Tổng hợp dẫn xuất flavonoit và xác định các hoạt tính kháng oxi hóa, kháng nấm và khả năng gây độc cho tế bào ung thư

Mục tiêu của luận án: Mục tiêu của luận án: Mục tiêu của luận án là tổng hợp các dẫn xuất từ một vài flavonoit có nhiều trong thiên nhiên và xác định các hoạt tính kháng oxi hóa, kháng n

Mở

Mở Đ Đ ĐầU ầU ầU

Xã hội hiện đại ngày nay cùng với yêu cầu về tuổi thọ phải ngày càng cao đã

đặt ra cho các nhà khoa học nhiều bài toán mới nhằm tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học đặc biệt là các chất có nguồn gốc từ thiên nhiên do khả năng gây độc của chúng thấp, độ an toàn cao trong sử dụng để ứng dụng trong điều trị bệnh nhất là các loại bệnh nan y Hiện nay nhóm flavonoit nhận được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới do chúng luôn có mặt trong các loại thực phẩm hàng ngày của con người Các nghiên cứu cho thấy các chất thuộc họ này không gây độc cho cơ thể

dù dùng ở liều cao và khi sử dụng kết hợp với các loại thuốc khác như thuốc trị ung thư thì giúp làm giảm tác dụng phụ của các loại thuốc này Rất nhiều các hợp chất

được chiết tách đã được nghiên cứu và thử nghiệm, hàng loạt các hợp chất tổng hợp

và bán tổng hợp vẫn đang liên tục được tạo ra tại nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nhằm tìm kiếm các loại thuốc trị bệnh có tác dụng mạnh hơn và ít độc hại hơn

đối với cơ thể người bệnh

Với xu thế quay trở lại nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên đang phát triển mạnh mẽ nhằm tìm kiếm các loại thuốc chữa bệnh, các phụ gia dùng trong thực phẩm, mỹ phẩm…, các nhà khoa học Việt Nam cũng đã có nhiều nghiên cứu về nhiều khía cạnh của các hợp chất thiên nhiên nước ta để tận dụng ưu thế của một nước nhiệt đới, nơi có một hệ động thực vật đa dạng, phong phú, có nhiều loại cây

cỏ có tác dụng sinh dược học mạnh Các nghiên cứu này cũng đã đạt được nhiều thành quả trong việc nghiên cứu và ứng dụng các hợp chất chiết xuất được vào một

Mục tiêu của luận án:

Mục tiêu của luận án:

Mục tiêu của luận án là tổng hợp các dẫn xuất từ một vài flavonoit có nhiều trong thiên nhiên và xác định các hoạt tính kháng oxi hóa, kháng nấm, kháng khuẩn

và khả năng gây độc tế bào ung thư của các hợp chất này để từ đó làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm đưa vào sử dụng các flavonoit và dẫn xuất của chúng cho các ngành y tế, thực phẩm

Dựa trên các kết quả thu được hy vọng có thể đưa ra nhận xét bước đầu về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học, từ đó làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu sâu hơn về mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học của các flavonoit nói chung và các dẫn xuất của chúng

Để đạt được các mục đích trên luận án đã thực hiện các nội dung sau:

Để đạt được các mục đích trên luận án đã thực hiện các nội dung sau:

1- Tách chiết rutin từ hoa hòe và hesperidin từ vỏ quýt và tiến hành thủy phân hai hợp chất này thành quercetin và hesperetin để làm nguồn nguyên liệu cho các phản ứng tổng hợp tiếp theo

2- Từ bốn hợp chất trên bằng các phương pháp este hóa, ete hóa, halogen hóa để tạo ra các dẫn xuất của flavonoit, xác định cấu trúc của sản phẩm và các điều kiện phản ứng

3- Khảo sát hoạt tính sinh học của các flavonoit và dẫn xuất gồm có hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn, hoạt tính kháng oxi hóa, khả năng gây độc tế bào ung thư trên 3 dòng tế bào: HeLa – tế bào ung thư cổ tử cung, MCF-7 – tế bào ung thư vú, NCI-H460 – tế bào ung thư phổi

4- Trên cơ sở những kết quả có được đưa ra mối quan hệ giữa cấu trúc với từng hoạt tính thử nghiệm

5- Thiết lập phương trình QSAR (quan hệ định lượng cấu trúc – hoạt tính) để có thể dự đoán tính gây độc tế bào của các dẫn xuất quercetin và hesperetin

Các khảo sát mối quan hệ giữa cấu trúc với hoạt tính kháng oxi hóa của flavonoit cho thấy các mối liên quan giữa độ âm điện của các nhóm -OH ở vòng B

và nhóm -OH ở vị trí C-3 với khả năng kháng oxi hóa của các flavonoit và dẫn xuất

Kết quả khảo sát mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính gây độc tế bào cũng

đã tiếp tục khẳng định mối liên quan giữa chỉ số logP, trọng l−ợng phân tử của hợp chất với khả năng thẩm thấu qua màng tế bào

