Vi sinh vật nội sinh thực vật

Vi sinh vật nội sinh thực vật

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-  

-SEMINAR

ĐỀ TÀI:

“Vi sinh vật nội sinh thực vật ”

Giảng viên HD : TS Nguyễn Văn Giang

MỤC LỤC

I MỞ ĐẦU

Những tương tác có lợi giữa thực vật và vi sinh vật thúc đẩy sức khỏe, sự phát triển của cây trồng, vấn đề này đang được các nhà nghiên cứu quan tâm Gần đây, họ đang nghiên cứu tiềm năng cho giải pháp nâng cao khả năng phân hủy sinh học của các chất gây ô nhiễm trong đất Hầu hết các nghiên cứu này tập trung vào các vi khuẩn

ở rễ (Lindow&Brandl,2003;Kuiper et al.,2004;berg et al,2005) Endophytic có thể được định nghĩa là những vi sinh vật cư trú trong nội mô của thực vật, chúng không có biểu hiện ra bên ngoài và gây tác động xấu đến thực vật mà chúng ký sinh (Holiday,1989; Schulz & Boyle, 2004), có khoảng 300.000 loài thực vật tồn tại trên trái đất, mỗi loài là một ký chủ cho một đến nhiều các dạng nội ký sinh cư trú Chỉ có một số loài thực vật được nghiên cứu hoàn chỉnh về các mối quan hệ nội ký sinh của chúng Do đó cơ hội nghiên cứu và tìm ra các dạng nội ký sinh mới và có lợi trong sự

đa dạng sinh học của các hệ sinh thái khác nhau là đáng kể

Endophytic cư trú trong hệ sinh thái thích hợp tương tự như các chồi mầm ở thực vật, điều này làm cho chúng trở thành các tác nhân kiểm soát sinh học (Berg et al., 2005) Thật vậy, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Endophytic bacteria có khả năng kiểm soát được mầm bệnh trên thực vật (Sturz & Matheson, 1996; Duijff et al., 1997; Krishnamurthy & Gnanamanickam, 1997), ở côn trùng (Azevedo et al, 2000.) và cả ở tuyến trùng ( Hallmann et al., 1997, 1998) Trong một số trường hợp chúng có thể đẩy mạnh tốc độ nẩy mầm của hạt, thúc đẩy sự hình thành cây con trong điều kiện bất lợi (Chanway,1997) và nâng cao khả năng tăng trưởng của thực vật ( Bent & Chanway,1998) Endophytic còn có thể ngăn chặn mầm bệnh phát triển bằng cách tổng hợp các chất nội sinh trung gian, qua đó để tiếp tục tổng hợp các chất chuyển hóa

và các hợp chất hữu cơ mới Nghiên cứu cơ chế sản sinh chất chuyển hóa mới trong sự

đa dạng sinh học của Endophytic có thể phát hiện các loại thuốc mới để điều trị có hiệu quả các bệnh ở người, thực vật và động vật (Strobel et al., 2004)

Cùng với việc sản xuất các chất mới, nhiều Endophytic bacteria đã cho thấy khả năng làm giảm các chất ngoại sinh (xenobiotic) hay có thể hoạt động như các vectơ

mở đầu cho quá trình đó Chúng có khả năng kháng kim loại nặng, kháng khuẩn và

3

làm giảm các gốc hữu cơ thông qua tiếp xúc với các hợp chất trong thực vật và đất nơi chúng cư trú Khả năng làm giảm những chất xenobiotics đang được nghiên cứu cẩn thận để cải tiến kỹ thuật khử độc bằng thực vật (Siciliano et al., 2001; Barac et al., 2004; Germaine et al., 2004, 2006; Porteous-Moore et al., 2006; Ryan et al., 2007a)

