Phân lập và biểu hiện gen mã hóa protein vỏ p10 của virus gây bệnh lúa lùn sọc đen ở việt nam

DANH MU ̣C BẢNG BIỂU Bảng 1: Các cặp oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu Bảng 2: Thành phần phản ứng ghép nối Bảng 3: Thành phần phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector pGEMT

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN 3

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS HẠI LÚA 3

1.2 BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN VÀ VIRUS SRBSDV 5

1.2.1 Bệnh lúa lùn sọc đen 5

1.2.2 Virus lúa lùn sọc đen phương Nam 11

1.3 ĐẶC ĐIỂM ĐOẠN GEN P10 VÀ PROTEIN VỎ NGOÀI SRBSDV 15

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ PHÁT HIỆN SRBSDV 17

1.5 KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ ỨNG DỤNG THỰC TIỄN 18

1.5.1 Giới thiệu chung về kháng thể đa dòng 18

1.5.2 Một số ứng dụng của kháng thể đa dòng 21

CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 24

2.1 VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT 24

2.1.1 Vật liệu thí nghiệm 24

2.1.2 Hóa chất 24

2.1.3 Thiết bị 25

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25

2.2.1 Nhân bản đoạn DNA đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR 25

2.2.2 Điện di DNA trên gel agarose 26

2.2.3 Ghép nối DNA bằng enzyme DNA ligase 26

2.2.4 Biến nạp vi khuẩn E coli 27

2.2.5 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn 27

2.2.6 Tinh sạch DNA từ gel agarose 28

2.2.7 Nhân dòng sản phẩm PCR 29

2.2.8 Phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn 29

2.2.9 Giải trình tự nucleotide các đoạn DNA 30

2.2.10 Điện di protein trên gel polyacrylamide có chứa SDS 31

2.2.11 Nuôi cấy E coli và chuẩn bị dịch chiết tế bào 32

2.2.12 Tinh sạch protein tái tổ hợp qua cột Ni2+ agarose 32

2.2.13 Định lượng protein bằng cách đo độ hấp thụ ánh sáng vùng tử ngoại (A280) 33

2.2.14 Gây kháng thể đa dòng trên chuột bạch 33

2.2.15 Phương pháp thẩm tách miễn dịch (Western blotting) 33

2.2.16 Tinh sạch kháng thể IgG bằng cột sắc kí protein A-sepharose 34

2.2.17 Phương pháp Dot Blot 35

2.2.18 Phương pháp ELISA 36

3.1 NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN P10 TỪ cDNA CỦA PHÂN ĐOẠN S10 37 3.1.1 Nhân bản đoạn gen P10 bằng phản ứng PCR 37

3.1.2 Ghép nối đoạn gen P10 vào vector pGEMT 39

3.1.3 PCR kiểm tra sự có mặt của plasmid tái tổ hợp 40

3.1.4 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pGEMT mang đoạn gen P10 41

3.1.5 Giải trình tự đoạn gen P10 của chủng SRBSDV 44

3.2 BIỂU HIỆN VÀ TINH SẠCH PROTEIN TÁI TỔ HỢP P10 45

3.2.1 Thiết kế vector biểu hiện pET28a mang đoạn gen P10 45

3.2.2 Biểu hiện và tinh sạch protein tái tổ hợp P10 52

3.3 GẤY KHÁNG THỂ ĐA DÒNG KHÁNG PROTEIN P10 58

3.3.1 Gây đáp ứng miễn dịch trên chuột bạch 58

3.4 PHÁT HIỆN VIRUS SRBSDV BẰNG KHÁNG THỂ TINH SẠCH 63

3.4.1 Đánh giá độ nhạy của kháng thể 63

3.4.2 Phát hiện SRBSDV bằng kĩ thuật ELISA 64

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 67

PHỤ LỤC i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS Phạm Xuân Hội

và GS.TS Phan Tuấn Nghĩa là những người thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn,

giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành khóa luận này

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các cán bộ, anh chị em trong Bộ môn Bệnh học Phân tử Thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp

đỡ tôi rất nhiều trong thời gian hoàn thành luận văn tại Bộ môn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy, cô giáo thuộc Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy, cô giáo trong Bộ môn Sinh lý thực vật và Hóa sinh đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập tại trường

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè đã nhiệt tình động viên và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành luận văn này

Hà Nội, ngày 03 tháng 11 năm 2014

Học viên

Phạm Thị Vân

DANH MU ̣C BẢNG BIỂU

Bảng 1: Các cặp oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu

Bảng 2: Thành phần phản ứng ghép nối

Bảng 3: Thành phần phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector pGEMT

Bảng 4: Enzyme cắt giới ha ̣n và trình tự nhận biết được sử du ̣ng trong đề tài

Bảng 10: Các điều kiện cảm ứng biểu hiện protein tái tổ hợp

Bảng 11: Kết quả đo OD492 thử độ đặc hiệu của kháng thể bằng phản ứng ELISA Bảng 12: Kết quả đo OD492 của phản ứng ELISA xét nghiệm SRBSDV trên mẫu rầy

DANH MU ̣C CÁC HÌNH

Hình 1: Triệu chứng cây lúa bị nhiễm bệnh LSĐ

Hình 2: Rầy lƣng trắng Sogatella furcifera truyền SRBSDV

Hình 3: Cấu trúc vỏ hình đa diện icosahedral kiểu T=13 của chi Fijivirus

Hình 4: Tinh thể virus và phân tử virus SRBSDV phát hiện bằng kính hiển vi điện

tử trên tế bào cây lúa bị bệnh LSĐ tại Việt Nam năm 2009

Hình 5: Điện di sản phẩm PCR nhân bản đoa ̣n gen P10 trên gel agarose 1%

Hình 6: Sơ đồ vector pGEMT và các vị trí enzyme giới hạn

Hình 7: Biến nạp vector tái tổ hợp mang đoa ̣n gen P10 vào tế bào E coli

Hình 8: PCR kiểm tra mô ̣t số khuẩn la ̣c trắng

Hình 9: PCR kiểm tra khuẩn lạc với thí nghiệm nhân đoa ̣n gen P10

Hình 10: Điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp pGEMT/P10

Hình 11: Điê ̣n di sản phẩm cắt giới ha ̣n bằng BamHI/XhoI

Hình 12: Sơ đồ vector pET28a và vi ̣ trí ghép nối đoa ̣n gen P10

Hình 13: Biến nạp vector tái tổ hợp mang đoa ̣n gen P10 vào E coli DH5α

Hình 14: Điện di sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc với cặp mồi T7-Fw/T7-Rv

Hình 15: Điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid pET28a/P10

Hình 16: Điện di sản phẩm cắt giới hạn vector tái tổ hợp pET28a/P10

Hình 17: Biến nạp vector pET28a/P10 vào vi khuẩn E coli Rossetta

Hình 18: Điện di SDS-PAGE kiểm tra sự có mặt của protein P10 tái tổ hợp trong điều kiện chuẩn

Hình 19: Kiểm tra sự có mặt của protein P10 tái tổ hợp trong điều kiện khác nhau

về nhiệt độ và thời gian

Hình 20: Điện di sản phẩm sau tinh sạch dịch chiết tế bào

Hình 21: Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của kháng huyết thanh bằng thẩm tách miễn dịch Hình 22: Sắc ký huyết thanh chuột sau khi gây miễn dịch qua cột protein A- sepharose

Hình 23: Điện di SDS- PAGE kiểm tra độ tinh sạch của kháng thể

Hình 24: Phân tích Western blotting sử dụng kháng thể tinh sạch (1:2000) Hình 25: Thử độ nhạy của kháng thể tinh sạch

Hình 26: Thử độ đặc hiệu của kháng thể tinh sạch (1:5000)

BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

CBB Coomassie Brillant Blue

dNTPs Deoxy triphosphates nucleotides

dsRNA Axit ribonucleotide sơ ̣i đôi

E coli Escherichia coli

EDTA Ethylenediamine tetraacetic acid

ELISA Kỹ thuật phân tích hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme- linked immunosorbent assay)

ORF Khung đọc mở (open reading frame)

PCR Phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction) SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide

SRBSDV Virus lúa lùn so ̣c đen phương Nam (Southern rice black strike

dwarf virus) TAE Tris base – Acetic - EDTA

TBE Tris base – Axit Boric – EDTA

TEMED N,N,N'N'-Tetramethyl-Ethylenediamine

1

Cây lúa (Oryza sativa L.) là cây lương thực lâu đời nhất và cũng là cây ngũ

cốc quan trọng cung cấp nguồn lương thực cho khoảng 2/3 dân số thế giới Ở nước

ta, cây lúa đã trở thành cây lương thực chủ lực liên quan đến việc làm và thu nhập của khoảng 80% số hộ nông dân Tuy nhiên, trong những năm gần đây, ngành trồng lúa đang phải đối mặt với nhiều khó khăn thách thức, nhất là thiên tai, biến đổi khí hậu, đặc biệt là dịch bệnh xảy ra thường xuyên đã ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất lúa gạo Do các đặc điểm về địa lý và khí hậu, Việt Nam là giao lộ các luồng di chuyển của nhiều loại côn trùng, trung gian truyền dịch; do đó các bệnh virus có diễn biến rất phức tạp, lây lan nhanh chóng và gây thiệt hại lớn

Vào cuối tháng 8/2009, tại Nghệ An, bệnh lúa lùn sọc đen (LSĐ) đã bùng phát với diện tích nhiễm bệnh lên tới 5.506 ha, trong đó gần 3.510 ha bị mất trắng Đến tháng 10/2010 bệnh đã phát triển và gây hại tại 28 tỉnh miền Bắc và Trung với tổng diện tích nhiễm bệnh lên tới 24.000 ha Bằng phương pháp sinh học phân tử, bước đầu nguyên nhân gây bệnh lạ nêu trên đã được xác định là do virus lúa lùn sọc đen phương Nam (Southern rice black strike dwarf virus - SRBSDV) Đây là một

thành viên mới của phân nhóm Fijivirus – 2, thuộc họ Reoviridae Hệ gen của

SRBSDV có chiều dài 29.124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích thước từ 1,8 đến 4,5 kb và được đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào kích thước phân đoạn RNA sợi đôi

Phân đoạn S10 có kích thước nhỏ nhất, mã hóa một protein vỏ ngoài virus và

có độ bảo thủ cao nên thường được chọn trong các nghiên cứu nhằm phát hiện các

virus trong chi Fijivirus

Việc chẩn đoán cây bị nhiễm SRBSDV hiện nay đều được thực hiện bằng phương pháp RT-PCR nhằm phát hiện phân đoạn RNA sợi đôi của virus có trong mẫu bệnh cây Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật cao, chi phí tốn kém đồng thời không thuận tiện cho việc tiến hành với điều kiện ngoài đồng ruộng Việc xác định tác nhân gây bệnh mất nhiều thời gian, chi phí cao đã dẫn tới khó khăn