- ý nghĩa thực tiễn

Việc tổng hợp ra các dẫn xuất flavonoit từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên Việt Nam sẽ giúp cho các nhà nghiên cứu ứng dụng tìm tòi phát hiện ra những hợp chất mới với những hoạt tính sinh học mới để có thể ứng dụng trong y d−ợc và nâng cao vai trò của cây thuốc Việt Nam

Phần khảo sát mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính sinh học giúp các nhà tổng hợp hóa d−ợc rút ngắn hơn thời gian của quá trình nghiên cứu, dự đoán đ−ợc hoạt tính sinh học của hợp chất flavonoit dựa trên cấu trúc của chúng

CHƯƠNG 1: TổNG QUAN CHƯƠNG 1: TổNG QUAN Flavonoit là một nhóm bao gồm khoảng 4000 hợp chất tự nhiên hiện diện trong nhiều thành phần của cây cối cũng như trong các loại rau quả: [36][69]

- Hoa: có nhiều màu sắc, bao gồm nhiều thành phần như antoxianidin, flavon, flavonol, flavanon, chalcon và auron Antoxianin làm cho hoa có màu đậm và tươi, polihydroxyflavon và flavonol thì làm cho hoa có ánh vàng Những bông hoa có màu sắc rực rỡ lại do sự có mặt của chalcon và auron Hoa là thành phần thích hợp nhất để chiết flavonoit do hàm lượng nhiều và ít tạp chất

- Vỏ quả: do có nhiều màu sắc nên cũng là thành phần được nghiên cứu nhiều Chúng có thể chứa tangeretin, naringin, rhoifolin, hesperidin, nobiletin… từ các vỏ quả họ Cam

- Hạt: chứa hydroxyflavon, các metyl ete của chúng, glycozit, furanoflavonoit, các dẫn xuất rotenoit và leucoantoxianidin

- Lá, gỗ, rễ và vỏ cây

Ngoài ra một số loại nước uống như rượu vang đỏ, trà, cà phê, bia hay cả trong các bài thuốc dân gian cũng được tìm thấy có chứa một lượng lớn flavonoit Người ta dự đoán con người tiêu thụ tổng lượng flavonoit trong thực phẩm vào khoảng vài trăm miligam mỗi ngày [97]

Với sự đa dạng như vậy, flavonoit là một hợp chất quan trọng không những

đối với cây cỏ mà còn đối với các loài động vật bao gồm cả con người

1.1

1.1 CấU TRúC Và PHCấU TRúC Và PHCấU TRúC Và PHÂÂÂN LOạI CáC N LOạI CáC N LOạI CáC FLAVONOITFLAVONOITFLAVONOIT

Flavonoit là những chất màu thực vật, có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng benzen

A và B nối với nhau qua một mạch 3 cacbon Cấu trúc là một vòng kín hoặc hở

Cách đánh số tùy theo mạch cacbon kín hay hở Nếu mạch cacbon kín, cách

đánh số bắt đầu từ nguyên tố dị vòng oxi mang số 1 rồi đánh tiếp đến vòng A, còn vòng B được đánh số phụ Nếu mạch cacbon hở, thì cách đánh số chính bắt đầu trên vòng B và đánh số phụ trên vòng A

Sự phân loại các flavonoit dựa vào vị trí gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxi hóa của mạch cacbon (hình 1.1)

- FlavonFlavonFlavon:::: Flavon có cấu trúc chung bao gồm 2 vòng benzen A và B Vòng B gắn vào vòng C (pyran) tại vị trí C2

- FlavanonFlavanonFlavanon:::: Flavanon khác với flavon ở chỗ không có nối đôi ở vị trí C2 và C3 Tất cả các flavanon đ−ợc phát hiện cho đến nay đều có nhóm OH ở vòng A hoặc B

- FlavonolFlavonolFlavonol:::: Khác với flavon, flavonol có thêm nhóm OH ở C3 Flavonol rất phổ biến trong tự nhiên Thống kê trên 1000 loài thuộc thực vật hạt kín thì thấy 48% loài có kaempferol, 26% loài có quercetin và myricetin chiếm 10% trong tổng số loài có flavonol

- DihydroflavonolDihydroflavonolDihydroflavonol:::: 3-hydroxyflavanol hoặc flavanol có cấu trúc cơ bản giống flavonol nh−ng không có nối đôi C2-C3

- ChalconChalconChalcon:::: Chalcon có 2 vòng A và B nối với nhau bởi 1 mạch hở 3 cacbon, không

có dị vòng nh− các flavonoit khác và số thứ tự cacbon bắt đầu từ vòng B

- DihydroDihydroDihydrochalconchalconchalcon: : : : Là chalcon mất dây nối đôi α, β Loại này ít gặp trong tự nhiên

- AuronAuronAuron: : : : Là nhóm flavonoit có màu vàng sáng Khung của auron cũng có 12 cacbon nh− các flavonoit khác, nh−ng dị vòng C chỉ có 5 cạnh Số l−ợng cũng nh− sự phân bố trong cây cũng hạn chế

- AntAntAntoxioxioxianidinanidinanidin: : : : Về cấu trúc, nhóm này khác các flavonoit khác ở chỗ không có nhóm cacbonyl ở C4

