Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng của liposome doxorubicin

Danh mục hình vẽ, đồ thị Hình 1.2 Các phương pháp tạo chênh lệch pH qua màng liposom 6 Hình 1.3 Một số trạng thái tập hợp của phospholipid 8 Hình 2.1 Sơ đồ hệ thống lọc tiếp tuyến tự

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ PHƯƠNG LINH

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CHẤT LƯỢNG CỦA LIPOSOME DOXORUBICIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2013

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ PHƯƠNG LINH

NGHIÊN CỨU CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN CHẤT LƯỢNG CỦA LIPOSOME DOXORUBICIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Lời cảm ơn

Đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới:

ThS Nguyễn Văn Lâm

Thầy là người đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành khóa luận

Đồng thời em xin chân thành cảm ơn PGS.TS Phạm Thị Minh Huệ

người trực tiếp giao đề tài và chỉ bảo, định hướng cho em thực hiện đề tài

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các anh chị kỹ thuật viên của

Bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Cuối cùng xin được cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè

đã luôn động viên, cổ vũ trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khóa luận của mình

Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013

Lê Phương Linh

Danh mục chữ và ký hiệu viết tắt

TT Viết tắt Từ/ cụm từ đầy đủ

1 Chol Cholesterol

2 CL Conventional liposome – Liposome quy ước

3 DĐVN Dược điển Việt Nam

4 D/L Drug / lipid- Tỷ lệ dược chất / lipid

5 DLS Dynamic Light Scattering – Tán xạ ánh sáng động

6 DSC Differenciel Scanning Calometry- Phân tích nhiệt vi sai

11 EE Encapsulation Efficient - Hiệu suất liposome hóa

12 GUV Giant Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp khổng lồ

13 IL Immunoliposome - Liposome miễn dịch

14 HBG HEPES Buffer Glucose – HEPES pH 7,4 trong môi trường glucose

5%

15 HBS HEPES Buffer Saline – HEPES pH 7,4 trong môi trường NaCl 9%

16 HEPES N-2- hydroxy ethyl piperazin-N-2-ethan sulfonic acid

17 HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng

cao)

18 KTTP Kích thước tiểu phân

19 LCL Long circulation liposome- Liposome tuần hoàn dài

20 LUV Large Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp lớn

21 MLV Multi Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp

22 MSPC Monostearoyl Phosphatidyl Choline

23 MUV Medium Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp trung bình

24 MVV Multi Vesicular Vesicle – Liposome đa khoang

25 NEFA Non-esterified Fatty Acid – Acid béo không ester hóa

26 OLV Oligo Lamellar Vesicle – Liposome đa lớp nhỏ

27 PB KTTP Phân bố kích thước tiểu phân

28 PDI Polydispersity Index – Chỉ số đa phân tán

29 PEG Polyethylen glycol

30 PL Phospholipid

31 P-31NMR Phosphorus-31 Nuclear magnetic resonance- Cộng hưởng từ hạt

nhân đồng vị P-31

32 SPC Soy phosphatidyl cholin - Phosphatidyl cholin dầu đậu nành

33 SUV Small Unilamellar Vesicle – Liposome đơn lớp nhỏ

34 TCCS Tiêu chuẩn cơ sở

35 TEM Transmission Electron Microscopy – Hiển vi điện tử truyền qua

Mục lục

CHƯƠNG1: TỔNG QUAN 2

1.1 Tổng quan về Doxorubicin 2

1.1.1 Công thức cấu tạo, tính chất lí hóa 2

1.1.2 Dược lý -cơ chế tác dụng và chỉ định 2

1.1.3 Dược động học 3

1.1.4 Các dạng thuốc chứa doxorubicin trên thị trường 3

1.2 Đại cương về liposom 3

1.2.1 Khái niệm, phân loại, ứng dụng 3

1.2.2 Phương pháp bào chế 5

1.2.3 Các phương pháp gắn dược chất vào liposome 6

1.2.4 Một số chỉ tiêu chất lượng hỗn dịch liposome 7

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng hỗn dịch liposome 7

1.2.5.1 Kích thước và cấu trúc 7

1.2.5.2 Thành phần lớp vỏ 8

1.2.5.3 Môi trường bên trong và bên ngoài liposome 12

1.2.6 Một số biện pháp tăng độ ổn định của liposome 13

1.2.7 Liposome doxorubicin 14

1.2.7.1 Ưu điểm so với dạng thông thường 14

1.2.7.2 Một số nghiên cứu gần đây về liposome DOX 14

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu 17

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.1.2 Nguyên vật liệu 17

2.1.3 Phương tiện nghiên cứu 17

2.2 Phương pháp nghiên cứu 18

2.2.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubicin 18

2.2.1.1 Bàochế liposome trắng chưa mang dược chất 18

2.2.1.2 Làm giảm kích thước tiểu phân 19

2.2.1.3.Tiến hành đổi hệ đệm bên ngoài liposome 19

2.2.1.4.Đưa DOX vào liposome 20

2.2.2 Phương pháp đánh giá cấu trúc và hình thái liposome 21

2.2.3 Phương pháp đánh giá kích thước và phân bố kích thước của liposome 22 2.2.4 Phương pháp định lượng 22

2.2.4.1 Xây dựng đường chuẩn bằng phương pháp đo quang UV-VIS 22

2.2.4.2 Định lượng dược chất toàn phần 22

2.2.4.3 Định lượng dược chất tự do 23

2.2.4.4 Hiệu suất liposome hóa 23

2.2.5 Phương pháp xử lý số liệu 24

CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 25

3.1 Xây dựng đường chuẩn 25

3.2 Lựa chọn quy trình làm giảm KTTP liposome bằng phương pháp nén

qua màng 26

3.3 Ảnh hưởng của phương pháp làm giảm KTTP 28

3.4 Ảnh hưởng của yếu tố công thức 33

3.4.1 Ảnh hưởng của loại muối đệm đến hiệu suất liposome hóa 35

3.4.1.1 Ảnh hưởng của muối đệm bên trong 35

3.4.1.2 Ảnh hưởng của muối đệm bên ngoài 36

3.4.2 Ảnh hưởng của tỉ lệ dược chất lipid 37

3.5 Bàn luận 38

3.5.1 Về quy trình bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml 38

3.5.2 Về công thức bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml 38

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42

Danh mục bảng biểu

Bảng 1.1 Phân loại dựa trên thành phần phospholipid khác nhau 4

Bảng 1.2 Một số chỉ tiêu chất lượng của liposome 7

Bảng 2.1 Nguyên vật liệu chính dùng trong nghiên cứu 17

Bảng 3.1 Kết quả đo mật độ quang các mẫu dung dịch doxorubicin

ở bước sóng 233 và 481 nm

25

Bảng 3.2 Công thức các quy trình nén đẩy qua màng 26

Bảng 3.3 Sự phân bố KTTP phụ thuộc vào quy trình nén đẩy qua

màng

27

Bảng 3.4 Các công thức mẫu sử dụng phương pháp giảm KTTP và

đưa dược chất khác nhau

28

Bảng 3.5 Chất lượng hỗn dịch liposome qua các phương pháp giảm

kích thước tiểu phân

29

Bảng 3.6 Các công thức bào chế liposome DOX 33

Bảng 4.1 Tỷ lệ dược chất / lipid của một số biệt dược trên thị

trường

40

Danh mục hình vẽ, đồ thị

Hình 1.2 Các phương pháp tạo chênh lệch pH qua màng liposom 6

Hình 1.3 Một số trạng thái tập hợp của phospholipid 8

Hình 2.1 Sơ đồ hệ thống lọc tiếp tuyến tự động 19

Hình 2.2 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn của quy trình bào chế liposom

