Tìm hiểu về protease và ứng dụng của protease trong công nghệ chế biến thịt

Mặc dù TTHĐ của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng cácenzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùngmột cơ chế chung như sau: Trong đó: E: enzyme, S: c

LỜI MỞ ĐẦU:

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, cácchế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng hầu hếttrong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế…Hàng năm, lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khácnhau Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việcthủy phân cơ chất tự nhiên Protease là một trong những enzyme được ứngdụng rất nhiều trong mọi lĩnh vực, trong đó, đặc biệt là công nghiệp thựcphẩm Protease đã có những đóng góp rất to lớn trong việc phục vụ, nâng caođời sống của con người Protease là enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện naytrong một số ngành sản xuất như: chế biến thực phẩm (đông tụ sữa làm fomat,làm mềm thịt, bổ sung để làm tăng chất lượng sản phẩm trong sản xuất bia, xử

lý phế phụ phẩm trong chế biến thực phẩm…), sản xuất chất tẩy rửa, thuộc da,

y tế, nông nghiệp… Vì tầm quan trọng của protease trong nhiều lĩnh vực, đặc

biệt là trong công nghệ thực phẩm, nên tôi chọn ”Tìm hiểu về protease và ứng dụng của protease trong công nghệ chế biến thịt” làm đề tài đồ án.

PHẦN I: TỔNG QUAN ENZYME PROTEASE

1.1 Giới thiệu enzyme protease

- Aminopeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptit ở đầu N tự do củachuỗi polypeptit để giải phóng ra một amino acid, một dipeptid hoặc mộttripeptit

- Carboxypeptidase: Xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu C của chuỗipolypeptid và giải phóng ra một amino acid hoặc một dipeptid

Dựa vào sự có mặt của các nhóm chức năng ở trung tâm hoạt động, cácprotease được chia làm 4 nhóm sau:

Hình 1.1 Phản ứng thủy phân liên kết peptide

- Serine protease: Là những protease có nhóm –OH của gốc serine trongtrung tâm hoạt động, có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xác táccủa enzyme.

- Nhóm này bao gồm tripsin, elastase Nhóm subtilisin bao gồm cácenzyme động vật như chymotrypsin, hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thểhiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

- Cysteine protease: Các protease có nhóm –SH trong trung tâm hoạtđộng Cysteine protease bao gồm protease thực vật như: papain, actindin,bromelin, một vài protease động vật và protease lý sinh trùng Các Cysteineprotease thường hoạt động mạnh ở pH trung tính, có tính đặc hiệu rộng và chỉhoạt động khi nhóm –SH trong trung tâm hoạt động của nó bị bao vây

- Aspartic protease: hầu hết các Aspartic protease thuộc nhóm pepsin.Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như pepsin, chymosin, cathepsin,renin, các protease của nấm mốc Các Aspartic protease có chứa nhómcarboxyl trong trung tâm hoạt động và thường hoạt động ở pH trung tính

- Metallo protease: Metallo protease là nhóm protease được tìm thấy ở vikhuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao Các Metallo proteasethường hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và hoạt độ giảm dưới tácdụng của EDTA

Người ta cũng có thể dựa vào vùng pH hoạt động tối thích để phânthành các protease acid tính (pH<6), kiềm tính (pH 8-11) và trung tính (pH 6-7,5) Tuy nhiên, cách phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng, không thật sựchính xác vì pH tối thích của mỗi enzyme còn phụ thuộc vào bản chất cơ chất

và nhiều yếu tố khác nữa

1.2.1 Cấu trúc trung tâm hoạt động (TTHĐ) của protease [2]

Trong TTHĐ của protease vi sinh vật ngoài gốc acid amin đặc trưngcho từng nhóm còn có một số gốc acid amin khác Các kết quả nghiên cứuchung về TTHĐ của một số Protease vi sinh vật cho phép rút ra một số nhậnxét chung như sau:

- TTHĐ của protease đủ lớn và bao gồm một số gốc acid amin và trongmột số trường hợp còn có cả kim loại

+ Các protease kim loại có TTHĐ lớn hơn vào khoảng 210A, có thểphân biệt thành sáu phần dưới TTHĐ (subsite), mỗi phần dưới TTHĐ tươngứng với mỗi gốc amino acid trong phân tử cơ chất

+ Đối với các protease acid, theo nhiều nghiên cứu cấu trúc TTHĐ của

các tinh thể Protease acid của Phizopus chinenis và Endothia parasilica đã

cho thấy phân tử các protease này gồm có hai hạt, giữa chúng có khe hở vàokhoảng 200A Khe hở này là phần xúc tác của các enzyme, các gốc Asp-35 và Asp-215 xếp đối diện nhau trong khe ấy.

- Đối với các protease không chứa cysteine, TTHĐ của chúng có tínhmềm dẻo hơn vì cấu trúc không gian của chúng không được giữ vững bởi cáccầu disulphide

Mặc dù TTHĐ của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng cácenzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùngmột cơ chế chung như sau:

Trong đó: E: enzyme, S: cơ chất, E- S: Phức chất enzym- cơ chất, P1:

Là sản phẩm đầu tiên của phản ứng, P2: Là sản phẩm thứ hai của phản ứng

1.2.2 Đặc tính của enzyme

E + S E– S E– S + P1 E + P2

Hình 1.2 Cơ chế xúc tác TTHĐ Enzyme

Phần lớn protease của vi khuẩn chỉ hoạt động trong một khoảng pH hẹpcòn protease của nấm mốc thì ngược lại, có nhiều loài rất khác nhau và cá thểhoạt động trong phạm vi pH rộng Dựa vào khoảng pH tối thích người ta chiachúng làm nhiều loại: [1],[3]

1.1.5 Ứng dụng enzyme protease

1.1.5.1 Ứng dụng trong y dược [6]

Dùng enzyme làm thuốc, ví dụ protease làm thuốc chống tắc nghẽn timmạch, tiêu mủ vết thương, làm thông đường hô hấp, chống viêm, làm thuốc hỗtrợ tiêu hóa protein và một sốloại thuốc dùng trong da liễu và mỹ phẩm…