- LeucoLeucoLeucoantantantoxioxioxianidinanidinanidin:::: Là 3,4-dihydroxyflavan, không màu, nh−ng gặp axit biến thành antoxianidin có màu hồng hoặc đỏ, rất phổ biến trong cây, nhất là trong vỏ cây và gỗ

- IsoIsoIsoflavonflavonflavon: : : : Là nhóm isoflavonoit phổ biến nhất Vòng B trong nhóm isoflavon nối với vòng C tại vị trí C3 trong khi vòng B ở nhóm flavon nối với vòng C ở vị trí C2

- RotenoiRotenoiRotenoitttt: : : : Người ta đã biết khoảng 15 chất rotenoit, chất điển hình nhất là rotenon

có trong cây thuốc cá Derris elliptica Tác dụng quan trọng của nhóm hợp chất này là diệt sâu bọ, do hạn chế khả năng thu nhận oxi của sâu bọ

- NeoNeoNeoflavonoitflavonoitflavonoit: : : : Không có nhóm cacbonyl ở vị trí C4 thay vào đó là vòng B Chất

đầu tiên phân lập là calophylolid chiết từ hạt cây Mù u Calophyllum inophyllum

và một số loài Calophyllum khác, họ Bứa (Guttifereae)

Hình 1.1:

Hình 1.1: Cấu trúc của một số dạng flavonoit

Apigenin, chrysin, luteolin

Daidzein, genistein, glycitein,

formononetin

Catechin, gallocatechin

Eriodictyol, hesperetin, naringenin

Hành, anh đào, táo, bông cải xanh, cải xoăn, cà chua, trà, rượu vang đỏ, … Mùi, cỏ xạ hương…

Đậu nành, các loại đậu…

1.2.1 Vai trò của Vai trò của Vai trò của flaflaflavonoitvonoitvonoit đối với cây cỏ đối với cây cỏ đối với cây cỏ [70][73]

Các flavonoit đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng, phát triển và tự vệ của cây

- Trong các phản ứng sinh hóa: Một số flavonoit có tác dụng như một chất chống oxi hóa, bảo vệ axit ascorbic, một thành phần quan trọng trong tế bào thực vật Một số có tác dụng ức chế các enzim và các chất độc của cây

- Vai trò ức chế và kích thích sinh trưởng: Nhiều công trình nghiên cứu về tác dụng

ức chế và kích thích sinh trưởng cây của flavonoit Nhóm chức hiđroxi có vai trò quyết định về tác dụng này

- Vai trò tạo màu sắc: Flavonoit đóng vai trò tạo màu sắc hấp dẫn cho cây, góp phần thúc đẩy sự sinh tồn của cây và phát triển hoa, quả

- Vai trò một chất bảo vệ cây: Một số flavonoit không màu trong lá đóng vai trò một chất bảo vệ cây Vị đắng và khó chịu của flavonoit làm cho động vật khi ăn phải mất cảm giác ngon và không thích ăn các loại cây cỏ này Ngoài ra, do khả năng hấp thụ mạnh tia UV mà các flavonoit giúp bảo vệ cây chống lại các tác hại của tia UV, nhiệt độ Chúng còn giúp cây chống lại một số vi khuẩn, nấm

1.2.2 Tính chất dược lý của Tính chất dược lý của Tính chất dược lý của flavonoitflavonoitflavonoit

Flavonoit có nhiều hoạt tính sinh học như khả năng kháng oxi hóa, kháng khối u, kháng viêm, chống dị ứng và là tác nhân bảo vệ gan Vì vậy, nghiên cứu về hoạt tính của các flavonoit luôn nhận được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học

đặc biệt là nghiên cứu về khả năng kháng khối u của flavonoit

1.2.2.1

1.2.2.1 Khả năng kháng Khả năng kháng Khả năng kháng oxioxioxi hóa của hóa của hóa của flavonoitflavonoitflavonoit [20][21][41][42][49][62] Các flavonoit là các chất kháng oxi hóa tự nhiênđược thể hiện thông qua khả năng bắt gốc tự do, tạo phức với ion kim loại và ức chế hệ thống enzim

1.2.2.2

1.2.2.2 Tác nhân chống ung thư Tác nhân chống ung thư Tác nhân chống ung thư

Trong những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu ở mức độ in vitro và in vivo cũng như các nghiên cứu về dịch tễ học đề cập đến vai trò của flavonoit ở khẩu phần ăn hàng ngày trong việc ngăn ngừa ung thư [56], một số sự kết hợp trong điều trị được thực hiện với thực phẩm giàu flavonoit như sử dụng đậu nành và ung thư vú thời kỳ tiền mãn kinh, trà xanh và ung thư bao tử, hành và ung thư phổi…[97] Vì vậy, hiểu biết thêm về khả năng chống ung thư của các loại thực phẩm này sẽ giúp cải thiện thói quen trong ăn uống của chúng ta

Ngoài ra, bên cạnh các flavonoit tự nhiên thì các flavonoit tổng hợp là những ứng cử viên cho các loại thuốc chống ung thư trong tương lai, một số các hợp chất này đang ở trong giai đoạn thăm dò lâm sàng như flavopiridol, 5,6-dimetylxanthenon-4-axetic axit, phenoxodiol hay silybin,… [100]