2

trong việc ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh làm thiệt hại nhiều hecta sản lượng lương thực Vì vậy, việc sớm tìm ra phương pháp chẩn đoán nhanh bệnh là việc làm

vô cùng quan trọng và cấp bách hiện nay

Với mục đích biểu hiện đoa ̣n gen P10 mã hoá protein vỏ virus làm tiền đề

cho viê ̣c phát triển kit chẩn đoán nhanh , chính xác bệnh lúa lùn sọc đen phương

Nam dựa trên phương pháp ELISA , chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Phân lâ ̣p và

biểu hiê ̣n gen mã hoá protein vỏ P10 của virus gây bệnh lúa lùn so ̣c đen ở Việt Nam” nhằm phục vụ công tác chẩn đoán sớ m bê ̣nh ha ̣i trên đồng ruô ̣ng

3

CHƯƠNG 1- TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ VIRUS HẠI LÚA

Virus là một trong những tác nhân gây bệnh nguy hiểm nhất và là nguyên nhân chính làm giảm sản lượng nông nghiệp, dẫn đến sản lượng nông nghiệp không

ổn định và gây ra tình trạng mất an ninh lương thực Đặc biệt trong bối cảnh thay đổi khí hậu toàn cầu, cân bằng sinh thái bị phá vỡ do việc canh tác quá phụ thuộc vào thuốc hóa học đã làm cho diễn biến phát sinh dịch và mức độ gây hại của các bệnh virus càng trở nên nguy hiểm và phức tạp hơn lúc nào hết

Trong sản xuất nông nghiệp có khoảng hơn 1000 loài virus gây hại cho thực vật và các loại cây nông nghiệp như cây ngô, đậu tương… và khoảng 16 loại virus

gây hại cho lúa (phụ lục 1) Trong số các virus hại lúa, ngoài Rice hoja blanca virus (một ternuivirus, phân bố tại Nam Mỹ), Rice giallume virus (một luteovirus, phân

bố tại châu Âu) và Rice stripe necrosis virus (một furovirus, phân bố tại châu Phi)

thì 13 virus còn lại đều phát hiện thấy tại các nước trồng lúa châu Á Tuy nhiên, chỉ

có 5 bệnh virus gây hại nghiệm trọng và phổ biến trên lúa là: bệnh vàng lùn (bệnh lúa cỏ), bệnh lúa lùn xoắn lá, bệnh Tungro, bệnh lúa sần lùn, bệnh vàng lá tạm thời [7, 11-13, 16]

Nghề trồng lúa ở Việt Nam đã và đang phải đối mặt với các đợt dịch bệnh virus diễn ra liên tiếp và đang diễn biến rất phức tạp Trong khi dịch virus vàng lùn

và lùn xoắn lá ở miền Nam chưa kết thúc thì các tỉnh miền Bắc và miền Trung đang phải đối mặt với dịch SRBSDV Vì vậy, định hướng nghiên cứu bệnh virus hại lúa trong giai đoạn hiện nay cần phải có sự kết hợp hài hòa giữa nghiên cứu đối ứng và nghiên cứu dài hơi Nghiên cứu đối ứng tập trung vào khâu chỉ đạo sản xuất và phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh từ đó xây dựng các biện pháp phòng trừ hiệu quả Trong khi đó, nghiên cứu dài hơi tập trung vào khâu xác định bản chất hệ gen, mức

độ đa dạng di truyền, tính độc và mức độ đột biến để xác định danh tính tác nhân gây bệnh, hoàn thiện các quy trình chẩn đoán chính xác, nguy cơ phát sinh chủng mới và tiến tới các biện pháp phòng trừ hiệu quả tác nhân gây bệnh dựa trên công

4

nghệ gen Các nghiên cứu về virus ở Việt Nam hiện mới tập trung ở khâu phát hiện sau đó áp dụng các biện pháp canh tác như nhổ bỏ cây bệnh, diệt môi giới truyền bệnh, trồng giống kháng rầy, luân canh… Gần đây, trướ c tình hình gây h ại và diễn biến phát dịch bệnh virus rất phức tạp, Nhà nước đã quan tâm nhiều đến việc đầu tư nghiên cứu và áp dụng các thành tựu khoa học và công nghệ trên thế giới trong việc phát hiện và phòng chống bệnh virus lúa, vì vậy đã nâng cấp một bước đáng kể năng lực trong nghiên cứu và phòng chống virus hại lúa ở Việt Nam Một số cơ quan nghiên cứu như Viện Bảo vệ thực vật và Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội

đã hoàn thiện quy trình chẩn đoán dựa trên kháng huyết thanh, RT-PCR và đã sản xuất được kháng huyết thanh cho virus vàng lùn và lùn xoắn lá; đã thiết kế các cặp mồi đặc hiệu cho virus lúa cỏ (Rice grassy stunt virus-RGSV), lùn xoắn lá (Rice ragged stunt virus-RRSV), lùn sọc đen (Rice black streaked dwarf virus-RBSDV), lúa sọc (Rice stripe virus-RSV), tungro (Rice tungro spherical virus-RTSV) và lùn sọc đen phương Nam (Southern rice black strike dwarf virus-SRBSDV) Các nghiên cứu về quan hệ giữa virus vàng lùn và lùn xoắn lá với rầy nâu, các loại rầy (rầy nâu, rầy nâu nhỏ và rầy lưng trắng) và biện pháp phòng trừ môi giới truyền bệnh và bệnh virus hại lúa cũng đã được nghiên cứu khá đầy đủ và bài bản tại Viện Bảo vệ thực vật Các nghiên cứu về virus hại lúa tại Viện Di truyền và Viện Công nghệ Sinh học lại tập trung vào các nghiên cứu phân tử như giải trình tự gen, tạo giống chống chịu virus bằng công nghệ gen như công nghệ RNAi Hiện Viện Di truyền đã đăng ký 14 trình tự gen của virus vàng lùn và lùn xoắn lá lúa trên Ngân hàng gen; đã xác định các gen quan trọng và các đoạn trình tự bảo thủ của các gen virus (không trùng lặp với trình tự gen của cây chủ); đã thiết kế các vector RNAi mang gen có khả năng làm bất hoạt virus và đã nhận được một số cây chuyển gen Gần đây, trong một hợp tác nghiên cứu với Trung tâm nghiên cứu Nông nghiệp Quốc gia Nhật Bản, Viện Di truyền đã sản xuất được 7 bộ kit chẩn đoán 7 loại virus gây bệnh trên lúa dựa trên kháng huyết thanh bao gồm: virus lúa cỏ (RGSV), lùn xoắn lá (RRSV), lùn sọc đen (RBSDV), lúa sọc (RSV), tungro (Rice tungro spherical virus-RTSV), tungro (Rice tungro bacilliform virus RTBV), bệnh lúa lùn

5

(Rice dwarf virus-RDV) và vết u lùn lúa (Rice gall dwarf virus-RGDV) với số lượng đủ cho hợp tác nghiên cứu và chẩn đoán Các tiến bộ trong nghiên cứu virus hại lúa ở Việt Nam trong thời gian qua là đáng ghi nhận nhưng vẫn chưa thể đáp ứng được với diễn biến phức tạp của dịch virus hiện nay, đặc biệt là SRBSDV Vì vậy các nghiên cứu về virus hại lúa cần phải nâng lên một bước, tập trung vào các nghiên cứu chuyên sâu mang tính chất dài hơi để giải quyết tận gốc căn nguyên như các nghiên cứu về bản chất phân tử, diễn biến phát dịch và các biện pháp kiểm soát dựa trên kỹ thuật phân tử như siêu biểu hiện gen, bất hoạt gen và đột biến

1.2 BỆNH LÚA LÙN SỌC ĐEN VÀ VIRUS SRBSDV

1.2.1 Bệnh lúa lùn sọc đen

1.2.1.1 Tình hình bệnh trên thế giới

Bệnh lúa LSĐ là bệnh do virus lúa lùn sọc đen (Rice black streaked dwarf virus-RBSDV) gây ra và được phát hiện lần đầu tiên ở Nhật Bản vào năm 1952 [27] RBSDV được ghi nhận gây hại và gây thành dịch ở các nước Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc Đợt dịch bệnh đầu tiên ở Nhật bản được ghi nhận trên ngô vào những năm 1957 – 1961, rồi trên lúa và ngô những năm 1965 – 1967 Ở Trung Quốc dịch bệnh đã xảy ra vào năm 1963 và sau đó 1965 – 1967 trên lúa, ngô, lúa mì

và đại mạch Tỷ lệ bệnh RBSDV đạt cao điểm vào các năm 1975 và 1976 [22] Ngoài những đợt cao điểm phát triển của bệnh kể trên thì bệnh lúa LSĐ thường chỉ xuất hiện cục bộ và rải rác với tỷ lệ nhiễm thấp ở cả 3 nước Tại cùng một khu vực

bị bệnh thì RBSDV thường gây hại nghiêm trọng trên ngô và ít nghiêm trọng hơn trên lúa cũng như các cây trồng khác Một số nơi như Tohuku, phía bắc Nhật Bản, virus này chỉ gây hại trên ngô mà không gây hại trên lúa Chỉ có một vùng nhỏ ở Hokkaido, phía Bắc của Tohoku, RBSDV gây hại cả trên ngô và trên lúa nhưng với

tỷ lệ nhiễm thấp [18]

Tại Nhật Bản, các nhà nghiên cứu đã phát hiện có mối quan hệ chặt chẽ giữa

sự tăng cao tỷ lệ nhiễm bệnh LSĐ với sự tăng mạnh của các diện tích gieo cấy lúa sớm Tuy nhiên, tỷ lệ nhiễm bệnh giảm mạnh sau năm 1968 và nguyên nhân chính

6

là do sự sụt giảm đáng kể các diện tích gieo cấy lúa mì và đại mạch Ở Trung Quốc,

sự bùng phát dịch những năm 1963 – 1967 được cho là do sự gia tăng đột biến các diện tích trồng lúa mì [33] Sau năm 1970, sự sụt giảm đáng kể tỷ lệ bệnh LSĐ lại được cho là do sự gia tăng các diện tích gieo cấy lúa 2 và 3 vụ, là nguyên nhân làm giảm đáng kể diện tích trồng lúa mì Sự bùng phát các đợt dịch chính tại Nhật bản

và Trung Quốc đã xảy ra cùng thời điểm và được cho là có liên quan đến nhau Tuy hàng năm là hy hữu, song đã có những ghi nhận về sự dịch chuyển qua lại của rầy

môi giới L striatellus, giữa Nam Trung Quốc và Nhật Bản [19]

