công nghệ chế biến sữa và đồ uống

Schrezenmeir và de Vrese 2001 ñịnh nghĩa thuật ngữ probiotic như là một chế phẩm chứa những vi sinh vật xác ñịnh còn sống với số lượng lớn có khả năng thay thế vi sinh vật ñường ruột bằn

Phần 1: GIỚI THIỆU CHUNG

1 ðỊNH NGHĨA VỀ PROBIOTIC:

Probiotic ñược ñịnh nghĩa khác nhau bởi nhiều nhà nghiên cứu ðịnh nghĩa về probiotic ñang ñược thay ñổi cùng với sự gia tăng kiến thức về chức năng của probiotic Probiotic ñược ñịnh nghĩa là một canh trường vi sinh vật còn sống ñược phát triển trong miệng và sống sót khi di chuyển tới ruột già, nơi chúng ñịnh cư (Frost và Sullivan, 2000; Saarela và cộng sự, 2000; Matilla-Sandholm và cộng sự, 2002; Betoret

và cộng sự, 2003) Schrezenmeir và de Vrese (2001) ñịnh nghĩa thuật ngữ probiotic như là một chế phẩm chứa những vi sinh vật xác ñịnh còn sống với số lượng lớn có khả năng thay thế vi sinh vật ñường ruột bằng cách ñịnh cư trong ruột của vật chủ và ảnh hưởng có lợi ñến sức khỏe vật chủ FAO/WHO, 2001, chấp nhận ñịnh nghĩa về probiotic như sau: “vi sinh vật còn sống tồn tại với số lượng vừa ñủ và ảnh hưởng tốt ñến sức khỏe của vật chủ” (Leahy và cộng sự, 2005)

Thực phẩm probiotic trở nên phổ biến nhờ vào ảnh hưởng tốt của chúng tới sức khỏe con người (Desmond và cộng sự, 2002) Trong liệu pháp probiotic, những vi sinh vật có lợi này ñược ñưa vào cơ thể qua ñường tiêu hóa và do ñó trở thành vi sinh vật ñường ruột ðiều này dẫn tới kết quả là một số lượng lớn vi khuẩn có lợi ñã ñược khám phá và hạn chế những vi khuẩn gây hại (Mombelli và Gismondo, 2000)

Ảnh hưởng có lợi của những vi khuẩn probiotic có ñược là do những vi sinh vật này bám chặt vào lớp biểu mô ruột (Sanminen và cộng sự, 1998) Sự hiện diện và bám chặt của probiotic vào lớp niêm mạc của thành ruột ñã tạo nên một rào chắn sinh học tự nhiên mạnh chống lại những vi khuẩn gây bệnh (Chen và Yao, 2002) Sự bám dính do

ñó là bước ñầu tiên ñể ñịnh cư của chúng Sự bám dính vào lớp biểu mô ruột rất rõ ràng bao gồm sự bám dính của vi khuẩn và phân tử nhận trên tế bào biểu mô hay không rõ ràng dựa trên những nhân tố hóa lý Có nhiều giống vi khuẩn lactic có nguốc gốc từ sữa và cả từ người có khả năng bám dính hiệu quả vào tế bào người (Samninen

− Sự sống sót của chúng trong ñiều kiện môi trường tại nơi chúng hoạt ñộng

− Sự sinh sôi và/hoặc sự ñịnh cư của chúng tại nơi hoạt ñộng

− Không có phản ứng miễn dịch chống lại probiotic từ cơ thể vật chủ

− Không gây bệnh, không ñộc, không gây dị ứng, không gây ñột biến hoặc các phản ứng gây ung thư sinh ra bởi bản thân giống probiotic, sản phẩm lên men hay do thành phần tế bào sau khi chết của tế bào

2 PHÂN BIỆT PROBIOTIC, PREBIOTIC VÀ SYNBIOTIC:

Thông tin về probiotic ñã ñược chúng tôi cung cấp trên ñây Tuy nhiên cũng có những thuật ngữ khác dễ gây nhầm lẫn ñó là prebiotic và symbiotic, sẽ ñược trình bày bên dưới

2.1 Prebiotic:

Prebiotic là những thành phần trong thức ăn không tiêu hóa ñược nhưng lại có ảnh hưởng tốt tới con người bằng cách kích thích chọn lọc sự phát triển và/hoặc hoạt tính của một hay một số lượng giới hạn vi sinh vật nào ñó trong ruột kết (Roberfroid, 1998; Theuer và cộng sự, 1998; Young, 1998; Fermia và cộng sự, 2002) Chúng làm thay ñổi

hệ vi sinh vật trong ruột, tạo ñiều kiện thuận lợi cho sự phát triển của những vi khuẩn

có khả năng tăng cường sức khỏe cho con người, ñặc biệt là Lactobacilli và Bifidobacteria, sao cho những vi khuẩn này chiếm ưu thế về số lượng (Roberfroid, 1998) ðiều này dẫn tới làm tăng cả số lượng vi khuẩn nội sinh trên trong phân (Fermia và cộng sự, 2002; Losada và Olleros, 2002) Prebiotic cũng ñiều hòa quá trình trao ñổi lipid thông qua quá trình lên men Sự kích thích chọn lọc sự phát triển của Bifidobacteria bởi prebiotic ñược cho thấy sự giảm ñáng kể số lượng vi khuẩn có nguy

cơ gây bệnh cho cơ thể (Losada và Olleros, 2002)

Carbohydrate ñược sử dụng ñể tăng sự phát triển của những vi khuẩn có lợi Những carbohydrate làm tăng sự phát triển của những vi khuẩn lactic ñược gọi là bifidogenic oligosaccharide (Farmer, 2002) Bifidogenic oligosaccharide chứa fructooligosaccharide (FOS) (inulin), glucooligosaccharide (GOS), những oligosaccharide mạch dài của fructose và/hoặc glucose và trisaccharide, raffinose Chúng không dễ ñược tiêu hóa bởi những vi khuẩn gây bệnh (Annika và cộng sự, 2002; Farmer, 2002; Fermia và cộng sự, 2002)

Những carbohydrate không tiêu hóa ñược tìm thấy trong nhiều loại trái cây, rau (artichoke, tỏi, tỏi tây và hành) và ngũ cốc (Fermia và cộng sự, 2002; Losada và Olleros, 2002) Chúng là một hỗn hợp các chuỗi ñường hình thành bởi các phân tử glucose và fructose Sử dụng thực phẩm chứa prebiotic oligosaccharide vận chưa ñủ ñể hoàn thiện hệ vi sinh vật ñường ruột và chúng chỉ chiếm một thành phần nhỏ trong những thực phẩm trên Thay vào ñó, prebiotic ñược khai thác từ những thực phẩm này

và ñược cho vào những thực phẩm thông thường dễ dàng ñược tiêu hóa hơn như bánh biscuit hay những thực phẩm có nguồn gốc từ những carbohydrate khác (Taylor và cộng sự, 1999) Những thành phần tự nhiên này có thể ñược sản xuất rẻ tiền hơn bằng cách sử dụng enzyme β-D-fructofuranosidase hay fructosyltransferase ñể bổ sung thêm

các phân tử fructose theo cơ chế chuyển gốc frutosyl (tranfructosylation) Những

enzyme như α-amylase, saccharase và maltase không phân hủy ñược những oligosaccharide này, ñặc biệt là trong cơ thể con người (Losada và Olleros, 2002) Những nguyên liệu này tới ruột kết, nơi chúng có thể bị lên men hoàn toàn hay một phần hay vẫn chưa ñược lên men Không có phân tử glucose hay fructose nào hình thành oligosaccharide hay inulin ngay tại tĩnh mạch cửa Những nguyên liệu này ñược lên men bởi hệ vi sinh vật trong ruột kết Quá trình lên men prebiotic dẫn tới sự kích thích chọn lọc sự phát triển của Bifidobacteria (Flamm và cộng sự, 2001) Trong ống

tiêu hóa (GI tract), bifidogenic oligosaccharide ñược chuyển hóa chỉ bởi vi khuẩn

Lactobacillus và Bifidobacteria có sẵn trong ruột mà không phải bởi những vi sinh vật

có hại như Clostridia, Staphylococcus, Salmonella và Escherichia coli Sử dụng

bifidogenic oligosaccharide cùng với vi khuẩn lactic tạo ra những ảnh hưởng tốt, vi khuẩn probiotic phát triển và cạnh tranh với những vi sinh vật gây bệnh không mong muốn trong ống tiêu hóa Bifidogenic oligosaccharide làm tăng mức ñộ bổ sung dinh dưỡng và tăng ñộ hòa tan các chất dinh dưỡng (Farmer, 2002) Không giống như probiotic, prebiotic không phải là cơ thể sống và do ñó, chúng không có vấn ñề về sự sống sót trong sản phẩm và cả trong ruột (Frost và Sullivan, 2000)

2.1.1 Oligosaccharide không tiêu hóa ñược (NDO):

Oligosacchride có trên thị trường ở dạng bột kết tinh hay sirup 75% (w/v).Sự chọn lựa oligosaccharide bị ảnh hưởng bởi vài nhân tố như chi phí, ảnh hưởng tới tính chất hóa lý của hực phẩm và ñộ bền của oligosaccharide trong ñiều kiện pH và nhiệt ñộ biến ñổi có thể làm thủy phân NDO Những nhân tố khác có thể ñược xem xét như ảnh hưởng của NDO lên sinh lý và sức khỏe của con người NDO có một số ảnh hưởng tới sinh lý của con người Chúng ñược sử dụng như chất thay thế chất béo và ít năng lượng Khả năng gây sâu răng thấp nên ngăn chặn ñược sự mài mòn của răng và xương và chúng cũng là một dạng của xơ ăn kiêng Tuy nhiên nếu dùng với một lượng quá nhiều, chúng cũng gây ra một số triệu chứng như chướng bụng, ñầy hơi hay tiêu chảy ðiều này xảy ra do có sự thay ñổi thế thẩm thấu hay do sự lên men quá nhiều Những ảnh hưởng không mong muốn chỉ xảy ra khi sử dụng NDO quá liều (Holzapfel

và Schillinger, 2002)

2.1.2 Fructooligosaccharide (FOS):

FOS là oligosaccharide hình thành bởi 1 phân tử glucose liên kết với 1 – 3 phân tử fructose Chúng là polymer mà các ñơn phân là β-D-fructosyl mạch ngắn gồm 9 ñơn phân (oligosaccharide) hay trung bình gồm 60 ñơn phân (inulin) FOS có trong các loài thực vật như hành, rễ măng tây, thân cây Jerusalem artichoke và lúa mạch Ngoài

ra còn có trong chuối, bia, cây ngưu bàng, hẹ, các cây graminae, mật ong, yến mạch, thông, lúa mạch ñen, rau diếp xoăn và ngay cả trong vi khuẩn và nấm men (Ziemer và Gibson, 1998; Bengmark và cộng sự, 2001) FOS mạch ngắn là một hỗn hợp oligosaccharide chứa glucose liên kết với fructose qua liên kết β-(1,2)-glucoside Chúng không ñược tiêu háo hiệu quả trong ruột non người nhưng ñược lên men trong ruột kết nhờ hệ vi sinh vật ở ñây (Bounik và cộng sự, 1999) Những ñơn phân ñược nối với nhau bằng cầu nối ñặc biệt có thể chịu ñược sự tấn công của enzyme ñộng vật

có vú (Ziemer và Gibson, 1998) Hầu hết các loài Bifidobacteria ñều có khả năng lên men ñược FOS Bifidobacteria có hoạt tính enzyme β-fructosidase tương ñối cao ñặc hiệu cho liên kết β-(1,2)-glucoside có mặt trong FOS Fructose, sản phẩm của quá trình thủy phân FOS, là nguồn cơ chất quan trọng cho quá trình lên men hầu như chỉ xảy ra với Bifidobacteria (Theuer và Cool, 1998) Chúng ảnh hưởng tốt lên cholesterol máu, triglyceride và áp suất máu ở những người lớn tuổi mắc bệnh tăng lipid máu (Bengmark và cộng sự, 2001)

FOS ñại diện cho nguồn dinh dưỡng ñặc hiệu của những vi sinh vật có lợi và do ñó

có tiềm năng ñể tăng sự hiệu quả của các sản phẩm probiotic hiện tại Những nghiên cứu khoa học tại Nhật Bản cho thấy rằng sự tiêu thụ FOS thay ñổi sự cân bằng của hệ

vi sinh vật ñường ruột theo chiều hướng gia tăng số lượng Bifidobacteria và các vi sinh vật có lợi khác ngay cả khi thiêu probiotic khi ăn kiêng (Losada và Olleros, 2002)

Chúng ñược sản xuất trong công nghiệp bằng cách sử dụng 2 kỹ thuật sản xuất khác nhau nhưng thành phẩm lại không khác nhau nhiều Trong phương pháp 1, FOS ñược tổng hợp từ nguyên liệu sucrose nhờ enzyme tranfructosylase còn trong phương pháp