Cơ chế kháng ung thư của flavonoit:

- Flavonoit là tác nhân ngăn ngừa về mặt hóa học:

Năm 1996, Calomme M và đồng nghiệp phát hiện flavonoit họ Cam có khả năng ức chế sự đột biến của vi khuẩn Các thí nghiệm cho thấy tangeretin kháng lại tất cả các thử nghiệm trên các chất gây đột biến gián tiếp, còn nobiletin lại kháng sự

đột biến do benzo[α]pyren và 2-aminofluoren gây ra Do tính chất này mà các flavonoit họ Cam (đặc biệt là tangeretin và nobiletin) đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa ung thư về mặt hóa học….[100]

- Flavonoit ức chế sự phát triển hoặc sự tăng sinh của tế bào ung thư:

Lee và đồng nghiệp [54] đã thử khả năng gây độc tế bào của 6 isoflavonoit, trong đó tectorigenin và genistein đã thể hiện khả năng gây độc tế bào trên các tế bào ung thư ở người và genistein gây chết tế bào theo chương trình bằng cách biến

đổi ADN Năm 2002, Manthey và Guthyie [59] nghiên cứu tác động của flavonoit

họ Cam lên 6 dòng tế bào ung thư ở người Họ thấy rằng các hợp chất tổng hợp có khả năng ức chế sự tăng sinh mạnh của tế bào ung thư tương tự như các hợp chất trong tự nhiên (nhiều hợp chất có IC50 < 10àM) Năm 2005, Zheng và đồng nghiệp [74] đã có báo cáo đầu tiên về khả năng gây cảm ứng apoptosis của apigenin …

- Flavonoit là tác nhân chống lại sự xâm nhập, sự bám dính và sự phát triển mạch:

Vào năm 2001, Rooprai [80] đã phát hiện ra ảnh hưởng của 4 tác nhân chống lại sự xâm nhập của các tế bào ung thư vào não, trong đó dựa trên các thông số về sự xâm nhập qua khối u não thì nobiletin có hiệu quả ức chế tốt nhất đối với sự xâm nhập, di chuyển và bám dính trên cả 4 dòng tế bào thử nghiệm (IPMA-E, IPSH-OA2, IPAB-AO3, IPLC-GM) Năm 2003, Tan W.F [97] đã cho thấy quercetin có khả năng chống lại sự phát triển mạch, sau đó Ma cũng đã tìm thấy tamoxifen có khả năng ức chế khối u tuyến tiền liệt CWR22 bằng cách phân hóa sự phát triển mạch và chống lại các mô ung thư mới khi sử dụng kết hợp với quercetin

- Các dẫn xuất flavonoit có tác dụng ngăn ngừa tác dụng phụ của doxorubicin:

Năm 2000, Van Acker [33] đã tìm ra rằng khi uống monohydroxyetylrutozit với liều 500mg/kg một giờ trước khi dùng doxorubicin sẽ bảo vệ cơ thể của bệnh nhân ung thư chống lại tác hại gây độc cho tim Năm 2001,

7-họ đã tìm ra được một số dẫn xuất flavon khi sử dụng kết hợp với phương pháp điều trị ung thư bằng doxorubicin cho kết quả bảo vệ tim tốt hơn …[34][35]

1.2.2

1.2.2.3.3.3 Khả năng kháng viêm Khả năng kháng viêm Khả năng kháng viêm

Do khả năng của flavonoit ức chế lại sự tạo thành các chất trung gian của quá trình viêm như prostaglandin, leukotrien hoặc nitric oxit… [43][49]

1.2.2.4 Vai trò trong phòng ngừa và điều t Vai trò trong phòng ngừa và điều t Vai trò trong phòng ngừa và điều trị bệnh timrị bệnh timrị bệnh tim

Các flavonoit kháng oxi hóa có mặt trong các loại quả, rau, trà và rượu vang

đều có khả năng ức chế sự oxi hóa của LDL (low-density lipoprotein) do khi bị ảnh hưởng tác động LDL sẽ gây ra bệnh tim Các nghiên cứu cho thấy rượu vang đỏ và các loại thực phẩm giàu flavonoit làm giảm nguy cơ bệnh tim động mạch vành [49]

1.2.2

1.2.2.5555 FlavonoitFlavonoitFlavonoit ức chế các ức chế các ức chế các enzimenzimenzim

Một số flavonoit thử nghiệm cho thấy khả năng ức chế các enzim là chìa khóa cho sự hô hấp của các ty thể, ức chế NADH (Nicotinamit adenin dinucleotit – coenzim trong cơ thể có mặt ở các phản ứng oxi hóa khử) Một số flavonoit còn có khả năng ức chế enzim oxi hóa xanthin, là enzim xúc tác cho quá trình oxi hóa xanthin và hypoxanthin thành axit uric [49]

1.2.2.61.2.2.6 Các hoạt tính khá Các hoạt tính khá Các hoạt tính khác của c của c của flavonoitflavonoitflavonoit

Flavonoit có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm [103], chống dị ứng, chống loét, và là tác nhân bảo vệ gan [49]