1.2.1.2 Tình hình bệnh ở Việt Nam

Vào cuối tháng 8/2009, tại Nghệ An, mô ̣t bê ̣nh la ̣ (bê ̣nh lùn lu ̣i) đã xuất hiê ̣n trên diê ̣n rô ̣ng trên lúa mùa với tổng diê ̣n tích nhiễm bê ̣nh lên tới 5.506 ha, trong đó gần 3.510 ha bị mất trắng Cây bệnh bi ̣ lùn ma ̣nh , lá xanh đâ ̣m , nhiều lá bi ̣ xoắn

vă ̣n, sau biến vàng , trỗ không thoát Triê ̣u chứng cây bê ̣nh khá giống với bê ̣nh lùn xoắn lá ta ̣i miền Nam Tất cả các giống gieo trồng ta ̣i Nghê ̣ An (TH3-3, Nhị ưu 838, Bio 404, Bắc thơm số 7, Khang dân 18 và Hương thơm ) đều bị nhiễm bệnh (Báo Nông nghiệp Việt Nam (NNVN), ngày 7/9/2009) Cho tới giữa tháng 9, mô ̣t số đi ̣a phương ta ̣i miền Bắc như Nam Đi ̣nh , Thái Bình cũng thông báo dịch bệnh tương tự (Báo NNVN, ngày 14/9/2009)

Báo cáo tại cuộc họp do bô ̣ Nông nghiê ̣p và Phát triển nông thôn

(NN&PTNT) chủ trì ngày 23/9/2009 cho biết từ ngày 16-19/9, Cục Bảo vệ thực vật

đã kiểm tra và lấy mẫu tại một số tỉnh ở miền Bắc Cục đã phát hi ện 5 tỉnh có diện tích lúa nhiễm bệnh gồm Nghệ An, Thanh Hóa, Nam Định, Thái Bình và Ninh Bình với trên 13.000 ha lúa nhiễm bệnh, trong đó hơn 8.000 ha bị bệnh rất nặng và có khả năng mất trắng (Báo NNVN, ngày 24/9/2009)

Để làm rõ nguyên nhân gây bê ̣nh t ại Nghệ An, đă ̣c biê ̣t khi bê ̣nh đang được liên tục báo cáo xuất hiê ̣ n ta ̣i nhiều tỉnh miền Bắc , ngày 4/9/2009, Bộ NN &PTNT đã tổ chức hô ̣i thảo khẩn cấp về nguyên nhân gây bê ̣nh ta ̣i Nghê ̣ An do đích thân Bộ trưởng Cao Đức Phát chủ trì với sự tham gia của T.S Rogelio- chuyên gia về bê ̣nh

7

virus lúa của Viê ̣n N ghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) và các chuyên gia đầu ngành trong nước Dựa chủ yếu vào triê ̣u chứng quan sát bê ̣nh trên thực đi ̣a và ý kiến chuyên gia , hô ̣i nghi ̣ kết luâ ̣n bê ̣nh lúa lùn lu ̣i ta ̣i Ng hê ̣ An là do 2 virus gây bê ̣nh vàng lùn/ lùn xoắn lá giống như ở miền Nam với vector truyền bê ̣nh là rầy nâu

Ngày 8/9/2009 Bộ NN&PTNT đã có công điê ̣n số 31 (Số: BVTV) để cảnh giác các địa phương miền Bắc về dịch bê ̣nh vàng lùn, lùn xoắn lá

31/CĐ-BNN-và biện pháp phòng trừ

Tiếp theo, ngày 23/9/2009, Bô ̣ NN & PTNT la ̣i tiếp tu ̣c ho ̣p khẩn về nguyên nhân gây bê ̣nh Dựa trên kết quả ELISA trên các mẫu rầy nâu thu thâ ̣p được thử nghiê ̣m ta ̣i IRRI và Trung tâm Bảo vê ̣ thực vâ ̣t phía Nam , Bô ̣ Nông nghiệp và Cục Bảo vệ thực vật kết luận nguyên nhân gây bệnh lúa lùn lụi ở miền Bắc là do 2 virus

vàng lùn và lùn xoắn lá và do rầy nâu lan truyền (Báo NNVN ngày 24/9/09)

Trong tháng 9 và 10 năm 2009, các hoa ̣t đô ̣ng nghiên cứu nhằm xác đ ịnh tác nhân gây bê ̣nh đã được thực hiê ̣n tích cực ta ̣i các cơ quan như Viê ̣n B ảo vệ thực vật, Cục Bảo vệ thực vật, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội và IRRI Kết quả nghiên cứu đã xác định được tác nhân g ây bê ̣nh lùn l ụi lúa tại Nghệ An và các tỉnh phía

Bắc trong vụ mùa 2009 là do SRBSDV Ngay sau khi tác nhân gây bệnh được xác

định, Bộ NN&PTNT đã thành lập ban chỉ đạo phòng chống dịch LSĐ do thứ trưởng

Bùi Bá Bổng làm trưởng ban chỉ đạo

Trong vụ xuân năm 2010, theo báo cáo của Cục Bảo vệ thực vật, tính tới tháng 6, bệnh LSĐ đã phát sinh gây hại tại 28 tỉnh/thành với tổng diện tích bị nhiễm

tới 29.000 ha Các tỉnh bị nhiễm bệnh bao gồm:

+ Bắc Bộ: 20 tỉnh (Thái Bình, Bắc Giang, Bắc Kạn, Bắc Ninh, Hà Nam, Hải Dương, Hải Phòng, Hòa Bình, Hưng Yên, Lai Châu, Lào Cai, Nam Định, Ninh Bình, Phú Thọ, Quảng Ninh, Sơn La, Yên Bái, Tuyên Quang, Điện Biên, Thái Nguyên)

+ Bắc Trung Bộ: 5 tỉnh (Thanh Hóa, Nghệ An, Quảng Trị, Quảng Bình, Thừa Thiên Huế)

8

+ Nam Trung Bộ: 3 tỉnh (Quảng Nam, Quảng Ngãi, Khánh Hòa)

Trong vụ mùa năm 2010, cũng theo thông báo của Cục Bảo vệ thực vật, tính đến tháng 10, bệnh LSĐ vẫn phát sinh gây hại tại 28 tỉnh/thành tổng diện tích bị nhiễm tính từ đầu vụ là 24.000 ha, trong đó diện tích phải nhổ tỉa là 9.000 ha và

phải tiêu hủy là 1.700 ha Các tỉnh có xuất hiện bệnh lùn sọc đen bao gồm:

+ Bắc Bộ (19 tỉnh): Bắc Kạn, Lào Cai, Yên Bái, Lai Châu, Lạng Sơn, Sơn

La, Bắc Giang, Hải Dương, Điện Biên, Thái Bình, Ninh Bình, Bắc Ninh, Hải Phòng, Hòa Bình, Nam Định, Quảng Ninh, Hưng Yên, Cao Bằng và Hà Nam

+ Bắc Trung Bộ (6 tỉnh): Nghệ An, Thừa Thiên Huế, Quảng Bình, Quảng Trị, Hà Tĩnh và Thanh Hóa

+ Duyên Hải Nam Trung Bộ (3 tỉnh): Quảng Nam, Quảng Ngãi và Đà Nẵng

Từ năm 2011 – 2013, bệnh dịch đã có dấu hiệu tạm lắng, chỉ còn xuất hiện cục bộ ở một số thửa ruộng đơn lẻ Tuy nhiên, nguy cơ bùng phát dịch vẫn luôn tiềm ẩn và đe dọa sản lượng thu hoạch lúa gạo của bà con nông dân các các tỉnh miền Bắc và miền Trung

1.2.1.3 Đặc điểm triệu chứng bệnh lúa lùn sọc đen

Biểu hiện bệnh của cây lúa nhiễm SRBSDV rất giống với biểu hiện của bệnh LSĐ do RBSDV gây ra Triệu chứng của lúa nhiễm bệnh bao gồm: cây lúa tương đối thấp lùn, lá xanh đậm, lá bị xoăn ở đầu lá hoặc toàn bộ lá, rách mép lá và đặc biệt có những u sáp màu trắng đến đen chạy dọc các đường gân ở mặt sau lá, bẹ lá hoặc các đốt thân Các u sáp này được hình thành do sự phát triển vượt trội cả về số lượng và kích thước của mô mạch dẫn nhựa Khi cây còn non, gân chính trên bẹ lá cũng bị sưng phồng Từ giai đoạn làm đòng và khi có lóng, cây bị bệnh thường nảy chồi trên đốt thân và mọc nhiều rễ bất định Trên bẹ và lóng thân xuất hiện nhiều u sáp và sọc đen (rất dễ nhận thấy u sáp khi dùng tay vuốt nhẹ thân) Cây lúa bị bệnh nặng không trổ bông được hoặc trổ bông không thoát, hạt thường bị đen

Vector chính truyền SRBSDV là rầy lưng trắng (Sogatella furcifera) Cả rầy

non và rầy trưởng thành đều có khả năng truyền bệnh Rầy lưng trắng sau khi đã chích hút nhựa cây bị bệnh mang virus có thể truyền virus gây bệnh đến khi chết Một nghiên cứu về phương thức lan truyền bệnh LSĐ đã được tiến hành nhằm đánh

10

giá khả năng lan truyền SRBSDV qua vector đã đư ợc thực hiện trên 3 loài rầy là rầy

lưng trắng (Sogatella furcifera), rầy nâu (Nilaparavata lugens) và rầy nâu nhỏ (Laodelphax striatellus) Kết quả cho thấy cả rầy lưng trắng và rầy nâu nhỏ đều có khả năng truyền SRBSDV từ lúa sang lúa với hiệu quả truyền rất cao (100 % cây nhiễm bê ̣nh với chỉ 3 - 4 rầy/cây) Tuy nhiên, chỉ có rầy lưng trắng mới có khả năng truyền SRBSDV từ lúa sang ngô Nghiên cứu này cũng cho thấy rầy nâu không thể truyền đươ ̣c SRBSDV