2, inulin từ rau diếp xoăn ñược chuyển hóa Polysaccharide sau ñó bị tác ñông bởi một enzyme thủy phân có kiểm soát (Frost và Sullivan, 2000) 2 FOS ñược sản xuất có cấu trúc tương tự nhau và có kích thước gần bằng nhau, do ñó chúng có sự khác nhau nhỏ trong chức năng là prebiotic FOS ñược sử dụng an toàn và hiệu quả ñối với người và ñộng vật Chúng không ảnh hưởng ñến AND, không có các chất gây ung thư và không

có ñộc tính FOS không chỉ ảnh hưởng tốt cho sức khỏe mà còn góp phần tạo nên kết cấu và hình dạng cho thực phẩm chứa chúng (Frost và Sullivan, 2000) Tuy nhiên, chúng khá nhuận tràng và gây ñầy hơi khi dùng với liều cao (Losada và Olleros, 2002)

2.1.3 Galactooligosaccharide (GOS):

ðược tổng hợp từ ryrup lactose sử dụng enzyme β-galactosidase (Frost và Sullivan, 2000; Gibson, 2004) Chúng không bị thủy phân và hấp thu trong ruột người và chỉ ñóng vai trò là cơ chất cho Bifidobacteria (Frost và Sullivan, 2000)

2.1.4 Ngũ cốc:

Ngũ cốc, các loại hạt, ñậu và dầu hạt là nguồn cung cấp xơ ăn kiêng Acid phytic là ñường bị hexaphosphoryl hóa và chiếm 1 – 5% khối lượng các loại thực phẩm trên Acid phytic tạo phức với sắt do ñó ngăn chặn những sản phẩm của quá trình oxy hóa như các gốc tự do ðiều này có thể giải thích cho những ảnh hưởng bảo vệ của xơ ăn kiêng (Taylor và cộng sự, 1999) Ngũ cốc có thể sử dụng như là cơ chất cho quá trình lên men của vi sinh vật probiotic (Charalampopoulos và cộng sự, 2002) Quá trình lên men xơ ăn kiêng bởi vi khuẩn trong ruột kết tạo thàh sản phẩm là các acid béo mạch ngắn (Taylor và cộng sự, 1999; Ridlon và cộng sự, 2006)

Butyrate là một acid béo mạch ngắn sản xuất bởi quá trình lên men xơ ăn kiêng Những cuộc thí nghiệm trên ñộng vật cho thấy butyrate tăng sự sinh sôi và chuyên hóa

của tế bào ruột kết Sự chết theo chương trình (apoptoxis) của những tế bào trong ruột

kết cũng bị giảm ñi bởi butyrate (Kailasapathy và Chin, 2000) Quá trình lên men chất

xơ tạo thành acid béo mạch ngắn bởi vi khuẩn trong ruột kết làm giảm pH trong ruột ðiều này làm giảm sự chuyển hóa từ acid mật bậc 1 thành acid mật bậc 2 ñộc hơn (Taylor và cộng sự, 1999) Muối mật bậc 1 kích thích tiêu hóa và tăng hấp thu lipid và những vitamin tan trong dầu tại ruột Tuy nhiên, khi chuyển thành muối bậc 2, chúng gây ra những bệnh trong ñường tiêu hóa như ung thư ruột kết hay sỏi mật (Ridlon và cộng sự, 2006)

Ngoài ra, chúng còn ñược sử dụng như là nguồng carbohydrate không tiêu hóa ñược làm tăng một số ảnh hưởng sinh lý có lợi cho cơ thể cũng như kích thích chọn lọc sự

phát triển của Lactobacillus và Bifidobacteria có mặt trong ruột kết, do ñó ñóng vai trò

như là prebiotic Chúng chứa các xơ tan trong nước như glucan và arabinoxylan,

oligosaccharide như GOS và FOS, tinh bột bền (resistant starch) Tất cả ñều có tính

chất của prebiotic Tinh bột cũng có thể ñược sử dụng ñể làm lớp vỏ bao probiotic ñể làm tăng tính bền trong quá trình bảo quản và làm tăng số lượng sống sót khi di chuyển qua môi trường bất lợi trong ống tiêu hóa (Charalampopoulos và cộng sự, 2002)

2.2 Synbiotic:

Synbiotic là sản phẩm chứa một probiotic và một prebiotic (Holzapfel và Schillinger, 2002; Touhy và cộng sự,2003) Chúng ñược ñịnh nghĩa như là một hỗn hợp của một probiotic và một prebiotic ảnh hưởng tốt ñến vật chủ nhờ việc tăng sự sống sót và ñịnh cư của các vi sinh vật sống bổ sung trong ống tiêu hóa, bằng cách kích thích chọn lọc và/hoặc kích hoạt sự trao ñổi chất của một hoặc một số lượng giới hạn vi sinh vật làm tăng sức khỏe cho vật chủ (Kailasapathy và Chin, 2000; Touhy và cộng sự,2003) Do ñó, synbiotic có thể làm tăng sự sống sót của probiotic bằng cách cung cấp cơ chất xác ñịnh cho tế bào probiotic cần thiết cho quá trình lên men (Gallaher và Khil, 1999) Sự bổ sung synbiotic là sự kết hợp Bifidobacteria và FOS,

Lactobacillus GG và inulin và Bifidobacteria, Lactobacilli và FOS hay inulin Sữa lên

men chứa vi sinh vật sống có lợi (probiotic) cũng như kích thích hệ vi sinh vật ñường ruột (prebiotic) Do ñó, chúng ñược xem là synbiotic Nghiên cứu chỉ ra tiềm năng của sữa lên men làm giảm nguy cơ bệnh tật như ung thư ruột kết (Kiebling và cộng sự, 2002; Saikali và cộng sự, 2004) Synbiotic có khả năng kháng vi sinh vật, chống ung thư, ñiều hòa miễn dịch, kháng tiêu chảy, chống dị ứng, giảm lipid trong máu, giảm glucose máu, tăng hấp thu va cân bằng khoáng, chống bệnh giòn xương

(antiosteoporotic) (Gallaher và Khil, 1999)

3 KHÓA PHÂN LOẠI PROBIOTIC:

3.1 Vi khuẩn:

Các probiotic vi khuẩn là Gam dương thuộc ngành Firmicutes (hệ gen có lượng

base nitơ Guanine – Cytosine (G – C) thấp) và Actinobacteria (hệ gen có lượng G-C

cao) Bên cạnh ñó cũng có probiotic là Gram âm, ví dụ Escherichia coli thuộc ngành

Proteobacteria

Vi khuẩn probiotic bao gồm các giống sau ñây:

− Vi khuẩn Acid lactic (Lactic Acid Bacteria – LAB):

Nhóm vi khuẩn rất ña dạng này có khả năng lên men cacbohydrate ñể tạo thành

acid lactic ðiển hình của probiotic thuộc nhóm này phải kể ñến Lactobacillus và

Bifidobacterium ðiểm khác biệt giữa Lactobacillus và Bifidobacterium là trong cơ thể

người, nếu Lactobacillus chủ yếu ñịnh cư ở ruột non thì Bifidobacterium chủ yếu sinh sống ở ruột già Bên cạnh ñó còn có Pediococcus, Enterococcus và Lactococcus

− Vi khuẩn không phải vi khuẩn lactic (Non – LAB): nhóm này gồm có:

Propionibacterium, Bacillus, Brevibacillus, Sporolactobacillus, Escherichia…

3.2 Nấm men:

Nấm men ñược sử dụng như probiotic là Saccharomyces Theo Kurtzman và Fell (1999), giống Saccharomyces gồm có 14 loài Còn theo nghiên cứu mới hơn của

Kurtzman (2003), giống này chỉ gồm 7 trong số 14 loài ñã công bố trước ñó (gồm:

Saccharomyces cariocanus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces mikatae, Saccharomyces kudriavzevii, Saccharomyces paradoxus, và Saccharomyces pastorianus) Các loài còn lại thì thuộc giống mới có tên là

Kazachstania ðiển hình của nấm men ñược sử dụng như probiotic là Saccharomyces

cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae sinh sản vô tính bằng cách nẩy chồi, sau ñó chồi sẽ

chuyển trực tiếp thành thể nang, bên trong thể nang có chứa các nang bào tử, ñược quan sát khi nuôi cấy chúng trên acetate agar Một ñiểm dễ dàng nhận thấy ở nấm men này là khả năng lên men ñường rất mạnh ñược ứng dụng rất nhiều trong sản xuất thực phẩm từ sản xuất bánh mì ñến thức uống có cồn từ nguồn nguyên liệu thô ban ñầu rất

ña dạng

Ngoài ra, một số nấm mốc (một số chủng Aspergillus), trực khuẩn sinh bào tử khác

(Wolfson, 1999; Mombelli và Gismondo, 2000; Fuller, 2003) cũng có tính chất probiotic

Phần 2: PROBIOTIC LACTOBACILLI

1 LACTOBACILLI:

1.1 Khóa phân loại:

Lactobacillus thuộc ngành Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Lactobacillales, họ

Lactobacillaceae Cùng họ với chúng là Paralactobacillus và Pediococcus (Garrity và

cộng sự, 2007)

Hình 1: Cây phân nhánh Lactobacilli

Lactobacilli là giống (genus) chiếm lượng ñông ñảo nhất trong số các vi khuẩn LAB Giống này có tính không ñồng nhất (heterogeneous), rất ña dạng về kiểu hình,

tính chất hóa sinh và sinh lý Sự không ñồng nhất này ñược phản ánh bởi hàm lượng các base nitơ G-C trong hệ gen của chúng (tính theo % số mol) Orla-Jensen (1919) ñã

phân Lactobacillus thành 3 nhóm phụ là Thermobacterium, Streptobacterium, và

Betabacterium Bảng 1 ñã tổng kết lại các ñặc tính dung ñể phân biệt 3 nhóm này và

cũng minh họa một vài loài tiêu biểu của từng nhóm Sự phân chia dựa trên những ñặc tính sinh lý cơ bản là sự có mặt hay vắng mặt lần lượt enzyme tiết ra cho quá trình lên men ñồng hình và dị hình, fructose-1,6-diphospate aldolase và phosphocetolase

Bảng 1: Sự phân chia nhóm phụ của Lactobacilli

Tính chất

Nhóm 1, lên men ñồng hình bắt buộc

- +

L brevis

L buchneri

L fermentum

L reuteri

(a: khi ñược lên men, b: cảm ứng bởi pentose)

Cách cổ ñiển nhất ñể phân biệt các loài Lactobacilli là dựa vào quy luật lên men carbohydrate, cấu hình của acid lactic ñược tạo thành, khả năng thủy phân arginine, ñiều kiện sinh trưởng, nhiệt ñộ sinh trưởng nhất ñịnh Những tính chất này ñến nay vẫn còn là một công cụ rất hữu dụng nhưng ñể có ñược khóa phân loại thích hợp thì

cần phải dựa vào kết quả phân tích peptidoglican, dùng phép thử LDH (Lactate

Dehydrogenase Test), % mol G + C của DNA, nghiên cứu về tính tương ñồng

DNA-DNA (DNA-DNA-DNA-DNA Homology) Ngoài ra người ta cũng sử dụng phân tích FAME (Fatty

Acid Methyl Ester) ñể nhận diện Lactobacilli từ sữa và các nguồn chứa probiotic Tuy

nhiên phương pháp FAME cũng bộc lộ khuyết ñiểm là khó khăn trong việc ñưa ra các lời giải thích và phải lệ thuộc vào phương pháp xử lý toán học Một công cụ giúp phân

loại ñơn giản hơn ñó là sử dụng ñầu dò oligonucleotide ñặc trưng cho loài

(Species-specific oligonucleotide probes) (là một dẫn xuất từ chuỗi rRNA) Các kĩ thuật PCR

khác nhau và các chuỗi trực tiếp của các phân ñoạn PCR (chẳng hạn, của rRNA) cũng

giúp nhanh chóng nhận diện và phân loại Lactobacilli nói riêng và các LAB nói chung

1.2 ðặc ñiểm hình thái, cấu trúc tế bào và trao ñổi chất:

Lactobacilli phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên và ñược sử dụng rất rộng rãi trong

công nghiệp thực phẩm Lactobacilli gồm có 116 loài (tính ñến tháng 9/2008), là nhóm

vi khuẩn Gram dương, kích thước khá nhỏ (<1.5µm), một số khác có thể có chiều dài 5µm, thậm chí 10µm, không có khả năng sinh bào tử, thường không chuyển ñộng, ñôi khi sử dụng ñược nitrate Hình dạng của các vi khuẩn này thường là hình que hoặc trực cầu khuẩn với hệ gen có hàm lượng G – C thấp hơn 50% (dao ñộng từ 32 – 55%) Chúng ñòi hỏi một môi trường giàu chất dinh dưỡng ñể phát triển và là các vi khuẩn vi hiếu khí Chúng không có enzyme catalase (Catalase (-)) cho dù hoạt tính pseudocatalase có thể hiện diện trong một vài giống và trong sự có mặt của nhóm

heme

Lactobacillus có thể kị khí hay hiếu khí, dung nạp acid (aciduric) hay ưa acid

(acidophilic), một số loài có khả năng chịu ñược nồng ñộ muối cao, áp suất thẩm thấu

và hoạt tính nước thấp, một số có thể chịu ñược ethanol và chịu ñược muối mật Chúng lên men ñồng hình (ñồng hình bắt buộc hay ñồng hình tùy tiện) hay dị hình, không có khả năng phân giải protein và lipid ñòi hỏi phải có một phức hợp các chất dinh dưỡng ñể sinh trưởng như carbohydrate, amino acid, peptide, các ester của acid béo, các muối, dẫn xuất của acid nucleic, vitamin… ðối với nguồn carbohydrate, chúng không những sử dụng ñược glucose, fructose, lactose mà còn có khả năng lên men carbohydrate có nguồn gốc thực vật như cellibiose, amygladin, trehalose, thậm chí một số loài có khả năng lên men tinh bột

Khả năng lên men của một số Lactobacilli ñược ñề cập trong bảng dưới ñây:

Bảng 2: ðặc tính lên men của Lactobacillus1

Lên men Giống ñại diện

%

G + C

Sinh trưởng

ở 15 o C Cel Fru Gal Lac Mal Sta Suc

Thủy phân Arg Nhóm 1:

−

−

− +

− + + + +

+ +

± + + + + +

+

− + + + + + +

+ + +

−

− +

Nhóm 2:

Lên men dị hình

tùy tiện

?