1.3

1.3 NH NH NHữữữữNG NGHING NGHING NGHIÊÊÊÊN CN CN CứứứứU TRU TRU TRÊÊÊÊN THN THN THếếếế GI GI GIớớớIIII

1.3.1

1.3.1 Tình hình nghiên cứu tổng hợp các Tình hình nghiên cứu tổng hợp các Tình hình nghiên cứu tổng hợp các flavonoitflavonoitflavonoit

Từ khi vai trò quan trọng của các flavonoit trong thực phẩm (đặc biệt trong việc ngăn ngừa ung thư) được phát hiện thì mặc dù có hàng ngàn hợp chất thiên nhiên đã được khám phá, hàng loạt nghiên cứu trên thế giới vẫn đang được thực hiện

để tổng hợp hoặc bán tổng hợp (tổng hợp từ cấu trúc ban đầu của flavonoit) các dẫn xuất của flavonoit (đặc biệt là các nhóm flavon, isoflavon, flavonol, flavanon) bằng nhiều con đường khác nhau (hóa học, sinh học [64][71]) cho nhiều mục đích: tăng khả năng kháng viêm, làm bền thành mạch máu, giảm các yếu tố tác động lên nguy cơ bị bệnh tim, bị ung thư, dưỡng da và bảo vệ da chống lại các tác hại của tia UV…

1.3.1.1

1.3.1.1 Các phản ứng tổng hợp dựa trên Các phản ứng tổng hợp dựa trên Các phản ứng tổng hợp dựa trên cấu trúc ban đầu của cấu trúc ban đầu của cấu trúc ban đầu của flavonoitflavonoitflavonoit

Các phản ứng thay đổi nhóm thế trực tiếp trên vòng flavonoit tự nhiên hầu như bị giới hạn bởi các phản ứng ankyl hóa hoặc axyl hóa [27][38][39][96][101], halogen hóa

- Đối với các phản ứng halogen hóa

Năm 2001, Yaipakdee [71] sử dụng cloroperoxiđaza enzim từ nấm

Caldariomyces để thực hiện việc halogen hóa naringenin, hesperetin và các flavon Tuy nhiên, chỉ có narigenin và hesperetin là có sự thay thế Cl và Br vào vị trí C-6 và C-8 còn các flavon thì không xảy ra Paolo Bovicelli vào năm 2002 [72] cũng đã báo cáo một phương pháp halogen hóa chọn lọc các flavanon bằng phương pháp sử dụng oxon (2KHSO5.KHSO4.K2SO4), NaBr trong axeton hoặc HCl, dimetyldioxiran trong axeton Năm 2003, để tổng hợp các dẫn xuất chứa Cl và Br của chrysin, Xing Zheng [98] đã sử dụng ICl hoặc dung dịch Br2

Năm 2005, Heil Park [43] thay thế các nhóm -H ở vị trí C-6 và C-8 của chrysin bằng -Br (sử dụng tác nhân Br2, CH2Cl2, CH3SCH3), -I (tác nhân I2,

CH3COOH), bằng nhóm –SCH3 (tác nhân FeCl3, dimetyldisulfite, toluen) hoặc là nghiên cứu thay thế bằng các nhóm này nhưng chỉ trên vị trí C-8 [93]

- Phản ứng tạo este

Phản ứng este luôn đóng một vai trò quan trọng trong quá trình bán tổng hợp tạo các dẫn xuất flavonoit Năm 2001, Mulholland [66] đã tổng hợp 3’-(N-cacboxymetyl)cacbamoyl-3,4’,5,7-tetrahydroflavon có khả năng tan trong nước cao hơn quercetin

Năm 2007, nhằm mục đích nghiên cứu làm tăng khả năng di chuyển của quercetin qua màng một số tế bào, Lucia Biasutto [58] đã tổng hợp một số dẫn xuất este của quercetin

O

O OH

HO

OH O

O N HO O

3'-(N-cacboxymetyl)cacbamoyl-3,4',5,7-tetrahydroflavon

OH

Sơ đồ 1.1:

Sơ đồ 1.1: Quy trình tổng hợp một số dẫn xuất este của quercetin

Cũng trong năm 2007, Bin Ye [19] bằng con đường este hóa qua quá trình bảo vệ nhóm chức đã tổng hợp dẫn xuất phenylisoxyanat của quercetin, kết quả thử nghiệm gây độc tế bào và gây apoptosis cho thấy dẫn xuất này có hoạt tính ức chế dòng CT26 cao hơn 308 lần và K562 cao hơn 73 lần so với quercetin

- Phản ứng ankyl hóa

Các phản ứng ankyl hóa quercetin cũng đã được nghiên cứu nhiều nhằm mục

đích sử dụng trong các sản phẩm chống nắng, bảo vệ da, chống dị ứng, bảo vệ thành mạch máu hoặc nghiên cứu trong điều trị bệnh tiểu đường Có thể tiến hành eter hóa toàn bộ hoặc 1 nhóm -OH thành -O-ankyl như nhóm tác giả [64] đã thực hiện khi nghiên cứu về các sản phẩm của quá trình chuyển hóa quercetin trong cơ thể Quy trình phản ứng được trình bày trong sơ đồ 1.2

O

O

O OH

H O

OH

O H

O H

D ẫn xuất phenylisoxyanat của quercetin

Sơ đồ 1.