Hình 2: Rầy lưng trắng Sogatella furcifera truyền virus SRBSDV

Một nghiên cứu về đặc tính lây truyền SRBSDV của rầy lưng trắng

Sogatella furcifera đã được các nhà khoa học Trung Quốc thực hiện nhằm xác định

các giai đoạn phát triển của bệnh cũng như tìm phương pháp kiểm soát bệnh hiệu quả nhất Bằng phương pháp RT-PCR, các nhà khoa học đã xác định được sự có

mặt của SRBSDV trong tất cả các giai đoạn phát triển khác nhau của S furcifera, bao gồm: giai đoạn ấu trùng, rầy cánh dài và rầy cánh ngắn S furcifera khi đã

nhiễm SRBSDV sẽ có khả năng truyền virus cho cây lúa trong suốt vòng đời còn

lại Tuy nhiên, SRBSDV không truyền qua giai đoạn trứng Mỗi cá thể rầy S

furcifera mang SRBSDV trung bình có thể lây nhiễm cho 48-50 cây lúa, tối đa là

87-90 cây lúa Thời gian tối thiểu và tối đa để rầy nâu lưng trắng truyền virus cho cây lúa non tương ứng là 5-7 phút và 10-12 phút, tùy theo từng giai đoạn phát triển của rầy Kết quả nghiên cứu cũng chứng tỏ giai đoạn lúa non là giai đoạn dễ bị nhiễm SRBSDV từ rầy nâu lưng trắng nhất

Rầy cánh ngắn Rầy cánh dài

11

Ngoài cây lúa, bệnh LSĐ còn gây hại trên ngô, cỏ lồng vực, cỏ chát, cỏ đuôi phụng, vì các cây này là ký chủ của rầy lưng trắng và cũng là nguồn chứa virus để rầy lưng trắng truyền sang cây lúa Bệnh cũng có thể lưu tồn trên lúa chét của cây lúa bị bệnh trước đó Virus gây bệnh tồn tại trong cơ thể rầy lưng trắng sống qua đông hoặc di chuyển rất xa theo gió và bão để gây bệnh cho lúa và một số loài cây khác ở các vùng khác hoặc vụ tiếp theo

1.2.2 Virus lúa lùn sọc đen phương Nam

1.2.2.1 Tình hình nghiên cứu virus gây bệnh lúa LSĐ ở Việt Nam

Khác biệt lớn nhất giữa nghiên cứu trong nước với nghiên cứu ngoài nước về SRBSDV là ta chưa có các nghiên cứu đầy đủ Thực tế các nghiên cứu hệ gen của

ta hiện nay chỉ dừng lại ở việc dựa trên trình tự bảo thủ của SRBSDV Trung Quốc

để thiết kế các cặp mồi nhân đoạn bảo thủ khoảng 1 kb rồi đem giải trình tự; chưa

có các nghiên cứu giải trình tự toàn bộ hệ gen, về tính đa dạng di truyền, nguy cơ phát sinh chủng mới; và đặc biệt là chưa có các nghiên c ứu tạo kháng thể để chẩn đoán và tạo giống chống bệnh virus bằng công nghệ gen Tuy nhiên, những nghiên cứu bước đầu về SRBSDV của các cơ quan như Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới (Đại học Nông nghiệp Hà Nội) và Viện Bảo vệ thực vật đã cho những đánh giá quan trọng về virus này

Ngày 27/9/2009, Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới (Đại học Nông nghiệp Hà Nội) đã nhâ ̣n đươ ̣c yêu cầu của trung tâm Kiểm di ̣ch sau nhâ ̣p khẩu 2 (thuộc Cu ̣c Bảo vệ thực vật) yêu cầu thử các m ẫu lúa thu thâ ̣p ta ̣i Nghê ̣ An (60 mẫu) Các thử nghiê ̣m ELISA với kháng huyết thanh do trun g tâm sản xuất cũng như RT -PCR với mồi đă ̣c hiê ̣u do trung tâm thiết kế đã cho thấy các mẫu lúa bê ̣nh thu ta ̣i Nghê ̣ An không bi ̣ nhiễm 2 virus gây bê ̣nh vàng lùn/lùn xoắn lá như ở miền Nam

Tuy nhiên khi chuẩn bi ̣ mẫu bê ̣nh cho kiểm tra ELISA, nhóm nghiên cứu đã quan sát thấy hai đă ̣c điểm không bình thường (ngoài các đặc điểm giống như cây bị

bê ̣nh lùn xoắn lá bi ̣ nhiễm bởi virus RRSV ở miền Nam như cây lùn , lá xanh đậm, ngọn lá xoắn vặn):

12

+ Cây bệnh khôn g biểu hiê ̣n triê ̣u chứng táp và biến vàng ta ̣i mô ̣t bên của mép lá ở các lá bị xoắn vặn Đây là mô ̣t triê ̣u chứng luôn được quan sát thấy trên cây bi ̣ bê ̣nh lùn xoắn lá bị nhiễm RRSV

+ Có nhiều nốt phồng nhỏ màu trắng tới nâu chạy do ̣c gân của thân cây lúa sau khi bóc lớp be ̣ bên ngoài Các nốt phồng này đặc biệt nhiều ở phần lóng sát gốc

Các mẫu được thu thập tiếp theo tại Nam Định , Thanh Hóa, Sơn La cũng đều

có triệu chứng tương tự mẫu Nghê ̣ An

Dựa trên hai triê ̣u chứng trên , đă ̣c biê ̣t là triê ̣u chứng thứ hai , tác nhân gây

bê ̣nh đã được dự đoán là do mô ̣t reovirus (họ Reoviridae) gây ra Các triệu chứng

này khá giống với 2 reovirus là SRBSDV và RBSDV Để kiểm tra liê ̣u mẫu lúa

bê ̣nh miền Bắc có bi ̣ nhiễm RBSDV và SRBSDV hay không , mô ̣t că ̣p mồi đă ̣c hiê ̣u đồng thời cho cả 2 virus này đã được thiết kế dựa trên vùng bảo thủ phân đoa ̣n S 10 của tất cả các chủng đã công bố của 2 virus này trên Ngân hàng gen Kết quả kiểm tra RT-PCR cho thấy các mẫu bê ̣nh thu thâ ̣p ta ̣i Nghê ̣ An và mô ̣t số đi ̣a phương miền Bắc như Thanh Hóa , Nam Đi ̣nh , Sơn La đều cho phản ứng RT -PCR dương tính đối với mồi đặc hiệu RBSDV và SRBSDV, nhưng không phản ứng với mồi đặc hiê ̣u virus lùn xoắn lá (RRSV) Bốn sản phẩm RT-PCR đa ̣i diê ̣n cho Nghê ̣ An, Nam

Đi ̣nh, Thanh Hóa và Sơn La đã được giải trình tự trực tiếp Kết quả phân tích trình tự và phả hệ cho thấy cả 4 mẫu này đều là SRBSDV Ngoài ra, nghiên cứu hiển vi điện tử cũng phát hiện thấy phân tử virus và thể vùi của virus trong mô cây lúa bị bệnh Dựa trên kết quả này , Trung tâm đã bước đầu kết luâ ̣n bê ̣nh lúa lùn lu ̣i ta ̣i miền Bắc là do SRBSDV gây ra [23, 24, 30, 34]

Trong cùng thời gian, các nghiên cứu tương tự cũng được tích cực thực hiện tại Viện Bảo vệ thực vật Nhóm nghiên cứu Viện Bảo vệ thực vật cũng hợp tác chặt chẽ với các chuyên gia Trung Quốc và Pháp để xác định tác nhân gây bệnh dựa trên

kỹ thuật RT-PCR, giải trình tự sản phẩm PCR và nghiên cứu hiển vi điện tử

Căn cứ vào đặc điểm triệu chứng bệnh trên cây, đặc điểm hình thái và kích thước tiểu thể virus trên kính hiển vi điện tử, kết quả lây bệnh nhân tạo nhằm khẳng

13

định nguyên tắc Koch, cũng như giải trình tự sản phẩm PCR trên phân đoạn S10 và S3 của hệ gen virus, nhóm nghiên cứu Viện Bảo vệ thực vật cũng xác định tác nhân gây bệnh là SRBSDV

Ngoài ra, các nghiên cứu lan truyền thực hiện tại Viện Bảo vệ thực vật cũng xác định được môi giới truyền bệnh là rầy lưng trắng giống như nghiên cứu của các tác giả Trung Quốc

Dựa vào các nghiên cứu trên, Bộ NN & PTNT thống nhất gọi lại tên bệnh tại Việt Nam là bệnh lú a LSĐ và virus gây bệnh là virus lúa lùn sọc đen phương Nam (SRBSDV)

1.2.2.2 Đặc điểm sinh học của SRBSDV

Từ năm 2001, một bệnh lúa lùn mới đã xuất hiện trên lúa (O sativa) tại một

số vùng thuộc tỉnh Quảng Đông và Hải Nam, phía Nam Trung Quốc Cây lúa nhiễm bệnh thấp lùn, lá xanh đậm, ở mặt sau lá và các đốt thân xuất hiện các nốt sần nhỏ Lúc ban đầu, virus gây bệnh chỉ được coi như là một biến chủng của RBSDV Gần đây, dựa vào các kết quả nghiên cứu về môi giới truyền bệnh, cấu trúc và bản chất

hệ gen virus, các nhà khoa học Trung Quốc đã kết luận nguyên nhân gây bệnh là do một chủng virus mới với tên gọi SRBSDV Kết luận này dựa vào các cơ sở khoa học như:

+ Virus mới có môi giới truyền bệnh riêng biệt là rầy lưng trắng – một đặc

điểm quan trọng và khá đặc trưng cho các thành viên trong nhóm Fijivirus

+ Hình dạng, kích thước và cấu trúc đặc trưng của các tiểu thể virus dưới kính hiển vi điện tử

+ Toàn bộ trình tự gen của hai biến chủng (Quảng Đông và Hải Nam) đã được xác định Các tính chất đặc trưng ở mức phân tử cho thấy trình tự gen cũng như trình tự axit amin của hai biến chủng này có độ tương đồng cao hơn hẳn so với

sự sai khác giữa các biến chủng của các thành viên khác trong nhóm Fijivirus và

nằm trong khoảng sai khác khi so sánh giữa các chủng với nhau Mặt khác, những

khác biệt này lại gần gũi hơn với Rice black streaked dwarf virus (RBSDV), Maize

14

rough dwarf virus (MRDV) và Mal de Rio Cuarto virus (MRCV) – các thành viên

trong phân nhóm Fijivirus-2 của nhóm Fijivirus, so với các thành viên thuộc các

phân nhóm khác Do đó, có thể nói chính xác hơn rằng SRBSDV là một thành viên

mới thuộc phân nhóm 2 – cùng với RBSDV, MRCV, MRDV, trong nhóm Fijivius,

họ Reoviridae

+ Việc đặt tên là SRBSDV là do có sự tương đồng về triệu chứng bệnh trên cây nhiễm, song RBSDV tập trung chủ yếu ở phía Bắc Bán cầu trong khi virus mới chỉ mới ghi nhận ở các tỉnh phía Nam Trung Quốc, đồng thời, môi giới truyền bệnh riêng – rầy lưng trắng, là côn trùng hiện diện ở phía Nam Trung Quốc trong khi rầy nâu nhỏ lại phổ biến hơn ở phía Bắc Trung Quốc [14, 16, 17]