doxorubicin bằng phương pháp tráng film

21

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ doxrubicin

và mật độ quang ở các bước sóng khác nhau

25

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn phân bố KTTP phụ thuộc vào quy trình

nén đẩy qua màng

27

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP (A) và hiệu suất

liposome (B) theo thời gian

30

Hình 3.4 Sự thay đổi hiệu suất liposome hóa của các mẫu M1→M4

theo thời gian

31

Hình 3.5 Ảnh chụp TEM của liposome DOX citrat khi sử dụng các

phương pháp giảm KTTP

32

Hình 3.6 Sự thay đổi KTTP theo thời gian giữa các mẫu bào chế 34

Hình 3.7 Sự thay đổi PDI theo thời gian giữa các mẫu bào chế 34

Hình 3.8 Ảnh hưởng của hệ đệm đến hiệu suất liposome hóa 35

Hình 3.9 Ảnh hưởng của tỷ lệ D/L đến hiệu suất liposome hóa 37

ĐẶT VẤN ĐỀ

Hiện nay căn bệnh ung thư đang là một trong những nguyên nhân tử vong hàng đầu trên thế giới Ở Việt Nam, theo thống kê của Dự án Mục tiêu quốc gia phòng chống ung thư ước tính mỗi năm có khoảng 150 nghìn ca mắc mới và 75 nghìn ca tử vong Việc điều trị ung thư đã và đang là một thách thức to lớn đối với nền y học hiện đại

Doxorubicin là một dược chất chống ung thư phổ biến hiện nay, tuy nhiên thuốc gây ra nhiều tác dụng không mong muốn nghiêm trọng vì gây độc trên cả tế bào ung thư và tế bào lành Để giảm độc tính cũng như tăng hiệu quả điều trị của doxorubicin và các hóa trị liệu khác, các nhà khoa học đã nghiên cứu và phát triển liposome như một hệ mang thuốc đến tế bào ung thư đầy triển vọng

Các chế phẩm liposome doxorubicin đang có mặt trên thị trường Việt Nam hiện nay như Cealyx, Doxil, Lipo-Dox, Myocet… Mặc dù dạng thuốc liposome có nhiều ưu điểm về khả năng mang thuốc, kiểm soát giải phóng thuốc và khả năng đưa thuốc tới đích nhưng việc ứng dụng trong thực tế còn nhiều hạn chế do liposome không ổn định Trong những năm gần đây liposome cũng là một trong những đề tài được quan tâm nghiên cứu nhiều ở trường Đại học Dược Hà Nội Chúng ta đã dần nắm vững các quy trình kỹ thuật bào chế liposome cũng như tiềm năng ứng dụng trong lâm sàng, tuy nhiên vẫn chưa có được biện pháp hiệu quả cải thiện chất lượng

liposome Đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới chất lượng của liposome

Doxorubicin” được thực hiện tại bộ môn Bào chế trường Đại học Dược Hà Nội dựa

trên các kết quả nghiên cứu từ trước đó nhằm hoàn thiện hơn dạng thuốc tiêm liposome với mục tiêu:

 Nghiên cứu ảnh hưởng của kỹ thuật bào chế và thành phần công thức đến một số chỉ tiêu chất lượng của liposome doxorubicin

 Đề xuất các cải tiến về công thức và quy trình bào chế thuốc tiêm liposome doxorubicin 2 mg/ml

CHƯƠNG1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về Doxorubicin

1.1.1 Công thức cấu tạo, tính chất lí hóa

- Công thức phân tử:C27H29NO11.HCL

- Khối lượng phân tử : 579,99

- Tên khoa học: (8S, 10S)-10-[(3-Amino-2,3,6-trideoxy- hexopyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-naphthacenedione [2], [20]

trideoxy-α-L-lyxo Tính chất: Tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam, không mùi Dung

dịch 5mg/ml có pH từ 4-5,5 Tan trong nước, methanol, acetonitril, tetrahydrofuran Không tan trong chloroform, aceton, ethyl ether, benzen, ether dầu [2],[20]

Doxorubicin là chất nhạy cảm với ánh sáng ở nồng độ thấp Tuy nhiên, ở nồng

độ điều trị thì doxorubicin được cho là không bị phân hủy đáng kể bởi ánh sáng và không nhất thiết phải có biện pháp riêng để bảo vệ doxorubicin khỏi ánh sáng Thực

tế thì dung dịch doxorubicin trong NaCl 0,9% có thể ổn định trong 24 ngày khi bảo quản trong lọ PV ở 250C và lâu hơn nếu bảo quản trong xylanh làm bằng polypropylen ở 4oC [2], [20]

1.1.2 Dược lý - cơ chế tác dụng và chỉ định

Cơ chế tác dụng của DOX chưa được rõ ràng nhưng nhiều nhà khoa học đã đồng ý với giả thiết rằng: DOX xen vào giữa cấu trúc chuỗi xoắn kép ADN tại vị trí giữa cặp base Guanin-Cytosin tạo ra phức hợp bền vững gây ức chế ADN phụ thuộc

vào enzym ARN-polymerase, làm rối loạn chức năng cũng như quá trình tổng hợp ADN khiến tế bào ung thư không nhân lên được DOX gây gián đoạn mạnh chu kỳ phát triển tế bào ở giai đoạn phân bào S và giai đoạn gián phân tuy nhiên cũng tác dụng tới các giai đoạn khác của chu kỳ phát triển tế bào

Được chỉ định chủ yếu trong các trường hợp: ung thư bàng quang, ung thư phổi, ung thư vú, ung thư dạ dày, ung thư buồng trứng, ung thư tinh hoàn, u lympho dạng Hodgkin và không Hodgkin, sarcoma xương và mô mềm, Dox có thể dùng đơn độc hoặc phối hợp với các thuốc khác như vincristin, methotrexat, cyclophosphamid [6]

1.1.3 Dược động học

Sau khi tiêm tĩnh mạch, doxorubicin nhanh chóng phân bố đến các mô phổi, gan, tim, lách, thận Doxorubicin bị chuyển hóa ở gan tạo thành doxorubicinol Khoảng 40 - 50% lượng doxorubicin bị đào thải qua mật trong 5 - 7 ngày ở dạng chưa chuyển hóa; 5% bị đào thải qua nước tiểu trong 5 ngày Doxorubicin không qua được hàng rào máu não nhưng qua được nhau thai và bài tiết được qua tuyến sữa

