biệt là các protein được ứng dụng trong y dược phải thỏa các yêu cầu nghiêm ngặt về độ tinh sạch cũng như hoạt tính sinh học vì được sử dụng trực tiếp trên người

Khi bước vào nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp tùy vào các tiêu chí như hiệu suất quá trình sản xuất, độ tinh sạch, mục đích sử dụng và giá thành mà người

ta phải tính đến các chiến lược tạo dòng, biểu hiện, lựa chọn chủng chủ cũng như các công đoạn tinh chế thu nhận tương ứng sau này sao cho phù hợp Phương thức tinh chế thu nhận còn tùy thuộc vào đặc điểm từng loại protein như trọng lượng phân tử, điện tích bề mặt, giá trị điểm đẳng điện (pI), tính kị nước, sự phân bố của các amino acid trên bề mặt phân tử, cấu trúc không gian,…Ngoài ra còn phụ thuộc vào đặc điểm biểu hiện protein mục tiêu ở tế bào chủ

Hình 1.4 Một số phương pháp sắc ký được sử dụng để tinh chế protein

Thông thường thì để thu nhận được một loại protein tái tổ hợp có độ tinh sạch cao thì thường phải trải qua ít nhất là hai bước tinh chế với mỗi bước là một

phương pháp tinh chế khác nhau Các phương pháp tinh chế được sử dụng chủ yếu hiện nay là sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography-IEC), sắc kí lọc gel (size exclusion chromatography), sắc kí ái lực (affinity chromatography), sắc kí kị nước (hydrophobic interaction chromatography), sắc kí đảo pha (reverse phase chromatography)

1.5 Thử nghiệm hoạt tính sinh học hIGF-1 in vitro

Trong việc nghiên cứu các phân tử có hoạt tính sinh học người ta sử dụng

phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro để đánh giá hoạt tính của chúng Đây là

phương pháp hiệu quả để đo đạc mức độ đáp ứng của dòng tế bào chuyên biệt đối với phân tử cần thử nghiệm Nguyên tắc của phương pháp này dựa trên việc sử dụng dòng tế bào có các receptor đáp ứng hiệu quả với phân tử cần thử nghiệm, từ

đó gây ra chuỗi truyền tín hiệu nội bào, kết quả là một số gene quan trọng được hoạt hóa dẫn đến các đáp ứng có thể đo đạc được [27]

Hình 1.5 Nguyên tắc chung của phương pháp thử nghiệm sinh học in vitro [27]

Dựa trên cách thức tác động của phân tử cần thử nghiệm đối với tế bào đích,

thử nghiệm sinh học in vitro được chia thành 4 nhóm bao gồm: thử nghiệm sinh học

đo mức độ tăng sinh hoặc ức chế tăng trưởng của tế bào, thử nghiệm sinh học đánh giá mức gây độc đối với tế bào, thử nghiệm sinh học đánh giá một chức năng đặc biệt nào đó của tế bào chẳng hạn kiểm tra tính xâm lấn của tế bào (invasive), và thử nghiệm sinh học định lượng các sản phẩm được tạo ra bởi tế bào đích dưới tác động của phân tử được thử nghiệm [27]

Trong phương pháp thử nghiệm sinh học tăng sinh tế bào, lượng phân tử thử nghiệm hoạt tính được xác định dựa trên khả năng kích thích tăng sinh dòng tế bào

Tế bào Hoạt hóa

receptor

Tín hiệu nội bào

Gen biểu hiện Đáp ứng

Tế bào Hoạt hóa

receptor

Tín hiệu nội bào

Gen biểu hiện Đáp ứng

đáp ứng chuyên biệt cho phân tử đó Nồng độ phân tử thử nghiệm tăng sẽ làm tăng mức độ tăng trưởng của tế bào Cuối quá trình thử nghiệm, số lượng tế bào tăng được ghi nhận bằng các phương pháp đếm tế bào, phương pháp sử dụng đồng vị phóng xạ, phương pháp tạo phức hợp màu bằng các phản ứng với các muối tetrazolium MTT, XTT,…[27]

hIGF-1 có vai trò tăng sinh hầu hết các loại tế bào trong cơ thể nên để kiểm

tra hoạt tính sinh học, người ta sử dụng phương pháp thử nghiệm tăng sinh dòng tế bào chuyên biệt đối với hIGF-1 Các dòng tế bào được sử dụng phổ biến là dòng tế bào MCF-7, BALB/3T3, HUVEC