Sơ đồ 1.2222:::: Quy trình tổng hợp một số dẫn xuất ete của quercetin

- Ngoài các phản ứng axyl hóa, ankyl hóa, halogen hóa flavonoit, còn có một số bài báo viết về các phản ứng tạo phức của flavonoit (quercetin, chrysin) với các kim loại đất hiếm [50][102] để tạo nên các hợp chất có hoạt tính cao hơn (hình 1.2)

Bên cạnh các phản ứng tổng hợp bằng phương pháp truyền thống, năm 2005, Wang [85] đã sử dụng phương pháp siêu âm để tiến hành bán tổng hợp các dẫn xuất của genistein cũng bằng phản ứng ankyl hóa hoặc axyl hóa

Hình 1.

Hình 1.2222:::: Phức của quercetin với các kim loại đất hiếm

1.3.1.2

1.3.1.2 Tổng hợp toàn phần Tổng hợp toàn phần Tổng hợp toàn phần

Ngoài việc bán tổng hợp, với mục tiêu đa dạng hóa các nhóm chức gắn vào cũng như không phải phụ thuộc vào nguồn nguyên liệu thiên nhiên, người ta còn tiến hành quá trình tổng hợp toàn phần các hợp chất flavonoit

Năm 1994, Mark Cushman [60] đã tổng hợp một loạt các nitroflavon, aminoflavon và muối aminoflavon hiđroclorua có khả năng ức chế protein-tyrosin kinaza

Sơ đồ 1.3:

Sơ đồ 1.3: Quy trình tổng hợp các nitroflavon, aminoflavon

Đến năm 2006 cũng bằng phương pháp này, Mughal [26] tổng hợp một số flavon, 4-thioflavon và 4-iminoflavon, hầu hết các hợp chất đều có khả năng kháng khuẩn trên 6 dòng vi khuẩn thử nghiệm

Sơ đồ

Sơ đồ 1.4:1.4:1.4: Quy trình tổng hợp các flavon, thioflavon và iminoflavon

Năm 1999, Traxler [75] tổng hợp các dẫn xuất của isoflavon và quinolon với mục đích thử nghiệm khả năng ức chế các enzim:

Sơ đồ 1.5:

Sơ đồ 1.5: Quy trình tổng hợp các isoflavon và quinolon

và năm 2004, bằng phương pháp tương tự Kim [105] và Su năm 2005 [18] cũng đã tổng hợp một số thioisoflavon có khả năng ức chế enzim aromataza

Người ta cũng có thể sử dụng các aryl alđehyt để làm tác nhân phản ứng [28][94]:

Sơ đồ 1

Sơ đồ 1.6666:::: Con đường tổng hợp các flavon và flavanon bằng các aryl alđehyt

Các nhà khoa học đã nghiên cứu khả năng chống ung thư của các flavonoit cùng dẫn xuất tổng hợp được và thấy rằng nhiều chất trong số đó có khả năng chống ung thư cao không chỉ trong thử nghiệm in vitro mà còn trên loài vật thử nghiệm

Đã có vài hợp chất tổng hợp đang vào giai đoạn thử nghiệm lâm sàng như là một loại thuốc điều trị ung thư: flavopiridol, 5,6-dimetylxanthenon-4-axetic axit, aminoflavon, phenoxodiol hay silybin,…

ở Việt Nam, có một số nghiên cứu về khả năng kháng oxi hóa của các flavonoit phân lập từ một số loại cây như nhóm của Trần Hùng (Bộ môn Dược liệu – Đại học Y dược TP.HCM), hoặc nhóm Trần Thành Đạo (Bộ môn Hóa dược - Đại học Y dược TP.HCM) nghiên cứu tổng hợp các dẫn xuất flavonoit với mục đích kháng viêm [5] và kháng oxi hóa [14]:

S O

R7

R 6

R3'

Ngoài ra còn có nghiên cứu về biến đổi cấu trúc một vài flavonoit (thay oxo ở

vị trí C4 bằng S) của Phạm Nguyễn Kim Tuyến(Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM) và thử khả năng gây độc tế bào trên dòng MCF-7 theo phương pháp MTT cho thấy các dẫn xuất này có hoạt tính gây độc tế bào rất thấp [15]:

Các nghiên cứu này vẫn chưa cho thấy được mối quan hệ giữa cấu trúc và hoạt tính của các hợp chất

1.3.1.3

1.3.1.3 Một số Một số Một số hợp chấthợp chấthợp chất tổng hợp tổng hợp tổng hợp c c có khả năng kháng tế bào ung thưó khả năng kháng tế bào ung thưó khả năng kháng tế bào ung thư

Ngoài các flavonoit tự nhiên có khả năng kháng tế bào ung thư (tangeretin, baicalein, wogonin, morin, quercetin, rutin…) [49][98][100], một số hợp chất tổng hợp cho kết quả về khả năng kháng tế bào ung thư cao trên các dòng thử nghiệm a) Các thioflavon: [100]