? + +

?

+ + + + +

±

− +

+ + + + + + + +

+ + + + +

− + +

±

± + + +

−

±

−

+ + + + + + + +

− + +

? +

− +

+

−

+ + + + + +

+ + +

±

±

− +

−

+ +

+ + + + + +

±

± +

− +

+

−

+ + +

− + +

1ðiều chỉnh từ Manual of Systematic Bacteriology – Volume 2, Bergey (1986)

2Cel – Cellulose; Fru – Fructose; Gal – Galactose; Lac – Lactose; Mal – Maltose; Suc – Sucrose; Star – Starch

phẩm từ sữa, thịt lên men, bột nhào chua (sourdoughs), rau quả, ñồ uống giải khát ), hệ

hô hấp, hệ tiêu hóa (GIT) (trong ruột non), cơ quan sinh dục của người và ñộng vật,

nước thải và cả ñất trồng ðối với hệ tiêu hóa và hệ sinh dụng niệu, ñây chính là môi trường ñịnh cư tự nhiên của Lactobacilli mặc dù số lượng của chúng không nhiều bằng

Bifidobacterium Vì thế, không có gì ngạc nhiên khi một lượng lớn các giống trong số

chúng ñược ứng dụng như những probiotic trong suốt 70 năm trở lại ñây

2 HỆ GEN CỦA PROBIOTIC LACTOBACILLI:

2.1 Giới thiệu:

Hiện nay, xu hướng và việc ứng dụng vi khuẩn acid lactic như là probiotic ñang rất phát triển trên thế giới Trong ñó, vi khuẩn probiotic từ LAB nhận ñược sự chú ý ñặc biệt của các nhà khoa học và người tiêu dùng, nhất là sự thành lập của Lactic Acid Bacteria Genome Consortium (LABGC) tại Mĩ ñã gây ảnh hưởng mạnh ñến ngành công nghiệp sản xuất sản phẩm probiotic LAB Do ñó, vấn ñề nghiên cứu hệ gen của probiotic LAB cũng như những tác ñộng của chúng ñối với sức khỏe con người là ñiều rất cần thiết

2.2 Những ñặc ñiểm chung về di truyền của probiotic Lactobacilli:

Gần ñây, những bước tiến lớn trong việc mô tả di truyền của probiotic Lactobacilli

ñã cho phép việc nghiên cứu, so sánh hệ gen của những vi sinh vật này và cung cấp cái nhìn sâu hơn về sự tiến hóa, sinh lý, trao ñổi chất và những tác ñộng lẫn nhau với mô

tế bào vật chủ 14 giống Lactobacillus bao gồm: L acidophilus, L casei, L gasseri, L

johnsonii, L salivarius, L plantarum và L reuteri ñang ñược xem như là probiotic

(Bảng 4) Lượng G + C của những vi sinh vật này trải dài từ 33% ñối với L salivarius cho ñến 46% ñối với L casei Hầu hết chúng ñều có bộ gen có kích thước khoảng 2Mb trong khi L plantarum và L casei ñược sử dụng như là probiotic và canh trường khởi

ñộng ñều có những nhiễm sắc thể lớn hơn tương ứng là 3.31 và 2.89Mb (Bảng 4) Một ñặc ñiểm di truyền chung nữa của những giống này là sự có mặt của những gen giả

(pseudogene) Lactobacilli sử dụng như là canh trường khởi ñộng trong sữa như L

delbrueckii subsp.bulgaricus (L bulgaricus) và L helveticus chứa nhiều gen giả trong

bộ máy di truyền hơn là khi ñược sử dụng như là canh trường probiotic (Bảng 4)

Trong trường hợp của L salivarius, gần 1/3 gen giả của chúng ñược ñặt trong

megaplasmid ñầu tiên ở tế bào LAB, pMP118 (Claesson và cộng sự, 2006) Megaplasmid này mã hóa một số ñặc ñiểm quan trọng như là locus ñể sản xuất bacteriocin, enzyme hydrolase muối mật và 2 gen ñể hoàn thành chu trình phosphoketolase (PKP) 2 gen này giúp chính thức phân loại những vi sinh vật này là nhóm lên men dị hình tùy tiện (Claesson và cộng sự, 2006) Thực tế, plasmid chiếm

15% trong bộ máy di truyền của L salivarius, giống khác với những probiotic khác

(Bảng 4) Tất cả những giống probiotic ñều chứa dấu vết của prophage hay phage

trong khi L helveticus và L bulgaricus sử dụng trong ngành sữa là những giống duy

nhất không chứa dấu vết của prophage hay phage mặc dù môi trường sản xuất chứa rất nhiều bacteriophage (Bảng 4)

Bảng 3: Một vài dự án về di truyền của probiotic Lactobacilli

Kích thước (Mb)

Altermann và

(2005)

University, USA

L casei

BL23

2.6 FM177140

INRA/CNRS, Caen

University, France

Peril và cộng

Kleerebezem

và cộng sự (2003)

L reuteri

ATCC55730

20

BioGaia, Swedish University of Agricultural Science, Sweden

Claesson và

(2006)

Bảng 4: Những ñặc ñiểm di truyền chung của một số Lactobacilli thông dụng

Giống

Số ñăng

ký

Kíc

h thư

ớc (M b)

% G

C

Prot ein

Plas mid

Prophage/

phage remnant

Pseudo gene

Ứng dụng Nguồn

Alterma

nn và cộng sự (2005)

g khởi ñộng, probiotic

Makaro

va và cộng sự (2006)

Probiotic

Azcarate-Peril và cộng sự (2008)

Pridmor

e và cộng sự (2004)

g khởi ñộng, probiotic

Kleerebezem và cộng sự (2003)

Morita

và cộng

sự (2008)

Claesso

n và cộng sự

g khởi ñộng

Makaro

va và cộng sự (2006)

g khởi ñộng

van de Guchte

và cộng

sự (2006)

g khởi ñộng

Makaro

va và cộng sự (2006)

g khởi ñộng

Callanan

và cộng

sự (2008)

g khởi ñộng

Chaillou vcs (2005)

Nguồn chủ yếu ñể sản xuất năng lượng trong Lactobacilli là quá trình lên men carbohydrate thông qua chu trình ñường phân (EMP) và/hoặc PKP Những phân tích

di truyền ñược tiến hành trên máy tính (in silico) khẳng ñịnh rằng tất cả các loài ngoại trừ những loài lên men dị hình bắt buộc như L brevis ATCC367 và L reuteri F275 mới có chu trình ñường phân hoàn chỉnh (Goh và Klaenhammer, 2008) Hơn nữa, L

salivarius có tất cả những enzyme quan trọng ñể hình thành glucose Những enzyme

này có thể hoạt hóa trong giai ñoạn thiếu glucose tạo nên sự thuận lợi khi cạnh tranh

của L salivarius trong hệ tiêu hóa (Claesson và cộng sự, 2006) Thêm vào ñó, tất cả

các loài ñều thiếu những enzyme quan trọng ñể sinh tổng hợp hầu hết vitamin và

cofactor Tuy nhiên, trong số các loài Lactobacilli thì duy nhất L reuteri CRL1098 có

khả năng tổng hợp cobalamin (vitamin B12) (Morita và cộng sự, 2008) Khác với Bifidobacteria, hầu hết Lactobacilli ñều thiếu khả năng tổng hợp lại một số amino acid

ngoại trừ L plantarum là loài có chu trình sinh tổng hợp ñầy ñủ tất cả các amino acid

không có nhánh (Kleerebezem và cộng sự, 2003) ðể thay thế cho sự thiếu sót này, bộ máy di truyền của probiotic mã hóa cho một chuỗi rộng hệ thống hấp thu các amino acid/peptide và peptidase (thường ñược sắp xếp trong operon) ñể sử dụng ñược nguồn

nitrogen bên ngoài này (Goh và Klaenhammer, 2008) Bộ máy di truyền của L

jonhsonii mã hóa cho một cặp aminopeptidase (LJ0176/LJ0178) với tính tương ñồng

ñặc trưng có khả năng tương tự như những enzyme trong Lactobacilli hệ tiêu hóa,

Streptococci, B longum và Bacteroides fragilis cho thấy rằng sự tiến hóa thích nghi ñể

sử dụng cấu trúc peptide là thường xuyên gặp phải trong hệ tiêu hóa (Pridmore và

cộng sự, 2004) Ngoài ra, L acidophilus và L johnsonii ñược cho là sở hữu proteinase

gắn với thành tế bào có khả năng làm thoái hóa polypeptide từ cơ chất là chất dinh dưỡng từ thức ăn của cơ thể vật chủ và/hoặc glycoprotein như là mucin của vật chủ (Pridmore và cộng sự, 2004) ða số các loài probiotic có tỷ lệ lớn các gen ñể vận chuyển và chuyển hóa carbohydrate và amino acid (Bảng 5) Lactobacilli trong hệ tiêu

hóa sử dụng hệ thống chuyển phospho không cần phosphoenolpyruvate (The

phosphoenolpyruvate (PEP)-dependent phosphotransferase systems – PTS) với trung

bình 20 – 30 phần tử vận chuyển ñược mã hóa trong mỗi gen, bổ sung thêm permease

(một protein vận chuyển) vào hệ thống vận chuyển trên màng tế bào (The major

facilitator superfamily) cũng như là hệ thống vận chuyển ñường không cần ATP dependent binding cassettes (ABC) sugar transporter) (Goh và Klaenhammer, 2008)

(ATP-Bảng 5: Chức năng COG của gen mã hóa protein từ probiotic

2.3 Từ nghiên cứu hệ gen đến đặc điểm probiotic Lactobacilli:

2.3.1 Sự trao đổi chất prebiotic và carbohydrate:

Khả năng của hệ vi sinh vật đường ruột cĩ thể sử dụng polysaccharide dinh dưỡng

từ thực vật nhưng khơng bị tiêu hĩa bởi cơ thể vật chủ tạo nên một lợi thế cạnh tranh cho sự ổn định và định cư của chúng trong ruột già ðường prebiotic như FOS và raffinose được sử dụng như là một thành phần thực phẩm chức năng khơng tiêu hĩa được để làm thúc đẩy chọn lọc sự phát triển của Lactobacilli và Bifidobacteria, những

vi sinh vật được xem là vi khuẩn cĩ lợi cho sức khỏe trong số những vi sinh vật đường ruột Gần đây, những nghiên cứu dựa trên nền tảng gen của sự tiêu thụ FOS bởi Lactobacilli đã khám phá ra nhiều con đường dị hĩa đa dạng giữa nhiều lồi khác nhau (Barrangou và cộng sự, 2003; Goh và cộng sự, 2006; Saunier và cộng sự, 2007)

Operon L acidophilus msm mã hĩa hệ thống vận chuyển ABC và β-fructofuranosidase

tế bào chất làm trung gian cho quá trình hấp thu và thủy phân nội bào FOS ðối với L

plantarum, con đường tiêu thụ FOS được mã hĩa bởi một nhĩm gen chứa 1 sucrose

PTS và 1 enzyme β-fructofuranosidase nội bào L casei cũng cĩ một operon đường tương tự như cấu trúc cùa fos operon trong L paracasei Dựa trên những phân tích chức năng của fos operon trong L paracasei, con đường tiêu thụ FOS của L casei

được tiên đốn bao gồm một enzyme β-fructosidase bám trên bề mặt tế bào và một fructose/mannose PTS làm trung gian cho quá trình thối hĩa FOS ngoại bào và sử

dụng fructose sau đĩ L acidophilus, L plantarum và L johnsonii cũng cĩ khả năng

sử dụng đường raffinose (Klaenhammer và cộng sự, 2005) Quá trình phân tích vi

chuỗi quá trình sao mã (Microarray transcriptional analysis) của L acidophilus sinh

trưởng trên raffinose cho thấy cĩ sự tham gia của một operon raffinose mã hĩa hệ thống vận chuyển ABC và một α-galactosidase trong quá trình dị hĩa raffinose (Barrangou và cộng sự, 2006)

Ngoại trừ L reuteri, L brevis, L bulgaricus, L sakei và L fermentum thì bộ di truyền của tất cả các lồi Lactobacillus khác mã hĩa ít nhất một neopullulanase cĩ khả

năng thủy phân pullulan, một polysaccharide mạch thẳng bao gồm những đơn vị maltotriose liên kết với nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside

2.3.2 Nhĩm gen sinh tổng hợp polysaccharide:

Nhĩm gen sinh tổng hợp polysaccharide cĩ mặt ở hầu hết các giống Lactobacillus ngoại trừ L reuteri, L fermentum và L brevis Những nhĩm gen sinh tổng hợp

polysaccharide ngoại bào nằm trên bề mặt tế bào cĩ mối quan hệ gần gũi với hệ gen

của L acidophilus, L johnsonii và L gasseri cĩ mức duy trì cao mặc dù tổ chức gen trong L gasseri đã được chuyển hĩa do quá trình đảo đoạn nhiễm sắc thể (Azcarate- Peril và cộng sự, 2008; Klaenhammer và cộng sự, 2005) Cả 3 nhĩm gen eps đều được

đặt trong khu vực cĩ lượng G + C thấp với một gen transposase đặt trong khu vực

downstream cho thấy rằng nhĩm gen eps cĩ được thơng qua quá trình chuyển gen ngang (horizontal gene transfer – HGT) từ một nguồn chung Một vài nhân gen eps tỏ

ra khá yếu hoặc khơng tương đồng với nhau mặc dù cĩ hức năng giống nhau chỉ ra sự biến đổi đa dạng của các ecopolysaccharide được sản xuất tạo nên một điểm duy nhất

trên bề mặt của những giống này (Klaenhammer và cộng sự, 2005; Pridmore và cộng

sự, 2004) đáng chú ý, hệ gen của L gasseri cũng mã hóa một số lượng lớn

glycosyltransferases không thông thường tạo nên sự ựa dạng của các exopolysaccharide ựược tổng hợp (Azcarate-Peril và cộng sự, 2008)

Hệ gen của L salivarius, L sakei và L bulgaricus ựều chứa 2 nhóm gen eps khác biệt trong khi L plantarum lại chứa 4 nhóm gen tổng hợp polysaccharide bề mặt khác

(Chaillou và cộng sự, 2005; Claesson và cộng sự, 2006; Kleerebezem và cộng sự, 2003; van de Guchte và cộng sự, 2006) Sturme và cộng sự (2005) mới ựây mô tả một

trong những locus tổng hợp polysaccharide của L plantarum, cps2 (lp_1197 ựến lp_1211) ựược ựiều hòa bởi hệ thống ựiều hòa gồm 2 thành phần giống arg (two-

component regulatory system Ờ 2CRS) ký hiệu là lam trong Lactobacillus đối với L salivarius, nhóm gen eps 1 (LSL_0977 ựến LSL_0997) ắt có sự tương ựồng với các eps khác trong khi nhóm gen 2 (LSL_1547 ựến LSL_1574) lại có sự tương ựồng cao

với nhóm gen polysaccharide bề mặt trong L plantarum với lượng GC thấp (Claesson

và cộng sự, 2006) 2 nhóm gen polysaccharide bề mặt có mặt trong gen của L sakei

(LSA1571 ựến LSA1585; LSA1510 ựến LSA1513) mã hóa cho protein cần thiết cho

sự sinh tổng hợp acid techoic liên kết polysaccharide và sự chuyển vị trắ của polysaccharide tới một thành phần trên bề mặt khác Những nhóm gen polysaccharide

này ựược dự ựoán là có khả năng tăng sự bám dắnh của L sakei lên bề mặt thịt hay niêm mạc ruột (Chaillou và cộng sự, 2005) đối với L bulgaricus, eps 1 và 2 rất gần

giống nhau (Makarova và cộng sự, 2006; van de Guchte và cộng sự, 2006) Nhóm gen

eps 1 của ATCC 11842 (Ldb1937 ựến Ldb1957) và ATCC BAA-365 (LBUL_1800

ựến LBUL1815) tương tự nhau trong khi nhóm 2 thì lại rất ựa dạng Makino và cộng

sự (2006) gần ựây công bố rằng những phân ựoạn polysaccharide ngoại bào có tắnh

acid và phân tử lượng lớn phân lập từ L delbrueckii subsp bulgaricus OLL1073R-1

có khả năng cảm ứng sản xuất interferon-gamma in vitro và tăng hoạt tắnh tiêu diệt tế bào tự nhiên in vivo Do ựó, sự ựa dạng của eps trong L bulgaricus có thể ựóng góp

vào những ựặc tắnh lưu biến cũng như ựặc tắnh kắch thắch miễn dịch của

polysaccharide ngoại bào Tương tự, L casei Shirota có nhóm gen cps mã hóa cho sự

sinh tổng hợp polysaccharide phân tử lượng lớn (PS-1) (Yasuda và cộng sự, 2008) Sự

tiếp xúc của tế bào ựột biến cps dễ bị tiêu diệt bởi nhiệt với ựại thực bào chuột và tế

bào lá lách tạo nên sự cảm ứng nhiều hơn của TNF-α, IL-12, IL-10 và IL-6 khi ựược

so sánh với giống bố mẹ Thêm vào ựó, giống ựột biến thiếu CPS làm tăng sự sản xuất IL-6 kắch thắch LPS bởi những tế bào giống ựại thực bào chuột trong khi ựiều này lại

bị ngăn chặn trong những giống bố mẹ Do ựó, PS-1 liên kết với thành tế bào của L

casei Shirota có khả năng ựiều biến những ựáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ bằng

cách giảm những ựáp ứng miễn dịch từ monocyte và ựại thực bào cũng như những chất gây cảm ứng khác

2.3.3 Phản ứng chống lại stress:

2.3.3.1 Acid:

Một số lượng ựa dạng các cơ chế ựể ựiều chỉnh pH nội bào xuất hiện trong cơ thể vi khuẩn Gram (+) bao gồm bơm proton F1F0-ATPase, phản ứng decarboxyl amino acid, sinh tổng hợp các protein chống lại tress và chaperone ựể sữa chữa hay làm thoái hóa

những sai sót trong DNA hay trong các protein khác Những cơ chế khác bao gổm sự sản xuất các thành phần có tắnh kiềm, ựiều chỉnh thành phần màng tế bào, ựiều hóa

quá trình sao mã thông qua các nhân tố sigma và 2-CRS Hệ gen của L plantarum mã

hóa 1 F1F0-ATPase, 10 protein vận chuyển (antiporter) Na-proton và 3 protein chống

shock kiềm ựể duy trì sự cân bằng pH nội bào (Kleerebezem và cộng sự, 2003) Một

nghiên cứu quá trình sao mã gần ựây của L plantarum cho thấy acid lactic gây ra hiện

tượng cảm ứng một cách ựặc biệt lên một vài protein bề mạt tế bào có chức năng chưa xác ựịnh rõ, Clp protease, catalase, excinuclease, squalene synthase và phytoene synthase (Pieterse và cộng sự, 2005) Các tác giả cho rằng một vài protein này có thể chịu trách nhiệm sữa chữa bề mặt tế bào, làm tăng dộ bền vững của màng tế bào ựể có thể chịu ựựng ựiều kiện acid Một vài nghiên cứu khác gần ựây về những ựáp ứng tổng

thể lên shock acid trong giai ựoạn cuối pha log của L reuteri ATCC 55730 cho thấy

rằng sự cảm ứng của gen mã hóa ClpL chaperone, một esterase và một phosphatidylglycerophosphatase xuất hiện trong quá trình sinh tổng hợp peptidoglycan

và màng tế bào Gen phage mã hóa cho protein làm thoái hóa thành tế bào cũng ựược cảm ứng (Wall và cộng sự, 2007) Kết quả phân tắch chức năng của ClpL và esterase ựột biến cho thấy tầm quan trọng của những gen này trong những ựáp ứng ban ựầu ựối với shock gây ra bởi acid và ảnh hưởng tới sự sống sót của tế bào khi di chuyển qua hệ

tiêu hóa đối với L acidophilus, operon atp mã hóa F1F0-ATPase ựược cảm ứng khi tế bào ở pha log có thể chịu ựược stress acid khi pH ở 3.5 với acid hypocloric (Kullen và

Klaenhammer, 1999) Thêm vào ựó, những nghiên cứu về gen in silico ựã ựịnh dạng

một vài enzyme amino acid decarboxylase, một ATPase vận chuyển cation và

chaperone Ffh nằm trong hệ thống ựiều chỉnh pH nội bào của L acidophilus

(Altermann và cộng sự, 2005) Azcarate-Peril và cộng sự (2004) gần ựây ựã khẳng ựịnh rằng gen mã hóa cho sự decarboxyl amino acid bao gồm 1 antiporter vận chuyển amino acid, 1 permease vận chuyển amino acid, 1 enzyme ornithine decarboxylase và

1 bộ ựiều hòa quá trình sao mã có liên quan tới khả năng chịu acid của L acidophilus

đáng ngạc nhiên hơn nữa, sự thắch nghi ban ựầu trong ựiều kiện pH 5.5 trong 1h của 4 giống ựột biến mẫn cảm với acid cho thấy sự hồi phục khả năng sống sót của chúng khi pH ở 3.5 cho thấy rằng những gen này có vai trò gián tiếp trong việc thắch nghi với ựiều kiện acid

2.3.3.2 Áp suất thẩm thấu:

Những kết quả phân tắch di truyền in silico ựã khám phá ra rằng L plantarum có ắt

nhất 3 hệ thống ựể tiêu thụ và sinh tổng hợp các chất bảo vệ khỏi áp suất thẩm thấu

(osmoprotectant) glycine-betaine/carnitine/choline (Kleerebezem và cộng sự, 2003) Locus cho việc sử dụng trehalose (tre) ở gen giống L acidophilus mã hóa 1 PTS (treB) và 1 enzyme trehalose-6-phosphate hydrolase (treC) có chức năng bảo vệ tế bào trong ựiều kiện lạnh ựông (cryoprotection) với sự tiêu thụ và thủy phân trehalose (Duong và cộng sự, 2006) Hơn nũa, sự vô hoạt treB hay treC làm cho tế bào không

còn khả năng sử dụng trehalose như là nguồn carbon hay cryoprotectant trong quá trình lạnh hay rã ựông Dựa trên những quan sát trên, người ta cho rằng lượng tiêu thu trehalose cũng như những sản phẩm thủy phân kế tiếp hay chất trung gian trong quá trình trao ựổi chất ựều ựóng góp vào khả năng chịu ựựng lạnh ựông của tế bào

2.3.3.3 Oxy hóa:

Gen của L plantarum mã hóa một số lượng lớn protein có khả năng chống lại quá

trình oxy hóa bao gồm catalase, peroxidase, thioredoxin, NADH oxidase và glutathione reductase Việc tăng tổng hợp thioredoxin có khả năng tăng khả năng chịu

ñựng (Serrano và cộng sự, 2007) Việc mô tả sâu hơn quá trình chuyển gen (gene

expression – là quá trình bao gồm sao mã và dịch mã ñể chuyển thông tin từ gen vào

sản phẩm như protein) cho thấy rằng quá trình chuyển gen tạo nhiều thioredoxin làm khởi ñộng quá trình sao mã của 16 gen mã hóa cho các protein tham gia vào quá trình trao ñổi chất purine, tổng hợp protein, ñáp ứng lại với stress và vận chuyển mangan Quá trình trên cũng ñược cảm ứng dưới ñiều kiện có hydrogen peroxide cho thấy thioredoxin ñóng một vai trò trong quá trình chuyển tín hiệu trong quá trình ñáp ứng lại stress oxy hóa Thêm vào ñó, ít nhất 5 hệ thống vận chuyển mangan ñược tìm thấy

trong gen của L plantarum cho thấy Mn2+ ñược xem như là chất bắt gốc tự do oxy quan trọng cũng như là cofactor cho enzyme catalase

2.3.3.4 Muối mật:

Enzyme hydrolase muối mật (bile salt hydrolase – BSH) hay choloylglycine

hydrolase chỉ ñược phân lập từ người hay từ những loài chịu ñược muối mật trong môi

trường cộng sinh như Lactobacillus, Bifidobacteria, L monocytogenes, Enterococcus

faecalis và Bacteroides (Begley và cộng sự, 2006; Elkins và cộng sự, 2001) Tuy

nhiên, không có gen mã hóa BSH nào ñược tìm thấy trong chuỗi gen của L

bulgaricus, L helveticus và L fermentum Những giống còn lại sở hữu ít nhất một gen

mã hóa BSH như L plantarum, L acidophilus, L johnsonii và L brevis có 2 gen mã hóa BSH hay hơn nữa Mặc dù L plantarum có 4 gen bsh nhưng kết quả phân tích ñột biến tổ hợp lại cho rằng chỉ có gen bsh1 mới mã hóa cho BSH chức năng trong khi

những gen bsh còn lại lại mã hóa cho protein thể hiện hoạt tính penicillin acylase (Lambert và cộng sự, 2008) Sự có mặt của BSH phức tạp có thể làm rộng tính ñặc hiệu với muối mật hay tạo nên sự khác biệt trong những chế ñộ hoạt ñộng của enzyme phụ thuộc vào sự thích nghi với muối mật cơ bản làm tăng sự sống sót của vi khuẩn trong môi trường không ổn ñịnh của vật chủ (Begley và cộng sự, 2006) Ví dụ, kết quả

phân tích chức năng của BshA và BshB của L acidophilus cho thấy rằng mỗi BSH có

tính ñặc hiệu khác nhau với mỗi loại muối mật dựa trên nhân steroid của muối mật hay chuỗi amino acid có mặt trong phân tử muối mật (McAuliffe và cộng sự, 2005) Nói

chung, gen BSH của L acidophilus và L reuteri ñều có chung nguồn gốc (ortholog

gene) với các Lactobacilli khác (Goh và Klaenhammer, 2008) Trong lúc ñó, gen BSH

từ L plantarum (Bsh1), L casei (LSEI_0412) và BSH mã hóa pMP118 trong L

salivarius (LSL_1801) có tính tương ñồng với BSH ortholog từ L monocytogenes và Enterococcus faecium Thực tế, không có sự tương ñồng giữa các BSH ñã ñược xác