1.1.4 Các dạng thuốc chứa doxorubicin trên thị trường

Thuốc tiêm dung dịch doxorubicin 2mg/ml: Adorucin, Adriamycin, Adrim Thuốc tiêm liposom doxorubicin: Caelyx, Doxil, Lipo-dox, Myocet

Bột đông khô pha tiêm 10mg, 20mg, 50mg, 150mg:Adriblastina, Doxorubicina

1.2 Đại cương về liposom

1.2.1 Khái niệm, phân loại, ứng dụng

Liposome thuộc hệ điều trị cao hơn của dạng thuốc kiểm soát giải phóng - hệ mang thuốc hướng đích (targeted drug delivery system) có cấu trúc hình cầu đơn hay

đa lớp kép cấu tạo gồm một nhân nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp, có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet [2],[4],[16]

Hình1.1: Cấu trúc liposome[6]

Phân loại

Theo cấu trúc: Dựa vào kích thước và số lớp lipid liposome gồm các loại:

+ Liposome đơn lớp (Unilamellar vesicle): Vỏ chỉ có một lớp phospholipid Tùy theo kích thước mà có 4loại: Loại nhỏ SUV có đường kính từ khoảng 20-50

nm, loại trung bình MUV có đường kính trên 100 nm, loại to LUV có đường kính trên 500 nm, loại khổng lồ GLV có đường kính trên 1000 nm

+ Liposome đa lớp (MLV: multilamellar vesicle): Cấu tạo gồm nhiều lớp lipid

và nhiều ngăn nước đồng tâm, kích thước 400 - 3.500nm Gồm 3 loại:OLV có ít hơn

5 lớp lipid kích thước 100-1000 nm, MLVcó 5-25 lớp lipid kích thước trên 500 nm,

MVV cấu trúc liposome kép (liposome trong liposome) [16]

Ứng dụng

Liposome đã nhận được rất nhiều sự chú ý trong suốt 30 năm qua như một hệ vận chuyển tới đích mang tiềm năng lớn, với những ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực dược phẩm Những ứng dụng tiêu biểu cần phải kể tới :

1 Bảo vệ các phân tử thuốc nhạy cảm (DNA, RNA, oligo-nucleotide)

2 Tăng cường sự hấp thu nội bào (chống ung thư, kháng khuẩn)

3 Thay đổi dược động học và phân bố sinh học (giải phóng kéo dài với những thuốc có thời gian bán thải ngắn)

4 Nâng cao sự hấp thu thuốc (Amphotericin B, Minoxidil, Paclitaxels,và Cyclosporins) [16]

Trong đó một số lĩnh vực đã thu được các kết quả đáng khả quan như: Hóa trị liệu ung thư, bào chế liposome phun mù, kháng sinh trị liệu, enzyme trị liệu, vận chuyển AND trong liệu pháp gene, ứng dụng trong miễn dịch trị liệu sản xuất vaccine và kháng nguyên, các thuốc dùng trong nhãn khoa,…

1.2.2 Phương pháp bào chế

Liposome được chế tạo theo nhiều phương pháp khác nhau: phương pháp hydrat hóa film lipid (phương pháp Bangham), phương pháp loại chất diện hoạt, phương pháp pha loãng alcol, phương pháp bốc hơi pha đảo, phương pháp đông khô, phương pháp sử dụng hệ thống kênh vi lỏng Việc lựa chọn phương pháp phụ thuộc vào: thuộc tính hóa lý của dược chất và của hợp chất dùng chế tạo liposome; đặc tính của môi trường phân tán liposome; nồng độ tác dụng của dược chất và độc tính tiềm tàng của nó; sự phù hợp của kích thước, thời gian tồn tại của liposome với vị trí sử dụng hay với mô bệnh; độ lặp lại giữa các lô trong sản xuất và khả năng sản xuất các liposome có độ an toàn và hiệu quả cao ở quy mô lớn … [15], [22]

Tất cả các phương pháp bào chế liposome trên thường tạo ra hỗn hợp các loại liposome khác nhau với các kích thước khác nhau (trừ phương pháp sử dụng hệ thống kênh vi lỏng) Liposome sau khi tạo ra thường được giảm kích thước và đồng nhất kích thước bằng các phương pháp thích hợp Có 4 biện pháp thường sử dụng để

đạt được mục đích này: Siêu âm, nén qua màng, đồng nhất hóa ở áp suất cao, đông chảy nhiểu lần Thường có sự kết hợp các phương pháp làm đồng nhất và làm giảm kích thước tiểu phân để đạt được hiệu quả mong muốn [2]

1.2.3 Các phương pháp gắn dược chất vào liposome

Dược chất có thể đưa vào trong liposome theo cơ chế thụ động hoặc chủ động

Theo cơ chế thụ động: dược chất được đưa vào liposome trong quá trình bào

chế liposome Theo đó, dược chất thân nước sẽ thêm vào pha nước, dược chất thân dầu sẽ thêm vào pha dung môi hữu cơ, sau đó tiến hành bào chế liposome bằng các phương pháp thích hợp [3],[23] Để tăng hiệu suất nạp thuốc, ít nhất là ba phương pháp có thể được sử dụng:

1 Tăng thể tích khoang nước của liposome trong khi duy trì nồng độ lipid

2 Tăng mật độ liposome trong khi vẫn giữ kích thước liposome

3 Tạo điều kiện cho việc phân phối thuốc thông qua các lớp kép (ví dụ, sử dụng phương pháp đông- chảy liên tục phá vỡ và tái cấu trúc các liposome trong quá

trình đó có thể đồng nhất với chất tan) [22]

Theo cơ chế chủ động:

Theo cơ chế này, trước tiên sẽ phải bào chế được liposome có kích thước và cấu trúc phù hợp với yêu cầu Sau đó sẽ tìm biện pháp để đưa dược chất từ ngoài vào Quá trình này đã được áp dụng thành công cho một số dược chất có tính acid yếu hay base yếu nhờ tạo ra chênh lệch ion (thường là chênh lệch H+) giữa bên trong

và bên ngoài liposome Doxorubicin là dược chất đầu tiên được đưa vào liposome thành công bằng phương pháp này với hiệu suất gắn thuốc lên tới >90%

Hình 1.2: Các phương pháp tạo chênh lệch pH qua màng liposom [11]

(A): Tạo chênh lệch ion H+ trực tiếp

(B): Tạo chênh lệch ion H+ gián tiếp thông qua tạo chênh lệch NH4+

(C): Tạo chênh lệch ion H+ gián tiếp bằng tạo chênh lệch ion kim loại hóa trị I hoặc II sử dụng kênh vận chuyển ion xuyên màng

1.2.4 Một số chỉ tiêu chất lượng hỗn dịch liposome

Sau khi bào chế và trước khi sử dụng liposome phải đạt được một số chỉ tiêu chất lượng cơ bản gồm các chỉ tiêu vật lý, hóa học và sinh học [8],[16]