1.1.5.2 Công nghiệp thực phẩm:

 Protease với công nghiệp thịt: Việc sử dụng protease trong chế biến làm mềm thịt là ứng dụng có tính truyền thống Nhân dân ta từ rất lâu đã dùngthơm để chế biến thịt bò, nấu chân giò với đu đủ xanh, kết hợp thức ăn nhiềuthịt với đu đủ để trị chứng khó tiêu hóa và táo bón…mà thực chất là sử dụng

các enzyme papain, bromelain, ficin Người Nga còn dùng protease từ hạt đậutương nẩy mầm để làm mềm thịt

Ngoài khả năng phân giải để làm mềm thịt, tạo thức ăn dễ tiêu hóa, công nghệsản xuất các loại dịch thủy phân giàu protein đã được áp dụng một cách có hiệu quả bởi tính năng của protease [1]

 Công nghệ chế biến sữa: Enzyme là một công cụ để chế biến các phếliệu của công nghiệp thực phẩm thành thức ăn cho người và vật nuôi Người

ta còn khai thác tính đông tụ sữa của renin, pepsin vào công nghiệp sản xuấtphomat

 Trong công nghiệp sản xuất bia rượu

- Tăng tỉ lệ nguyên liệu thay thế

- Giảm thời gian lên men

- Hiệu suất thu hồi tăng

- Bia, rượu thành phẩm đạt các chỉ tiêu quy định tốt hơn khoảng 30%

- Nâng cao hiệu quả kinh tế, giảm chi phí sản xuất.[4]

 Trong công nghệ sản xuất nước chấm

- Sử dụng enzym từ các nguồn tự nhiên:

+ Động vật: trong nội tạng của gia súc có hiện diện nhiều enzym thủy phânprotease như: pepsin, tripsin, cathepsin

+ Thực vật: có một vài loại thực vật cũng có enzym protease như trong đu đủ

có enzym papain, dứa có enzym bromelin

+ Vi sinh vật: trong quá trình hoạt động sống nhiều hệ enzym sinh ra từ nấm

mốc Aspergillus oryzae, Asp niger

- Phương pháp sử dụng

+ Sử dụng dưới dạng thô: cho các nguyên liệu có enzym đó vào chượp với tỉ

lệ nhất định

+ Sử dụng dưới dạng chiết xuất: chiết enzyme từ các nguyên liệu trên thànhdạng tinh chế sau đó cho vào trong chượp.

1.1.5.3 Công nghiệp thuộc da

Trong công nghiệp da, enzyme protease được dùng để làm mềm da, làmsạch lông và da, rút ngắn thời gian, tránh ô nhiễm môi trường Việc xử lý đãđược tiến hành bằng cách ngâm da trong dung dịch enzyme, hay phết dịchenzyme lên bề mặt da Enzyme sẽ tách các chất nhờn và làm đứt một số liênkết trong phân tử collagen làm cho da mềm hơn Thực tế cho thấy khi xử lý dabằng chế phẩm protease từ vi sinh vật có thể rút ngắn thời gian làm mềm vàtách lông xuống nhiều lần Điều quan trọng là chất lượng lông tốt hơn sau khi

xử lý So với phương pháp hóa học thì việc xử lý bằng enzyme có số lượnglông tăng 20-30% Lông không cần xử lý thêm sau khi ngâm trong dịchenzyme [6]

1.1.5.4 Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa

- Công dụng của protease là phân hủy vết bẩn dạng protein trên vải

- Tên thương mại: Savinase và Relase

- Proteaza có tác dụng tẩy rửa các vết bẩn như máu, lòng đỏ trứng, sữa,nước rau, đậu, nước xốt thức ăn,… và chỉ có hoạt tính trong dung dịch giặt

- Enzyme có những tác dụng như sau khi được sử dụng trong chất tẩyrửa:

+ Giúp tăng hiệu quả của việc giặt tẩy

+ Giảm thời gian giặt nhờ khả năng phân hủy vết bẩn nhanh

+ Giảm năng lượng tiêu thụ do có thể giặt ở nhiệt độ thấp

+ Giảm lượng nước tiêu thụ do hiệu quả giặt rửa cao

+ Giảm ảnh hưởng đối với môi trường vì enzym là chất có thể phân hủysinh học

+ Tăng độ trắng và chống chất bẩn bám trở lại [4]

1.1.5.5 Trong sản xuất tơ tằm

- Quá trình làm sạch tơ sợi tự nhiên tương đối phức tạp và khó khăn

- Sợi sau khi kéo kén thường có khoảng 30% xerixin Muốn tách xerixinphải nấu trong dung dịch xà phòng Một lượng nhỏ xerixin nằm lại ở trên lụa

sẽ làm giảm độ đàn hồi của lụa

- Để tách lượng xerixin còn lại người ta thường dùng chế phẩm protease từnấm mốc, vi khuẩn [6]

1.2 Nguồn thu nhận enzyme protease

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từmức độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiềuđối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa )

và động vật (gan, dạ dày bê )

1.2.1 Thực vật

Enzyme protease được lấy từ nguồn thực vật được sử dụng nhiều nhấtlà: papain (đu đủ), bromelin ( dứa), Ficin (sung), Keratinase

1.2.1.1 Enzyme papain

 Cấu tạo hóa học và tính chất của papain

Papain là một endoprotease có chứa 16,1 % N và 1,2% S Papain là mộtprotease thiol Papain là một chuỗi polypeptide gồm 185 amino acid, trọnglượng phân tử là 20.900 Dalton.[2]

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng của trái đu đủ chín (tính trên 100g) [6]

lượng phần lượng lượng

95, 153-200, không có chức năng sinh học, chỉ làm tăng tính chất bền vữngcủa cấu trúc và một nhóm -SH tự do ở vị trí 25

Thành phần chính của papain chưa hoạt hóa là hỗn hợp proteindisulfurcysteine Khi hoạt hóa papain bằng KCN sẽ giải phóng ra nhóm thiolcủa enzyme và β-thio cyanatalanine do sự tương tác giữa cyanur và cysteine.Sau đó, β-thio cyanatalanine khép vòng tạo thành α-iminotiazolidin Khi cóoxy không khí, cơ chế trên xảy ra theo chiều ngược lại, tức là cystein kết hợpvới nhóm sulfurhydride của papain hoạt hóa tạo thành sản phẩm không hoạthóa