ñịnh từ L casei (LSEI_0412) với các BSH từ các loài Lactobacilli khác tại thời ñiểm

phân tích Những quan sát trên cho thấy rằng việc chuyển gen mã hóa BSH có thể là khuynh hướng chung ñối với các vi sinh vật trong hệ tiêu hóa (Goh và Klaenhammer, 2008)

Những nghiên cứu gen gần ñây về ñáp ứng ñối với muối mật của L acidophilus, L

plantarum và L reuteri dựa trên môi trường in vitro (Bron và cộng sự, 2004; Bron và

cộng sự, 2006; Pfeiler và cộng sự, 2007) ựã mở rộng cái nhìn về cơ chế ở mức ựộ phân

tử của sự dung nạp muối mật ở các Lactobacilli trong hệ tiêu hóa Nghiên cứu bởi

Bron và cộng sự (2004, 2006) sử dụng alr (mã hóa alanine racemase) và phương pháp

phân tắch sao mã vi chuỗi cho thấy rằng gen mã hóa cho việc tổng hợp vỏ tế bào, hệ thống dẫn truyền muối mật và protein liên kết với acid và ựáp ứng với stress oxy hóa ựược cảm ứng bởi dịch mật của lợn đáng chú ý, 2 trong số các gen ựáp ứng muối mật

ựược cảm ứng trong quá trình di chuyển in vivo qua hệ tiêu hóa chuột (Bron và cộng

sự, 2004) Tương tự, những nghiên cứu về quá trình chuyển gen của L reuteri ATCC

55730 khi ựược tiếp xúc với dịch mật bò cho thấy sự cảm ứng của gen liên kết với những stress xảy ra trên vỏ tế bào, stress oxy hóa, biến tắnh protein và tổn thương DNA trong khi gen vận chuyển cơ chất và trao ựổi chất bị giảm số lượng (Whitehead

và cộng sự, 2008) Sự hư hỏng của gen ựáp ứng lại stress gây ra bởi dich mật mã hoá ClpL, một esterase hay một protein chưa biết càng tăng thì tắnh mẫn cảm của giống ựột

biến càng tăng đối với L acidophilus, kết quả phân tắch quá trình chuyển gen của

toàn bộ gen khi ựáp ứng lại dịch mật bò ựã khám phá ra rằng sự tăng số lượng operon

7 Kb bao gồm 8 gen mã hóa cho 1 2CRS, 1 protein vận chuyển, 1 enzyme oxidoreductase và 4 protein giả ựịnh khác (hypothetical protein) (Pfeiler và cộng sự, 2007) Sự ựột biến 2CRS, protein vận chuyển và một trong số các protein giả ựịnh có thể phá hủy khả năng chịu ựựng dịch mật trong khi ựột biến enzyme oxidoreductase và các protein giả ựịnh còn lại thì lại làm tăng khả năng chịu dịch mật điều này cho thấy vai trò song song của operon này ựối với khả năng dung nạp cũng như tắnh mẫn cảm với dịch mật của tế bào Thật thú vị là gen bao gồm khả năng sử dụng lactose và galactose và các yếu tố bám dắnh bề mặt tế bào cũng ựược xác ựịnh như là regulon ựáp ứng lại stress từ dịch mật (Pfeiler và cộng sự, 2007) Những quan sát trên dẫn tới những suy luận rằng dịch mật có thể ựóng vai trò như một tắn hiệu từ môi trường và chất chỉ thị vị trắ khởi ựộng quá trình chuyển gen có vẻ quan trọng trong việc tiêu thụ các chất dinh dưỡng từ sữa và làm tăng tác ựộng hỗ trợ với biểu mô ruột trong vật chủ

2.3.4 Các nhân tố bề mặt tế bào:

Do sự quan trọng của probiotic cũng như là tác ựộng cộng sinh với hệ tiêu hóa vật chủ ựã ựược nhận ra nên những nỗ lực ựã ựược ựặt ra nhằm tập trung vào nhận diện những nhân tố bề mặt tế bào tiềm năng (Hình 2) Những tác ựộng hỗ trợ tới cơ thể vật chủ ựược trung gian bởi yếu tố bám dắnh có thể làm tăng khả năng loại trừ những vi sinh vật gây bệnh, tắnh bền của lớp niêm mạc ruột cũng như là khả năng kắch thắch miễn dịch trong cơ thể vật chủ Những nhân tố bám dắnh ựiển hình là protein hay polysaccharide thể hiện trên bề mặt tế bào Số lượng protein với các peptide tắn hiệu và/hay transmembrane domain (là những chuỗi xoắn α của protein xuyên màng tế bào

(transmembrane)) cho mỗi loài probiotic ựược thể hiện trong Hình 4 Vai trò của protein bám vào màng nhầy (mucus-binding proteins Ờ Mub) có tác dụng bám dắnh vào lớp màng nhầy của ruột lần ựầu tiên ựược mô tả ựối với L reuteri 1063 khi Roos

và Jonsson (2002) xác ựịnh ựược Mub có kắch thước 358 kDa bám dắnh chọn lọc vào

glycoprotein của lớp nhầy trong ruột Sự phát hiện Mub in silico ựược mã hóa trong gen của Lactobacillus cho thấy rõ ràng sự hiện diện chiếm ưu thế của chúng trong hệ

tiêu hóa (Boekhorst và cộng sự, 2006) Mub chỉ ựược tìm thấy ựộc nhất trong

Lactobacilli ở ruột cho thấy rằng những protein này làm trung gian trong quá trình tác động lẫn nhau hay chức năng giữa vi khuẩn và vật chủ

L acidophilus cĩ 13 protein chứa một hay nhiều hơn protein Mub nhưng chỉ 3

protein cĩ cả chuỗi peptide tín hiệu và hệ thống bám vào bề mặt tế bào LPxTG (Tallon and Klaenhammer, dữ liệu chưa cơng bố) Một trong những protein Mub này mã hĩa

bởi LBA1392 gồm 4326 amino acid (residue) và là protein lớn nhất được mã hĩa

trong gen (Hình 2) (Altermann và cộng sự, 2005) Kỹ thuật làm mất hoạt tính gen bằng

cách thêm đoạn (insertional inactivation) áp dụng cho locus gen LBA1392 gây ra sự giảm nghiêm trọng tới khả năng bám dính vào tế bào biểu mơ Caco-2 in vitro (Buck và cộng sự, 2005) Trong số các Lactobacilli bám vào hệ tiêu hĩa thì L gasseri cĩ số

lượng lớn nhất protein Mub (14) (Alcarate-Peril và cộng sự, 2008) Những Mub này

chứa 6 – 12 chuỗi xoắn và cĩ tính tương đồng với Mub từ L reuteri 1063 và L

acidophilus (mã hĩa bởi LBA1392) ðối với L plantarum, một trong số Mub dự đốn

của chúng được nhận biết như là chất bám dính vào mannose cĩ bản chất giống lectin

(mannose-specific adhesin – Msa) (Pretzer và cộng sự, 2005) Protein bám vào bề mặt

tế bào Msa cĩ 2 chuỗi xoắn giống như Mub của L reuteri 1063 và 1 chuỗi lectin giống

ConA đều cĩ tác dụng bám vào chất nhận cĩ chứa mannose trên bề mặt lớp niêm mạc Kết quả phân tích tin học cơng nghệ sinh học của những secretome (một tập hợp các

proteome cĩ hoạt tính) dự đốn trong L salivarius được nhận dạng là 3 Mub tương đồng đi kèm sortase, Mbp-1, LspA và LspC (van Pijkeren và cộng sự, 2006) LspA

đột biến cho thấy sự giảm khả năng bám dính vào tế bào biểu mơ HT29 Trong khi đĩ,

mpb-1 xuất hiện như một gen giả, ngược lại, khơng cĩ quá trình sao mã nào của lspC

được phát hiện trong điều kiện in vitro Theo như van Pijkeren và cộng sự (2006), lspA

cĩ thể đạt được thơng qua việc chuyển gen phụ do cĩ hàm lượng GC cao (40%) Hệ

gen của L johnsonii mã hĩa 3 protein bề mặt cĩ chứa chuỗi Mub giống như Mub của

L reuteri 1063 (Pridmore và cộng sự, 2004) ðiều đáng ngạc nhiên là vùng lặp amino

acid của 2 Mub, LJ0047 và LJ1839, khá giống protein SP18 bám trên bề mặt tế bào tinh trùng bị nằm trong vùng gần đầu gốc amino tự do của chuỗi protein hay HR44 ở

Homo sapiens

Gen mã hĩa protein bám vào fibronectin (fibronectin-binding protein – Fbp) được duy trì trong tất cả các gen của Lactobacillus (Goh và Klaenhammer, 2008) L brevis cũng cĩ một phiên bản thêm của gen fbp (LVIS_0267) trong đĩ các protein tương tự như các protein giả thiết trong L plantarum và Fbp từ Enterococcus và Listeria Kết quả phân tích BlastB cho thấy Fbp từ nhĩm L acidophilus cĩ tính đồng nhất cao (77 –

88% chuỗi đồng nhất) hơn là Fbp từ các lồi khác cùng phả hệ (Goh và Klaenhammer,

2008) Buck và cộng sự (2005) cho thấy rằng FbpA từ L acidophilus tham gia vào khả năng bám dính của vi khuẩn vào tế bào biểu mơ Caco-2 in vitro L plantarum cũng cĩ

một protein bề mặt lớn gồm 3360 amino acid, Sdr, cĩ độ lặp lại gần hồn hảo Ser-Asp khoảng 1600 gốc (Boekhorst và cộng sự, 2006; Kleerebezem và cộng sự, 2003) Sự

lặp lại Ser-Asp tương tự cũng được tìm thấy trong protein ClfB của Staphylococcus

aureus cĩ khả năng bám vào fibrinogen (Hartford và cộng sự, 1997) 3 gen

glycosyltransferase xuất hiện ở vùng lân cận của clfB được dự đốn cĩ khả năng tổng

hợp được những cấu trúc giống màng nhầy mucin bao phủ bề mặt tế bào hay là trung gian của những tác động hỗ trợ lên vật chủ

Hình 2: Những nhân tố bám dính ñược mô tả trong Lactobacilli Những protein ñược

mô tả dựa trên những dữ liệu của Pfam

Hình 3: Tỷ lệ gen mã hóa protein với peptide tín hiệu hay transmembrane domain

Cấu trúc bề mặt tế bào chủ yếu như lớp protein bề mặt (surface layer protein –

SLP), acid techoic (TA) và acid lipotechoic (LTA) cũng ñược xem như là chất trung

gian của quá trình bám dính và kích thích miễn dịch Lớp S là những chuổi kết tinh của những tiểu phần protein có rất nhiều trên bề mặt tế bào của ña số Eubacteria và Archaebacteria SlpA của L brevis ATCC 8287 có thể bám vào rất nhiều loại tế bào của người, fibronectin và laminin thông qua những vùng xác ñịnh chứa các hệ thống nhận (de Leeuw và cộng sự, 2006) Cũng có kết quả cho rằng lớp S chiếm ưu thế trong

tế bào L acidophilus mã hóa bởi slpA cũng tham gia tạo nên khả năng kết dính của tế

bào vào lớp biểu mô ruột (Buck và cộng sự, 2005) Sự ñột biến SlpA- không những làm thay ñổi hình thái của tế bào mà còn làm giảm ñáng kể khả năng bám vào tế bào Caco-2 Tuy nhiên, sự giảm khả năng bám dính cũng có thể là do mất những nhân tố bám dính tiềm năng bám trên lớp S Bằng cách sử dụng kháng thể ñơn dòng

(monoclonal antibodies), Granato và cộng sự (1999) nhận ra rằng LTA là một thành phần không phải là portein trên bề mặt tế bào L johnsonii tham gia vào khả năng bám dính vào tế bào Caco-2 Một nghiên cứu gần ñây cũng cho thấy rằng ñột biến dltB của