Bảng1.2: Một số chỉ tiêu chất lượng của liposome

Chỉ tiêu Phương pháp đánh giá Tiêu

chuẩn

sinh học

Nội độc tố vi khuẩn Phản ứng sốt trên thỏ

Độc tính trên động vật Theo dõi số lượng chuột sống sót

Tiêu

chuẩn

vật lý

Hình dạng và đặc điểm bề mặt TEM hoặc SEM

Phân bố kích thước TEM, nhiễu xạ ánh sáng động

Điện tích bề mặt và thế zeta Phương pháp điện di

Tỉ lệ dược chất gắn với liposome Sắc ký lọc gel, li tâm, thẩm tích Dược chất được giải phóng Thẩm tích, phân tán

Phospholipid bị thủy phân HPLC/TLC

Cholesterol tự oxy hóa HPLC/TLC

Chỉ tiêu sinh học áp dụng cho dạng thuốc vô khuẩn (thuốc tiêm, tiêm truyền,

nm Ngoài ra liposome có kích thước nhỏ hơn 200 nm có khả năng lưu hành trong

máu lâu hơn liposome kích thước lớn Độ ổn định của liposome giảm theo sự tăng kích thước tối ưu với kích thước từ 80 đến 200 nm [6],[18]

Cấu trúc của liposome cũng ảnh hưởng tới hiệu suất đưa thuốc Với dược chất tan trong dầu chủ yếu nằm ở phần vỏ lipid của liposome, MLV với cấu tạo gồm nhiều lớp lipid thể tích khoang nước nhỏ là thích hợp Với những dược chất tan trong nước, lượng dược chất đưa vào phụ thuộc vào thể tích khoang nước của liposome do

đó LUV là thích hợp nhất vì có dung tích nước lớn nhất, SUV có hiệu suất nạp thuốc rất thấp do dung tích nhỏ Benny C.L Cheung và các cộng sự đã nghiên cứu khả năng đưa thuốc của dược chất tan trong nước Atenolol giữa 2 loại liposome MLV và SUV Kết quả cho thấy hiệu suất đưa thuốc vào trong SUV cao hơn là MLV Tuy nhiên khi thêm Chol hoặc tăng chiều dài mạch carbon của PL hiệu suất đưa thuốc vào MLV tăng do đường kính liposome tăng, đặc biệt khi có thêm các chất tích điện dicetyl phosphate đươc đưa vào trong MLV sẽ khiến cho hiệu suất đưa thuốc tăng lên đáng kể do xảy ra sự tương tác tĩnh điện giữa các lớp vỏ lipid làm tăng dung tích khoang nước [4],[9]

1.2.5.2.Thành phần lớp vỏ

Phospholipid

Hình 1.3: Một số trạng thái tập hợp của phospholipid [6]

Các PL có một vài đặc tính ảnh hưởng tới độ ổn định của liposome trong đó phải

kể tới như quá trình oxy hóa, quá trình thủy phân, quá trình chuyển trạng thái tập hợp

Hiện tượng chuyển trạng thái tập hợp: các phân tử PL có thể tồn tại nhiều trạng

thái tập hợp khác nhau như: dạng micel, dạng lớp kép, dạng micel đảo, dạng hexagonal… trong đó ở liposome là dạng lớp kép Các trạng thái tập hợp này có thể chuyển đổi qua lại cho nhau với các điệu kiện nhiệt động thích hợp Do đó, hiện tượng chuyển trạng thái tập hợp của các phân tử PL có thể xuất hiện trong quá trình bào chế hay bảo quản liposome gây ra sự mất ổn định của sản phẩm và đòi hỏi quá trình bào chế phải được tiến hành cẩn thận

Sự oxy hóa phospholipid: quá trình oxy hóa phospholipid trong liposome chủ

yếu diễn ra trong chuỗi acyl béo không bão hòa Các PL có chuỗi acyl béo không bão hòa như linoleic, linonic, arachidonic rất dễ bị oxi hóa tạo ra các sản phẩm thứ cấp gây tổn hại cho màng làm tăng tính thấm của lớp màng kép mất độ ổn định của cấu trúc liposome Do bị oxy hóa khi tiếp xúc với bức xạ điện từ hoặc sự hiện diện của một lượng nhỏ các ion kim loại chuyển tiếp do khơi mào quá trình hình thành các gốc tự do [5], [ 12]

Quá trình thủy phân lipid: bốn liên kết este có trong một phân tử phospholipid

có thể bị thủy phân trong nước

Các sản phẩm thủy phân là acid béo tự do, lysophospholipid và glycerol phosphoric acid Các sản phẩm này hòa tan trong nước do đó sẽ phân vùng vào môi trường nước trong hoặc ngoài liposome.Tuy nhiên, các acid béo và lysophospholipid

sẽ là một phần của liposome trong lớp màng lipid kép sẽ ảnh hưởng đến các đặc tính vật lý của liposome [12]

Cholesterol

Cholesterol có vai trò tăng độ cứng, giảm tính thấm của màng (giúp tránh rò rỉ dược chất trong thời gian bảo quản) và tăng khả năng chịu áp suất thẩm thấu của màng lipid kép

Cholesterol đã được chứng minh trước đây có tính chất chống oxy hóa trong màng sinh học và liposome gián tiếp qua cơ chế dehydrat làm giảm độ ẩm của lớp màng kép Do đó Chol làm giảm hàm lượng nước trong màng khiến suy giảm lượng ion H+ và OH-, dẫn đến làm giảm trực tiếp phản ứng thủy phân PL [10],[12],[17] Sara Zalba và các cộng sự (2012) đã nghiên cứu vai trò của Chol trong cả 3 phương pháp bào chế liposome Oxaliplatin khác nhau là: tráng phim, đông khô và bốc hơi pha đảo Các sterol tăng sự ổn định của màng, hiệu suất gắn Oxaliplatin của liposome có sử dụng Chol cao hơn 10% so với không sử dụng Chol trong thành phần vỏ.Tuy nhiên, việc giải phóng thuốc trong môi trường tế bào diễn ra chậm hơn khi có mặt Chol Ngoài ra, các liposome có Chol cũng có giá trị PDI cao hơn các liposome không có Chol trong công thức thành phần [23]

Tỉ lệ phospholipid:cholesterol

Cholesterol có khả năng liên kết với PL ở hàm lượng rất cao Tỷ lệ Chol : PL

có thể là 1:1 thậm chí 2:1 nhưng đa số trong các công thức bào chế liposome tỷ lệ Chol thường sử dụng là 20-30% Khi sử dụng Chol với hàm lượng quá thấp dưới 20% Chol không đủ để phân bố đồng đều trong lớp lipid kép Khi Chol dư thừa quá 50% khối lượng màng, các PL bị kéo giãn quá giới hạn cho phép không che chắn được cho Chol, khiến Chol tiếp xúc với nước làm thay đổi đặc tính hóa lý kết tinh lại màng dẫn tới mất nhiệt độ chuyển pha của màng, ảnh hưởng tới ổn định màng Vì vậy tỷ lệ Chol: PL là một thông số quan trọng cần nghiên cứu trong bào chế liposome [2]