6-hydroxythioflavon R 6 = OH

6, 7- hydroxythioflavon R 6 = R 7 = OH 3’, 6, 7- metoxythioflavon R 3’ = R 6 = R 7 = OH 6,7- axetoxythioflavon R 6 = R 7 = OCOCH 3

6- aminothioflavon R 6 = NH 2 b) Các hợp chất chalcon: [100]

Bảng Bảng 1111.2:.2:.2: Cấu trúc các hợp chất chalcon

R 2’ R 3’ R 4’ R 5’ R 2 R 4 R 5 R 6 Tên

H OCH 3 OH H OCH 3 OCH 3 H OCH 3

2,3’,4,6-tetrametoxy-4’-hydroxychalcon OCH 3 H H OCH 3 OCH 3 OCH 3 H OCH 3 2,2’,4,5’,6-pentametoxy-

chalcon

H OCH 3 OCH 3 OCH 3 H OCH 3 H H 3’,4’,4,5’-tetrametoxy-chalcon

F H OCH 3 H F H Br H 2,2’-flo-4’-metoxy-5-bromchalcon

H OCH 3 OCH 3 OCH 3 H N(CH 3 ) 2 H H 2’,3’,4’-trimetoxy-4-dimetylaminochalcon

H OCH 3 OCH 3 OCH 3 OCH 3 OCH 3 H OCH 3

2,3’,4,4’,5,6-hexametoxychalcon

c) Các aminoflavon hiện đang là ứng cử viên đầy hứa hẹn trong giai đoạn thăm

dò lâm sàng pha I (thử nghiệm trên 20-80 người khỏe mạnh) [17] [100]

d) Flavopiridol: là một dẫn xuất flavon bán tổng hợp của ruhitukin, có trong một loại cây của Ấn Độ Đây là hợp chất đầu tiên được thăm dò lâm sàng ở pha II (số lượng thử nghiệm từ 20-300 người) Trên cơ sở đó người ta đã tiến hành tổng hợp thêm các dẫn xuất thio- và oxoflavopiridol [99]

e) Phenoxodiol: là một dẫn xuất tổng hợp của isoflavon daidzein và đang trong quá trình thử nghiệm dược lý với vai trò là một loại thuốc điều trị ung thư [99]

f) 5,6-dimetylxanthenon-4-axetic axit (DMXAA): đã hoàn tất thử nghiệm ở pha

I và cho thấy hoạt tính chống ung thư trên cả chuột và người [99]

Nghiên cứu mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính (viết tắt là QSAR: Quantitative Structure-Activity Relationships) được dựa trên quan điểm là hoạt tính sinh học của một hợp chất có liên quan chặt chẽ đến các thông số lý hóa của hợp chất đó Các thông số thường được sử dụng trong nghiên cứu là thông số

điện tử, khả năng tan trong dầu hoặc nước và thông số lập thể Khi nghiên cứu mối liên hệ cấu trúc-hoạt tính sẽ thu được nhiều thông tin hữu ích giúp xác định các yếu

tố ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính, trên cơ sở đó sẽ có được sự định hướng cần thiết khi muốn thay đổi hoạt tính của một hợp chất

Các yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới các thông số lý hóa từ đó ảnh hưởng đến hoạt tính sinh học của hợp chất là:

v Kích thước, khoảng cách giữa các nhóm phản ứng và hình dạng phân tử:

- Trong một dãy đồng đẳng, sự thay đổi độ dài của mạch sẽ dẫn đến sự thay đổi hoạt tính sinh học Trong rất nhiều trường hợp, việc tăng độ dài mạch cacbon (tương ứng với việc tăng tính ái dầu) sẽ làm tăng tác động dược học do tính chất dễ dàng thấm qua màng tế bào Tuy nhiên khi mạch cacbon quá dài, khả năng hòa tan trong nước kém đi sẽ cản trở sự di chuyển trong môi trường nước, do đó hoạt tính sinh học của hợp chất giảm

- Khoảng cách cần thiết giữa các nhóm hoạt động cũng tạo điều kiện cho sự tương tác giữa các nhóm này với chất thụ cảm

- Đồng thời hình dạng của phân tử cũng phải đạt mức mềm dẻo hoặc cứng nhắc cần thiết và vị trí của các nhóm hoạt động có thuận lợi khi tương tác với chất thụ cảm hay không Điều này có thể thấy được qua các hoạt tính khác nhau của các đồng phân khác nhau

v Sự thế và biến đổi nhóm chức:

Khi thay đổi nhóm chức này bằng một nhóm chức khác, một hoặc nhiều thông số sau của hợp chất cũng sẽ thay đổi: kích thước, hình dạng, mật độ điện tích, tính ưa dầu, ưa nước, pKa, liên kết hiđro Từ đó sẽ dẫn tới ý tưởng thay đổi nhóm chức tùy theo mục đích mong muốn:

- Cấu trúc: nếu nhóm muốn thay đổi có một yếu tố hình học đóng vai trò quan trọng thì phải lưu tâm đến kích thước, hình dạng và liên kết hiđro

