BÁO CÁO THỰC HÀNH MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA

1. KHẢ NĂNG CHỊU MẶN • Nhằm xác định khả năng chịu mặn của vi sinh vật. • Môi trường: NA: Nutrient + Agar + Nacl 8.5% • Kết quả: những vi sinh vật có khả năng chịu mặn sẽ tồn tại trong môi trường, ngược lại sẽ chết. 2. THỬ NGHIỆM BẰNG UREASE NGUYÊN TẮC • Xác định khả năng của vi sinh vật tổng hợp enzyme urease xúc tác sự thủy phân urea tạo ra 2 nguyên tử NH3 và CO2 làm tăng pH của môi trường và có thể được theo dõi qua sự thay đổi màu của chất chỉ thị pH. • Thử nghiệm urease là đặc trưng cho các loài Proteus spp. Và thường được dùng để phân biệt các dạng Proteus với các thành viên khác của Enterobacteriaceae. • Cơ sở sinh hóa: (NH2)2CO + H2O → 2NH3 + CO2 → tăng pH môi trường → đỏ phenol. MÔI TRƯỜNG Thử nghiệm Urease được thực hiện trên 2 môi trường: • Môi trường urea lỏng RustigianStuart’s Urease Broth • Môi trường Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng) KẾT QUẢ: Môi trường urea lỏng RustigianStuart’s Urease Broth: • Dương tính (+): Màu đỏ tím trong khắp môi trường • Âm tính () : Môi trường không có sự đổi màu (màu vàng cam) Môi trường Christensen Urea: Dương tính (+): Màu đỏ tím trên bề mặt môi trường thạch nghiêng • + + + + : toàn bộ thạch đổi màu • + + + : chỉ mặt thạch đổi màu • + : mặt thạch ở đỉnh đổi màu, phần môi trường còn lại không đổi màu (+) nhanh: màu đổi trong vòng 16 giờ (+) chậm : màu đổi trong vòng 24 giờ đến 6 ngày ủ hoặc lâu hơn. 3. THỬ NGHIỆM GELATINASE MỤC ĐÍCH Thử nghiệm khả năng phân giải gelatin bởi gelatinase CƠ SỞ SINH HÓA Gelatine polypeptide + acid amin Gelatine trong môi trường dinh dưỡng → môi trường đông đặc VSV phân hủy gelatine → môi trường lỏng.  Đối chứng dương: Aeromonas hydrophila  Đối chứng âm: E.Coli  Môi trường sử dụng: Nutrient Gelatine  Dạng ống nghiệm thạch sâu  Cấy vi sinh vật và ủ ở nhiệt độ phòng. KẾT QUẢ:  Đọc kết quả (+): môi trường tan chảy () : môi trường không tan chảy

BÁO CÁO THỰC HÀNH

MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA

1 KHẢ NĂNG CHỊU MẶN

• Nhằm xác định khả năng chịu mặn của vi sinh vật.

• Môi trường: NA: Nutrient + Agar + Nacl 8.5%

• Kết quả: những vi sinh vật có khả năng chịu mặn sẽ tồn tại trong môi trường, ngược lại sẽ chết.

2 THỬ NGHIỆM BẰNG UREASE

NGUYÊN TẮC

• Xác định khả năng của vi sinh vật tổng hợp enzyme urease xúc tác sự thủy phân urea tạo ra 2 nguyên tử NH 3 và CO 2 làm tăng pH của môi trường và có thể được theo dõi qua sự thay đổi màu của chất chỉ thị pH

• Thử nghiệm urease là đặc trưng cho các loài Proteus spp Và thường được dùng để phân biệt các dạng Proteus với các thành viên khác của Enterobacteriaceae.

• Cơ sở sinh hóa: (NH 2 ) 2 CO + H 2 O → 2NH 3 + CO 2 → tăng pH môi trường → đỏ phenol.