M Glavas-Dodova và các cộng sự sau khi nghiên cứu bào chế liposome 5-FU bằng phương pháp đông khô đã đưa ra kết quả khi giảm nồng độ Chol từ tỷ lệ PL: Chol từ 9 : 1 xuống còn 12 : 1 và 15 : 1 thì hiệu suất nạp thuốc đối với các hoạt chất không liên kết với lớp vỏ lipid như 5-FU tăng lên do thể tích khoang nước trong liposome được cải thiện khi giảm nồng độ Chol [10]

Tỉ lệ dược chất: lipid (D/L)

Nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng khả năng giải phóng của DOX nạp trong LUV có thể được điều chỉnh bằng cách thay đổi tỉ lệ D/L Thời gian bán thải của doxorubicin từ LUV thành phần DSPC / cholesterol trong ống nghiệm tăng hơn 6lần bằng cách tăng tỷ lệ D/L từ 0,05 (kl/kl) lên 0,39 (kl/kl) Tuy nhiên khi tỷ lệ D/L tăng

từ 0,05- 0,46 (kl/kl) hình thái LUV biến đổi 1 cách bất thường chuyển dần sang hình tam giác hoặc hình chữ nhật Hiệu suất nạp thuốc từ 100% tại D/L 0,05 (kl/kl) giảm xuống còn 70% tại D/L 0,8 (kl/kl) Sự biến đổi hình thái liposome bắt đầu tại D/L > 0,2 (kl/kl) Tỷ lệ D/L tối ưu là một thông số quan trọng trong việc nâng cao độ ổn định của liposome Tỷ lệ D/L thấp khó có tác dụng điều trị ngược lại D/L cao lại ảnh hưởng trực tiếp tới độ ổn định của liposome cũng như tăng độc tính Do đó một tỷ lệ D/L tối ưu là có thể tối đa tải trọng của thuốc tới khối u mà không ảnh hướng tới sự

ổn định Số lượng thuốc tối đa nạp vào trong liposome phụ thuộc vào phương pháp nạp, kích thước liposome, [14]

Các thành phần lipid có mặt trong liposome

Gigi N.C Chiua, và các cộng sự đã tiến hành so sánh 2 công thức bào chế DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000 (tỷ lệ mol 90:10:4) hoặc DPPC/DSPE-PEG2000 (95:5) về khả năng đưa thuốc vào trong liposome và khả năng giải phóng dược chất theo thời gian với cùng một loại đệm và cùng một tỷ lệ D/L.Với cùng hệ đệm citrat

sử dụng, hiệu quả đưa thuốc không phụ thuộc vào thành phần lipid, cả 2 công thức đều đạt được hiệu suất cao nhất sau 10-20phút ủ ở 37oC và giảm dần sau 80 phút Khi đưa thuốc thông qua cơ chế chênh lệch H+ gián tiếp khi sử dụng ionophore A23187 và MnSO4, tỷ lệ D/L ban đầu 0,2(kl/kl) sau khi ủ 80 phút cho kết quả D/L lần lượt 0,05 (kl/kl) và 0,08 (kl/kl) Các kết quả này cho thấy xây dựng thành phần lysolipid trong liposome nhạy cảm nhiệt sẽ hạn chế lượng doxorubicin được đưa vào liposome thông qua kỹ thuật chênh lệch H+ gián tiếp DPPC/MSPC/DSPE-PEG2000

có khả năng giải phóng dược chất nhanh phụ thuộc vào nhiệt độ, chỉ có dưới 10% dược chất giải phóng ở 37oC trong 24h nhưng trên 85% giải phóng ở 42oC trong 5phút Trong khi đó DPPC/DSPE-PEG2000 (95:5) lại có khả năng giải phóng dược

chất từ từ, dưới 5% dược chất giải phóng ở 37oC sau 24h và 55% giải phóng ở 42oC sau 60 phút [9]

1.2.5.3 Môi trường bên trong và bên ngoài liposome

Vai trò của pH

pH đóng vai trò quan trọng tới hiệu suất nạp thuốc, ảnh hưởng lớn tới độ ổn định cũng như khả năng giải phóng dược chất của liposome

Hiệu suất đưa thuốc: với những dược chất được đưa vào liposome dựa vào

chênh lệch pH thì hiệu suất đưa thuốc bị ảnh hưởng nhiều bởi pH Trạng thái tồn tại của dược chất là ion hóa hay không ion hóa; độ tan của dược chất,… đều chịu nhiều tác động của pH Mặt khác, độ chênh lệch pH giữa 2 bên màng cũng ảnh hưởng tới tốc độ thấm của dược chất qua màng Theo các nghiên cứu, tốc độ thấm dược chất vào trong liposome sẽ giảm dần theo thời gian do đó, chênh lệch pH 2 bên màng phải tối thiểu là 3 đơn vị mới đảm bảo thu được hiệu suất liposome hóa cao [8], [16]

Độ ổn định của liposome: quá trình thủy phân PL chịu sự ảnh hưởng của pH

Theo như kết quả nghiên cứu của Grit et al về ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân của PC đậu tương trong một phạm vi pH từ 4,0-9,0 ở 400C và 700C cho thấy tốc độ thủy phân tối thiểu ở pH 6,5 [8] Kết quả tương tự cũng được báo cáo về sự thủy phân của DSPC và phosphatidyl hydrogen hóa pH cũng ảnh hưởng đến quá trình suy thoái gián tiếp bởi sự tương tác của DOX với các ion kim loại… Ngoài ra,

pH còn ảnh hưởng đến khả năng tích điện tiểu phân, thế zeta do đó ảnh hưởng tới độ

ổn định hóa lý của liposome [8], [12]

Loại muối đệm sử dụng để tạo chênh lệch pH

Các loại muối đệm sử dụng để tạo chênh lệch pH ảnh hưởng lớn tới hiệu suất liposome hóa do cơ chế đưa thuốc vào liposome khác nhau Bên cạnh đó anion của muối đệm sử dụng bản thân nó không tham gia vào quá trình nạp thuốc nhưng lại có ảnh hưởng tới độ ổn định của liposome, do khả năng tạo kết tủa với dược chất ở bên trong màng Dược chất sau khi vào vận chuyển vào bên trong liposome tạo phức với anion dạng keo tủa sẽ ổn định hơn trong quá trình nạp thuốc, hạn chế được sự rò rỉ ra

ngoài tuy nhiên các loại phức khác nhau lại làm thay đổi hình dạng của liposome do thay đổi áp suất thẩm thấu

Gigi Chiua N.C và các cộng sự đã tiến hành so sánh hiệu quả đưa thuốc với các hệ đệm khác nhau: citrat, MnSO4+ionophore A23187 khi bào chế liposome nhạy cảm nhiệt.Tỷ lệ D/L ban đầu là 0,2 (kl/kl), sử dụng citrat chỉ đạt được một hiệu suất nạp khoảng 25% trong công thức liposome nhạy cảm với nhiệt Trong khi sử dụng MnSO4 hiệu suất nạp có thể trên 90% gấp bốn lần so với dùng citrate [9]