 Cấu trúc không gian [2]

Papain thủy phân protein thành các polypeptide và các amino acid,đóng vai trò vừa như endopeptidase vừa như exopeptidase

So với các protease có nguồn gốc động vật và vi sinh vật khác thìpapain có khả năng thủy phân sâu hơn Tính đặc hiệu cơ chất của papain rất

rộng vì nó có khả năng phân hủy hầu hết các liên kết peptide trừ các liên kếtvới proline và các glutamic acid có nhóm carboxyl tự do Papain có thể nhậnbiết một chuỗi gồm 7 amino acid trên cơ chất peptide của mình và sẽ ưu tiêncắt liên kết peptide trên một chuỗi có phenylalanine như sau: nếu peptide códạng X-Phe-Y-Z (X, Y, Z là các gốc amino acid) thì papain sẽ cắt tại vị trígiữa Y và Z, nhưng nếu peptide có dạng X-Phe-Y (có Phe nằm ở vị trí thứ haitrước đầu tận cùng) thì không được thủy phân bởi papain

Ngoài ra papain còn có hoạt tính esterase, thiolesterase và transferase

 Hoạt hoá papain: [2]

Papain chỉ thể hiện hoạt tính xúc tác của mình khi nhóm –SH ở dạng

tự do Vì vậy ta phải sử dụng chất hoạt hóa để đưa papain từ trạng thái khônghoạt động sang trạng thái hoạt động Do trung tâm hoạt động của papain cótính khử nên các chất hoạt hóa là các chất có tính khử như cysteine, glutationacid, hydrocyanic…

Trong đó cysteine là chất hay dùng nhất Khi có mặt các chất này thìnhóm –SH của papain được phục hồi và làm tăng hoạt tính papain Để thuđược hoạt tính cao nhất thì thích hợp nhất là dùng hỗn hợp cysteine và EDTA,trong đó cysteine đóng vai trò là chất hoạt hóa papain, còn EDTA đóng vaitrò chất liên kết tạo phức với ion kim loại nặng có trong nhựa đu đủ

 Bất hoạt: [2]

- Papain bị kìm hãm (ức chế bất thuận nghịch) bởi các chất oxi hoánhư: O2, O3, H2O2, iodur acetate, cystine và các hợp chất disulfur khác Cácchất này phản ứng với nhóm –SH ở trung tâm hoạt động của papain và làmphá vỡ cấu trúc tâm hoạt động của nó

- Papain bị bất hoạt thuận nghịch bởi không khí, cysteine ở nồng độthấp

- Papain tác dụng với chloromethyl cetone của Phe và Lys thì mất hoàntoàn hoạt tính Tuy nhiên, papain lại rất bền với các tác nhân biến tính là dungmôi hữu cơ (độ quay cực của papain hầu như không biến đổi trong ethanol70% hay urea 6 - 8 M/l)

 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính papain:

Nhiệt độ:

Papain là enzyme chịu được nhiệt độ tương đối cao Ở dạng nhựa khôpapain không bị biến tính trong 3 giờ ở 100oC Ở dạng dung dịch, papain bịmất hoạt tính sau 30 phút ở 82.5oC và nếu tăng nhiệt độ trên 100oC thì sẽ mấthoàn toàn hoạt tính kể cả khi thêm lượng lớn chất hoạt hóa vào dung dịch vìcấu trúc tâm hoạt động của enzyme đã bị phá hủy hoàn toàn

Papain đã được tinh sạch và ở trạng thái tinh thể có độ bền nhiệt thấphơn papain ở trong mủ nhựa, vì trong mủ nhựa còn chứa các protein khác cótác dụng bảo vệ nó Papain trong dung dịch NaCl giữ ở 4oC bền trong nhiềutháng Trong dung dịch dẫn xuất thủy ngân, papain cũng không mất hoạt tínhtrong nhiều tháng, trong khi enzyme mất hoạt tính mỗi ngày 1-2% do sự tựphân hoặc oxi hoá Papain dạng ổn định (có cấu trúc không gian ổn định) ởtrạng thái khô có thể chịu được nhiệt độ sấy ở 115oC trong 2 giờ mà hoạt tínhvẫn duy trì được 90% [2]

pH

Papain hoạt động trong khoảng pH tương đối rộng từ 4.5 – 8.5 nhưnglại dễ iến tính trong môi trường acid có pH < 4.5 hoặc trong môi trường kiềmmạnh có pH > 12 Tuỳ thuộc bản chất của cơ chất mà pH tối ưu của papainkhác nhau Papain dạng ổn định có thể chịu được pH = 1.5 và pH = 8.5 trong

90 phút.[2]

Dung môi

Papain không thay đổi độ quay quang học trong methanol 70%, không

bị giảm hoạt tính trong dimethylsulfoxide chứa 20% dung môi hữu cơ và urea8M, nhưng trong dung dịch TCA 10% papain bị biến đổi bất thuận nghịch [2]

 Một số phương pháp lấy enzyme papain từ cây đu đủ [5]

- Có thể sản xuất papain thô bằng cách sấy khô nhựa trực tiếp lấy từ quả

đu đủ Sản phẩm thô này có hoạt lực thấp Dạng sản phẩm sạch hơn thu đượcnhờ sự kết tủa phân đoạn bằng dung môi hoặc muối trung tính enzim đã đượchoạt hoá, sau đó sấy khô ở nhiệt độ thấp

- Để lấy nhựa mủ (papain thô) dùng dao bén sắc rạch dọc quả đu đủxanh, cho mủ chảy vào bát, sau đó phơi nắng hoặc sấy khô ở 40-60ºC Tinhchế papain bằng cách hòa tan papain thô vào nước thành dung dịch, sau đó rótvào cồn 90º, papain kết tủa, lọc, sấy