L plantarum với sự thay thế LTA bằng gốc D-ananyl làm tăng ñáng kể sự cảm ứng

của IL-10 và làm giảm ñáp ứng tăng hiện tượng viêm ở mẫu chuột viêm ruột kết

(Grangette và cộng sự, 2005) Trong một nghiên cứu về công nghệ chuyển gen in vivo (in vivo expression technology – IVET), Walter và cộng sự (2005) cho rằng một trong những gen cảm ứng ñặc hiệu bởi L reuteri 100-23 trong ruột chuột mã hóa một protein bề mặt có kích thước 300 kDa, Lsp Sự làm vô hoạt gen lsp làm giảm khả năng của giống ñột biến ñể bám vào tế bào biểu mô dạ dày trước của chuột in vivo và ex

vivo cũng như thay ñổi ñặc trưng sinh thái trong ruột chuột

Có thể một trong những phát hiện thú vị nhất là yếu tố kéo dài Tu (EF-Tu) và

GroEL trong khả năng bám dính và kích thích miễn dịch của L johnsonii (Bergonzelli

và cộng sự, 2006; Granato và cộng sự, 2004) Những nghiên cứu này mô tả sự khu trú trên bề mặt tế bào LAB của EF-Tu và GroEL Cả 2 EF-Tu và GroEL ñều ưu tiên bám dính vào tế bào biểu mô và lớp nhầy ruột ở pH 5.5, giá trị pH rất gần với ñiều kiện

sinh lý trong ruột non (Blum và cộng sự, 2000) Hơn nữa, sự tái kết hợp EF-Tu và GroEL cĩ khả năng gây ra đáp ứng tăng viêm bằng cách cảm ứng việc tiết CD-14 đi

kèm IL-8 tan trong tế bào biểu mơ ruột HT29 GroEL tái tổ hợp chuyển từ L johnsonii

sang một vi khuẩn Gram (+) khác cũng cĩ khả năng thúc đẩy đặc hiệu sự kết chùm của

Helicobacter pylori Ngồi những nhân tố bề mặt tế bào đã được mơ tả theo chức năng

ở trên, gen của L johnsonii cũng mã hĩa một danh mục đa dạng các nhân tố bám dính

khác, một vài trong số chúng ít gặp trong LAB (Pridmore và cộng sự, 2004) 2 trong

số 42 lipoprotein dự đốn trên bề mặt tế bào cĩ độ tương đồng thấp so với kháng thể kích thích tế bào T CD4+ của L monocytogenes và một protein gắn với nước bọt từ S

sanguinis Thêm vào đĩ, 2 bộ gen tương tự như operon rìa (fimbrial operon) của Streptococcus gordonii cĩ thể mã hĩa cho việc tổng hợp những protein nhung mao

liên kết với đường trên bề mặt tế bào tương tự như Fap1 của Streptococcus

parasanguis và protein bám vào tiểu cầu GspB của S gordonii Kết quả phân tích gen

cũng khám phá ra một protein trên bề mặt tế bào khác tương tự như protease IgA của

Streptococci gây bệnh L johnsonii cũng cĩ gen mã hĩa fructosyltransferase được duy trì giữa các giống L johnsonii và L gasseri cho thây rằng những lồi này cĩ khả năng

sản xuất polysaccharide fructan để bám dính vào tế bào biểu mơ

2.3.5 Sinh tổng hợp bacteriocin và sự miễn dịch:

Bacteriocin sản xuất bới LAB rất đa dạng dựa trên cấu tạo của vi khuẩn và chế độ hoạt động của chúng được phân loại thành bậc I, II, III và IV (Klaenhammer, 1993) Khả năng của Lactobacilli sản xuất bacteriocin cĩ thể gĩp phần tạo nên khả năng thích nghi cạnh tranh của chúng trong mơi trường sống Hơn nữa, quá trình tổng hợp bacteriocin là một đặc điểm mong muốn trong việc chọn giống như là một cơ chế quan trọng để loại trừ những yếu tố gây bệnh trong thực phẩm lên men cũng như là trong hệ tiêu hĩa Nhĩm gen tổng hợp bacteriocin được tìm thấy ở các lồi LAB trong hệ tiêu

hĩa cũng như là trong cơng nghiệp bao gồm L brevis, L casei và L bulgaricus L

johnsonii NCC533 cĩ một operon (LJ0763b đến LJ0775) mã hĩa sự sản xuất lactacin

F, một bacteriocin bậc II gồm 2 thành phần (Pridmore và cộng sự, 2004) Operon

lactacin F này tương đồng với operon lactacin F của L johnsonii VPI11088 (Allison

và cộng sự, 1994) Operon lactacin F được tạo thành từ các gen mã hĩa phức hợp nhân

peptide của bacteriocin (lafAX), một thành phần miễn dịch (lafI), một 2CRS và hai hệ

thống vận chuyển ABC Tuy nhiên, operon lactacin F trong NCC533 lại khơng cĩ chức năng do sự cĩ mặt của thành phần IS trong gen histidine kinase của 2CRS gây trở ngại sự sản xuất cũng như điều hịa quá trình sinh tổng hợp bacteriocin (Pridmore và cộng sự, 2004)

Hệ thống đảo gen (genomic island) pdu-cbi-cob-hem gồm 58 gen gần đây được phát hiện trong L reuteri JCM1112T mã hĩa sự sinh tổng hợp reuterin (mã hĩa bởi pdu operon) và cofactor cobalamin (mã hĩa bởi nhĩm operon cbi-cob-hem) (Morita và cộng sự, 2008) Nhĩm gen gupCDE trong operon pdu mã hĩa enzyme glycerol

dehydratase xúc tác quá trình chuyển hĩa glycerol thành reuterin Sử dụng phương

pháp cộng hưởng từ hạt nhân 2 chiều (2D-NMR) với glycerol đánh dấu 13C3, Morita và

cộng sự (2008) cho thấy rằng reuterin được tổng hợp in vivo trong những con chuột thí

nghiệm cĩ liên quan tới những giống hoang dại chứ khơng phải với giống đột biến

gupCDE Sự có mặt của glycerol trong ñường ruột cho thấy hệ thống ñảo gen cob-hem ñại diện cho sự thích nghi tiến hóa của L reuteri trong hệ tiêu hóa

pdu-cbi-Megaplasmid pMP118 của L salivarius chứa một nhóm gen mã hóa cho sự sinh

tổng hợp bacteriocin bậc IIB, ABP-118 (Claesson và cộng sự, 2006; Flynn và cộng sự,

2002) ABP-118 là một dãy rộng salivaricin có thể ức chế một số loài như Bacillus,

Listeria, Enterococcus và Staphylococcus (Flynn và cộng sự, 2002) và bảo vệ chuột

khỏi Listeria monocytogenes, in vivo (Corr và cộng sự, 2007) Sự sản xuất ABP-118

ñược cảm ứng peptide AbpIP là một phần của hệ thống ñiều hòa 3 thành phần (3CRS)

có thể bao gồm một histidine kinase và một hệ ñiều hòa ñáp ứng Trong khi ñó, polycistronic 9.5 kb mã hóa sự sản xuất lactacin B (LBA1791 ñến LBA1803) ñược

phát hiện trong gen của L acidophilus (Altermann và cộng sự, 2005) Operon lab gồm

12 gen ñược sắp xếp trong 3 nhóm gen tương ứng mã hóa cho 1 3CRS, 1 hệ thống vận chuyển ABC và 3 protein chưa biết (Dobson và cộng sự, 2007) Kết quả phân tích chức năng của các nhóm gen cho thấy LabT (LBA1796) rất cần thiết cho chức năng của lactacin B Hơn nữa, sự sản xuất lactacin B ñược cảm ứng bởi peptide từ

LBA1800 cho thấy rằng gen này cùng với labK và labR mã hóa các thành phần của

3CRS ñóng một vai trò quan trọng trong truyền tín hiệu và ñiều hòa quá trình tổng hợp lactacin B

3 MỘT SỐ PROBIOTIC LACTOBACILLI TIÊU BIỂU:

Lactobacilli là nhóm vi sinh vât ñầu tiên và lớn nhất và cũng chỉ một số giống ñược xem là probiotic (Wolfson, 1999; Mombelli và Gismondo, 2000) bao gồm các nhóm:

L acidophilus, L casei, L delbrueckii ssp bulgaricus, L reuteri, L brevis, L cellobiosus, L curvatus, L fermentum, L plantarum, L helveticus…

3.1.1 ðặc ñiểm:

3.1.1.1 Lactobacillus acidophilus:

ðây là vi khuẩn rất ưa acid Những giống của loài này thường xuất hiện ở dạng que

có “ñuôi” tròn (rounded end), nằm ñơn lẻ, thành cặp hoặc cũng có thể thành một chuỗi

ngắn

Chúng ñược phân lập từ ruột người và ñộng vật, trong miệng và âm ñạo của con người và dễ dàng tìm thấy chúng trong sữa và các sản phẩm từ sữa ðây là vi khuẩn dị

thể (heterogeneous) Với hình thức trao ñổi chất là lên men ñồng hình, chúng có thể

chuyển hóa hầu hết hàm lượng dextrose có trong môi trường thành acid latic (kể cả ñồng phân D và L) (Hammes và Vogel, 1995) Trong cây phân nhánh thì chúng nằm

trong nhóm Lactobacillus delbrueckii (Fellis và Dellaglio, 2007) Hàm lượng base nitơ

G – C trong hệ gen của chúng từ 34 – 37%

3.1.1.2 Lactobacillus casei và Lactobacillus paracasei:

ðây là 2 loài thường hiện diện cùng nhau, gần giống nhau vì chúng có mối liên hệ chặt chẽ, danh pháp của chúng ñã ñược bàn luận trong thời gian dài và mới ñược quyết ñịnh gần ñây (Judicial Commission 2008)

ðây là các vi khuẩn có nguồn gốc từ sữa và các sản phẩm từ sữa, bên cạnh ñó còn ñược tìm thấy trong bột nhào chua, silage, dạ dày-ruột người (GI), cơ quan sinh dục nữ

và cả trong nước thải

Là những trực khuẩn với “ñuôi” vuông (square ends), chúng thường nằm ở dạng chuỗi Khác với L acidophilus, chúng lên men lactic dị hình tùy tiện bằng cách sử

dụng ñường dextrose và cả ñường pentose (Hammes và Vogel, 1995) và sản phẩm của quá trình này là L-acid hoặc cả hai dạng ñồng phân D và L, tùy thuộc vào từng giống

Hệ gen của chúng có chứa hàm lượng G – C vào khoảng 45 – 47% ðại diện tiêu biểu

là Lactobacillus casei Shirota (LcS)

Lactobacillus Casei Shirota (LcS):

Lactobacillus casei Shirota ñược phân lập và nuôi cấy thành công vào năm 1930

bởi Minrou Shirota (1899 – 1982) tại Phòng thí nghiệm vi sinh của Khoa Dược , ðại học Kyoto, Kyoto, Nhật Bản Vi khuẩn này có thể chống lại ñược acid của dạ dày và acid mật, do ñó chủng này có thể ñi vào ruột già sau khi qua miệng Và tiến sĩ Shirota

ñã phát triển chủng này, sử dụng nó vào sản xuất Yakult (1935)

− Hình thái và cấu trúc:

LcS là trực khuẩn có kích thước trung bình Mỗi tế bào dài từ 1 – 2.5µm và có ñường kính là 0.5µm khi quan sát dưới kính hiển vi Nói chung, kích thước có thể thay ñổi ñôi chút trong quá trình nuôi cấy, chẳng hạn chiều dài tế bào là hơn 4µm khi tế bào ở pha suy vong, không phân chia nữa LcS hơi tròn, với bề mặt trơn, không có tiên mao

Hình 4: Ảnh SEM của L casei Shirota (LcS) cho thấ hình dạng que với ñường kính

0.5mm và chiều dài 1.5mm (×17000) (Nguồn: Lactobacillus casei strain Shirota –

Intestinal Flora and Human Health, Yakult Central Institute for Microbiological

Research, Tokyo, 1990, p.23)

Hình 5: Ảnh SEM những phần siêu mỏng của LcS cho thấy bề mặt tế bào tương ñối

trơn (×66000) (Nguồn: Lactobacillus casei strain Shirota – Intestinal Flora and

Human Health, Yakult Central Institute for Microbiological Research, Tokyo, 1990,

p.24)

Mỗi một tế bào LcS ñược bao bọc bởi thành tế bào dày 20 – 30nm, chứa peptidoglycan (murein), teichoic acid, protein cũng như các vi khuẩn Gram dương khác Sau khi cố ñịnh bằng phương pháp Ryter-Kellenberger, phương pháp cố ñịnh vi

khuẩn tiêu chuẩn, LcS xuất hiện lớp “vỏ” (coat) bên ngoài như polysaccharide bên

ngoài thành tế bào Lớp “vỏ” này có thể không có bản chất cấu trúc như capsule Có thể ñây là sự bám dính của sản phẩm trao ñổi chất lên thành tế bào vì không có một lớp vỏ nào ñược tìm thấy sau khi cố ñịnh kép với glutaraldehyde và osmium tetroxide

hoặc sau khi cố ñịnh thay thế (substitution fixation) và làm lạnh nhanh LcS không có lớp mảng bám thông thường (array layer) chứa các hạt protein nhỏ

Phân tích hóa học cho thấy LcS ñược bao bọc bởi thành tế bào cấu thành bởi peptidoglycans gắn với polysaccharide là các polymer phụ trợ, trong khi ñó, acid lipoteichoic và các polymers khác kéo dài từ màng tế bào ñến thành tế bào như ở các

vi khuẩn Gram dương khác Một vài vi khuẩn G (+) có capsule là một cấu trúc ngoài

cùng hoặc có protein M hay lớp S (S layers) trên thành tế bào Tuy nhiên, không có

cấu trúc nào như vậy ñược tìm thấy ở LcS Do ñó, các phần cấu tạo chính của bề mặt LcS gồm có lipoteichoic acid, peptidoglycan và polysaccharides gắn với thành tế bào (Hình 6)

