Phân lập và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ p10 của virus gây bệnh lúa lùn sọc đen ở việt nam

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --- PHẠM THỊ VÂN PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ P10 CỦA VIRUS GÂY BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN Ở VIỆT NAM Chuyên ngành

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

PHẠM THỊ VÂN

PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ P10 CỦA VIRUS GÂY BỆNH

LÚA LÙN SỌC ĐEN Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2014

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

-

PHẠM THỊ VÂN

PHÂN LẬP VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ P10 CỦA VIRUS GÂY BỆNH

LÚA LÙN SỌC ĐEN Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm

Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học: PGS TS PHẠM XUÂN HỘI

GS.TS PHAN TUẤN NGHĨA

Hà Nội - 2014

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU i

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN Error! Bookmark not defined

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS HẠI LÚAError! Bookmark not defined

1.2 BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN VÀ VIRUS SRBSDVError! Bookmark not defined

1.2.1 Bệnh lúa lùn sọc đen Error! Bookmark not defined 1.2.2 Virus lúa lùn sọc đen phương NamError! Bookmark not defined

1.3 ĐẶC ĐIỂM ĐOẠN GEN P10 VÀ PROTEIN VỎ NGOÀI SRBSDV

Error! Bookmark not defined

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ PHÁT HIỆN SRBSDV

Error! Bookmark not defined

1.5 KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ ỨNG DỤNG THỰC TIỄN Error! Bookmark not defined

1.5.1 Giới thiệu chung về kháng thể đa dòngError! Bookmark not defined

1.5.2 Một số ứng dụng của kháng thể đa dòngError! Bookmark not defined

CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Error! Bookmark not defined

2.1 VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT Error! Bookmark not defined 2.1.1 Vật liệu thí nghiệm Error! Bookmark not defined 2.1.2 Hóa chất Error! Bookmark not defined 2.1.3 Thiết bị Error! Bookmark not defined

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Error! Bookmark not defined 2.2.1 Nhân bản đoạn DNA đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR Error! Bookmark not defined

2.2.2 Điện di DNA trên gel agarose Error! Bookmark not defined 2.2.3 Ghép nối DNA bằng enzyme DNA ligaseError! Bookmark not defined

2.2.4 Biến nạp vi khuẩn E coli Error! Bookmark not defined

2.2.5 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩnError! Bookmark not defined

2.2.6 Tinh sạch DNA từ gel agarose Error! Bookmark not defined 2.2.7 Nhân dòng sản phẩm PCR Error! Bookmark not defined 2.2.8 Phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạnError! Bookmark not defined

2.2.9 Giải trình tự nucleotide các đoạn DNAError! Bookmark not defined

2.2.10 Điện di protein trên gel polyacrylamide có chứa SDS Error! Bookmark not defined

2.2.11 Nuôi cấy E coli và chuẩn bị dịch chiết tế bàoError! Bookmark

not defined

2.2.12 Tinh sạch protein tái tổ hợp qua cột Ni2+ agarose Error! Bookmark not defined

2.2.13 Định lượng protein bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng vùng tử ngoại (A280) Error! Bookmark not defined

2.2.14 Gây kháng thể đa dòng trên chuột bạchError! Bookmark not defined

2.2.15 Phương pháp thẩm tách miễn dịch (Western blotting) Error! Bookmark not defined

2.2.16 Tinh sạch kháng thể IgG bằng cột sắc kí protein A-sepharose

Error! Bookmark not defined

2.2.17 Phương pháp Dot Blot Error! Bookmark not defined 2.2.18 Phương pháp ELISA Error! Bookmark not defined

3.1 NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN P10 TỪ cDNA CỦA PHÂN ĐOẠN S10

Error! Bookmark not defined

3.1.1 Nhân bản đoạn gen P10 bằng phản ứng PCRError! Bookmark not defined

3.1.2 Ghép nối đoạn gen P10 vào vector pGEMTError! Bookmark not defined

3.1.3 PCR kiểm tra sự có mặt của plasmid tái tổ hợpError! Bookmark not defined

3.1.4 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pGEMT mang đoạn gen P10 Error!