- Ngoài ra ta cũng có thể thu thập và chế biến enzyme phân giải papain

từ trái đu đủ với số lượng lớn bằng cách cắt quả đu đủ xanh còn nguyên vỏhoặc phần vỏ xanh bên ngoài thành các miếng nhỏ có kích thước thích hợp vàsấy khô dưới ánh nắng mặt trời hoặc bằng nhiệt tạo thành nguyên liệu thô [9]

1.2.1.2 Bromelin

 Đặc điểm hình thái cây dứa

Dứa, thơm hay khóm (có nơi gọi là khớm), tên khoa học Ananas comosus, là một loại quả nhiệt đới Dứa là cây bản địa của Paraguay và miền

nam Brasil

Quả dứa thực ra là trục của bông hoa và các lá bắc mọng nước tụ hợplại Còn quả thật là các "mắt dứa" Quả dứa được ăn tươi hoặc đóng hộp dướidạng khoanh, miếng hoặc đồ hộp nước dứa, hoặc nước quả hỗn hợp

Dứa có các lá gai mọc thành cụm hình hoa thị Các lá dài và có hìnhdạng giống mũi mác và có mép lá với răng cưa hay gai Hoa mọc từ phầntrung tâm của cụm lá hình hoa thị, mỗi hoa có các đài hoa riêng của nó

Chúng mọc thành cụm hình đầu rắn chắc trên thân cây ngắn và mập Các đàihoa trở thành mập và chứa nhiều nước và phát triển thành một dạng phức hợpđược biết đến như là quả dứa (quả giả), mọc ở phía trên cụm lá hình hoa thị.[1]

 Định nghĩa – Cấu tạo

- Bromelin là một enzym có tác dụng thủy phân protein thành các acidamin

- Bromelin thủy phân protid rất mạnh

- Bromelin được chiết xuất từ dứa

- Dạng độc lập của enzyme này lần đầu tiên được tách ra năm 1891 bởiVicente Marcano, năm 1892 được trích ly dạng đầy đủ

 Cấu trúc không gian

Murachi và Buán phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelin và nhận thấycách sắp xếp amino acid trong phân tử bromelin như sau:

Ser – Val – Lys – Asn – Gln – Asn – Pro – Cys – Gly – Ala – Cys – Tryp

- Gly - Cys - Lys –

Bromelin là một protease trong trung tâm hoạt động có chứa cysteine vàhai sợi polypeptide liên kết với nhâu bằng cầu nối –S-S- Phân tử có dạng hìnhcầu do sắp xếp phức tạp

Trong phân tử bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryt có vai trò chủyếu trong hoạt tính xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite.Ngoài ra, trong phân tử còn có các ion Zn2 có lễ có vai trò trong duy trì cấutrúc không gian của enzyme

 Hoạt tính phân giải của bromelin

Bromelin có ba hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase.Bromelin thân có nhiều cơ chất tự nhiên và có thể thủy phân cả cơ chất tự [2]

 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelin

 Ảnh hưởng bởi cơ chất

Trên những loại cơ chất khác nhau, bromelin có hoạt tính khác nhau.Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải của bromelin mạnh hơnpapain 4 lần, nếu cơ chất là casein thì hoạt tính của bromelin tương tự nhưpapain Đối với các cơ chất tổng hợp như BAA , BAEE thì khả năng thủy giảicủa bromelin yếu hơn papain.[2]

 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ của phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố: thờigian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnh hưởng đếnhoạt tính enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại của enzyme

Ở dịch chiết quả (pH=3.5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60oC thì bromelinvẫn còn hoạt tính nhưng bromelin tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ Ở 5oC

pH = 4-10 thì enzyme vẫn giữ được hoạt tính tối đa trên casein trong vòng 24giờ Ở 55oC, pH = 6.1 thì enzyme bị mất 50% hoạt tính trong vòng 20 phút.Quá trình đông khô làm mất 27% hoạt tính

 Ảnh hưởng của độ pH

pH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme pHtối thích của bromelin không ổn định mà tùy thuộc nhiệt độ, thời gian phảnứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch cuae enzyme, bản chất dụngdịch đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt

Khi thu nhận bromelin thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là ammonisulfate hoặc molypdenum carbonate thì enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH 4.8

và ổn định ở pH 8.0 ổn định ở pH = 3.5 - 5.6 ở nhiệt độ 63oC Enzymebromelin đã tinh sạch chỉ còn lại 60-70% hoạt tính Bromelin có biên độ pHrộng nhưng pH tối thích của enzyme là 5-8 thùy thuộc vào cơ chất [2]

 Ảnh hưởng bởi các ion kim loại

Các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme do chúngthường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme Muối thủy ngân có ảnhhưởng quan trọng đến hoạt tính của bromelin và mức độ kìm hãm thay đổinồng độ của muối.

Ngoài ra, còn có những chất có tác động ức chế bromelin do chúng kếthợp với nhóm SH của trung tâm phân ứng của enzyme [2]

 Phương pháp lấy enzyme Bromelin từ cây dứa [2]

Enzyme bromelin có thể thu được trong thân, trong phần thịt quả vàtrong chồi quả Việc thu nhận và tinh sạch bromelin có thể thực hiện theo sơ

đồ sau:

Bã Quả/thân/chồi dứa Xay nhuyễn Dịch lọc Ly tâm

Lọc Dịc ly tâm Kết tủa

Tinh sạch Sấy khô Chế phẩm bromelin thô

Hình 1.3 Quy trình tổng quát thu nhận và tinh sạch enzyme bromelin[2]

Quả dứa hoặc thân được xay nhuyễn, vắt kỹ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc,

ly tâm dịch lọc với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất xơ sẽthu được dịch chiết có chứa bromelin

Khi sử dụng phương pháp siêu lọc để tinh sạch enzyme bromelin thì cáchợp chất pectin ở trong dịch chiết quả sẽ làm tăng độ nhớt của dịch lọc Cácnhà khoa học S Sathivel, K Niranjan và W Prinnyawiwatkul đã tìm raphương pháp đồng hóa nguyên liệu dưới điều kiện áp suất cao thì có thể phá

vỡ tế bào mô dứa, giảm độ nhớt của dịch chiết, phóng thích các enzyme nộibào mà không làm biến tính chúng [2]