Một nghiên cứu về phương thức lan truyền đã được tiến hành nhằm đánh giá

khả năng lan truyền virus qua vector bằng 3 loài rầy là rầy lưng trắng (S furcifera), rầy nâu (N lugens) và rầy nâu nhỏ (L striatellus) Kết quả cho thấy cả rầy lưng

trắng và rầy nâu nhỏ đều có khả năng truyền SRBSDV từ lúa sang lúa với hiê ̣u suất truyền rất cao (100% cây nhiễm bê ̣nh với chỉ 3 – 4 rầy/cây) Tuy nhiên, chỉ có rầy lưng trắng mới có khả năng truyền SRBSDV từ lúa sang ngô Nghiên cứu này cũng cho thấy rầy nâu không thể truyền đươ ̣c SRBSDV Ngoài lúa và ngô, SRBSDV cũng được xác định có thể nhiễm tự nhiên trên 3 loài cỏ dại là cỏ lồng vực

(Echinochloa crusgalli), cỏ đuôi voi (Pennisetum flaccidum) và Juncellus serotinus

có mặt trong hoặc xung quanh ruộng lúa nhiễm bệnh [6, 8, 17]

SRBSDV là một thành viên mới của phân nhóm Fijivirus-2, thuộc ho ̣

Reoviridae Hệ gen có chiều dài 29.124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích

thước từ 1,8 đến 4,5 kb và được đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào kích thước phân đoạn RNA sợi đôi Phân đoạn S1 có chiều dài 4.500 bp, mã hóa một polypeptide (chứa các vùng chức năng của enzym RNA polymerase) có trọng lượng phân tử 169 kDa Phân đoạn S2 có chiều dài 3.815 bp, chứa một ORF mã hóa một protein vỏ virus có trọng lượng phân tử 141 kDa (chưa xác định rõ chức năng) Phân đoạn S3 có chiều dài 3.618 bp, chứa một ORF mã hóa một protein có trọng lượng phân tử 141 kDa (chưa xác định rõ chức năng) và có điểm đẳng điện pI

15

(Isoelectrics point) là 5,96 Phân đoạn S4 có chiều dài 3.618 bp, chứa một ORF mã hóa một protein có vùng trình tự từ axit amin 608 – 786 tương đồng 22 – 25% với các thành viên khác của Reovirus Phân đoạn S5 có chiều dài 3.167 bp, chứa một ORF chính và một ORF mã hóa một protein (chưa xác định rõ chức năng) trọng lượng phân tử 24 kDa chồng lên ORF chính Phân đoạn S6 có chiều dài 2.651 bp,

mã hóa một protein có trọng lượng phân tử 90 kDa và có điểm đẳng điện 4,89; đây

là phân đoạn có sự khác biệt lớn nhất về trình tự nucleotide so với các thành viên

trong phân nhóm Fijivirus-2 (70,6% tương đồng so với RBSDV và 62,4% tương

đồng so với MRCV) Phân đoạn S7 có chiều dài 2.176 bp, chứa hai ORF có chiều dài 1.073 và 930 nucleotide mã hóa hai protein có trọng lượng phân tử tương ứng là 40,5 kDa và 36,4 kDa Phân đoạn S8 có chiều dài 1.928 bp, chứa một ORF có chiều dài 1.776 nucleotide mã hóa protein có trọng lượng phân tử tương ứng là 67,9 kDa Phân đoạn S9 có chiều dài 1.899 bp, chứa hai ORF có chiều dài 1.044 bp và 630 nucleotide mã hóa hai protein có trọng lượng phân tử tương ứng là 39,9 kDa và 24,2 kDa Phân đoạn S10 có chiều dài 1.797 bp, chứa một ORF có chiều dài 1.674 nucleotide mã hóa protein hình thành lớp vỏ ngoài của phân tử virus có tr ọng lượng phân tử tương ứng là 62,6 kDa [16, 17] Một nhóm nghiên cứu khác đã phân lập và giải trình tự hệ gen SRBSDV phân lập ở tỉnh Hải Nam Trung Quốc và kết quả là trình tự nucleotide của hai phân đoạn S9 và S10 có độ tương đồng 98-99% so với chủng Quảng Đông [17] Khi so sánh toàn bộ hệ gen thì hai chủng SRBSDV ở Quảng Đông và Hải Nam có độ tương đồng >97% Khi so sánh với các thành viên

của phân nhóm Fijivirus-2, hai chủng virus này chỉ có độ tương đồng ở mức độ axit amin là 77-78% so với RBSDV, 65% so với MRCV và 44% so với Fiji disease

virus (FDV) [16] Như vậy, sau 25 năm kể từ khi dịch virus lú a LSĐ bùng phát l ần cuối cùng tại Trung Quốc (năm 1975), trình tự nucleotide của hệ gen RBSDV đã thay đổi hơn 20%

1.3 ĐẶC ĐIỂM ĐOẠN GEN P10 VÀ PROTEIN VỎ NGOÀI SRBSDV

Virus SRBSDV là một thành viên mới của phân nhóm Fijivirus-2, thuộc ho ̣

Reoviridae Hệ gen có chiều dài 29.124 bp, gồm 10 phân đoạn RNA sợi đôi, có kích

16

thước từ 1,8 đến 4,5 kb và được đặt tên theo thứ tự từ S1 đến S10 dựa vào kích thước phân đoạn RNA sợi đôi [14] Phân đoạn S10 là phân đoạn nhỏ nhất , có chiều dài 1.797 bp, có tỷ lệ GC đạt 35,6%, đươ ̣c đánh giá có đô ̣ bảo thủ cao do có tỷ lê ̣

tương đồng đa ̣t gần 80% so với các loài khác trong phân chi Fijivirus 2 [29] Phân

đoa ̣n này chứa một ORF có chiều dài 1.674 nucleotide, mã hoá cho 557 axit amin,

có độ tương đồng lần lượt đạt 84,3% và 83,5% so với RBSDV và MRDV Dựa vào

đô ̣ tương đồng của trình tự nucleotide cũng như axit amin , các nhà nghiên cứu đã xác đi ̣nh được ORF này mã hóa protein vỏ ngoài của hạt virus

Protein P10 có trọng lượng phân tử là 62,6 kDa, phối hợp với protein P 8 do

gen trên phân đoạn S8 mã hóa tạo thành cấu trúc vỏ điển hình của chi Fijivirus là

dạng hình cầu đa diện đối xứng icosahedral [37] Đường kính lớp vỏ ngoài là ~ 70 nm, trên bề mặt vỏ ngoài có 12 gai ngắn gắn trên 12 đỉnh của hình đa diện icosahedral kiểu T=13 [7, 38]

Hình 3: Cấu trúc vỏ hình đa diện icosahedral kiểu T=13 của chi Fijivirus [38]

Protein P10 liên quan đến tính tương tác đă ̣c hiê ̣u với v ật trung gian và tương tác với côn trùng trung gian truyền bệnh là rầy lưng trắng , do đó có vai trò quan trọng trong sự tiến hoá của virus Kết quả so sánh các trình tự protein P10 từ nhiều nguồn đã cho thấy hầu hết các bô ̣ ba t rong trình tự có tính bảo thủ cao , chịu tác

đô ̣ng của cho ̣n lo ̣c tự nhiên ở mức âm tí nh hoă ̣c trung tính , trong khi bô ̣ ba thứ 550 chịu tác động của chọn lọc tự nhiên ở mức dương tính Nghiên cứu bước đầu đã xác

17

đi ̣nh bô ̣ ba n ày có thể là isoleucine (codon ATT), methionine (codon ATG) hoă ̣c valine (codon GTT) Kết quả này còn cần được nghiên cứu xa hơn để làm rõ vai trò của protein P10 trong tiến hoá của virus [30]

Hình 4 : Tinh thể virus và phân tử virus SRBSDV phát hiê ̣n bằng kính hiển vi

điê ̣n tử trong tế bào cây bi ̣ bê ̣nh LSĐ tại Việt Nam năm 2009 [7]

1.4 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VÀ PHÁT HIỆN SRBSDV

Việc phát hiện bệnh LSĐ khi gieo trồng lúa không quá khó khăn do cây lúa bệnh có biểu hiện khá rõ Tuy nhiên, việc phân biệt bệnh do virus SRBSDV và bệnh

do RBSDV rất khó thực hiện bằng cách quan sát hình thái bên ngoài, do cả hai bệnh đều có chung những đặc điểm về triệu chứng bệnh Cho đến nay , công tác chẩn đoán bê ̣nh virus trên lúa nhìn chung vẫn khá phức ta ̣p Hiê ̣n nay, kỹ thuật chẩn đoán

bê ̣nh virus phổ biến nhất vẫn là phương pháp ELISA và phản ứng trùng hợp chuỗi (RT-PCR và PCR)

Wang và cộng sự (2006) [32] đã ta ̣o ra kháng huyết thanh từ nguồn protein vỏ virus tái tổ hợp nhằm chẩn đoán RBSDV bằng kỹ thuâ ̣t ELISA Phương pháp này tỏ

ra khá hiệu quả khi cần chẩn đoán nhanh sự có mặt của virus gây bệnh LSĐ Tuy nhiên, đối với SRBSDV, do đây là virus mới được phát hiê ̣n (năm 2008) nên hiê ̣n nay vẫn chưa có kháng huyết thanh đă ̣c hiê ̣u virus ở mức độ thương mại Hơn nữa, theo

18

nghiên cứu của Zhang và cộng sự (2008) [35], SRBSDV có phản ứng dương tính với kháng huyết thanh của RBSDV Chính vì vậy, RT-PCR là phương pháp tối ưu, được các phòng thí nghiệm sử dụng phổ biến để phát hiện virus SRBSDV Phương pháp RT-PCR sử dụng cặp mồi được thiết kế đặc hiệu cho hệ gen của SRBSDV (chủ yếu

là phân đoạn bảo thủ S10) để khuếch đại một đoạn trình tự DNA từ khuôn là RNA sợi đôi của SRBSDV Phương pháp này có ưu điểm là độ nhạy và độ chính xác rất cao, tuy nhiên có hạn chế lớn đó là thao tác kỹ thuật phức tạp, tốn kém, đòi hỏi kỹ thuật viên phải có trình độ nhất định, khó áp dụng trên thực địa