Bookmark not defined

3.1.5 Giải trình tự đoạn gen P10 của chủng SRBSDV Error!

Bookmark not defined

3.2 BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP P10 Error! Bookmark not defined

3.2.1 Thiết kế vector biểu hiện pET28a mang đoạn gen P10 Error!

Bookmark not defined

3.2.2 Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp P10Error! Bookmark not defined

3.3 GẤY KHÁNG THỂ ĐA DÒNG KHÁNG PROTEIN P10 Error! Bookmark not defined

3.3.1 Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột bạchError! Bookmark not defined

3.4 PHÁT HIỆN VIRUS SRBSDV BẰNG KHÁNG THỂ TINH SẠCH

Error! Bookmark not defined

3.4.1 Đánh giá độ nhạy của kháng thể Error! Bookmark not defined 3.4.2 Phát hiện SRBSDV bằng kĩ thuật ELISAError! Bookmark not defined

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Error! Bookmark not defined

TÀI LIỆU THAM KHẢO iii

PHỤ LỤC Error! Bookmark not defined

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Phạm Xuân Hội

và GS.TS Phan Tuấn Nghĩa là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn,

giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp

đỡ tôi rất nhiều trong thời gian hoàn thành luận văn tại Bộ môn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy, cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã nhiệt tình động viên và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 03 tháng 11 năm 2014

Học viên

Phạm Thị Vân

DANH MU ̣C BẢNG BIỂU

Bảng 1: Các cặp oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2: Thành phần phản ứng ghép nối

Bảng 3: Thành phần phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector pGEMT

Bảng 4: Enzyme cắt giới ha ̣n và trình tự nhận biết được sử du ̣ng trong đề tài

Bảng 5: Thành phần gel SDS-PAGE 12 %

Bảng 6: Thành phần phản ứng PCR nhân bản đoạn gen P10

Bảng 7: Thành phần phản ứng cắt giới hạn pGEMT/P10

Bảng 8: Thành phần phản ứng cắt giới hạn pGEMT/P10 và pET28a

Bảng 9: Thành phần phản ứng cắt giới hạn pET28a/P10

Bảng 10: Các điều kiện cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp

Bảng 11: Kết quả đo OD492 thử độ đặc hiệu của kháng thể bằng phản ứng ELISA Bảng 12: Kết quả đo OD492 của phản ứng ELISA xét nghiệm SRBSDV trên mẫu rầy

DANH MU ̣C CÁC HÌNH

Hình 1: Triệu chứng cây lúa bị nhiễm bệnh LSĐ

Hình 2: Rầy lƣng trắng Sogatella furcifera truyền SRBSDV

Hình 3: Cấu trúc vỏ hình đa diện icosahedral kiểu T=13 của chi Fijivirus

Hình 4: Tinh thể virus và phân tử virus SRBSDV phát hiện bằng kính hiển vi điện

tử trên tế bào cây lúa bị bệnh LSĐ tại Việt Nam năm 2009

Hình 5: Điện di sản phẩm PCR nhân bản đoa ̣n gen P10 trên gel agarose 1%

Hình 6: Sơ đồ vector pGEMT và các vị trí enzyme giới hạn

Hình 7: Biến nạp vector tái tổ hợp mang đoa ̣n gen P10 vào tế bào E coli

Hình 8: PCR kiểm tra mô ̣t số khuẩn la ̣c trắng

Hình 9: PCR kiểm tra khuẩn lạc với thí nghiệm nhân đoa ̣n gen P10

Hình 10: Điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp pGEMT/P10

Hình 11: Điê ̣n di sản phẩm cắt giới ha ̣n bằng BamHI/XhoI

Hình 12: Sơ đồ vector pET28a và vi ̣ trí ghép nối đoa ̣n gen P10

Hình 13: Biến nạp vector tái tổ hợp mang đoa ̣n gen P10 vào E coli DH5α

Hình 14: Điện di sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv

Hình 15: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid pET28a/P10

Hình 16: Điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp pET28a/P10

Hình 17: Biến nạp vector pET28a/P10 vào vi khuẩn E coli Rossetta

Hình 18: Điện di SDS-PAGE kiểm tra sự có mặt của protein P10 tái tổ hợp trong điều kiện chuẩn

Hình 19: Kiểm tra sự có mặt của protein P10 tái tổ hợp trong điều kiện khác nhau

về nhiệt độ và thời gian

Hình 20: Điện di sản phẩm sau tinh sạch dịch chiết tế bào

Hình 21: Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của kháng huyết thanh bằng thẩm tách miễn dịch Hình 22: Sắc ký huyết thanh chuột sau khi gây miễn dịch qua cột protein A- sepharose

Hình 23: Điện di SDS- PAGE kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể

Hình 24: Phân tích Western blotting sử dụng kháng thể tinh sạch (1:2000) Hình 25: Thử độ nhạy của kháng thể tinh sạch

Hình 26: Thử độ đặc hiệu của kháng thể tinh sạch (1:5000)

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

dNTPs Deoxy triphosphates nucleotides

dsRNA Axit ribonucleotide sơ ̣i đôi

EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid

ELISA Kỹ thuật phân tích hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme- linked immunosorbent assay)

IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside

ORF Khung đọc mở (open reading frame)