1.2.2 Động vật ( pepsin)

Sản phẩm

enzyme

tinh khiết

1.2.2.1 Cấu tạo và đặc tính [2]

Pepsin hoạt động trong dịch vị của động vật có vú, chim, bò sát và cá Ởheo, pepsin tập trung chủ yếu ở phần đáy dạ dày Pepsin thô là một hỗn hợpcủa pepsin, gelatinase, cathepsin và Brucke pepsin Pepsin heo thô chứa mộtpepsin chính A, pepsin phụB, C, D và gastricsin

Pepsin là một enzyme quan trọng của tuyến tiêu hóa động vật, thuộcnhóm enzyme thủy phân (hydrolase) Số phân loại: E.C.3.4.4.1, pepsin có tên

hệ thống là peptide-peptidohydrolase

 Cấu tạo

Pepsin là một sợi polypeptide đơn giản, có thể cuộn lại làm thành hìnhcầu, tỷ lệ bán trục = 3 - 3.6, rất ít xoắn dạng cấu trúc bậc hai, cấu trúc bậc 4cũng gồm 4 tiểu phần

Pepsin là một protein vững chắc bởi các mối liên kết hydro,hydrophobic, liên kết điện tử và S-S Chỉ có 3 liên kết S-S trong phân tửpepsin, người ta nhận xét ít nhất một trong những liên kết đó không cần thiếtcho hoạt động enzyme Liên kết hydro có thể không đóng vai trò quan trọngtrong việc ổn định phân tử Pepsin gồm một mạch polypeptide hợp thành bởi

329 amino acid, đầu C là alanin và đầu N là isoleucin Nhóm N cuối củapepsin là chuỗi liên kết peptide gồm sáu amino acid như sau:

Leu - Gly - Asp - His - Glu Thứ tự đầu cuối C của pepsin đã được xác định bởi thứ tự là:

Val - Leu - Ala Nói chung, việc nghiên cứu cấu trúc của pepsin cho đến nay vẫn cònnhiều vấn đề cần giải quyết Về cấu trúc bậc 1, chỉ mới có phần đầu C và N,cũng như phần của phân tử nằm kề các amino acid kiềm tính (Arg, Lys) vàgốc phosphoserin là được nghiên cứu chi tiết ) với cấu trúc như sau:

Glu - Ala - Thr - SerP - Glu - Glu - Leu

Thứ tự trong phần kề cận gốc phosphoserin của pepsin đã được xác địnhbằng phương pháp sắc ký những phosphopeptide sinh ra từ sự thủy phân acid,được biết đến là:

Thr - Ser - Phos - Glu Trong phân tử pepsin có chứa S tạo thành ba cầu disulfur và một gốcacid phosphoric kết hợp với nhóm hydroxyl của một trong các gốc serin

Sự hiểu biết về cấu trúc tâm hoạt động của pepsin cũng còn rất nhiềuhạn chế Trung tâm hoạt động của pepsin gồm một hoặc hai nhóm carboxylcủa acid glutamic, một nhân thơm (phenol) của tyrosin [2]

 Đặc tính:

Chế phẩm pepsin (dược phẩm) tồn tại ở dạng bột vô định hình, trắnghay vàng nhạt hay mảnh nhỏ, trong hay hơi đục, mùi đặc biệt giống mùi nướcthịt, vị hơi chưa, nếu thêm lactose, glucose hay saccharose thì có vị ngọt

Pepsin dễ hút ẩm, tan trong nước cho một dung dịch đục lờ, không tantrong cồn 95O, ester, chloroform Pepsin ở cả hai dạng: kết tinh và thô (pepsinthô là hỗn hợp của pepsin, gelatin và cathesin)

Điểm đẳng điện của pepsin ở gần pH = 1 Pepsin thủy phân proteintrong vùng acid khá rộng, từ 1 - 4 pH hoạt động tối ưu của pepsin thay đổitùy theo bản chất và trạng thái của cơ chất, thường pH trong khoảng từ 1.9 –2.2 Với cơ chất là protein biến tính, pH tối ưu của hoạt tính xúc tác củapepsin hơi chuyển vùng có pH kiềm so với protein nguyên thể Điều đó có thể

do sự biến tính của protein đã làm thay đổi tính chất của liên kết thủy phân

Pepsin bền nhất ở pH trong khoảng từ 4-5, nhưng trong vùng pH này,hoạt lực của enzyme có phần thay đổi giảm đi Từ pH = 5.5 trở lên, pepsinkhông hoạt động

Chế phẩm pepsin thô có thể giữ được trong nhiều năm ở nhiệt độ 0 - 4

OC Pepsin dạng dung dịch không bền ở pH = 6 Pepsin ở trạng thái khô khá

bền, ngay cả trong điều kiện môi trường nhiệt độ thường, dung dịch pepsinkém bền nhất là ở pH quá thấp Khi đó, xảy ra hiện tượng tự tiêu của enzyme,kèm theo sự tạo thành các phân tử nhỏ , vì pepsin là một protease hoạt độngmạnh trong môi trường khá acid [2]

1.2.2.2 Sự hoạt hóa pepsinogen:

Pepsin được tiết ra dưới dạng tiền pepsin, tức là pepsinogen bất hoạt.Khi tiếp xúc với môi trường acid tự nhiên của bao tử hoặc chính pepsin,pepsinogen sẽ được hoạt hóa thành pepsin

Quá trình hoạt hóa pepsinogen là quá trình thủy phân liên kết peptidegiữa acid glutamic 41 và isoleucin 42, giải phóng peptide kìm hãm Thànhphần amino acid của peptide kìm hãm này tương ứng với 41 amino acid củapepsinogen và phản ứng được xúc tác bởi ion H và cũng chính bởi pepsin

Pepsin được tạo thành lại tiếp tục xúc tác quá trình giải phóng peptidekìm hãm, chuyển pepsinogen thành pepsin hoạt động Vì vậy, quá trình nàymang tính chất của một quá trình tự xúc tác Sự hoạt hóa pepsinogen chỉ xảy

ra trong môi trường acid có pH < 5.6 Khi pH > 5.6 peptide kìm hãm lại có thểkết hợp thuận nghịch với pepsin tạo thành phức hợp không hoạt động [2]