MÔI TRƯỜNG

Thử nghiệm Urease được thực hiện trên 2 môi trường:

• Môi trường urea lỏng Rustigian-Stuart’s Urease Broth

• Môi trường Christensen Urea (môi trường thạch nghiêng)

KẾT QUẢ:

Môi trường urea lỏng Rustigian-Stuart’s Urease Broth:

• Dương tính (+): Màu đỏ tím trong khắp môi trường

• Âm tính (-) : Môi trường không có sự đổi màu (màu vàng cam)

Môi trường Christensen Urea:

Dương tính (+): Màu đỏ tím trên bề mặt môi trường thạch nghiêng

• + + + + : toàn bộ thạch đổi màu

• + + + : chỉ mặt thạch đổi màu

• + : mặt thạch ở đỉnh đổi màu, phần môi trường còn lại không đổi màu

(+) nhanh: màu đổi trong vòng 1-6 giờ

(+) chậm : màu đổi trong vòng 24 giờ đến 6 ngày ủ hoặc lâu hơn.

3 THỬ NGHIỆM GELATINASE

MỤC ĐÍCH

Thử nghiệm khả năng phân giải gelatin bởi gelatinase

CƠ SỞ SINH HÓA

Gelatine trong môi trường dinh dưỡng → môi trường đông đặc

VSV phân hủy gelatine → môi trường lỏng.

 Đối chứng âm: E.Coli

 Môi trường sử dụng: Nutrient Gelatine

 Dạng ống nghiệm thạch sâu

 Cấy vi sinh vật và ủ ở nhiệt độ phòng.

KẾT QUẢ:

 Đọc kết quả

(+): môi trường tan chảy

(-) : môi trường không tan chảy

4 THỬ NGHIỆM AMYLASE

MỤC ĐÍCH

Phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme amylase

Dùng thuốc thử I 2 để nhận biết Nếu trong môi trường thử nghiệm, vi sinh vật có hệ enzyme amylase, amylase sẽ thủy phân tinh bột thành những cầu tử nhỏ hơn, khi cho I 2 vào, dung dịch có màu tím xanh (+).

5 THỬ NGHIỆM KIA/TSI

gelatinase

MỤC ĐÍCH

Phát hiện khả năng:

 sử dụng các nguồn cacbonhydrate

 sinh H 2 S

 tạo hơi (gas)

MÔI TRƯỜNG: KIA: Kligler iron agar

 Agar 15g

pH 7,4±0,2

• Môi trường KIA chỉ có hai loại đường 0.1% glucose, 1% lactose.

• Môi trường TSI có thành phần giống KIA, có bổ sung thêm 1% sucrose.

KẾT QUẢ:

Quan sát: Phần nghiêng / phần sâu / hơi / H 2 S

370C/24h

Cơ chế: Có ba trường hợp xảy ra:

• Chỉ sử dụng glucose, sau 18-24h nuôi cấy phần nghiêng (bề mặt) trở nên có

pH kiềm và phần đứng (phần sâu trong ống nghiệm) có pH acid Do Glucose trên bề mặt của môi trường được vi sinh vật oxy hóa hoàn toàn thành CO 2 và nước để thu lấy năng lượng, đáp ứng nhu cầu năng lượng trong tăng trưởng Vi sinh vật tiếp tục dị hóa peptone qua đó giải phóng NH 3 làm phần

bề mặt của môi trường có pH kiềm Trong khi đó, ở phần sau trong môi trường có điều kiện oxy không đầy đủ, glucose được lên men kị khí sinh các acid hữu có làm pH môi trường giảm.

• Sử dụng cả glucose và Lactose, sau 18-24h, toàn bộ môi trường đều trở nên

có PH acid vì sự biến dưỡng đồng thời cả hai loại đường giúp vi sinh vật đủ năng lượng để tăng trưởng mà chưa cần sử dụng đến peptone Nếu kéo dài thời gian nuôi cấy quá 24h bề mặt pH sẽ trở nên kiềm do hết nguồn cacbon

vì vi sinh vật phỉa sử dụng đến peptone.

• Không sử dụng glucose, lactose: vi sinh vật sẽ biến dưỡng peptone để thu lấy năng lượng và vật chất cho sự tăng trưởng tuy nhiên do peptone chỉ được biến dưỡng trong điều kiện hiếu khí nên hiện tượng kiềm hóa của môi trường chỉ diễn ra trên bề mặt môi trường.