- MCF-7 là dòng tế bào ung thư vú được phân lập vào năm 1970 từ một phụ

nữ 69 tuổi bị bệnh ung thư vú ở Hoa Kỳ Dòng tế bào này có khả năng phân chia vô hạn và được sử dụng để nghiên cứu về các vấn đề liên quan đến bệnh ung thư MCF-7 được kích thích tăng sinh bởi estrogen và nhiều nhân tố tăng trưởng khác như hIGF-1, bFGF, nhân tố tăng trưởng biểu mô MCF-7 bị ức chế tăng trưởng khi

xử lý với nhân tố TNFα và tiết ra các IGFBPs khi xử lý với các tác nhân ức chế estrogen [14]

- BALB/3T3 là dòng tế bào nguyên bào sợi được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu Được phân lập lần đầu tiên từ phôi chuột Swiss 14-17 ngày vào năm

1968 tại đại học New York Tế bào thuộc dòng này có đặc tính kiềm hãm tiếp xúc, tăng trưởng ở mật độ thấp, mật độ bão hòa thấp Thuật ngữ 3T3 được đặt theo quy trình nuôi cấy dòng tế bào này Tế bào được cấy chuyền sau mỗi 3 ngày ở mật độ là 3x105tế bào/ml Dòng tế bào 3T3 thường được sử dụng để nuôi cấy cùng với tế bào keratinocyte vì 3T3 có khả năng tiết ra các nhân tố tăng trưởng giúp kích thích tăng sinh tế bào keratinocyte Các hợp chất như benzodiazepines làm ức chế khả năng tăng sinh của tế bào 3T3 Dòng tế bào 3T3 được sử dụng để kiểm tra hoạt tính của nhiều nhân tố tăng trưởng và cytokine [24]

- HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) là dòng tế bào nội mô tĩnh mạch được phân lập từ tĩnh mạch rốn ở người bình thường HUVEC đáp ứng với các kích thích của các cytokine để biểu hiện các phân tử bám dính tế bào Dòng

tế bào này được sử dụng phổ biển cho các nghiên cứu sinh lý và y học, các phân tử vận chuyển, đông tụ huyết và phân giải fibril Trên bề mặt tế bào HUVEC có biểu

hiện nhiều thụ thể IGF1R do đó, hIGF-1 có khả năng kích thích tăng sinh dòng tế bào này [30]

PHẦN II VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Dụng cụ và thiết bị

Ngoài các dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm, còn có các thiết bị sau:

- Máy ly tâm lạnh Mikro22R (Hettich Zentrifugen)

- Máy đo quang phổ Ultrospec 2000

- Máy lắc ổn nhiệt (Stuart Scientific)

- Máy đo nồng độ DNA Nanodrop

- Máy PCR (Biorad)

- Máy Vortex (IKA, Mỹ)

- Máy đo pH (Orion, Anh)

- Máy đo quang phổ chuyên dụng GeneQuanpro (Amersham Biosciences)

- Máy chụp hình gel Imagemaster VDS (Amersham Biosciences)

- Máy hút chân không

- Máy heat nhiệt Dri-Block DB-2D (Techne, Mỹ)

- Máy khuấy từ VWR 360 (Mỹ)

- Cân kỹ thuật TE612, cân phân tích CP224S (Sartorius, Đức)

- Thiết bị chuyển màng lai Hoefer mini VE

- Nồi hấp Autoclave (SS325-TOMY)

- Bộ điện di protein (Biorad)

- Bộ điện di DNA Horizon 58 (Life technology)

- Hộp đèn soi tia tử ngoại Hoefer (UVTM-19-230V)

- Máy phá tế bào bằng áp suất

- Kính hiển vi soi ngược CKX41 (Olympus)

2.1.2 Hóa chất và môi trường

a Hóa chất

Phản ứng PCR

- Dung dịch MgCl2 25mM, MgSO4 25mM (Fermentas, Đức)