Chất bảo vệ khi đông khô

Một trong các biện pháp làm tăng độ ổn định liposome là đông khô hỗn dịch liposome để bảo quản và sẽ phân tán trở lại trong nước khi sử dụng Sự thay đổi nhiệt độ và quá trình mất nước trong quá trình đông khô có thể làm vỡ cấu trúc của các liposome, do đó rất cần thiết phải có các chất bảo vệ trong quá trình đông khô Các chất này có khả năng hấp phụ lên bề mặt màng lipid nhờ các liên kết hydro với đầu thân nước của phân tử PL và ổn định liên kết giữa các phân tử lipid giúp chúng không bị vỡ ra trong quá trình đông khô

M Glavas-Dodova tiến hành so sánh độ ổn định của 2 mẫu bào chế MUV

5-FU bằng phương pháp tráng phim sau đó đem đông khô có sử dụng và không sử dụng chất bảo vệ khi đông khô là saccharose Hai mẫu được so sánh dựa trên các tiêu chí kích thước liposome, hiệu quả nạp thuốc, khả năng giải phóng dược chất trước và sau khi đông khô Kết quả cho thấy mẫu bào chế không sử dụng saccharose có sự gia tăng kích thước tiểu phân cũng như sự rò rỉ dược chất một cách đáng kể do saccharose có khả năng làm ổn định màng cũng như giảm tính thấm tránh rò rỉ dược chất Khi sử dụng saccharose có tới 80% dược chất được giữ lại trong liposome sau quá trình đông khô [10]

1.2.6 Một số biện pháp tăng độ ổn định của liposome

• Bảo quản ở nhiệt độ thấp,tránh ánh sáng và oxy

• Sử dụng chất chống oxi hóa như tocoferol và butyl hydroxy toluen (BHT)

để bảo vệ các phân tử PL EDTA cũng có thể được sử dụng khóa các ion kim loại chuyển tiếp ion

• Làm việc dưới môi trường khí trơ như nitrogen hoặc argon

• Điều chỉnh pH của môi trường phân tán gần với pH trung tính

• Đông khô hỗn dịch liposome giúp chế phẩm ở dạng bột khô dễ bảo quản hơn, ổn định hơn, tuổi thọ dài hơn [16]

1.2.7 Liposome doxorubicin

1.2.7.1 Ưu điểm so với dạng thông thường

- Có thể mang đồng thời cả dược chất thân dầu và dược chất thân nước

- Làm thay đổi dược động học của thuốc: tăng thời gian tuần hoàn đối với những thuốc có thời gian bán thải ngắn, thay đổi phân bố sinh học tập trung thuốc tại đích giảm phân bố tại cơ quan lành nên giảm độc tính, tăng hiệu quả điều trị

- Bảo vệ dược chất khỏi các tác động bất lợi của môi trường bên ngoài trong quá trình bảo quản và vận chuyển thuốc tới đích

- Các ligand giúp liposome có khả năng định vị và tập trung tại mô đích

- Có cấu trúc tương tự với màng sinh học của cơ thể sống nên là một chế phẩm

có độ an toàn sinh học cao Ngoài ra cũng giúp liposome dễ thấm vào tế bào tăng sinh khả dụng dược chất

Dược động học của liposome doxorubicin khác hẳn so với doxorubicin dạng tự

do Doxorubicin khi gắn với liposome đã PEG hóa có thời gian tồn tại trong vòng tuần hoàn kéo dài hơn và ít phân bố tới các mô hơn Các liposome doxorubicin phân

bố nhiều tới các mô ung thư có hệ mạch máu không bình thường Do đó giảm độc tính khi điều trị

1.2.7.2 Một số nghiên cứu gần đây về liposome DOX

Yi Zhao và các cộng sự (2013) đã có phương pháp bào chế nhằm tăng hiệu quả điều trị của Doxil bằng cách sử sụng Pluronic 85 (P85) kết hợp trong màng liposome P85 có tác dụng tăng tính thấm của màng làm tăng hiệu quả điều trị của Doxil do tăng khả năng xâm nhập và giải phóng thuốc vào các khối u rắn trong các thí nghiệm trên tế bào ung thư buồng trứng A2780 Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc bằng phương pháp thẩm tích cho thấy rằng việc bổ sung P85 tăng đáng kể khả năng giải phóng DOX khoảng 50% thuốc đã được giải phóng trong thời gian 24 giờ trong khi giải phóng thuốc từ một mình Doxil là dưới 20% Cụ thể, việc tăng cường giải phóng

tương đối mạnh với 0,02% đến 0,5% P85, ít hiệu quả với nồng độ 0,001% P85 và hầu như không có tác dụng ở nồng độ 0,0001% Kích thước và PDI của liposome trong không bị ảnh hưởng ngay cả khi sử dụng nồng độ cao nhất của P85 Tác dụng chống ung thư được tăng cường mạnh nhất khi P85 được dùng 48 giờ sau khi dùng Doxil Trong trường hợp này, sau 21 ngày kích thước khối u đã được giảm gần 3 lần so với Doxil [24]

Zhaohui Wang và các cộng sự (2012) đã nghiên cứu bào chế liposome miễn dịch gắn peptide hướng đích trong điều trị ung thư di căn (TMT-LS: tumor metastasis targeting liposome) bằng cách sử dụng liposome ngụy trang với một peptide hướng đích

di căn ung thư cụ thể Liposome được bào chế theo phương pháp tráng phim (SPC/ cholesterol / DSPE PEG: 20:10:02) hyrat hóa bằng 123mM amoni sulfat, siêu âm trong

30 phút sử dụng sắc ký lọc gel Sephadex G-50 thu lấy các liposome có kích thước 100

nm sau đó tiến hành nạp DOX nhờ phương pháp chênh lệch pH, tinh chế liposome cũng bằng phương pháp lọc trên gel Sau quy trình bào chế thu được các TMT-LS có kích thước 94,41 ± 0,1 nm, hiệu suất liposome hóa gần 100% Phân tích qua đo dòng tế bào cho thấy nồng độ TMT-LS-DOX tập trung tại dòng tế bào ung thư di căn (MDA-MB-435S và MDA-MB-231) cao hơn hẳn so với LS-DOX trong khi đó không có sự khác biệt đáng kể về nồng độ dược chất tại khối u giữa TMT-LS-DOX và LS-DOX ở dòng tế bào ung thư không di căn (MCF-7) Sau 14 ngày, kích thước khối u từ 6,6±1,57 cm giảm xuống 3,63±0,37 cm khi điều trị bằng LS-DOX và 1,71±0,33 cm khi sử dụng

TMT-LS-DOX [21]