II. NỘI DUNG

2.1.Vi khuẩn nội sinh thực vật

II.1.1 Sự phân lập và đa dạng sinh học của vi khuẩn endophytes

Để tự bảo vệ mình trước những tác động của môi trường, Endophytic bacteria tạo thành những ổ vi khuẩn ,xâm chiếm và ký sinh trên đốt cây Những vi khuẩn này thường xâm chiếm vào vùng không gian ở giữa các tế bào, và chúng có thể được phân lập từ tất cả các bộ phận của cây, bao gồm cả hạt giống (Posada & Vega, 2005) Endophytic bacteria được phân lập từ cây một lá mầm tới cây hai lá mầm, từ những loài cây thân gỗ, như gỗ sồi và lê, cây thân thảo tới cây lương thực như củ cải đường

và ngô Những nghiên cứu cổ điển về sự đa dạng của Endophytic bacteria tập trung vào phương pháp phân lập chúng từ các mô nội sinh sau khi khử trùng bề mặt thực vật với hypochlorite natri hoặc các hóa chất tương tự (Miche & Balandreau, 2001) Một nghiên cứu của et al Lodewyckx (2002) nêu lên phương pháp phân lập và mô tả đặc điểm vi khuẩn endophytes từ các loài thực vật khác nhau Dựa trên nền tảng nghiên cứu của Hallmann et al (1997) và Lodewyckx et al (2002),Rosenblueth & Martinez-Romero (2006) và Berg & Hallmann (2006) đã công bố một danh sách toàn diện của Endophytic bacteria được phân lập từ một loạt các bộ phận của cây

Một nghiên cứu gần đây của al Porteous-Moore và cộng sự (2006) mô tả sự đa dạng của Endophytic bacteria tìm thấy trong cây Dương, tăng trưởng tại môi trường phytoremediation nhiễm toluene, với mục đích xác định các chủng tiềm năng để tăng cường phytoremediation toluene, Ethylbenzene, và hợp chất xylen (BTEX) Theo mô

tả của nghiên cứu trên, Endophytic bacteria được phân lập từ hai giống Dương Sau khi phân lập, tiến hành phân tích, so sánh trình tự của đoạn mồi 16S RNA, BOX-PCR của DNA,các trình tự mang đặc tính sinh lý, liên quan đến chất sử dụng, thuốc kháng sinh và kim loại nặng nhạy cảm Nghiên cứu này và một nghiên cứu của Germaine et

al (2004, 2006) đã chứng minh rằng trong các cộng đồng đa dạng vi khuẩn tìm thấy trong cây Dương, một số chủng Endophytic có mặt và có tiềm năng để tăng cường các chất hữu cơ dễ bay hơi phytoremediation và thuốc diệt cỏ.Công trình nghiên cứu gần

5

đây của Frank et al (2006) là dùng kỹ thuật sinh học phân tử trong việc phân lập, tìm hiểu các đặc tính của Endophytic bacteria và ứng dụng trong cộng đồng.Các chủng Endophytic sinh sống trên thân cây, rễ, củ…đã được phân tích và nhận diện bằng cách chạy RFLP với đoạn mồi là 16S rRNA Năm đơn vị phân loại triển vọng nhất và khả năng tồn tại được xác định là Cellulomonas, Clavibacter, Curtobacterium, Pseudomonas và Microbacterium được tìm ra thông qua trình tự gen 16S rRNA, acid béo và sử dụng nguồn phân tích carbon (Elvira-Recuenco & van Vuurde, 2000; Zinniel

et al, 2002)…

Việc nuôi cấy dựa trên môi trường nuôi cấy cơ bản và môi trường nuôi cấy độc lập thật sự rất hữu ích Reiter & Sessitsch (2006) đã điều tra sự hiện diện và phân loại Endophytic bacteria ở các bộ phận khí sinh hoàn toàn trên cây nghệ (cây nghệ albiflorus) Kết quả của họ cho thấy rằng tương tự như ở các loài thực vật khác, cây nghệ là một ký chủ cho cộng đồng Endophytic bacteria sinh trưởng và phát triển, tuy nhiên cũng có loài chưa được biết đến Các bước tiến hành thí nghiệm bao gồm ly trích, phân lập, nuôi cấy và nhận diện Endophytic bacteria bằng kỹ thuật in dấu DNA với đoạn mồi 16S rRNA Kết quả chỉ ra rằng một số nhóm mới xuất hiện góp phần vào tính đa dạng của Endophytic bacteria, chủ yếu là Gammaproteobacteria and Firmicutes, chúng sống nội sinh trên cây nghệ.Thành phần, phân loại các nhóm Endophytic bacteria đa dạng và có sự khác nhau là do sự đa dạng của gen 16S rRNA trong thư viện gen Chỉ có ba nhóm vi khuẩn được tìm thấy trong môi trường nuôi cấy, trong đó có 17 loại đại diện Trong khi sáu nhóm được xác định trong phân tích thư viện gen bao gồm 38 loại Nhóm nổi bật tìm thấy trong môi trường nuôi cấy là nhóm