Theo công bố mới nhất Zhenchao Wang và cộng sự (2012) [36] đã phát triển một phương pháp phát hiện nhanh SRBSDV trong mẫu lúa nhiễm bệnh, sử sụng kĩ thuật DOT-ELISA Phương pháp của Z Wang sử dụng loại kháng thể đa dòng đặc hiệu cho protein vỏ của SRBSDV (mã hóa bởi phân đoạn S10) để phát hiện sự có mặt của SRBSDV trong mẫu lúa bệnh Kết quả xét nghiệm trên 100 mẫu lúa bằng phương pháp này cho kết quả tương đồng với kết quả xét nghiệm bằng phương pháp RT-PCR Phương pháp DOT-ELISA này khắc phục được những nhược điểm của phương pháp xét nghiệm truyền thống bằng RT-PCR, đồng thời vẫn có độ chính xác cao, cho phép phát hiện sớm SRBSDV

1.5 KHÁNG THỂ ĐA DÒNG VÀ ỨNG DỤNG THỰC TIỄN

1.5.1 Giới thiệu chung về kháng thể đa dòng

Kháng thể là các globulin có trong huyết thanh của động vật có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó Kháng thể theo định nghĩa trên được gọi là kháng thể miễn dịch (immunoglobulin, kí hiệu là Ig) hay kháng thể đặc hiệu Huyết thanh động vật chứa kháng thể đặc hiệu kháng nguyên được gọi là kháng huyết thanh

Kháng thể cũng có thể được tìm thấy trong các thể dịch khác của cơ thể như sữa, nước tiểu… Những kháng thể có sẵn từ trước khi có sự tiếp xúc với kháng nguyên được gọi là kháng thể tự nhiên hay kháng thể không đặc hiệu Ở đây, chúng

ta chỉ xem xét loại kháng thể đặc hiệu

19

Trong huyết thanh người và động vật có vú chứa albumin ,  và  - globulin, thì  - globulin là kháng thể Vì bản chất của kháng thể là protein, nên các tác nhân hoá, lý như nhiệt độ, axit, kiềm làm biến tính protein có thể phá huỷ kháng thể

Hai đặc tính sinh học quan trọng của kháng thể là khả năng phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên và khả năng biểu hiện như một kháng nguyên, tức là kích thích sinh kháng thể chống lại nó Kháng thể chống lại kháng thể gọi là kháng kháng thể Có thể tạo kháng thể chống từng loại Ig (IgA, IgG, IgM …) hoặc chống từng phần cấu trúc của phân tử Ig (mảnh Fab hoặc Fc)

Tất cả các kháng thể đều có cấu trúc giống nhau gồm một hay nhiều đơn vị (monome) hợp thành Mỗi đơn vị là một phân tử protein chứa 4 chuỗi polypeptit Hai chuỗi nhẹ (ngắn) kí hiệu là L và hai chuỗi nặng (dài) kí hiệu là H được gắn với nhau bởi cầu disulfua (S – S) Trình tự axit amin ở kháng thể giống hệt nhau theo từng đôi chuỗi nặng và từng đôi chuỗi nhẹ Toàn bộ phân tử có cấu tạo đối xứng

Chuỗi nhẹ có trọng lượng phân tử là 25000, chứa khoảng 211 - 221 axit amin Ở tất cả các lớp globulin miễn dịch đều có hai loại chuỗi nhẹ, chuỗi nhẹ kappa () hoặc chuỗi nhẹ lambda () Mỗi phân tử Ig chỉ chứa hoặc hai chuỗi nhẹ 

hoặc hai chuỗi nhẹ  mà không bao giờ chứa cả hai loại Mỗi chuỗi nhẹ của Ig chứa hai vùng axit amin Một vùng có trật tự axit amin có thể thay đổi gọi là vùng biến đổi, kí hiệu là VL (variable), vùng này nằm ở phía đầu amin (-NH2) của phân tử Vùng còn lại có trật tự axit amin không thay đổi gọi là vùng cố định kí hiệu là CL(constant), vùng này nằm phía đầu carboxyl (-COOH) Trật tự axit amin vùng cố định của chuỗi nhẹ luôn giống nhau ở tất cả các lớp kháng thể hoặc theo trật tự 

hoặc theo trật tự  Ngược lại trật tự axit amin của vùng biến đổi luôn khác nhau kể

cả ở các Ig do cùng một tế bào sinh ra

Chuỗi nặng có trọng lượng phân tử khoảng 50.000, chứa khoảng 450 axit amin Có 5 loại chuỗi nặng là , , ,  và  ứng với 5 lớp kháng thể là IgG, IgM, IgA, IgD và IgE Như vậy mỗi lớp kháng thể có một loại chuỗi nặng riêng và hai loại chuỗi nhẹ chung (và ) Do vậy lớp IgG có chuỗi nặng là  được kí hiệu là

20

22 hay 22 Tương tự như vậy, lớp IgM có chuỗi nặng ký hiệu là 22 hay 22; lớp IgA có chuỗi nặng là 22 hay 22; lớp IgD có chuỗi nặng là 22 hay 22 và lớp IgE có chuỗi nặng là 22 hay 22

Mỗi chuỗi nặng chứa bốn vùng axit amin: một vùng biến đổi và ba vùng cố định Cũng tương tự như ở chuỗi nhẹ, vùng biến đổi của chuỗi nặng nằm ở phần đầu amin, kí hiệu là VH Vùng cố định nằm ở đầu cacboxyl và có trật tự axit amin giống nhau ở tất cả globulin miễn dịch thuộc cùng một lớp Ba vùng cố định của chuỗi nặng được kí hiệu là CH1, CH2, CH3 Hai vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ nằm kề nhau tạo thành vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop do vậy bảo đảm tính đa dạng của phân tử kháng thể

Vùng nằm giữa CH1 và CH2 của chuỗi nặng gọi là khớp nối, có tác dụng như chiếc bản lề, làm cho phân tử có cấu tạo hình chữ Y, nên có thể điều chỉnh dãn ra hay khép lại (từ 0 – 180o) giúp cho việc gắn phù hợp với hai quyết định kháng nguyên (epitop)

Cấu trúc kháng thể liên quan đến vị trí gắn kháng nguyên, trong mỗi vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ có ba đoạn polypeptit ngắn, tại đây trật tự axit amin rất hay thay đổi, được gọi là vùng siêu biến, đôi khi còn được gọi là vùng quyết định bổ sung CDR (Complementary Determinant Regions), đồng thời xen vào chúng là 4 đoạn trật tự axit amin ít bị thay đổi hơn, được gọi là vùng Chính sự không đồng nhất về trật tự axit amin của vùng siêu biến đã tạo nên sự đa dạng về cấu trúc của vị trí kết hợp kháng nguyên

Chuỗi J là một chuỗi glycopolypeptit có kích thước xấp xỉ chuỗi L và có trọng lượng phân tử 15.000 làm nhiệm vụ nối các đơn vị (monome) globulin miễn dịch thành các phân tử lớn (polyme) Ví dụ phân tử IgM và phân tử IgA tiết Trong thành phần của chuỗi J có nhiều cystein

21

1.5.2 Một số ứng dụng của kháng thể đa dòng

Như đã nói ở trên, kháng thể có tính đặc hiệu rất cao với kháng nguyên tương ứng của nó Kháng thể có khả năng nhận ra một phân tử protein kháng nguyên trong hơn 108 phân tử protein tương tự nhau Lợi dụng đặc điểm này, người

ta sử dụng kháng thể đa dòng vào rất nhiều mục đích khác nhau:

1.5.2.1 Sắc kí ái lực

Một kháng nguyên có thể tinh sạch bằng cột sắc kí ái lực được chế tạo bằng chính kháng thể kháng kháng nguyên ấy Kháng thể được gắn vào giá thể (gel) và nhồi lên cột, sau đó cho hỗn dịch có chứa kháng nguyên chảy qua cột Kháng nguyên sẽ liên kết một cách đặc hiệu với kháng thể trong khi tất cả các thành phần khác bị đẩy ra Cuối cùng kháng nguyên sẽ được thu lại bằng cách sử dụng đệm đẩy

có pH 2,5 hoặc >11 ở giá trị pH này, liên kết giữa kháng nguyên và kháng thể bị phá vỡ Bằng phương pháp này cũng có thể tinh sạch được kháng thể từ kháng

huyết thanh với cột sắc kí sử dụng kháng nguyên gắn trên giá thể [15]

1.5.2.2 Kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA) và hấp phụ miễn dịch liên kết enzyme (ELISA)

Cả hai kĩ thuật đều có chung một nguyên tắc là dựa trên liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, tuy nhiên cách phát hiện liên kết là khác nhau Kĩ thuật ELISA sử dụng một enzyme gắn với kháng thể, sau khi kháng thể liên kết với kháng nguyên, liên kết này sẽ được phát hiện bằng cơ chất đặc hiệu của enzyme, có khả năng hiện màu khi tiếp xúc với enzyme Trong khi đó, kĩ thuật RIA sử dụng phương pháp đánh dấu đồng vị phóng xạ để phát hiện ra liên kết kháng nguyên - kháng thể Có nhiều cách đánh dấu đồng vị phóng xạ, phổ biến là sử dụng trực tiếp hoặc gián tiếp 125I Do đặc điểm, tính phức tạp cũng như độ chính xác của hai kĩ thuật khác nhau, nên chúng có những ứng dụng khác nhau Kĩ thuật RIA thường được dùng để định lượng hormon có trong máu hay dịch mô, trong khi kĩ thuật ELISA thường dùng trong chẩn đoán virus, ví dụ như HIV Phương pháp “ELISA

22

bánh kẹp” được cải tiến từ kĩ thuật ELISA, có thể dùng để phát hiện các sản phẩm tiết, ví dụ như cytokine

1.5.2.3 Kĩ thuật thẩm tách miễn dịch (Western blotting)

Kĩ thuật này cũng dựa trên nguyên tắc tính đặc hiệu của kháng thể với kháng nguyên như kĩ thuật ELISA, nhưng có nhiều ưu điểm hơn Với những protein - kháng nguyên khó tinh sạch, muốn phát hiện, định lượng hay xác định khối lượng phân tử…người ta dùng kĩ thuật thẩm tách miễn dịch Dịch chiết thô tế bào sau khi

xử lí nhiệt được điện di trên gel polyacrylamide có SDS (SDS- PAGE) Các băng protein trên gel được điện chuyển lên màng lai, sau đó xử lý với kháng thể đặc hiệu protein kháng nguyên quan tâm Bằng cách sử dụng kháng kháng thể gắn với enzyme có khả năng hiện màu khi có mặt cơ chất, có thể phát hiện cũng như định lượng được protein quan tâm