Constanze Hantel cùng các cộng sự (2012) đã nghiên cứu và phát triển liposome miễn dịch gắn kháng thụ thể IGF1(SSLD-1H7) để điều trị các khối u nội tiết của hệ thống tiêu hóa Đánh giá kết quả trên dòng tế bào NCIH295 Kết quả sau khi đo dòng tế bào cho tỷ lệ liposome miễn dịch IGF1 tập trung ở khối u (57,1 ± 2,4%) cao hơn các liposome tuần hoàn dài (SPC / Chol-PEG: 50,1 ± 2%) Giảm đáng kể kích thước khối u trong NCIH295 ở chuột phương pháp điều trị duy nhất với SSLD-1H7 (0,89 ± 0,15 cm) cao hơn khi dùng SSLD-PEG (1,01 ± 0,19 cm) so với không được điều trị (1,5 ± 0,10 cm) Liposomes miễn dịch kháng IGF1-R đã được thử nghiệm thành công trong ống nghiệm và trong một mô hình tiền lâm sàng ung thư biểu mô tuyến thượng thận trong cơ thể, đại diện cho phương pháp trị liệu đầy hứa hẹn cho các thực thể khối u này [13]

Antonella Accardo và cộng sự (2012) đã nghiên cứu bào chế và đánh giá tác dụng của liposome doxorubicin gắn nhóm peptid MonY-BN tới các receptor bombesin tại các

tế bào ung thư (DSPC-MonY-BN-DOX) Liposome với thành phần bao gồm DSPC và Mony-BN (tỉ lệ mol 97:3) được bào chế bằng phương pháp bốc hơi pha đảo rồi được đùn qua màng polycarbonat kích thước lỗ lọc 100nm nhờ áp suất khí Nitơ tạo ra liposome đường kính 145,5 ± 31,5 nm và chỉ số PDI 0,20 ± 0,05, thế zeta -12,8 ± 3,6

mV Nạp DOX bằng phương pháp chênh lệch pH sử dụng citrat làm hệ đệm bên trong liposome, môi trường bên ngoài HEPES pH 7,4 (20mmol HEPES, 150mmol NaCl) hiệu suất liposome hóa: 95,0 ± 2,7% Liposome DSPC/ Mony-BN tập trung trong tế bào PC-

3 là 2,7% ± 0,3% ở 37oC, so với liposome DSPC peptide tự do 1,4% ± 0,2% ở 37oC DSPC-MonY-BN-DOX ức chế sự phát triển khối u cao hơn (60%) so với DSPC /Dox liposome không đặc hiệu (36%) [7]

Tại Việt Nam, trường Đại học Dược Hà Nội là đơn vị tiên phong đầu tiên trong nghiên cứu về liposome ứng dụng làm chất mang thuốc Các nghiên cứu về liposome doxorubicin được thực hiện tại 2 đơn vị là Bộ môn Bào chế và Bộ môn Hóa sinh và đã thu được nhiều kết quả quan trọng [2],[4],[5]

Tại Bộ môn Bào chế, ThS Nguyễn Văn Lâm và các cộng sự sau 1 thời gian dài nghiên cứu đã đưa ra được công thức và quy trình bào chế cho thuốc tiêm liposome doxorubicin 2mg/ml Liposome được bào chế bằng phương pháp hydrat hóa film với thành phần màng lipid gồm PC và cholesterol, sau đó sử dụng siêu âm để làm giảm kích thước, sử dụng phương pháp lọc tiếp tuyến để tiến hành đổi đệm, tạo ra các liposome có

sự chênh lệch pH hai bên màng Sau đó bơm hỗn dịch này vào các lọ thủy tinh có chứa bột đông khô của doxorubicin và ủ ở 50oC trong 15 phút Kết quả tạo ra liposome doxorubicin có kích thước dưới 200 nm, hiệu suất liposome trên 80% Đánh giá tác dụng chống ung thư trên khối u cơ và khối u dưới da chuột cho thấy sản phẩm của nghiên cứu cho tác dụng tốt hơn hẳn so với dạng thuốc tiêm dung dịch doxorubicin nhưng còn hơi kém so với Lipo-Dox

Nhìn chung, các nghiên cứu về liposome doxorubicin ở trường Đại học Dược Hà nội hiện nay, đang gặp khó khăn lớn trong vấn đề tăng độ ổn định cho liposome

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Liposome DOX

2.1.2 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1: Nguyên vật liệu chính dùng trong nghiên cứu

TT Tên nguyên liệu Nguồn gốc Tiêu chuẩn

3 Phosphatidyl cholin đậu nành (soy

phosphatidyl cholin)

Avanti polar

6 Hepes

15 Dung dịch tiêm truyền glucose 5% Việt Nam DĐVN

2.1.3 Phương tiện nghiên cứu

 Hệ thống cất quay Rovapor R-210 (hãng Buchi- Đức)

 Thiết bị siêu âm Labsonic

 Thiết bị lọc tiếp tuyến MicroKros, màng polysulfone, 10kD, 28cm2 (Mỹ)

 Thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern-Anh)

 Máy ly tâm lạnh Universal 320R (Hettich- Đức)

 Thiết bị qua màng ER1 (Eastern Scientific LLC-USP)

 Màng lọc polycarbonate với kích thước lỗ lọc 1-0,8-0,4-0,2 µm

 Màng lọc cellulose acetat 0,2µm, 0,4µm

 Máy quang phổ UV – VIS U-1800 (Hitachi - Nhật Bản)

 Máy đo pH InoLab

 Bơm nhu động

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp bào chế liposome doxorubicin

Dựa theo các kết quả của các nghiên cứu về liposome DOX đã đạt được[1], [ 2], liposome doxorubicin được bào chế qua các giai đoạn sau:

2.2.1.1 Bào chế liposome trắng chưa mang dược chất

Tạo lớp film lipid: hòa tan SPC : Chol (7:3) trong Choloroform Tiến hành bốc

hơi dung môi trên thiết bị cất quay ở nhiệt độ 40oC trong điều kiện chân không, tốc

độ quay là 50 vòng/phút Thời gian cất quay tiến hành khoảng 12h

Hydrat hóa: sử dụng 2 loại đệm citrat pH 4,0 hoặc amoni sulfat pH 5,5 đã lọc

qua màng lọc 0,2 μm Tăng tốc độ quay lên 80 vòng/phút và tăng nhiệt độ lên 50oC,

mở van của thiết bị cất quay để hút hết dung dịch đệm citrat / amoni vào Sau 90 phút hydrat hóa thu được hỗn dịch liposome có màu trắng đục

+ Công thức đệm citrat: hòa tan 3,15 g acid citric và 0,7 g NaOH hòa tan trong

100 ml nước cất pha tiêm điều chỉnh tới pH 4,0 ± 0,1 bằng dung dịch NaOH 10% Lọc qua màng cellulose acetate 0,2 μm

+ Công thức đệm amoni sulfat: hòa tan 1,68g (NH4)2SO4 vào100 ml nước cất pha tiêm điều chỉnh tới pH 5,5 ± 0,1 bằng dung dịch NaOH 10% Lọc qua màng cellulose acetate 0,2 μm

2.2.1.2 Làm giảm kích thước tiểu phân

Sử dụng 1 trong 2 phương pháp sau:

Phương pháp siêu âm: cho vào lọ thủy tinh hỗn dịch liposome ở trên, nhúng

đầu siêu âm của thiết bị Labsonic ngập 1/3 hỗn dịch, siêu âm với tần số 30 kHz, biên