Gram dương, có tỷ lệ G+C thấp.Trong khi ở các thư viện clone, các Gammaproteo

bacteriachiếm ưu thế Nghiên cứu này khẳng định rằng các nhóm Endophytic bacteria

trong môi trường nuôi cấy là một tập hợp con của đa dạng sinh học tổng endophyte

II.1.2 Một số nhóm vi khuẩn endofphytic

tả một cách rõ ràng và một số vi khuẩn được xếp vào nhiều nhóm

Vi khuẩn sống cộng sinh:

là những vi khuẩn sống tương tác với thực vật ký chủtheo kiểu hai bên cùng có lợi Khi đó, vi khuẩn cộng sinh sẽ tiến hành trao đổi chất dinhdưỡng với thực vật và làm thay đổi cấu trúc mô thực vật ở nơi vi khuẩn định cư, điểnhình là hiện tượng tạo nốt sần ở rễ của những cây họ Đậu Hiện tượng cộng sinh giữa vikhuẩn và cây họ Đậu được xem là tương tác gần giữa vi khuẩn và thực vật, trong đó, vi khuẩn được gọi là sinh vật cộng sinh Hầu hết các vi khuẩn cố định nitơ là vi khuẩn gram âm, có khả năng hình thành nốt sần ở rễ cây họ Đậu, hay là những thành viên xạ khuẩn thuộc chi

Frankia – là vi khuẩn gram dương có khả năng hình thành nốt sần trên câythân gỗ, cây

hai lá mầm và cây bụi Ban đầu, những vi khuẩn cộng sinh với cây họ đậu được phân

loại thành chi Rhizobium, do đó, những vi khuẩn này thường được nói đến như là

7

những vi khuẩn nốt rễ (rhizobia) Ngày nay, những vi sinh vật cộng sinh ở cây họ Đậu

được phân thành nhiều chi, trong đó, hầu hết các loài thuộc chi Rhizobium,

Sinorhizobium (Ensifer), Mesorhizobium và Bradyrhizobium.

Vi khuẩn cố định nitơ tự do:

là những vi khuẩn cố định nitơ tương tác với thựcvật mà không xâm nhập vào

cơ thể của chúng theo hướng cộng sinh chuyên biệt Trongsố này quan trọng nhất là

các loài thuộc chi Azotobacter, Pseudomonas và Clostridium.

Vi khuẩn cố định nitơ tương tác:

là những vi sinh vật tham gia vào quá trình traođổi chất dinh dưỡng với thực vật nhưng không làm thay đổi cấu trúc của rễ thực vật Để phân biệt được vi sinh cố định nitơ cộng sinh hay tương tác với thực vật ký chủ thì chủyếu dựa vào mức độ tương tác Sự cố định nitơ tương tác được hiểu là quá trình cố địnhnitơ bởi những vi sinh vật sống tự do nhưng lại chịu ảnh hưởng trực tiếp bởi cây trồng.Theo Klucas (1991), trong mối quan hệ tương tác, cả cây trồng và vi khuẩn cố định nitơ đều có lợi nhưng mối quan hệ này thường diễn ra ngẫu nhiên nhiều hơn là sự cộng tác bắt buộc

Sự cố định nitơ tương tác là một quá trình sinh thái trung gian giữa cố định nitơ cộng sinh và nitơ tự do Và vi khuẩn cố định nitơ tương tác bao gồm những vi khuẩn sống

tự do trong vùng lân cận rễ cây thực vật đến những vi sinh vật sống nội sinh trong mô

tế bào thực vật Để quá trình cố định nitơ của vi sinh vật tương tác có thể diễn ra cần những yêu cầu sau đây:

+ Thực vật ký chủ

+ Chất nền thực vật

+ Môi trường thích hợp để enzyme nitrogenase hoạt động

+ Quá trình chuyển nitơ được cố định từ vi khuẩn sang cây trồng

Một số vi khuẩn tham gia vào quá trình cố định nitơ tương tác điển hình như:

Azospirillum, Burkholderia, Enterobacter, Gluconoacetobacter, Herbasspirillum và K lebsiella