1.5.2.4 Tạo kháng kháng thể (anti- antibody)

Kháng kháng thể được tạo ra bằng cách sử dụng kháng thể của một loài nhất định (liên kết đặc hiệu với một kháng nguyên) làm kháng nguyên để gây miễn dịch trên một loài khác Đặc điểm của kháng kháng thể là có thể liên kết đặc hiệu với tất

cả các kháng thể của loài, vì vậy tránh được việc phải tạo ra nhiều loại kháng thể đánh dấu để phát hiện ra các kháng nguyên tương ứng Kháng kháng thể có đánh dấu huỳnh quang hiện nay được sử dụng rất rộng rãi trong miễn dịch học và nhiều lĩnh vực khác của sinh học như là một nhân tố thứ cấp cho việc phát hiện kháng thể cần quan tâm, ví dụ như để xác định các cấu trúc trong tế bào, hay hỗ trợ trong kĩ thuật RIA và ELISA với những kháng thể không thể đánh dấu [15]

Một cải tiến trong việc phát hiện các kháng thể quan tâm là lợi dụng những protein vi khuẩn có khả năng liên kết đặc hiệu với kháng thể Một trong số những

protein sử dụng phổ biến là protein A, một loại protein vỏ của vi khuẩn Staphylococcus

aureus, được dùng rất nhiều trong tinh sạch kháng thể IgA, IgG [15]

1.5.2.5 Tách và xác định đặc điểm của một gen và sản phẩm protein của nó

23

Để chọn lọc một gen từ ngân hàng gen, ngoài các phương pháp lai DNA, RNA, còn có thể sử dụng phương pháp kháng nguyên - kháng thể Dùng sản phẩm protein của gen để tạo ra kháng thể đặc hiệu, sau đó dùng chính kháng thể này để phát hiện ra tế bào biểu hiện mang vector có chứa cDNA từ ngân hàng gen Phương pháp này được sử dụng rất phổ biến trong chọn lọc các gen mã hoá protein bề mặt

tế bào từ ngân hàng gen [15]

Dựa trên nguyên tắc liên kết đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể người ta cũng có thể xác định được sản phẩm protein chưa biết của một gen nhân dòng Từ trình tự nucleotit đã biết của gen, một đoạn peptit được tổng hợp và sử dụng để gây miễn dịch, tạo kháng thể đặc hiệu Kháng thể kháng peptit này sau đó có thể sử dụng để phát hiện các sản phẩm protein của gen, cũng như có thể tìm hiểu sự phân

bố hay chức năng của protein này trong tế bào và mô [15]

Những ứng dụng nêu trên chỉ là một trong số những ứng dụng chính của kháng thể đa dòng, ngoài ra còn rất nhiều các ứng dụng khác trong y học cũng như trong nghiên cứu sinh học Mỗi phương pháp, kĩ thuật có những ưu, nhược điểm riêng nhưng đều có chung một nguyên tắc là dựa trên tính liên kết đặc hiệu của kháng nguyên với kháng thể

24

CHƯƠNG 2- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU VÀ HÓA CHẤT

2.1.1 Vật liệu thí nghiệm

cDNA của phân đoa ̣n S 10 được nhân bản từ RNA hệ gen của SRBSDV phân

lâ ̣p từ mẫu lúa bê ̣nh thu thâ ̣p ta ̣i Sơn La , do bộ môn Bê ̣nh ho ̣c P hân tử thực vật, Viê ̣n Di truyền Nông nghiê ̣p (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) cung cấp Vi

khuẩn E.coli chủng DH5α và chủng Rossetta được cung cấp bởi Trung tâm Kỹ

thuật di truyền và Công nghệ sinh học Quốc tế (New Delhi, Ấn Độ) Chuột nhắt

trắng dòng Swiss do Trường Đại học Khoa học Tự nhiên cung cấp

2.1.2 Hóa chất

Cặp oligonucleotide sử dụng làm mồi trong phản ứng PCR nhân bản đoạn

gen P10 được thiết kế dựa trên trình tự đầy đủ của phân đoạn S10 đã được nhóm

nghiên cứu của Bộ môn Bệnh học phân tử thực vật, Viện Di truyền Nông nghiệp (Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) phân lập (bảng 1)

Bảng 1: Trình tự các cặp oligonucleotide sử dụng trong nghiên cứu

Tên mồi Trình tự mồi

25

PCR pGEMT Easy Vector System I củ a hãng Promega ; gel Ni-NTA dùng cho thí nghiệm tinh sạch protein được đặt mua từ hãng Invitrogen Cột sắc ký ái lực protein-A của hãng Pierce Thang chuẩn protein Bench mark prestain, Novex sharp unstain của hãng Invitrogen Các hóa chất cơ bản khác sử dụng cho sinh học phân

tử được mua của công ty Sigma và Merk (Mỹ) đều đạt độ tinh khiết cần thiết dùng cho sinh học phân tử

2.1.3 Thiết bị

Máy PCR 9700 của hãng Applied Biosystem, hệ thống điện di agarose, hệ thống điện di polyacrylamide của hãng Biorad Máy ly tâm Universal 30RF của hãng Hettich, Biofuge 28RS của hãng Heraus Máy chụp ảnh huỳnh quang Firereader của hãng UVItec

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nhân bản đoạn DNA đặc hiệu bằng kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) được Kary Mullis cùng cộng sự (1986) [25] và được tiếp tục hoàn thiện thông qua việc phát hiện và sản xuất

enzyme DNA polymerase bền nhiệt từ vi khuẩn Thermophilus aquaticus và một số

loài vi khuẩn khác Nguyên tắc của kỹ thuật PCR là phối hợp khả năng lai đặc hiệu

của DNA và khả năng tổng hợp DNA in-vitro của DNA polymerase trong môi

trường thích hợp có dư các dNTPs và cặp mồi đặc hiệu để nhân bản các đoạn DNA khác nhau lên hàng nhiều triệu lần so với ban đầu

Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại, mỗi chu kỳ đều có ba giai đoạn cơ bản:

+ Giai đoạn biến tính (Denaturing): Tách DNA mạch kép thành dạng mạch đơn ở nhiệt độ cao (94-95°C) trong thời gian ngắn

+ Giai đoạn gắn mồi (Annealing): Các đoạn mồi đặc hiệu sẽ bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên tắc bổ sung bằng cách hạ nhiệt độ xuống trong khoảng 30-65°C

+ Giai đoạn kéo dài chuỗi (Extending): Nhờ hoạt tính của enzyme DNA polymerase các dNTP được lắp ráp để tạo thành mạch đơn DNA mới bổ sung với

2.2.2 Điện di DNA trên gel agarose

Nguyên lý: Các phân tử DNA là các polyanion nên trong môi trường trung

tính và kiềm, dưới tác dụng của điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương Mức độ di chuyển của các phân tử DNA qua hệ thống các lỗ ma ̣ng lưới của gel agarose dưới tác du ̣ng của đi ện trường phụ thuộc chủ yếu vào kích thước (hay khối lượng phân tử) của chúng Phân tử có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh còn phân

tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm Sử dụng thang chuẩn DNA với kích thước

đã biết có thể dễ dàng xác định được kích thước tương đối của DNA mẫu

Tiến hành: 1g agarose được đun nóng để hòa tan trong 100 ml đệm TBE, sau

đó đưa về 65°C và đổ vào khuôn đúc gel Gel agarose 1% sau khi được chuẩn bị, tiến hành tra mẫu gồm 5 l mẫu DNA được trộn với 1 l đệm mẫu có chứa chất chỉ thị màu là bromophenol xanh, xylene cyanol Bản gel được chạy điện di với hiệu điện thế ổn định là 10 volt/cm gel đến khi vạch màu bromophenol xanh cách mép gel khoảng 2 cm thì dừng lại Gel được lấy ra nhuộm bằng cách ngâm trong EtBr ở nồng độ 50 g/l và rửa bằng nước Cuối cùng, soi gel dưới ánh sáng tử ngoại của

máy soi gel, các băng DNA gắn với EtBr xuất hiện dưới dạng các băng màu sáng trên nền tối

2.2.3 Ghép nối DNA bằng enzyme DNA ligase

Nguyên tắc: Phản ứng ghép nối DNA được thực hiện dựa trên khả năng xúc

tác của enzyme DNA ligase khi có mặt ATP cho phản ứng hình thành liên kết phosphodiester giữa đầu 3’-OH và đầu 5’-PO4 của 2 chuỗi DNA DNA ligase sử dụng năng lượng giải phóng ra từ quá trình adenyl hóa đầu 5’-PO4 của chuỗi DNA thứ nhất (liên kết với AMP, giải phóng pyrophosphate) để hình thành liên kết

Enzyme T4 DNA Ligase (5 U/μl) 0,2

H2O cất khử ion vô trùng 1,8

2.2.4 Biến nạp vi khuẩn E coli

Tế bào khả biến E coli DH5α (bảo quản trong tủ lạnh sâu -80°C) được làm

tan trên đá trong 10 phút Tiếp đó, DNA plasmid được bổ sung vào dung dịch tế bào đã

rã đông và ủ trên đá 20 phút để tạo điều kiện cho vector bám vào thành tế bào Tế bào được sốc nhiệt bằng cách chuyển sang bể ổn nhiệt 42°C trong 45 giây, sau đó được chuyển lại ủ trên đá trong 2 phút Tiếp theo, 450 µl LB lỏng được bổ sung vào hỗn hợp biến nạp và ủ ở nhiệt độ 37°C trong vòng 20 phút trước khi được nuôi lắc với tốc độ

220 vòng/phút trong thời gian 30 phút Hỗn hợp tế bào biến nạp được cấy trải trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung chất kháng sinh thích hợp và ủ ở 37°C qua đêm [26]

2.2.5 Tách chiết DNA plasmid từ tế bào vi khuẩn

DNA tái tổ hợp được tinh sạch từ tế bào vi khuẩn E coli bằng bộ kit

GenJET™ Plasmid Miniprep (Fermentas) Một khuẩn lạc dương tính được nuôi lắc trong 5 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin 100 µg/ml với tốc

28

độ 220 vòng/phút ở 37°C qua đêm Tế bào được thu bằng cách ly tâm ở vận tốc

6000 vòng/phút trong 10 phút, ở 4°C Tế bào được hòa trở lại trong 250 µl đệm P1 (Resuspension solution) đã bổ sung enzyme RNase A 250 µl đệm P2 (Lysis solution) được bổ sung vào dịch tế bào và đảo nhẹ 3-5 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid Hỗn hợp được trung hòa bởi 350 µl đệm P3 (Neutralization solution), đảo đều 4-6 lần Mảnh vỡ tế bào và protein biến tính được loại bỏ bằng cách ly tâm hỗn hợp với vận tốc 13000 vòng/phút trong 10 phút