Hình 6: Giản ñồ cấu trúc bề mặt tế bào của vi khuẩn Gram (+) M; N-acetylmuramic

acid, G: N-acetylglucosamine, : cầu peptide (Nguồn: Lactobacillus casei strain

Shirota – Intestinal Flora and Human Health, Yakult Central Institute for

Microbiological Research, Tokyo, 1990, p.31)

− Trao ñổi chất- năng lượng của LcS:

Ở LcS, phosphoenolpyruvic – hệ thống phosphotransferase phụ thuộc tạo sự thuận lợi cho sự hấp thu lactose trong tế bào Khi sinh trưởng trên môi trường Glucose hay lactose như nguồn carbon chính, LcS lên men sản xuất ra chủ yếu acid lactic Vì thế, ñây là vi khuẩn lên men lactic ñồng hình (tạo ra 2 mol acid lactic, 2 mol ATP từ 1 mol glucose) Hiệu quả của sự hình thành ATP trong quá trình lên men ñồng hình gấp ñôi quá trình lên men dị hình acid lactic Vì thế, năng lượng LcS tạo thành nhiều hơn so với các vi khuẩn LAB lên men dị hình khác

Nhóm vi khuẩn lên men ñồng hình ñược phân thành lên men ñồng hình bắt buộc và lên men ñồng hình thay thế Vì LcS có thể sản xuất ra hàm lượng vết ethanol và acid acetic nên thuộc về nhóm lên men ñồng hình tùy tiện

− Nhu cầu dinh dưỡng của LcS

Nhu cầu dinh dưỡng của LcS rất phức tạp, giống như nhiều vi khuẩn LAB khác ðể ñạt ñược sự sinh trưởng tối ña của LcS trong môi trường tổng hợp, cần phải có ñến 4 vitamin và 12 amino acid Một vài các chất thêm vào như amino acid, vitamin, acid nucleic có khả năng thúc ñẩy sự sinh trưởng của LcS LcS có hiện tượng dinh dưỡng thụ ñộng với valine, acid glutamic, acid nicotinic, acid pantothenic, ñây ñều là những chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng của hầu hết các vi khuẩn LAB khác Nhu cầu về khoáng của LcS cũng rất cao, ñặc biệt là mangan rất cao

Bảng 6: Nhu cầu dinh dưỡng của LcS

− Hệ gen của LcS:

Sato và cộng sự ñã công bố hệ gen của LcS Chromosome của LcS ñược xây dựng nên bởi 3035753 bp nucleotide và ước tính khoảng 2760 gen, 5 phiên bản rRNA

operon, 58 phiên bản tRNA gen và 70 phiên bản của chuỗi chèn vào (insertion

sequence) Hình 7 phân loại gen của LcS LcS có một vài thiếu hụt trong gen liên quan

ñến chu trình TCA và tổng hợp amino acid Vì thế không có vùng tương ñồng nào

giữa LcS và Lactobacillus plantarum WCFS1 ở cấp ñộ gen Phát hiện này cho thấy

LcS ñạt hiệu quả thấp hơn các vi khuẩn hiếu khí khác trong việc sản xuất ATP và nhu cầu phức hợp các chất dinh dưỡng Việc phân tích gen cũng chỉ ra rằng LcS thích nghi tốt với môi trường ruột người, nơi ít oxy và giàu chất dinh dưỡng

Hình 7: Phân loại gen của LcS

3.1.1.3 Lactobacillus crispatus:

Hình dạng của chúng là hình que thẳng hoặc hơi cong trong môi trường lỏng, xuất hiện ở dạng ñơn lẻ hay thành các chuỗi ngắn Loài có mối quan hệ gần với chúng là

Lactobacillus kefiranofaciens Tương tự như L acidophilus, chúng cũng trao ñổi chất

bằng lên men ñồng hình, hệ gen của chúng cũng có lượng G – C vào khoảng 35 – 38% Vi khuẩn này ñược tìm thấy trong phân, nước bọt và niệu sinh dục của con người

và gà

3.1.1.4 Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus:

ðây là vi khuẩn ñược sử dụng nhiều trong ngành công nghiệp chế biến sữa và các sản phẩm từ sữa Chúng có thể lên men sữa ở nhiệt ñộ cao (Germond và cộng sự, 2003) ðiều này cũng giải thích hàm lượng G – C trong hệ gen của chúng cũng cao khác thường (49 – 51%) và khả năng rất hiếm thấy là lên men nhiều loại ñường khác

hơn là ñường lactose Lactobacillus delbrueckii ñược phân lập từ dịch ngâm chua của

hạt lúa ñược ủ ở 45oC, còn loài Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus lại ñược

phân lập từ yogurt Bulgarian

3.1.1.5 Lactobacillus johnsonii:

ðược ñặt theo tên của nhà vi khuẩn học ñã tìm ra chúng, Jonhson, Lactobacillus

johnsonii là vi khuẩn lên men lactic ñồng hình, cho ra hai loại ñồng phân D và L Hệ

gen cũng có từ 33 – 35% hàm lượng G – C Chúng ñược phân lập từ mẫu vật phẩm của người và trong phân của ñộng vật

3.1.1.6 Lactobacillus plantarum:

Theo như tên gọi thì vi khuẩn này ñược tìm thấy nhiều trong ñất trồng Bên cạnh

ñó chúng cũng sinh trưởng ñược trên nhiều môi trường khác chẳng hạn như các sản phẩm từ sữa, mẫu vật phẩm từ người, kể cả nước thải… ðây là vi khuẩn hình que với

“ñuôi” tròn (rounded ends), lên men dị hình tùy tiện (facultatively heterofermentative)

cho ra cả hai ñồng phân acid lactic từ nguồn carbohydrate, hàm lượng G – C của hệ

gen là 44 – 46% Loài này có mối quan hệ gần nhất với Lactobacillus pentosus và

Lactobacillus paraplantarum

− ðặc ñiểm tiêu biểu củaL plantarum:

ðặc ñiểm tiêu biểu của L plantarum theo Bergey’s Manual (1986), là trực khuẩn,

sinh trưởng ở 15oC nhưng không thể sinh trưởng ở 45oC, thành tế bào có chứa acid teichoid, peptidogycan của thành tế bào kiểu m-diaminopalemic-direct type Sản xuất

ra cả 2 ñồng phân D và L acid lactic, không có khả năng sinh NH3 từ arginine, sử dụng

ñược ñường pentose bằng enzyme cảm ứng phosphoketolase Giống tiêu biểu của L

plantarum là ATCC 14917 Khả năng lên men các loại carbohydrate khác nhau của

các giống L plantarum khác nhau phong phép thử API 50CH ñược nêu ra ở Bảng 7 dưới ñây L plantarum có khả năng nổi bật trong việc lên men nhiều carbohydate khác

nhau Một vài giống cũng có khả năng lên men ñược tinh bột

Bảng 7: Tỷ lệ % giống L plantarum có khả năng lên men các loại carbohydrate khác

nhau sử dụng bộ thử API 50CH Test Kita ở 37oC

Kiểu hình của L plantarum có thể không ñồng nhất, gây khó khăn trong việc nhận

diện kiểu hình Tuy nhiên, nghiên cứu quy luật của chuỗi gen rRNA 16S cho thấy nó

hoàn toàn ñồng nhất với các loài thuộc L plantarum, bất kể kiểu hình hay nguồn phân

lập giống từ ñâu Chính vì thế, cách nhận diện bằng hệ gen là ñặc biệt chính xác và ñược ñề nghị sử dụng nhiều trong việc phân tích kiểu hình

− Sinh lý học và sinh thái học:

L plantarum là vi khuẩn ñược sử dụng nhiều trong các thực phẩm lên men lactic

truyền thống từ nguồn nguyên liệu thực vật Thực phẩm lên men từ thực vật có thể

ñược cấy thêm giống L plantarum có nguồn gôc từ thực vật vì lượng vi khuẩn này

trên thực vật sống không cao, nhỏ hơn 10cfu/g thực vật sống Tuy nhiên, nguyên liệu

từ thực vật ban ñầu cũng có thể ñược cấy thêm các vi khuẩn L plantarum có nguồn gốc từ ñông vật hay con người L plantarum thường thấy trong niêm mạc, từ miệng ñến trực tràng và cũng có thể xuất hiện trong dạ dày-ruột (GIT) của các ñộng vật như

chó, lợn và ngựa Chúng cũng xuất hiện trong cả côn trùng, nhện và ốc

Vi khuẩn này có khả năng tồn tại ñược trong hệ tiêu hóa và có khả năng bám vào niêm mạc ruột ñể tránh sự rửa trôi

− Khả năng bám dính:

L plantarum giống 299 và 299v là 2 giống có nguồn gốc từ biểu mô ruột ñồng thời

cũng có thể tìm thấy chúng ở các thực phẩm lên men lactic Khả năng bám dính vào tế bào niêm mạc ruột người phụ thuộc vào cơ chế bám dính liên kết với mannose Nấm

men có cơ quan thụ cảm mannose nằm trên bề mặt và L plantarum nhạy cảm với mannose sẽ liên kết với bề mặt của nấm men Vì thế, L plantarum thường xuất hiện

cùng với nấm men trong các sản phẩm lên men lactic truyền thống Có thể việc bám

dính của L plantarum lên các tế bào nhân thật là ñể sử dụng nguồn chất dinh dưỡng

“rò rỉ” từ các tế bào nhân thật L plantarum cần có các chất dinh dưỡng như Ca,

pantothenate và niacin Và tế bào nấm men cũng có tác dụng trong việc bảo vệ vi khuẩn này khỏi tác ñộng ñộc hại của oxy

L plantarum có khả năng ức chế E coli gây các bệnh ñường ruột và chảy máu

ñường ruột bám vào ruột bằng cách cảm ứng chất nhày (mucin) trên ruột , tức là lúc

ñó, tế bào biểu mô ruột sẽ sản xuất ra nhiều dich nhầy ruột hơn ñể hạn chế sự tấn công của chất ñộc lê bề mặt

− Các phản ứng oxy hóa:

L plantarum sử dụng hệ thống enzyme của nó ñể bắt các oxy gốc tự do Tuy nhiên,

vi khuẩn này ñược xem là vi hiếu khí nên khả năng bắt các gốc tự do không cao bằng

các vi khuẩn hiếu khí Các phản ứng oxy hóa có thể xảy ra với L plantarum là:

Với enzyme pyruvate oxidase, tạo thành H2O2, carbonic, acetyl phosphate từ pyruvate, oxy và phosphate

Với L-lactate oxidase hoặc D-lactate dehydrogenase không phụ thuộc NAD, sản xuất pyruvate và hydroperoxide từ lactate và oxy

Với NADH oxidase, sản xuất NAD+ và hydroperoxide từ NADH, H+ và oxy

Với phản ứng khử peroxide không enzyme bởi mangan , tạo ra hydroperoxide từ

O2- và hydrogen

Lactobacillus plantarum ñòi hỏi một nhu cầu rất cao về mangan và có thể tích lũy

một lượng lớn nguyên tố này trong tế bào Một ñiều thú vị là thực vật lại giàu mangan,

mangan lại chính là nguyên tố bảo vệ L plantarum trong việc chống lại ñộc tính của

oxy bằng cách khử các gốc oxy tự do từ hydroperoxide Hydroperoxide ñược sinh ra

sẽ ñược chuyển thành oxy và nước nhờ pseudocatalase có cofactor là mangan ở L

plantarum

− Khả năng lên men carbohydate:

Mặc dù lactic acid chính là sản phẩm chủ yếu từ glucose khi hô hấp kị khí, một

lượng ñáng kể acid acetic ñược sản xuất bởi L plantarum dưới ñiều kiện hiếu khí.1/3 acid acetic và 2/3 acid lactic ñược tạo thành bởi L plantarum ATCC 8014 dưới ñiều

kiện hiếu khí

Vi khuẩn này chẳng những lên men ñường hexose, pentose (1 mol lactate, 1 mol acetate, 1 mol CO2 cho 1 mol pentose) mà còn có thể sử dụng cả các acid hữu cơ như acid malic, tactric, citric ñể tạo thành khí CO2, lactic, acetic và các sản phẩm phụ khác Phản ứng chuyển malic acid thành CO2 và lactic acid là một phản ứng rất quan trọng

trong công nghiệp sản xuất rượu (con ñường lên men malolactic) Các phương thức

trao ñổi chất của L plantarum ñược ñánh giá bởi Vescovo và cộng sự (1993)và

Daeschel và Nes (1995) Vi khuẩn này cũng có khả năng sản sinh một ít diacetyl hoặc acetoin, các chất này có tính kháng vi sinh vật và có thể ảnh hưởng ñến hương vị của thực phẩm

− Khả năng chống lại pH thấp:

L plantarum thường xuyên sản xuất ra acid lactic trong thực phẩm lên men, nơi có

pH thấp dưới 4 và cũng có thể tồn tai ñược dưới acid của dạ dày Vì thế chũng có khả năng chịu ñược acid cao Chúng cũng ñược so sánh với các vi khuẩn lactic khác về khả

năng chịu pH thấp Ví dụ, một sự so sánh giữa L plantarum và Leuconostoc

mesenteroides cho thấy sự sinh trưởng của Leuconostoc mesenteroides dừng lại khi pH

nội bào ñạt 5.4 – 5.7, còn ở L plantarum là 4.6 – 4.8 Thậm chí, L plantarum còn có

khả năng duy trì gradient pH xuống pH nội bào là 3

− Khả năng phá hủy tannin:

Bên cạnh pH, các nhân tố ñược ñiều khiển trong quá trình lên men các nguyên liệu thực vật là sự có mặt của tannin và các phenolic khác Tannin thường ở dạng polyphenol tan trong nước với các phân tử lượng khác nhau, khác với các phenolic khác vì khả năng kết tủa protein trong dung dịch Tannin ức chế quá trình sinh trưởng của vi sinh vật và chống lại sự tấn công ủa vi sinh Non-hydrolysable tannin có khả năng chống lại sự phá hủy của vi sinh vật cao hơn hydrolysable tannin Tannin gặp nhiều trong trái cây và hạt như nho, táo, olive, ñậu…hạt coca, hạt café, trà Nấm sợi, nấm men và một vài vi khuẩn hiếu khí khác thường có khả năng phân hủy tannin

nhưng sự phân hủy dưới ñiều kiện yếm khí cũng xảy ra trong ñường ruột Các giống L

plantarum có enzyme tannase và cũng có thể trao ñổi acid phenolic L plantarum khi

sinh trưởng trong một môi trường chứa nồng ñộ tannin cao có khả năng ñặc biệt trong việc phá vỡ tannin và trao ñổi acid phenolic Vi khuẩn này biến ñổi tannin và tạo ra các sản phẩm phân hủy từ chúng chẳng hạn như acid phenylpropionic Chúng cũng có khả năng tạo ra một lượng nhỏ phenyl-acid chẳng hạn như acid benzoic và acid phenyl-lactic, có tính chống nấm

Phenolic, chẳng hạn flavonoid là chất chống oxy hóa mạnh có khả năng ảnh hưởng tích cực lên sinh lý Ảnh hưởng kết hợp của quả tầm xuân, một loại trái có chứa nhiều

polyphenol có hoạt tính sinh học cao, và L plantarum ñã ñược thử nghiệm trên chuột

mắc bệnh thiếu máu cục bộ/nghẽn mạch máu Bệnh thiếu máu cục bộ/nghẽn mạch máu ở ruột già bao gồm sự viêm dẫn tới tổn thương các mô, nơi các loài vi sinh vật

phản ứng chống lại với oxy, ñóng vai trò trung tâm L plantarum 299v sở hữu enzyme

tác ñộng lên polyphenol (tannin), có thể phân hủy tannin thành nhiều flavonoid và làm tăng khả năng chống oxy hóa của quả tầm xuân Nó cho thấy rằng quả tầm xuân cùng

với L plantarum làm giảm ñáng kể quá trình peroxide hóa lipid trong mô ruột tịt

Sự phân hủy tannin bởi L plantarum tác ñộng một cách tích cực lên thành phần

dinh dưỡng của thực phẩm lên men từ nguyên liệu giàu tannin và ñiều này ảnh hưởng ñến tính chất sinh lý của GIT của vật chủ Dường như, môi trường giàu tannin ñem lại

lợi thế chọn lọc cho L plantarum, ñược dùng ñể so sánh với các vi sinh vật không có

khả năng phân hủy tannin và thậm chí bị ức chế bởi chất này

3.1.1.7 Lactobacillus reuteri:

Là vi khuẩn hình que với “ñuôi” tròn, chúng lên men dị hình, ñược phân lập từ ruột, phân người và ñộng vật, bột nhào chua và thịt Chúng cũng thường sinh ra một phức

chất kháng vi trùng ñó là reuterin Lactobacillus reuteri có khả nằng lên men và cho ra

cả 2 ñồng phân acid và hệ gen của chúng chứa khoảng 40 – 42% hàm lượng G – C

Loài này có mối quan hệ gần với Lactobacillus antri, Lactobacillus coleohominis,

Lactobacillus ingluviei, Lactobacillus mucosae, Lactobacillus oris, Lactobacillus panis, Lactobacillus pontis, Lactobacillus secaliphilus, and Lactobacillus vaginalisoris, Lactobacillus panis, Lactobacillus pontis, Lactobacillus secaliphilus và Lactobacillus vaginalis

3.1.1.8 Lactobacillus rhamnosus:

Khả năng lên men ñược rhamnose là một trong những ñặc trưng cơ bản của trực khuẩn này Chúng ñược phân lập từ các sản phẩm từ sữa, nước thải, và các mẫu vật phẩm của con người Chúng trao ñổi chất bằng con ñường lên men dị hình không bắt

buộc (facultatively heterofermentative), tương tự như Lactobacillus paracasei Chúng

ñược tìm thấy trong các mấu bệnh phẩm như của các bệnh viêm màng trong của tim và các bệnh lây nhiễm cơ hội khác

3.1.1.9 Lactobacillus salivarius:

Như tên gọi cho thấy, ñây là giống xuất hiện ngay trong nước bọt của người, cũng như trong khoang miệng và trong ruột của người và ñộng vật Chúng lên men cả ñường hexose và pentose bằng kiểu lên men dị hình không bắt buộc (Lee và cộng sự, 2006), và cho ra sản phẩm là L-acid lactic Hệ gen của chúng chứa khoảng 34 – 36% hàm lượng G – C Vi khuẩn này ñược phân lập từ nước bọt người

3.1.2 Tác ñộng lên sức khỏe con người của probiotic nói chung và một vài probiotic Lactobacilli nói riêng:

Probiotic ảnh hưởng có lợi lên vật chủ bằng cách tăng cường hoạt ñộng của các vi sinh vật ñường ruột có lợi và duy trì sự cân bằng vi sinh vật trong ruột (Frost và Sullivan, 2000; Saarela và cộng sự, 2000; Matilla-Sandholm và cộng sự, 2002; Betoret

và cộng sự, 2003) Chúng cạnh tranh chất dinh dưỡng và vị trí bám dính với những vi khuẩn gây bệnh (Chen và Yao, 2002) Canh trường vi khuẩn probiotic thúc ñẩy sự phát triển của những vi sinh vật có lợi khác cũng như loại bỏ những vi khuẩn có nguy

cơ gây hại cho cơ thể, từ ñó củng cố hệ thống bảo vệ tự nhiên của cơ thể (Saarela và cộng sự, 2000) Chúng củng cố hệ vi sinh vật ñường ruột, làm vững chắc lớp niêm mạc ruột, ngăn cản sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh, làm cho vi khuẩn gây bệnh không hoạt ñộng, củng cố hoạt tính enzyme vi khuẩn, ảnh hưởng tới tính thấm của lớp biểu mô ruột và ñiều khiển hệ thống miễn dịch (Salminen và cộng sự, 1998; Betoret và cộng sự, 2003; Krasaekoopt và cộng sự, 2003)

Tác ñộng của probiotic ñược thừa nhận do những sản phẩm bậc 2 mà chúng tạo ra như acid, hydrogen peroxide, các kháng sinh từ vi khuẩn như lactocidin, acidophilin thể hiện hoạt tính kháng sinh và ngăn chặn một số lượng khá lớn các vi sinh vật gây

bệnh và/hoặc có nguy cơ gây bệnh như Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter,

Pseudomonas, Salmonella, Serratia và Bacteroides (Chen và Yao, 2002; Krasaekoopt

và cộng sự, 2003) Vi khuẩn lactic ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh bằng cách sản xuất một chuỗi acid béo ngắn như acid acetic, acid propionic, acid butyric cũng như là acid lactic và acid formic làm giảm pH trong ruột Một lượng ñáng

kể acid lactic sản xuất bởi Bifidobacteria có hoạt tính kháng vi sinh vật như nấm men, nấm mốc và vi khuẩn (Percival, 1997; Adams và Moss, 2000), Những loài này có khả năng làm giảm hoạt tính của enzyme trong phân bằng cách sản xuất những chất trao ñổi gó thể gây biến ñổi và như β-glucuronidase và glycolic acid hydroxilase (Collins

và Hall, 1984; Mombelli và Gismondo, 2000) Probiotic sản xuất các enzyme giúp cho việc tiêu hao protein, chất béo và lactose (Frost và Sullivan, 2000) Chúng cũng sản xuất enzyme β-galactosidase giúp hỗ trợ cho những người không tiêu hóa ñược ñường lactose (Krasaekoopt và cộng sự, 2003)

Trong thương mại, những giống probiotic còn sống ñượng cho vào những thực phẩm lên men hoặc ñược trữ lạnh ñông ñể sử dụng trong y học hay nhiều mục ñích khác (Holzapfel và Schillinger, 2002)

Một số tác ñộng của probiotic Lactobacillus lên sức khỏe con người ñược trình bày dưới bảng sau ñây:

Bảng 8: Sự tác ñộng của một số probiotic Lactobacilli lên sức khỏe con người:

L rhamnosus GG (ATCC 53013)

− ðiều trị và ngăn ngừa rủi ro tình trạng tiêu chảy Ngăn chặn kháng sinh có liên quan ñến chứng tiêu chảy Ngăn chặn

chứng tiêu chảy tái phát C difficile

− Giảm dị ứng aczema ở trẻ sơ sinh

− Ngăn chăn dị ứng

− Làm giảm triệu chứng xơ nang

− Tăng cường vi sinh vật ñường ruột Bifidobacteria

− Giảm hiểm họa do Streptococcus

mutan gây ra

Cân bằng vi sinh vật ñường ruột

− Hoạt tính enzyme lactase cao, ñiều tri chứng không dung nạp lactose, sản xuất kháng sinh từ vi khuẩn

L.casei Shirota

− Ngăn ngừa rối loạn tiêu hóa

− Làm cân bằng hệ vi khuẩn ñường ruột

− Làm yếu ñi hoạt tính enzyme trong phân, tác ñộng tích cực trong bệnh ung thư bóng ñái tái diễn.(giảm)

L.bulgaricus

− Không tác ñộng ñến bệnh tiêu chảy Không làm tăng cường miễn dịch với bệnh tiêu chảy Không ảnh hưởng ñến hoạt tính enzyme phân

− Khả năng cải thiện chứng không dung nạp lactose tùy thuộc vào giống

L acidophilus La-5

− Cân bằng hệ vi khuẩn ñường ruột, bảo vệ chống lại bệnh tiêu chảy, thúc ñẩy miễn dịch

trong ruột

Lactobacillus reuteri

− ðịnh cư ở ruột, ñiều trị chứng tiêu chảy rotavirus, cân bằng hệ vi sinh vật ñường ruột

sinh vật ñường ruột

Lactobacillus rhamnosus DR 1

− Tăng miễn dịch, bám vào thành ruột, tác ñộng ñến hệ vi sinh vật ñường ruột Cải thiện tình trạng sức khỏe người cao tuổi

Phần 3: QUÁ TRÌNH LÊN MEN SẢN XUẤT PROBIOTIC

LACTOBACILLI

Quy trình lên men sản xuất probiotic gồm có những bước cơ bản sau ñây:

(1) Chuẩn bị môi trường sinh trưởng

(2) Sản xuất sinh khối

(3) Tăng nồng ñộ sinh khối (biomass concentration)

(4) Ổn ñịnh sinh khối (biomass stabilization)

Sơ ñồ thiết bị quy trình sản xuất probiotic ñược trình bày trong Hình 8 dưới ñây:

Hình 8: Sơ ñồ thiết bị quy trình sản xuất probiotic

Ở ñây, chúng tôi chỉ trình bày quá trình lên men sản xuất probiotic, tức là công ñoạn (h) trên sơ ñồ thiết bị

1 TIÊU CHUẨN CHỌN GIỐNG PROBIOTIC:

Chọn giống probiotic thích hợp là một khía cạnh hết sức quan trọng Tiêu chí cơ bản của việc chọn giống propiotic là: sự an toàn, tính chức năng và công nghệ (Hình 9)

Hình 9: Tiêu chuẩn chọn giống probiotic

Tiêu chuẩn an toàn cho probiotic ñã ñược ñịnh nghĩa bởi nhiều nhà khoa học như Lee và Salminen (1995); Donohue và Salminen (1996); Salminen và cộng sự (1996b,

1998); Adams (1999)…Chọn giống có nguồn gốc từ con người (human origin) ñã

ñược tranh cãi nhiều nhưng hầu hết các giống ñược chọn thành công ñều có nguồn gốc này Cũng có ý kiến tranh luận rằng probiotic sẽ có tính chất chức năng tốt hơn khi nó ñược nuôi cấy trên một môi trường tương tự nơi nó ñược phân lập Khía cạnh an toàn bao gồm những ñặc trưng sau ñây:

− Giống cho con người sử dụng tốt nhất là có nguồn gốc từ con người

− Giống ñược phân lập từ tuyến tiêu hóa (GIT) khỏe mạnh

− Lịch sử giống không có ñộc tính

− Không có mối liên hệ với các bệnh như bệnh viêm màng trong tim, rối loạn chức năng tiêu hóa

− Giống phải không ñược kết hợp với muối mật (quá trình kết hợp và hydroxyl hóa

(dehydroxylation) muối mật tác ñộng tiêu cực ñến ruột non, theo Marteau và cộng sự

(1995))

− Không có gen gây chống lại

− Không có phản ứng miễn dịch chống lại probiotic trong cơ thể