1.2.2.3 Sự tự tiêu của pepsin:

Pepsin vừa là protein, vừa là enzyme phân giải protein nên có khả năngphân giải chính nó Sự tự tiêu đã được coi là nguyên nhân của tính khôngđồng nhất khi điện di nhiều chế phẩm pepsin Sự tự tiêu của pepsin thườngxảy ra trong trường hợp pepsin ở dạng dung dịch, pH thấp, nhiệt độ thíchhợp, tạo ra nhiều thành phần có phân tử lượng nhỏ hơn pepsin, giảm lượngtyrosin và chỉ thành phần nào có đặc tính của pepsin gốc thì mới hoạt động.[2]

1.2.2.4 Hoạt động xúc tác của pepsin [2]

Pepsin là một protease thuộc nhóm hydrolase có khả năng phân cắt cácliên kết peptide của protein Pepsin tác động lên hầu hết các protein tự nhiên

và có khả năng phân cắt tới 30% liên kết peptide có trong phân tử protein tạothành chủ yếu các peptide chứa từ 5 - 8 amino acid

Pepsin không có khả năng phân cắt triệt để protein thành các amino acidriêng lẻ, mà chỉ cắt khoảng 15% nối liên kết peptide của protein, tạo sản phẩmpepton có trọng lượng phân tử nhỏ Đôi khi pepsin phân cắt protein tạo thànhnhững dạng peptide đơn giản hơn như oligo protein và một số amino acid tự

do như leucine, alanine, tyrosine Nhưng đây không phải trường hợp thôngthường Pepsin chỉ thủy phân những liên kết peptide, nó không phải là mộtesterase và không tác dụng vào những mối liên kết amid Pepsin phân cắt dễdàng các protein tan trong nước như albumin, hemoglobin, mystin, globulin,caxin Còn những protein nhưng không tan hay các nucleoprotein, proteinhình sợi như keratin, neucin, glagen, gluten, các nuclepprotein…Pepsin phâncắt khó hay không cắt được Nó sẽ không cắt ở liên kết valine, alanine vàglycine Pepsin bị ức chế bởi cơ chất dạng epoxides

1.2.2.5 Những yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của pepsin [2]

 pH

Pepsin là một protease acid điển hình, hoạt động ở vùng pH acid từ1→4, pH thích hợp cho pepsin khoảng 1.5 → 2.4 Đối với mỗi cơ chất, pHthích hợp có thể thay đổi Pepsin bền vững ở vùng pH rất acid, nó có độ bềntối đa ở pH = 4→5, nhưng trong vùng pH này, hoạt lực của enzyme rất thấp

Từ pH > 5.5 pepsin không hoạt động vì có sự biến tính của proteinenzyme mà cụ thể là phá vỡ một số liên kết hydro trong phân tử, làm cho cấutrúc của enzyme bị biến đổi Ở pH quá thấp thì xảy ra hiện tượng tự phân củapepsin Pepsin đã bị vô hoạt trong môi trường kiềm, có thể phục hồi hoạt tínhmột phần khi đưa pH về vùng thích hợp với nó Pepsin có điểm đẳng điện pIkhoảng 1-1.4

 Nhiệt độ

Pepsin chịu ảnh hưởng của nhiệt độ giống như những enzyme khác nóichung Pepsin cũng là một enzyme hoạt động ở nhiệt độ khá cao Nhiệt độhoạt động tối ưu cho pepsin khoảng 40 - 50OC Ở 70OC, pepsin mất khảnăng tiêu đạm

Tốc độ xúc tác phản ứng thủy phân của pepsin không cao bằng cácprotease khác nhưng độ bền nhiệt của pepsin cao hơn, nhất là khi cơ chất cómặt một số ion kim loại đặc biệt như Ca2 [2]

 Muối và các dung môi hữu cơ

Tùy theo bản chất hóa học của muối mà ảnh hưởng ít nhiều đến hoạtđộng xúc tác của pepsin Các chất hữu cơ kiềm hay dung dịch muối kiềm nhưNaHCO3 làm chậm sự pepton hóa của pepsin Trong sự pepton hóa, HCl làacid gây ra sự thủy phân mạnh nhất, kế đó là HNO3, HBr, H2SO4, H3PO4,các acid lactic, formic gây tác động kém hơn

Các muối kim loại nặng ở nồng độ thấp vẫn có thể gây kết tủa và làmbiến tính enzyme Nguyên nhân là do muối kim loại nặng tạo nên các phức hệvới các nhóm quan trọng của protein - enzyme, làm thay đổi cấu trúc proteindẫn tới sự biến tính của enzyme

Các dung môi hữu cơ ít phân cực, cũng như các chất hoạt động bề mặt

có tác dụng phá vỡ cấu trúc bậc ba và làm tăng độ xoắn của mạch polypeptidetrong phân tử pepsin , do đó làm giảm hoạt tính của pepsin.[2]

 Chất sát khuẩn: Các chất sát như HCN, salisilic acid, cloroform…Với

liều lượng nhỏ thì không ảnh hưởng đáng kể đến pepsin Nhưng khi với liềulượng cao, chúng làm đáng kể hoạt tính pepsin.[2]

 Các chất kìm hãm: Tất cả các chất gây biến tính protein đều là những

chất kìm hãm không đặc hiệu của enzyme nói chung và pepsin nói riêng.Ngoài ra, có nhiều chất không làm biến tính protein enzyme nhưng vẫn làm

giảm hoạt độ xúc tác do cơ chế kìm hãm cạnh tranh và kìm hãm không cạnhtranh…[2]

1.2.2.6 Các phương pháp thu nhận pepsin [2]

của quá trình chiết tách từ màng nhầy dạ dày là sự phối hợp của ba quá trình:phá vỡ tế bào, hoạt hóa và chiết tách enzyme

Sản xuất pepsin hiện nay có hai phương pháp là phương pháp chiết và

tự phân, đều dựa trên nguyên tắc: pepsin được giải phóng từ màng nhầy dạdày động vật bằng cách chiết trong dung dịch acid loãng