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide

SRBSDV Virus lúa lùn so ̣c đen phương Nam (Southern rice black strike

dwarf virus) TAE Tris base – Acetic - EDTA

TBE Tris base – Axit Boric – EDTA

TEMED N,N,N'N'-Tetramethyl-Ethylenediamine

i

Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực lâu đời nhất và cũng là cây

ngũ cốc quan trọng cung cấp nguồn lương thực cho khoảng 2/3 dân số thế giới Ở nước ta, cây lúa đã trở thành cây lương thực chủ lực liên quan đến việc làm và thu nhập của khoảng 80% số hộ nông dân Tuy nhiên, trong những năm gần đây, ngành trồng lúa đang phải đối mặt với nhiều khó khăn thách thức, nhất là thiên tai, biến đổi khí hậu, đặc biệt là dịch bệnh xảy ra thường xuyên đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất lúa gạo Do các đặc điểm về địa lý và khí hậu, Việt Nam là giao lộ các luồng di chuyển của nhiều loại côn trùng, trung gian truyền dịch; do đó các bệnh virus có diễn biến rất phức tạp, lây lan nhanh chóng và gây thiệt hại lớn

Vào cuối tháng 8/2009, tại Nghệ An, bệnh lúa lùn sọc đen (LSĐ) đã bùng phát với diện tích nhiễm bệnh lên tới 5.506 ha, trong đó gần 3.510 ha bị mất trắng Đến tháng 10/2010 bệnh đã phát triển và gây hại tại 28 tỉnh miền Bắc và Trung với tổng diện tích nhiễm bệnh lên tới 24.000 ha Bằng phương pháp sinh học phân tử, bước đầu nguyên nhân gây bệnh lạ nêu trên đã được xác định là do virus lúa lùn sọc đen phương Nam (Southern rice black strike

dwarf virus - SRBSDV) Đây là một thành viên mới của phân nhóm Fijivirus – 2, thuộc họ Reoviridae Hệ gen của SRBSDV có chi ều dài 29.124 bp, gồm

10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thước từ 1,8 đến 4,5 kb và được đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào kích thước phân đoạn RNA sợi đôi

Phân đoạn S10 có kích thước nhỏ nhất, mã hóa một protein vỏ ngoài virus và có độ bảo thủ cao nên thường được chọn trong các nghiên cứu nhằm

phát hiện các virus trong chi Fijivirus

Việc chẩn đoán cây bị nhiễm SRBSDV hiện nay đều được thực hiện bằng phương pháp RT-PCR nhằm phát hiện phân đoạn RNA sợi đôi của virus

có trong mẫu bệnh cây Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật cao, chi phí tốn kém đồng thời không thuận tiện cho việc tiến hành với điều kiện ngoài đồng ruộng Việc xác định tác nhân gây bệnh mất nhiều thời gian, chi phí cao

ii

đã dẫn tới khó khăn trong việc ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh làm thiệt hại nhiều hecta sản lượng lương thực Vì vậy, việc sớm tìm ra phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh là việc làm vô cùng quan trọng và cấp bách hiện nay

Với mục đích biểu hiện đoa ̣n gen P10 mã hoá protein vỏ virus làm tiền

đề cho việc phát triển kit chẩn đoán nhanh , chính xác bệnh lúa lùn sọc đen phương Nam dựa trên phương pháp ELISA , chúng tôi đã thực hiện đề tài:

“Phân lâ ̣p và biểu hiê ̣n gen mã hoá protein vỏ P10 của virus gây bệnh lúa lùn sọc đen ở Việt Nam” nhằm phục vụ công tác chẩn đoán sớm bê ̣nh ha ̣i

trên đồng ruô ̣ng

iii

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

1 Lê Bền (2009), “Bắt bệnh” lúa lùn: Chưa ngã ngũ nguyên nhân”, Báo Nông

nghiê ̣p Viê ̣t Nam, Số ra ngày 24/9/2009

2 Bộ NN & PTNT (2009), Công điê ̣n (Số 31/CĐ-BNN-BVTV) v/v Cảnh giác đối với bê ̣nh vàng lùn, lùn xoắn lá trên lúa bộc phát lần đầu tiên ở phía Bắc