ở 4°C Dịch nổi sau khi ly tâm được đưa lên cột tinh sạch plasmid và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút Plasmid được giữ lại trên lớp màng silica còn dịch qua cột được gạn bỏ 500 µl đệm rửa (Wash buffer) được bổ sung và ly tâm 30-60 giây, sau

đó gạn bỏ dịch qua cột Bước này được lặp lại một lần nữa Cột tinh sạch chứa plasmid được chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới 50 µl đệm đẩy (Elution buffer) được bổ sung vào chính giữa màng silica của cột và ủ ở nhiệt độ phòng 2 phút Plasmid được thu bằng cách ly tâm với vận tốc 10000 vòng/phút trong 1 phút Mẫu plasmid tinh sạch được bảo quản ở -20°C

2.2.6 Tinh sạch DNA từ gel agarose

Bộ kit GenJET Gel Extraction được thiết kế để tinh sạch các phân đoạn DNA

từ gel agarose chạy trong đệm TAE hoặc TBE với hiệu suất cao trong thời gian ngắn Bộ kit sử dụng để tinh sạch các phân đoạn DNA có kích thước từ 25 bp đến

20 kb, hiệu suất có thể lên đến 95% đối với các phân đoạn từ 100 bp đến 10 kb Quy trình được thực hiện ở nhiệt độ phòng

Tiến hành: Băng DNA quan tâm được cắt chính xác bằng lưỡi dao sạch từ

gel agarose và đưa vào ống eppendorf 1,5 ml Đệm bám (binding buffer) đươ ̣c bổ sung vào với 1 thể tích bằng khối lượng miếng gel (1 µl : 1 mg) và ủ ở 60°C trong khoảng 10 phút đến khi gel tan hoàn toàn Dung dịch gel agarose đã hòa tan được chuyển lên cột tinh sạch và ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút Sau đó phần dịch

đi qua màng được gạn bỏ 500 µl đệm rửa (Wash buffer) đươ ̣c bổ sung vào cột và ly tâm 1 phút với vận tốc 10000 vòng/phút Phần dịch đi qua màng được gạn bỏ Lặp

29

lại bước này một lần nữa Cột tinh sạch có chứa DNA được chuyển sang ống eppendorf 1,5 mới và bổ sung 100 µl Elution buffer vào chính giữa lớp màng silica của cột Ly tâm 1 phút với tốc độ 10000 vòng/phút để thu DNA Mẫu DNA tinh sạch được bảo quản ở -20°C để sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo

2.2.7 Nhân dòng sản phẩm PCR

Đoạn gen P10 được khuếch đại bằng phản ứng PCR nhờ enzyme Taq DNA

polymerase Do vậy, sản phẩm PCR thu được là các đoạn DNA kích thước 1,7 kb

có đầu dính Adenin Các đoạn DNA này dễ dàng ghép nối vào vector pGEMT có đầu dính Thymin nhờ tác dụng của enzyme T4 ligase Phản ứng ghép nối sản phẩm PCR vào vector pGEMT được thực hiện theo quy trình kèm theo của bộ kit của hãng Promega với các thành phần như trong bảng 3 Hỗn hợp phản ứng gắn được ủ

trong ở 4°C qua đêm, sau đó biến nạp vào tế bào E coli chủng DH5α và cấy trải

trên đĩa môi trường LB đặc có bổ sung ampicillin 100 µg/ml

Bảng 3: Thành phần phản ứng ghe ́p nối sản phẩm PCR vào vector pGEMT

Thành phần phản ứng Thể tích (µl)

Enzyme T4 DNA Ligase (3 U/μl) 1

H2O cất khử ion vô trùng 2

2.2.8 Phản ứng cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn

Nguyên tắc: Enzyme cắt giới ha ̣n s ử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử

là những enzyme endonuclease có khả năng nhâ ̣n biết v ị trí đặc hiệu trên DNA và phân huỷ liên kết phosphodieste của bộ khung DNA mạch đôi ta ̣i đó mà không gây tổn hại đến bazơ nucleotide Trình tự nhận biết của enzyme giới hạn được cấu tạo từ

30

4 đến 6 đôi bazơ và có cấu trúc đối xứng nghịch đảo Enzyme cắt giới ha ̣n có thể cắt ngay chính giữa trình tự nhận biết để tạo ra hai đoạn DNA đầu bằng hoặc có thể cắt lệch tâm để tạo ra hai đoạn DNA có kiểu đầu dính

Bảng 4: Enzyme cắt giới ha ̣n và trình tự nhận biết đươ ̣c sử du ̣ng trong đề tài

Enzyme Trình tự nhận biết Đầu dính

2.2.9 Giải trình tự nucleotide các đoạn DNA

Đoạn trình tự gen đặc hiệu sau khi được nhân dòng vào vector pGEMT sẽ được đọc trên hệ thống máy giải trình tự ABI 3100 Cụ thể, phản ứng PCR được tiến hành qua 2 bước: bước PCR thông thường để khuếch đại đoạn trình tự cần đọc

và bước PCR cho xác định trình tự Trong đó, phản ứng PCR thông thường sử dụng khuôn là vector tái tổ hợp pGEMT mang đoạn gen đặc hiệu với cặp mồi của vector Sản phẩm PCR sau đó được tinh sạch, pha loãng ở nồng độ thích hợp và dùng làm khuôn cho phản ứng PCR xác định trình tự Về cơ bản, phản ứng PCR này có các thành phần giống như PCR thông thường nhưng có một số khác biệt là sự có mặt của ddNTP và chỉ cần dùng một loại mồi (mồi xuôi hoặc mồi ngược) Các ddNTP khác với các dNTP là thiếu một nhóm 3’-OH nên khi được enzyme DNA polymerase gắn vào chuỗi DNA đang tổng hợp thì chúng sẽ không thể hình thành liên kết phosphodiester với nucleotide được đưa vào kế tiếp và khiến cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừng lại Như vậy, từ một đoạn DNA ban đầu, nhiều sợi đơn mới được đánh dấu ở một đầu tận cùng bằng ddNTP sẽ được tổng hợp và các sợi này có

độ dài khác biệt nhau một nucleotide Các sợi đơn mới tổng hợp được phân tách trên gel điện di acrylamide dạng mao quản Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích các kết quả để đưa ra trình tự đoạn DNA gốc

31

2.2.10 Điện di protein trên gel polyacrylamide có chứa SDS

Nguyên tắc : Các protein có thể được phân tách dựa trên khối lượng bằng

điện di trên acrylamide dưới điều kiện đã bị biến tính Hỗn hợp protein được hòa tan trong dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS), một chất tẩy mang điện tích âm

sẽ phá tất cả các liên kết không c ộng hóa trị của protein ban đầu Phức hợp SDS với protein đã bị biến tính có một điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lượng của protein Phức hợp SDS-protein sau đó sẽ là mẫu để chạy điện di Khi điện di kết thúc, những protein trên gel sẽ được nhuộm với bạc hay một chất nhuộm màu như Coomassie blue Những protein nhỏ di chuyển nhanh trong gel, trong khi những protein lớn ở phía đầu, gần vị trí nạp mẫu Vì vậy, những protein chênh lệch về khối lượng có thể phân biệt được bằng SDS-PAGE

Tiến hành: Gel polyacrylamide hai lớp, trong đó gel cô là 6% và gel tách là

12%, với tỉ lệ các thành phần như trong bảng 5

Ngay sau khi bổ sung APS và TEMED, hỗn hợp được trộn đều và đúc vào khuôn kính đã được gắn sẵn trên giá đỡ Sau khi phần gel tách được trùng hợp hoàn toàn, tiếp tục đúc phần gel cô và để gel trùng hợp hoàn toàn sau 30 phút mới sử dụng cho mục đích điện di

Mẫu protein được trộn vào đệm mẫu (nồng độ 4X) theo tỉ lệ thể tích 3:1, đun cách thủy trong 10 phút ở 95oC, làm lạnh và dùng để tra giếng chạy điện di Đệm chạy điện di là Tris-glycin, pH 8,8 chứa SDS 1%, chạy điện di với điện thế ổn định

10 volt/cm gel cho tới khi vạch màu chỉ thị (bromophenol xanh) cách đáy bản gel 0,5 cm thì dừng lại Tiến hành nhuộm gel với dung dịch CBB 1% pha trong hỗn hợp methanol: axetic: H2O với tỉ lệ thể tích là 3: 6: 1, sau khoảng 20 phút tiến hành tẩy màu bằng hỗn hợp đã dùng để pha CBB cho tới khi bản gel có nền sáng

2.2.11 Nuôi cấy E coli và chuẩn bị dịch chiết tế bào

Tế bào E coli Rossetta mang cấu tru ́ c p ET28a/P10 được nuôi lắc trong bình

thủy tinh chứa 100 ml môi trường LB lỏng có bổ sung kanamycin (50 g/ml) và chloramphenicol (34 g/ml) ở 370C tới khi OD600 đạt 0,3-0,6 thì tiến hành cảm ứng bằng IPTG, sau 3 tiếng tế bào được thu bằng ly tâm và hoà trở lại trong 20 ml đệm Tris (Tris 50 mM, pH 8,0; NaCl 100 mM; Triton X-100 0,1%; PMSF 1 mM; β-mercaptoethanol 1 mM; benzamidine 1 mM) Tế bào được phá vỡ bằng sóng siêu

âm và dịch siêu âm được ly tâm ở tốc đô ̣ 14.000 vòng trong 20 phút để loại bỏ xác

tế bào, thu dịch chiết

2.2.12 Tinh sạch protein tái tổ hợp qua cột Ni 2+

agarose (Theo hãng Invitrogen)

Gel Ni-Agarose-NTA được nhồi vào cột (kích thước 1x2 cm) để có thể tích cột gel 2 cm3 và tiến hành cân bằng cột gel với 20 ml đệm không biến tính (Tris 50

mM, pH 8,0; NaCl 100 mM) Dịch chiết tế bào chứa protein mong muốn được cho lên cột với tốc độ 10 ml/giờ Các protein không gắn với gel đã được rửa kỹ bằng đệm CB có Imidazol 30 mM cho đến khi A280 của dịch qua cột < 0,01 Phần protein gắn trên cột được rửa chiết bằng 5 ml đệm CB có 250 mM imidazol Các phân đoạn tách ra qua cột được phân tích trên gel SDS-PAGE