2.1.2.2 Nhóm vi sinh vật sinh kích thích tố sinh trưởng thực vật

Auxins là một chất kích thích sinh trưởng có thể được tổng hợp bởi thực vật, IAA có vai trò trong quá trình phát triển tế bào như tăng trưởng tế bào, phân chia, hình thành rễ (Ann Vande Broek, 1998), tuy nhiên sự tăng trưởng của thực vật lại chịu sự tác động không nhỏ từ nguồn auxins bên ngoài và một trong những nguồn đó là auxins được tổng hợp bởi các vi sinh vật có ích trong đất Trong đó các vi sinh vật được phân lập từ vùng rễ và trên bề mặt rễ của nhiều loại cây trồng là có khả năng tổng hợp IAA cao (Arshad và Frankenberger, 1998) Theo Loper và Schroth (1986) thì có đến 80% các chủng vi sinh vật được phân lập từ vùng rễ của nhiều loại cây trồng là có khả năng

tổng hợp auxins Các chủng vi sinh vật thuộc các giống như Azospirilium,

Pseudomonas, Rhizobium, Xanthomonas, Bradyrhizobium japonicum, Gluconobacter diazotrophicus đã được xác định là có khả năng tổng hợp IAA giúp kích thích sự sinh

trưởng của cây trồng (Patten và Glick, 1996) Gần đây là Ahmad (2005) đã phân lập

được 10 chủng Azotobacter và 11 chủng Pseudomonas từ đất vùng rễ cây lúa mì, mù

tạt, cây cải, đều cho thấy chúng có khả năng tổng hợp IAA rất cao trong môi trường có

bổ sung Tryptophan và không có bổ sung Tryptophan

Nhiều dòng vi sinh vật sống trong đất có khả năng tổng hợp nên các chất tăng trưởng của thực vật và giúp cho cây trồng phát triển Trong đó có nhiều vi sinh vật sống trong vùng rễ (rhzophere) có khả năng tổng hợp chất kích thích sự tăng trưởng của thực vật gọi là nhóm (PGPR)(Trúc, 2007) Vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật cải thiện sự tăng trưởng thực vật và gia tăng năng suất với cơ chế trực tiếp(cố định đạm, hòa tan lân khó tan, sản xuất ra auxin hay cytokinin) và cơ chế gián tiếp (hạn chế sự phát triển vi sinh vật gây hại)(Brown, 1974; Klopper và ctv, 1986, 1989; Davision, 1988; Lambert và Joos, 1989) Với rất nhiều nhóm vi sinh vật sơ hạch

như Pseudomonas syringae (Glickmann và ctv, 1998), Azosprillium brasilense (Hartman và ctv, 1983), Azobacter vineelandii (Garcia-Tavares và ctv, 1987),

Agrobacterium tumefasciens (Liu và ctv, 1982), Rhizobium trifolii và Rhizobium leguminosarum (Badenoch-Jones và ctv, 1982), Rhizobium phaseoli (Ernstsen và ctv,

1987), Bradyrhizobium japonicum (Kaneshiro và ctv, 1983), Erwinia herbola (Koga

và ctv, 1991), thanh tảo Anabaena cylindrica và Nostoc rivulare (Florenzano và ctv,

9

1978), Enterobacter cloacae (Koga, 1995), các vi sinh vật trên là đại diện cho những

vi sinh vật có khả năng tổng hợp kích thích tố tăng trưởng cho cây trồng, bảng 1 dưới đây là một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp kích thích tố tăng trưởng

Bảng 1: Các nhóm vi sinh vật tổng hợp IAA và các chất dẫn xuất

Bacillus circuslans Tương tự auxin Stzelczyl và

Prokojska-Burdziez(1984)

IPyA Martens và Franerberger (1991)

Pseudomonas syringae pv.

glycinea

IAA, Iald, ILA Fett và ctv (1987)

Prokojska-Burdziez(1984)

Xanthomonas pv glycine IAS, ILA, IAM Fett và ctv (1987)

ctv(1981)

Wardomyces humicola IAA Reddy và ctv(1988)

(Nguồn:Trích từ các bảng trong phytohormone trong đất của W.T.Frankenberger và Jr.Muhannad Arshas, 1995.)