- Taq polymerase (1u/µl), pfu polymerase (2,5u/μl) (Fermentas, Đức)

- dNTPs 8mM (Fermentas, Đức)

- Buffer 10X tương ứng (Fermentas, Đức)

- Mồi đặc hiệu T7 pro/ T7 ter (IDT, Hoa Kỳ)

- Mồi 5’-NdeI-higf1/3’-BamHI-higf1 (IDT, Hoa Kỳ)

- MiliQ (dd H2O)

Tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn

- Dung dịch I: Glucose 50mM; Tris-HCl 2,5mM pH 8,0; EDTA 10mM pH 8,0

- Dung dịch II (pha ngay trước khi sử dụng): 100µl SDS 10%; 40µl NaOH 5N; 860µl dH2O

- Dung dịch III: KOAc 5M; Glacial acetic acid 0,2M; pH 4,8

- Phenol bão hòa trong TE (pH 8,0) (giữ ở 4oC)

Hóa chất sử dụng cho phản ứng nối

- Enzyme T4 DNA ligase 10u/µl (Fermentas)

- Buffer ligation10X tương ứng (Fermentas)

Tinh chế DNA

- Binding buffer I, Wash buffer, Elution buffer (Biobasic, Canada)

Chuẩn bị tế bào vi khuẩn khả nạp

- Dung dịch CaCl2 100mM, hỗn hợp dung dịch MgCl2 20mM và CaCl2 80mM

vô trùng (giữ 4oC)

- Dung dịch glycerol 80% vô trùng

- dH2O vô trùng

Điện di DNA trên gel agarose

- Dung dịch TAE: Tris acetate 40mM; EDTA 0,1M (pH 8,0)

- Dung dịch nạp mẫu DNA 6X: Bromophenol blue 0,25%; xylene cyanol 0,25%; glycerol 30% (pha trong TAE)

- Agarose (Biobasic, Canada)

- Ethidium bromide 10% (Merck, Đức)

Phản ứng cắt hạn chế

- Enzyme cắt hạn chế NdeI 10u/µl, BamHI 10u/µl (Fermentas, Đức)

- Buffer Tango 10X (Fermentas, Đức)

- MiliQ

Cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu

- IPTG 1M

Phá tế bào vi khuẩn

- Dung dịch ly giải: Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM, pH 8,0

- Dung dịch rửa thể vùi: Wash I (Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM, TritonX-100 1%), Wash II (Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM, SOC 1%), Wash III (Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM, NaCl 1M)

Điện di Tricine SDS-PAGE

- Dung dịch pha gel-3X

- Dung dịch nhuộm gel

Coomassie brilliant blue 0,625g

- Dung dịch nhuộm bạc (Ag)

Dung dịch cố định 1: ethanol 50ml, acetic acid 5ml, dH2O 160ml

Methanol (thêm vào trước khi sử dụng) 200ml

- Dung dịch PBST (Phosphate Buffered Saline Tween) dùng để pha loãng và rửa

- Dung dịch hiện phim HyperfilmTM ECL của Amersham Biosciences

Dung dịch hòa tan thể vùi

- Urea 4M, Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM, pH 12,5

Dung dịch tái gấp cuộn protein hIGF-1

- Urea 2M, Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM, cysteine 5mM, cystine 0,5mM,

Tween 80 0,1%, pH 10,5

Tinh chế protein hIGF-1

- Binding buffer: NaOAc 25mM, pH 4,0

- Elution buffer: NaCl 1M pH 4,0 và NH4OAc 100mM pH 7,0

Định lượng protein bằng phương pháp Bradford

- Dung dịch Albumine 10mg/ml

- Dung dịch thuốc thử Bradford

Coomassie brilliant blue 100mg

Nuôi cấy tế bào động vật

- Dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline) 1X: NaCl 8g, KCl 0,2g, Na2HPO4 1,44g, KH2PO4 0,24g, nước cất vừa đủ 1000ml, pH 7,4

- Dung dịch FBS (Fetal Bovine Serum) (GIBCOTM, Mexico)

- DMSO (Merck, Đức)