độ 100% Làm mát bằng nước lạnh để đảm bảo nhiệt độ siêu âm không vượt quá

60oC Sau khi siêu âm, lọc hỗn dịch qua màng cellulose acetat 0,45 μm rồi 0,2 μm

Phương pháp nén qua màng (extrusion) Mỗi lần hút 1ml hỗn dịch vào xilanh

rồi lần lượt đẩy qua các màng polycarbonat với kích thước lỗ lọc giảm dần từ 1000

nm đến 100 nm Duy trì nhiệt độ khi nén qua màng ở nhiệt độ chuyển pha của lipid

2.2.1.3 Tiến hành đổi hệ đệm bên ngoài liposome

Sử dụng phương pháp lọc tiếp tuyến để đổi môi trường Sử dụng 1 trong 2 loại dung dịch đệm sau để thay đổi môi trường bên ngoài liposome:

 Đệm HBS (HEPES buffer saline): hòa tan 20mM HEPES trong 1l dung dịch NaCl 0,9%

 Đệm HBG (HEPES buffer glucose): hòa tan 20mM HEPES trong 1l dung dịch glucose 5%

Tiến hành: bố trí hệ thống lọc tiếp tuyến như hình 2.1

Hình 2.1: Sơ đồ hệ thống lọc tiếp tuyến tự động [2]

Bơm tuần hoàn hỗn dịch liposome qua cột lọc, liposome không qua được màng liên tục chạy qua cột.nước và các phân tử chất tan thấm qua màng thoát ra ngoài bị

loại bớt khiến áp suất trong lọ thủy tinh chứa hỗn dịch liposome giảm tạo lực hút đệm HEPES sang để bù vào lượng nước bị loại mất Kết quả là bao nhiêu thể tích dung dịch cũ bị loại thì được bù vào bằng bấy nhiêu thể tích dung dịch đệm HEPES Quá trình sẽ diễn ra cho tới khi thể tích dung dịch đổi gấp 8-10 lần thể tích liposome thì có thể loại được hoàn toàn môi trường cũ

Khi pH dịch lọc đạt 7,2 - 7,4 mà dung tích HEPES vẫn nhỏ hơn 8 lần thể tích hỗn dịch thì vẫn tiếp tục chạy bơm tới khi đủ 8-10 lần thể tích để đảm bảo loại bỏ gần như hoàn toàn anion citrat hoặc sulfat có mặt trong môi trường ngoài liposome

có khả năng gây tủa DOX khi nạp thuốc

2.2.1.4.Đưa DOX vào liposome

Sử dụng 2 phương pháp nạp DOX dựa trên chênh lệch pH và chênh lệch amoni + Chênh lệch pH: môi trường bên trong liposome là đệm citrat

+ Chênh lệch amoni: môi trường bên trong liposome là đệm amoni sulfat Quá trình đổi môi trường bên ngoài liposome bằng đệm HEPES kết thúc sẽ thu được được liposome có sự chênh lệch pH hoặc chênh lệch amoni giữa 2 bên màng Quá trình gắn DOX vào liposome được tiến hành như sau:

Cân chính xác một lượng doxorubicin hydrochlorid rồi hòa tan từ từ vào hỗn dịch trên bằng máy khuấy từ và khuấy liên tục trong khoảng 15 phút ở 50oC để DOX

có thể hòa tan và khuếch tán vào trong liposome

Sơ đồ quy trình bào chế liposome DOX [1], [2]

Hình 2.2: Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn của quy trình bào chế liposom doxorubicin

bằng phương pháp tráng film

2.2.2 Phương pháp đánh giá cấu trúc và hình thái liposome

Sử dụng phương pháp chụp hiền vi điện tử truyền qua (TEM) với kỹ thuật nhuộm soi âm bản để đánh giá cấu trúc bề mặt và cấu trúc bên trong của liposome từ

đó xác định cấu trúc của liposome là SUV hay MLV

Kỹ thuật nhuộm soi âm bản: kỹ thuật này được thực hiện trên giấy parafin theo kiểu nhỏ giọt sử dụng lưới đồng có phủ màng collodion- cacbon

1 Đưa mẫu lên lưới (10 phút)

Hòa tan trong 50ml cloroform

Cất quay tạo film lipid

Hydrat hóa tạo liposome

liposome

Nhiệt độ: 40oC Tốc độ quay: 50v/phút Thời gian: 12h

Nhiệt độ: 50⁰C Tốc độ quay: 80v/phút Thời gian: 2h

2 Cố định mẫu bằng dung dịch glutaraldehyte 1% / nước cất (5 phút)

3 Rửa mẫu bằng dung dịch amonium acetate 0.1% / nước cất (5 phút)

4 Nhuộm bằng dung dịch nhuộm uranyl acetate 1% / nước cất (5 phút)

5 Để khô tự nhiên, quan sát hình thái, kích thước mẫu dưới kính hiển vi điện

tử JEM1010

Phương pháp chụp TEM cũng giúp xác định chính xác kích thước tiểu phân liposome tạo ra

2.2.3 Phương pháp đánh giá kích thước và phân bố kích thước của liposome

Pha loãng mẫu liposome 100 lần bằng dung dịch đẳng trương NaCl 0,9% (đã lọc qua màng 0,2 μm) rồi đo phân bố kích thước tiểu phân bằng kỹ thuật tán xạ ánh sáng động (DLS) trên thiết bị Zetasizer ZS90 Đánh giá đặc tính phân bố kích thước tiểu phân của hệ qua chỉ số đa phân tán (PDI), Z-average, đồ thị phân bố kích thước tiểu phân

2.2.4 Phương pháp định lượng

2.2.4.1 Xây dựng đường chuẩn bằng phương pháp đo quang UV-VIS

Dãy dung dịch chuẩn được chuẩn bị như sau: cân chính xác 100 mg DOX.HCl hòa tan hoàn toàn trong 100 ml dung dịch đệm phosphat pH 4,0 sử dụng thiết bị khuấy từ Cho vào bình định mức 100 ml thêm từ từ dung dịch phosphate tới vạch thu được dung dịch DOX với hàm lượng 1000 μg/ml Từ dung dịch gốc đem pha loãng bằng đệm phosphat pH 4,0 để thu được các dung dịch chuẩn có nồng độ 1, 2,

4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 μg/ml Các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 1 tới 12 μg/ml được đo quang ở bước sóng 233 nm từ đó định lượng DOX tự do Các dung dịch chuẩn có nồng độ từ 6 đến 20 μg/ml được đo quang ở bước sóng 481 nm để định lượng DOX toàn phần Cả 2 trường hợp đều sử dụng mẫu trắng là dung dịch đệm phosphat pH 4,0

Từ kết quả thu được, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính , vẽ đồ thị biểu hiện mối quan hệ tương quan giữa nồng độ DOX và mật độ quang [1], [4]

2.2.4.2.Định lượng dược chất toàn phần

Mẫu thử: hút 1ml mẫu liposom, thêm 1ml dd Triton X100 10% (tt/tt) vào bình

định mức 10 ml Lắc kỹ, để yên 5 phút Thêm đệm phosphat pH 4,0 đến vạch Để