Các nhà khoa học đã tiến hành phân lập, xác định và nghiên cứu để đưa các vi sinh vật này vào phân sinh học để góp phần làm taweng năng suất cây trồng và thân thiện với môi trường sống và đã đạt được những kết quả khả quan trên đậu nành (Molla và ctv, 2001), lúa gạo (Rasul và ctv, 1998), trên bắp lai (Chabot và ctv, 1996) Như vậy khả năng tổng hợp kích thích tố tăng trưởng ở vi sinh vật là rất lớn, cá thể chia thành ba nhóm vi sinh vật sơ hạch là: vi khuẩn nốt rễ (Rhizobia), vi khuẩn cố định đạm sống tự do và vi khuẩn vùng rễ

Vi khuẩn nốt rễ

Các nhà khoa học đã phát hiện ra vi sinh vật nốt rễ tổng hợp được IAA từ tiền chất tryptophan nhưng nhóm này có thể tổng hợp IAA không có tryptophan , tuy nhiên nếu bổ sung tryptopgan thì chúng tổng hợp IAA nhiều gấp 7 lần (Kittell và ctv, 1989).Nhiều vi khuẩn nốt rễ thích hợp với loại truptophan khác nhau, như vi khuẩn nốt rễ từ nốt rễ cây đậu phọng thích DL-tryptophan (Roy và Basu, 1988), còn vi khuẩn nốt từ cây Crotalria retusa thích D-tryptophan hơn loại L-tryptophan hay DL-tryptophan (Bhattacharyya và Basu, 1991)

Azotobacter

Sử dụng vi khuẩn Azotobacter chroococcum làm phân chủng cho hột giống để

cung cấp Nitow cho cây trồng được phổ biến rộng rãi ở Liên Xô trong những năm

1950 (Cooper, 1950),nhưng sau này người ta đã chứng minh nó có thể tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật (Muller và ctv, 1989) và nhiều loài khác trong giống này

có khả năng tổng hợp được kích thích tố tăng trưởng Azotobacter chroococcum có

thể tổng hợp IAA trong điều kiện không có tryptophan (Elwan và El-Naggar, 1972), nhưng nếu chúng ta cung cấp thêm tryptophan thì lượng IAA được tổng hợp sẽ nhiều hơn (Apte và Sharde, 1981)

11

chủng cho cỏ làm thức ăn gia súc nhờ khả năng cố định đạm cao (Bashan và ctv,

1989), nhưng gần đay các nhà khoa học đã phát hiện ra thêm Azospirillum có khả năng

tổng hợp IAA cung cấp cho cây trồng giúp tăng nbawng suất cây trồng (Barbieri và

Galli, 1993) Azospirillum brasilense có khả năng tổng hợp IAA nhờ gen ipdC(Ann

Vande Broek,1998), Azospirillum có thể tổng hợp tryptophan mà không có mặt của

tryptophan (Fallik và ctv, 1989) tuy nhiên nếu bổ sung tryptophan thì chúng sẽ tổng hợp lượng tryptophan nhiều hơn (Horemans và ctv, 1986)

Vi khuẩn Pseudomonas syringae pv Savastanoi

Pseudomonas là vi khuẩn gram âm, vi khuẩn này tạo ra các bướu hay nốt trên

nhiều loài vây gỗ (Smidt và Kosuge, 1978), nhưng sau này nhiều nhà khoa học đã chứng minh loài này có khả năng tổng hợp IAA từ tryptophan nhờ hai gen iaaM và iaaH trong plasmid (White và Ziegler, 1991), gần đây, Gardan và ctv (1992) tìm thấy

131 dòng từ loài này được phân lập từ đất vùng rễ của nhiều loài cây trồng có khả năng tổng hợp IAA

Vi khuẩn Guconacetobacter

Vi khuẩn Guconacetobacter và Guconobacter thuộc họ Acetobacteraceae, đây

là những vi khuẩn sinh trưởng tốt ở môi trường hiếu khí, ở nhiệt độ 300 và pH khoảng

5.5-6 Có nhiều loài khác nhau trong đó loài Guconacetobacter diazotrophicus đã

được xác định là hiện diện rất nhiều trong mía và các loài cây hòa bản, chúng có khả năng cố định đạm, hòa tan lân, tổng hợp kích thích tố tăng trưởng auxin cho cây (Mthukumarasamy và ctv, 2002; Madhaiyan, 2004)

Vi khuẩn Burkholderia