- Dung dịch Trypan Blue 0.22%

- Dung dịch kháng sinh: Penicillin 100g/ml, Streptomycin 100g/ml

- Dung dịch 0,25% Trypsin-0,53mM EDTA

b Môi trường

- Môi trường Luria-Bertani (LB): Trypton 10g/l, NaCl 5g/l, cao nấm men 5g/l

- Môi trường LB agar: Môi trường LB lỏng bổ sung thêm 2% agar

- Môi trường LB-Amp100: Môi trường LB bổ sung thêm ampicillin nồng độ cuối là 100g/ml

- Môi trường LB-Amp100-Kana40-agar: Môi trường LB bổ sung thêm

ampicillin nồng độ cuối là 100g/ml, kanamycin nồng độ cuối là 40g/ml và 2% agar

Tất cả các môi trường trên đều được hấp khử trùng ở 121oC, 20 phút

- Môi trường DMEM/F12: là môi trường cơ bản được sử dụng để nuôi cấy tế bào động vật

2.1.3 Nguyên vật liệu

Tất cả các nguyên vật liệu đều được cung cấp bởi bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử và Môi trường, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh

a Chủng vi sinh vật

- Chủng Escherichia coli DH5 {F- endA1 hsdR17 (r k -/m k -) supE44 thi  recA1 gyrA96  lacU169 (80 lacZ M15)} dùng để dòng hóa

Chủng chủ Escherichia coli Origami (DE3) [F- ompT hsdSB(rB- mB-) gal dcm

lacY1 ahpC (DE3) gor522: Tn10 trxB (KanR, TetR)] dùng để biểu hiện vector tái tổ

hợp mang gen mục tiêu

b Plasmid

- Plasmid phIGF1 có chứa trình tự gene higf-1 mã hóa cho hIGF-1, dùng để thu nhận gene higf-1 bằng phản ứng PCR

- Plasmid pET-22b (Novagen) mang gene kháng kháng sinh ampicillin, có

vùng MCS, trình tự khởi đầu sao chép, T7 promoter, T7 terminator và lac operator

Hình 2.1 Cấu trúc plasmid pET-22b

- Mồi: T7 pro/T7 ter, 5’-NdeI-higf1/3’-BamHI-higf1 đặc hiệu cho gen higf-1

được thiết kế bởi Bộ môn Công nghệ Sinh học Phân tử & Môi trường, trường ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐHQG TP HCM và đặt tổng hợp tại công ty IDT (Hoa Kỳ)

- Màng lai Hybond ECL (nitrocellulose), HyperfilmTM ECL (Amersham Biosciences)

- Kháng thể đơn dòng kháng hIGF-1 (R&D system, Hoa Kỳ)

- Kháng thể thứ cấp kháng IgG chuột có đánh dấu Horseradish peroxidase (Piera, India)

2.2 PHƯƠNG PHÁP

Để tiếp cận mục tiêu nghiên cứu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu theo tiến trình thực nghiệm như sau:

PCR thu nhận gene higf-1

Cắt gene bằng cặp enzyme

NdeI và BamHI

Cắt plasmid pET22b bằng cặp

enzyme NdeI và BamHI

Nối gene mục tiêu vào plamid bằng phản ứng

nối với sự xúc tác của enzyme T4 DNA ligase

Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E coli DH5α khả nạp

PCR khuẩn lạc với cặp mồi đặc hiệu cho gene higf-1

Tách chiết plasmid từ thể biến nạp cho kết quả PCR dương tính

Sàng lọc trên môi trường LB-Amp100

Thu nhận dòng plasmid tái tổ hợp pET22b-higf1 và dòng tế bào

Phân tích sự biểu hiện protein hIGF-1 bằng phương pháp Tricine

SDS-PAGE và xác nhận sự biểu hiện bằng phương pháp lai Western

với kháng thể đặc hiệu kháng protein hIGF-1

Sàng lọc thể biến nạp trên môi trường LB-Amp100-Kana40 và kiểm

tra bằng phương pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi T7pro/T7ter

Cảm ứng ở thể tích 1 lít LB, phá tế bào bằng áp suất, ly tâm và thu

nhận thể vùi Kiểm tra plasmid bằng các phương pháp: PCR với mồi đặc hiệu; cắt bằng cặp

enzyme NdeI và BamHI; PCR với mồi thương mại T7pro/T7ter; giải trình tự