để phát hiện, phòng trừ kịp thời

3 Hà Viết Cường, Nguyễn Viết Hải, Vũ Triệu Mân (2009), "Xác định nguyên

nhân lúa lùn sọc đen (lùn lụi) trên lúa mùa năm 2009 tại miền Bắc", Tạp chí

BVTV, 6, tr 24-31

4 Nguyễn Đình Hương (2009), “Nghệ An: Ra quân tiêu diệt nguồn bệnh dịch

“lùn lụi” lúa”, Báo Nông nghiê ̣p Viê ̣t Nam, Số ra ngày 14/9/2009

5 Sao Mai (2009), “Chuyện khẩn cấp ở Nghệ An: Trên 5.500 ha lúa HT bị VL

– LXL”, Báo Nông nghiê ̣p Viê ̣t Nam, Số ra ngày 7/9/2009

6 Vũ Triệu Mân (2007), Giáo trình bệnh cây đại cương , Trườ ng Đa ̣i ho ̣c Nông nghiê ̣p I, Hà Nội

7 Vũ Triệu Mân (2010), Bê ̣nh virus hại thực vật ở Viê ̣t Nam, NXB Nông

nghiê ̣p Hà Nô ̣i

8 Đinh Văn Thành, Nguyễn Thị Dương, Lại Tiến Dũng, Phan Thị Bích Thu (2008), "Một số kết quả nghiên cứu về sinh thái rầy lưng trắng ở phía Bắc Việt Nam", Hội nghị côn trùng toàn quốc Việt Nam lần thứ 6, Hà Nội, 9-10/5/2008, 281-287

9 Ngô Vĩnh Viễn, Phạm Thị Vượng, Nguyễn Như Cường, Tạ Hoàng Anh, Nguyễn Thị Me, Phan Bích Thu, Phạm Hồng Hiển, Hà Viết Cường (2009),

"Kết quả chẩn đoán bệnh virus lúa lùn sọc đen ở một số tỉnh miền Bắc Việt

Nam", Tạp chí BVTV, 6, tr 8-18

iv

Tài liệu tiếng Anh

10 Amero S A., James T C and Elgin C R (1994), "Production of

antibodies using protein in gel bands" In: Basic Protein and Peptide

Protocols Vol.32 (Humana Press, editor), Springer, pp 717-720

11 Caspal D L., Klug A (1962), "Physical principles in the construction of

regular viruses", Cold Spring Harb Symp Quant Biol., 27, pp 1-24

12 Cuong H V., Coombs S., Revill P., Harding R., Vu M., Dale J L (2008),

"Design DNA application of two novel degenerate primer pairs for the

detection DNA complete genomic characterization of potyvirus", Arch

Virol., 153, pp 25-36

13 Cuong H V., Coombs S., Revill P., Harding R., Vu M., Dale J L (2008),

“Molecular characterization of begomovirus DNA satellites from Vietnam: additional evidence that the New World geminivirus were

present in the Old World prior to continental separation”, J Gener Virol.,

89, pp 312-326

14 Dodds J A., Morris T J., Jordan R L (1984), "Plant viral double-stranded

RNA", Annu Rev Phytopathol., 22, pp 151-168

15 Goodman M F (2002) "Error-prone repair DNA polymerase in

prokaryotes and eukaryotes", Annu Rev Biochem, 71, pp 17 - 50

16 GuoHui Z., Jung W J., Jiang C D., Peng L., Lin X D., Guang Z S (2008), "Southern rice black–streaked dwarf virus: A new proposed

Fijivirus species in the family Reoviridae", Chin Sci Bullet., 53, pp

3677-3685

17 Hibino H (1989), "Insect-borne virus of rice", Advances in Disease Vector

Research, Springer 6, pp 209-41

18 Hibino H (1996), "Biology and epidemiology of rice viruses", Ann Rev

Pathology., Springer 34, pp 249-274

v

19 Kishimoto R (1979), "Brown planthopper migration", In Brown

Planthopper: Threat to Rice Production in Asia, Los Ba˜nos, Philippines: IRRI, pp 113–124

20 Hoang A T., Zhang H M., Yang J., Chen J P., Hebrard E., Zhou G H., Vinh V N., Cheng J A (2011), "Identification, characterization, and distribution of southern rice black-streaked dwarf virus in Viet-nam",

Plant Dis., 95, pp 1063–1069

21 Laemmli V K (1970) "Cleavage of structure protein during the assembly

of the head of bacterophage T4", Nature 227, pp 680 - 685

22 Lee J Y, Lee S H., Cung B J (1977), "Studies on the occurrence of rice

black-streaked dwarf virus in Korea", Korean J Plant Prot., 16, pp.121–

25

23 Li Y., Xia Z., Peng J., Zhou T., Fan Z (2013), "Evidence of recombination

and genetic diversity in southern rice black-streaked dwarf virus", Arch

Virol., 158, pp, 2147-2151

24 Michael G R., Venigalla B R (2012), "Viral Molecular Machines",

Advance in Experimental Medicine and Biology, pp 726

25 Mullis K F., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G and Erlich H (1986)

"Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: The polymerase chain

reaction", Cold Spring Harbor Symposium in Quantitative Biology, 51, pp

263 – 273

26 Sambrook J and Russell D W (2001), Molecular Cloning:A Laboratory

Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,

NY

27 Shikata E (1974), “Rice black streaked dwarf virus”, CMI/AAB

Description of Plant Viruses No 135

28 Studier F W (2005), "Protein production by auto-induction in

high-density shaking cultures", Protein Expr Purif, 41, pp 207 – 234