-Phương pháp 1: Phương pháp chiết

Dạ dày rửa sạch Tách màng nhày, nghiền, ngâm vào nước có 5%butanol hay glycerin, có cloroform để tránh nhiễm khuẩn sau chế hóa bằngetanol để pepsin kết tủa Thời gian ngâm: 48-72 giờ, nhiệt độ thường

-Phương pháp 2: phương pháp tự phân

Niêm mạc dạ dày bảo quản ở nhiệt độ lạnh hay vừa tách ra khỏi heomới mổ, xay nhỏ, dùng HCl hay H2SO4, H3PO4 với nồng độ thích hợp đểchiết và hoạt hóa pepsinogen thành pepsin Thời gian tự phân: 48 giờ ở 40-42

OC

 Các phương pháp thu pepsin thô từ dịch chiết

 Phương pháp tủa bằng muối

Các muối trung tính ở nồng độ cao có thể kết tủa thuận nghịch cácenzyme mà không gây biến tính hay giảm hoạt tính enzyme Các protein khácnhau sẽ có tính hòa tan khác nhau trong dung dịch Do đó khi tăng dần nồngmuối, các protein riêng biệt sẽ kết tủa theo các trình tự khác nhau

Người ta thường dùng các muối trung tính khác nhau như (NH4)2SO4,NaCl…ở nồng độ gần bão hòa để làm tủa pepsin Ly tâm lấy tủa, trộn tủa với

tá dược như lactose, glucose hay tinh bột là các chất phụ gia có tính ổn định

enzyme, đồng thời rút ngắn thời gian sấy, hạn chế sự giảm hoạt tính enzymetrong khi sấy Thường sấy ở nhiệt độ ≤ 45OC hay sấy kèm chân không.

 Phương pháp tủa bằng cồn hay dung môi hữu cơ

Dung dịch pepsin thô được cô dưới áp suất thấp, ở nhiệt độ ≤ 45OC đếnkhi chỉ còn lại 1/8 so với thể tích ban đầu thì đem tủa với cồn 95Ohay aceton( tỷ lệ 1:3) Sau đó ly tâm, sấy ở nhiệt ≤ 45OC Thường phương pháp tủa cầnđược tiến hành ở nhiệt độ thấp 0 - 5OC để đảm báo hoạt tính của enzyme

Phương pháp hấp thụ: người ta có thể dùng một số chất hấp phụ đặchiệu để hấp phụ enzyme Cơ sở của phương pháp này là cho enzyme hấp thụchọn lọc lên các chất hấp phụ đặc biệtđể tách enzyme ra khỏi chất hấp phụ vàthu nhận enzyme mong muốn

Phương pháp cô dưới áp suất thấp để được dung dịch pepsin đậm đặc:với phương pháp này người ta phải tiến hành ở nhiệt độ 45OC, áp suất thấp

để enzyme không bị giảm hoạt tính, tạo dung dịch pepsin thô đậm đặc, sau đóđược trộn với tá dược như lactose, tinh bột, sấy nhẹ tạo bột khô

1.2.3 Vi sinh vật

1.2.3.1 Nguồn thu nhận enzym protease

Nhiều VSV có khả năng tổng hợp mạnh protease Các enzym này có thể

ở trong tế bào hoặc được tiết vào môi trường nuôi cấy Một số protease nộibào đã sản xuất theo quy mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trongnhiều ngành công nghiệp ,trong nông nghiệp và y học

- Nguồn vi sinh vật thu nhận enzyme protease chủ yếu gồm: vi khuẩn,nấm mốc, xạ khuẩn

 Vi khuẩn [2]

Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng 500 tấn,chiếm 59% lượng enzyme được sử dụng

Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loạiendopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hailoại trên, do đó Protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao Chúng cókhả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein

Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh Protease là Bacillus subtilis, B.mesentericus, B.thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium Trong đó, B.subtilis S5 có khả năng tổng hợp protease mạnh

nhất Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng

pH trung tính và kiềm yếu

Các Protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH5-8) và có khả năng chịu nhiệt thấp Các protease trung tính tạo ra dịch thủyphân protein thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trịdinh dưỡng Chúng còn có khả năng ái lực cao đối với các acid amin ưa béo

và thơm và được sinh ra nhiều bởi B.subtilis, B.mesentericus, B thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium [2].

Protease của Bacillus ưa kiềm có điểm đẳng điện bằng 11, khối lượng

phân tử từ 20.000-30.000dalton Ổn định trong khoảng pH 6 - 12 và hoạt độngtrong khoảng pH rộng 7 - 12 [2]

 Nấm mốc

Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được

ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như các chủng: Aspergillus oryzae, A terricola, A fumigatus, A saitoi, Penicilliumchysogenum)…Các loại nấm

mốc này có khả năng tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính.Nấm mốc đen tổng hợp chủ yếu các protease acid, có khả năng thủy phânprotein ở pH 2.5-3 [4]

Các chế phẩm xạ khuẩn được biết nhiều là pronase (Nhật) được tách

chiết từ S.grieus, enzyme này có đặc tính đặc hiệu rộng, có khả năng thủy

phân tới 90% liên kết peptide của nhiều protein thành acid amin

Từ S fradiae cũng có thể tách chiết được keratinase thủy phân karetin.