Khả năng sinh H 2 S do trong môi trường sodium thiosunfat, vi sinh vật khử sunface

có thể khử chất này, nhờ có enzyme thiosunfat reductase để giải phóng H 2 S, H 2 S sẽ phản ứng với Ion Fe 2+ của chỉ thị amonium citrate tạo kết tủa màu đen F 2 S.

ĐC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Một số trường hợp có thể xảy ra khi dùng môi trường KIA/TSI

Ý nghĩa: định danh các loại vi khuẩn có khả năng: sử dụng các nguồn cacbon khác nhau và có khả năng sinh H 2 S, khả năng sinh hơi Thường được dùng để định danh các vi khuẩn gram (-), vi sinh đường ruột

6 THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG SINH H 2 S

MỤC ĐÍCH: Phát hiện khả năng sinh H 2 S của vi sinh vật.

CƠ SỞ SINH HÓA:

H 2 S sinh ra được nhận biết bởi ion sắt, chì tạo kết tủa màu đen (FeS, PbS).

MÔI TRƯỜNG:

• KIA, TSA (thạch nghiêng)

• SIM, PIA (thạch sâu)

• BSA (thạch đĩa)

desulfohydrase

Thiosulfate reductase

Cấy vi sinh vật lên môi trường, Ủ 37 o C, 24 - 48h

KẾT QUẢ:

• Xuất hiện màu đen trong môi trường (+)

• Không xuất hiện màu đen trong môi trường (-)

7 THỬ NGHIỆM CATALASE

MỤC ĐÍCH : Phát hiện vi sinh vật có hệ enzyme catalase

CƠ SỞ SINH HÓA:

Catalase hiện diện ở các VSV hiếu khí và kỵ khí tùy ý

(hydrogen peroxide)

THỰC HIỆN

◦ VSV lấy từ môi trường nuôi cấy (lỏng, rắn)

◦ Đặt VSV lên lam kính sạch

◦ Nhỏ H 2 O 2 30%

ĐC

Catalase

◦ Quan sát sau 1-2 giây

 Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện

 Phản ứng (-): không có bọt khí xuất hiện

Thử nghiệm catalase trên đĩa petri: sử dụng H2O2 30%

8 KHẢ NĂNG LÊN MEN CÁC LOẠI ĐƯỜNG

NGUYÊN TẮC:

- Xác định khả năng của một số vi sinh vật lên men (phân giải) một carbohydrate đặc hiệu có trong môi trường cơ bản để tăng trưởng.

- Khi sử dụng các nguồn carbohydrate để lên men, tùy theo phương thức lên men các sản phẩm được tạo ra sẽ khác nhau: rượu, các acid hữu cơ, CO 2 … Trong các trường hợp, các sản phẩm tạo thành đều làm giảm pH của môi trường

- CO 2 được tạo thành sẽ được bẫy lại tạo thành bọt khí trong ống chuông Durham làm nổi ống chuông này (trường hợp sử dụng môi trường lỏng)

(trường

hợp

sử dụng

trường

- Thử nghiệm khả năng lên men thường được dùng để định danh các vi sinh vật đường ruột (Enterobacteriaceae có khả năng lên men glucose, E.coli, Klebsiella, Enterobacter lên men được gluocose và lactose) và phân biệt một

số giống vi sinh vật.

MÔI TRƯỜNG: Phenol Red Broth Base

THỰC HIỆN:

Cấy vi khuẩn mới hoạt hoá vào các ống nghiệm, đặt ở 36 0 C, theo dõi hiện tượng sinh acid sau 1-3 ngày

- Lọc vô trùng môi trường qua màng lọc có kích thước lỗ 0,45µm hoặc 0,2µm.

- Phân phối vào các ống nghiệm Hấp ở 121 0 C trong 15 phút

- Tiến hành cấy chủng vào các ống môi trường bằng que cấy vòng.

- Ủ các ống môi trường ở 37 0 C trong 18 – 20 giờ Trong trường hợp khẳng định kết quả âm tính, cần dùng paraffin để bịt kín nút bông và theo dõi thời gian ủ có thể kéo dài đến trong 14-30 ngày.

KẾT QUẢ:

• Phản ứng (-): môi trường có màu đỏ