Ở Mỹ, CP được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da Protease từ

Hình 1.5 Bào tử Aspergillus oryzae

Hình 1.6 Xạ khuẩn

S fradiae cũng có hoạt tính elastase cao, do đó chúng được dùng trong công

s Bac.thermoacidurans Bac.thermmoproteoly ticus

Bac.brevis Bac.licheniformis Bac.mesenlericus Bac.megaterium Bac.cerus

Bac.pumilus Cl.perfringens Cl.sporogens .vv

Protease trung tính, protease kiềm (subtilizin)

ColagenaseColagenaseProtease trung tính, Protease kiềm

Xạ

khuẩn

Str.griseus Str.rimosus Strfradiae Str.faeca is Str.reetus

Dùng trong kỹ nghệ ở Nhật, Mỹ, gồm ít nhất là 11 enzyme với cơ chất procolagen phân giải 70%.Đến amino acid có 5 protease,haiPeptidase (lơxinamino_peptidase,

var.pro-teolyticus cacboxypeptidase), hai protease:

protease-serinNấm

mốc

Asp.oryzae Asp.satoi Asp.awamori Asp.niegr Asp.shirousami Asp.fumigatus Asp.tericola Pen.chrysogenum

……vv

Protease-kim loại protease serin,có

ba loại: Protease acid, protease tung tính, Protease kiềm Protease acid (aspergilopepti-dase A)

Protease acidHai Protease acidProtease acidHai Protease: Protease acid và Protease kiềm

Protease acid có tác dụng làm đông sữa

Protease acid có tác dụng làm đông sữa đã được dùng ở Nhật để thay thế cho rennin

1.2.3.2 Đặc điểm và tính chất của protease vi sinh vật

Các công trình nghiên cứu protease vi sinh vật ngày càng nhiều Cáckết quả nghiên cứu cho thấy ngay cả các protease của cùng một nòi vi sinh vậtcũng có thể khác nhau về nhiều tính chất Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pHhoạt đông thích hợp,…Các nhà khoa học đã phân loại các proteinase vi sinhvật thành 4 nhóm như sau: Protease-serine, protease-thiol, protease-kim loại,protease-acid

Một số tác giả khác chia protease ra 3 nhóm, dựa vào pH hoạt động củachúng bao gồm: protease-acid, protease trung tính, protease kiềm

Trong bốn nhóm protease kể trên, các protease-serine và protease-thiol

có khả năng phân giải liên kết este và liên kết amide của các dẫn xuất acid củaamino acid Ngược lại các protease kim loại, protease acid thường không cóhoạt tính esterase và amidase đối với các dẫn xuất của amino acid Nhiềuprotease ngoại bào của vi sinh vật đã được nghiên cứu tương đối kỹ về cấu tạophân tử, một số tính chất hóa lý và cơ chế tác dụng Kết quả nghiên cứu chothấy trọng lượng phân tử của các enzyme này tương đối bé nhất là protease-serine

Các protease-serine có trọng lượng vào khoảng 20.000-27.000dalton.Tuy nhiên, cũng có một số protease-serine có trọng lượng phân tử lớn

hơn như các enzyme của Penicillium cyoneo-fulvum (44.000) Trọng lượng

phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease-serine (vào khoảng33.800-48.400) Protease-thiol và nhiều loại protease-acid cũng có trọnglượng phân tử vào khoảng 30.000-40.000

Nói chung, tính đặc hiệu của các protease không chỉ thể hiện đối vớigốc amino acid chứa nhóm -CO- hoặc nhóm -NH- của liên kết bị phân giải(đặc hiệu sơ cấp) mà còn cả đối với các gốc amino acid ở xa liên kết bị phângiải (đặc hiệu thứ cấp hoặc tương tác thứ cấp) Các enzyme cùng một nhóm,

có tính đặc hiệu giống nhau cũng chịu ảnh giống nhau của tương tác thứ cấp.Các enzyme có tính đặc hiệu nghiêm ngặt thường chịu ảnh hưởng của tươngtác thứ cấp ít hơn và ngược lại Chẳng hạn các protease-serine giống trypsinecủa Streptomyces, protease kim loại trung tính,…thường ít chịu ảnh hưởngcủa tương tác thứ cấp khi chúng tác dụng với cơ chất phân tử bé cũng như cácpeptit phân tử lớn hoặc protein Ngược lại, các protease-serine kiềm hoặcprotease acid chiụ ảnh hưởng lớn của tương tác thứ cấp mặc dù các enzymenày có tính đặc hiệu nghiêm ngặt đối với cơ chất phân tử bé Khi tác dụng trên

các cơ chất phân tử lớn tính đặc hiệu của các enzyme này cũng đựơc xác địnhbởi tương tác thứ cấp

Các protease vi sinh vật mới được nghiên cứu từ năm 1960 Những kếtquả đạt được trong lĩnh vực nghiên cứu protease vi sinh vật đã góp phần mởrộng quy mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng protease trong thực tế

1.2.3.3 Các phương pháp thu nhận enzym protease [2]

Để thu nhận chế phẩm protease từ VSV cũng như các enzym khác cóthể dùng hai phương pháp nuôi cấy: phương pháp bề mặt (phương pháp nổi)

và phương pháp bề sâu (phương pháp chìm) Phương pháp bề mặt thườngdùng để nuôi cấy nấm sợi, phương pháp bề sâu thường dùng đối với vi khuẩn

và nấm sợi

Nhiều nhà nghiên cứu cho rằng, sử dụng phương pháp bề mặt kinh tếhơn.Vì vậy các cơ sở sản xuất enzyme mới xây dựng thường dùng phươngpháp này Hiện nay phương pháp bề mặt đượ sử dụng rộng rãi ở Nhật Khi sửdụng phương pháp bề sâu thường dễ bị nhiễm hơn phương pháp bề mặt

Ở phương pháp bề mặt, người ta thường sử dụng môi trường có độ ẩm

và giữ ở nhiệt độ không đổi Trong suốt quá trình nuôi, độ ẩm của môi trườngvào khoảng 50-55%w Nhiệt độ nuôi cấy tùy thuộc vào VSV, đối với nấm sợitrong thời gian đầu từ 10 -18 giờ giữ ở 29 - 31 OC, sau khi có mixen thì giảmnhiệt xuống còn 24 - 25 OC Đối với vi khuẩn, nhiệt độ thích hợp là 37 - 38 O

C

 Nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt

Môi trường thường dùng là cám, có pH từ 5.6 - 6.2 (đối với nấm sợi)hoặc từ 6.2 - 7.29 đối với vi khuẩn) Cho môi trường vào những khay lớn đểnuôi cấy Thời gian nuôi cấy thay đổi tùy vào vi sinh vật, do đó đối với mỗi visinh vật cần lựa chọn thời gian thích hợp nhất Đối với đa số nấm sợi mesofil

có thể nuôi từ 32 - 42 giờ Sau đó dùng nước hay dung dịch nuôi để chiết rút