- Tương tác với chất thụ cảm: nếu nhóm chức muốn thay đổi có tương tác đặc biệt với một chất thụ cảm hoặc enzim thì tất cả các thông số trừ khả năng tan trong dầu

và trong nước đều quan trọng

- Dược động học: nếu nhóm muốn thay thế với mục đích cần cho quá trình hấp thu, vận chuyển và đào thải của hợp chất thì khả năng tan trong dầu, trong nước, pKa,

và liên kết hiđro là quan trọng

- Chuyển hóa: nếu nhóm chức đó liên quan đến việc bảo vệ hoặc hỗ trợ sự chuyển hóa thì khả năng phản ứng hóa học phải được chú ý

Từ các vấn đề mang tính lý thuyết định tính đó, người ta đã đưa ra một số nghiên cứu về các thông số lý hóa tác động lên mối quan hệ định lượng giữa cấu trúc và hoạt tính:

- ảnh hưởng của thông số điện tử: các thông số điện tử có mối quan hệ mật thiết đến khả năng phản ứng và hoạt tính sinh học của hợp chất Các thông số đó có thể là thông số Hammett, moment lưỡng cực, điện tích nguyên tử Q,…

- ảnh hưởng của khả năng tan trong dầu: cơ bản dựa trên quan điểm của Hansch và

đồng sự [79] về hoạt động của thuốc phụ thuộc vào hai quá trình: dược động học (nghiên cứu ảnh hưởng của cơ thể đối với thuốc) và dược lực học (nghiên cứu tác dụng của thuốc đối với cơ thể) Đối với quá trình thứ nhất, một trong những nguyên tắc cần thiết để một hợp chất có thể tấn công vào tế bào đó là nó phải đi qua môi trường bên ngoài và dễ dàng xâm nhập được qua màng tế bào, điều này

đòi hỏi hợp chất đó phải tương tác được với cả hai môi trường khác nhau: ưa béo (thí dụ: màng tế bào) và ưa nước (thí dụ: tế bào chất) Nhóm của Hansch đã đưa ra một thông số có thể giúp cho việc tính toán này đó là logP LogP được định nghĩa

là hệ số chỉ khả năng phân bố của hợp chất giữa 1-octanol (được xem như có tính chất gần giống với màng tế bào tự nhiên) và nước

Khi một hợp chất tan trong nước nhiều hơn, P < 1, logP sẽ âm Nếu tan nhiều hơn trong 1-octanol, P > 1, logP sẽ dương Khi logP quá lớn, tương tác lớn đến nỗi hợp chất không thể băng qua pha nước mà sẽ cố định ngay tại pha chất béo đầu tiên mà nó tương tác Còn khi logP quá âm, hợp chất không vào được pha chất béo

mà nằm lại ở pha nước Vì vậy sẽ có một giá trị logPo là hệ số phân bố tối ưu cho hoạt tính sinh học Theo Hansch, giá trị logPo gần bằng 2 là giá trị tốt nhất cho quá trình thẩm thấu

- ảnh hưởng của các thông số lập thể: phản ánh tính chất không gian của hợp chất

Dựa trên các nghiên cứu trên mà người ta đã đưa ra nhiều mô hình toán học để thiết lập mối liên quan định lượng cấu trúc-hoạt tính, mô hình đơn giản ban đầu của Hansch đưa ra có dạng [4]:

log1/C = B1logP + B2σ + K sau đó được ông phát triển thành dạng:

log1/C = -B1(logP)2 + B2logP + B3σ + K log1/C = -B1π2 + B2π + B3σ + B4ES + K

P: hệ số phân bố của hợp chất trong n-octanol/nước ES: thông số lập thể

B1, B2, B3, B4, K: hệ số hồi quy π: logP

Ngoài ra còn có các mô hình cộng hợp (mô hình Free-Wilson hay mô hình de Novo), mô hình hóa lượng tử…

Từ các thông số lý hóa của từng nhóm chất, làm thế nào để có thể tạo mối thông tin liên hệ để tổng hợp các hợp chất khác nhau nhằm tối ưu hóa cấu trúc của chất nền ban đầu? Đầu tiên phải tổng hợp nhiều hợp chất có liên quan đến chất nền ban đầu và xác định hoạt tính sinh học trên một số thử nghiệm Sau đó dựa trên các dữ liệu này sẽ tiến hành tính toán bằng một số phương pháp định lượng liên quan hoạt tính và cấu trúc hóa học (QSAR) bằng các phần mềm mô hình hóa trên máy tính…

1.3.2.2

1.3.2.2 Các nghiên cứu về mối quan hệ giữa các Các nghiên cứu về mối quan hệ giữa các Các nghiên cứu về mối quan hệ giữa các flavonoitflavonoitflavonoit và các dẫn xuất và các dẫn xuất

với hoạt tính sinh học với hoạt tính sinh học [57]

Nhiều nghiên cứu được tiến hành để tìm mối tương quan giữa cấu trúc và hoạt tính của các flavonoit để phục vụ cho việc phát hiện các loại thuốc mới Tuy nhiên có thể do các thông tin về các hợp chất khá phân tán nên người ta đạt được rất

ít thông tin về mối quan hệ có thể có giữa cấu trúc và hoạt tính Nếu có các kết luận thì đôi khi lại mâu thuẫn nhau giữa các tác giả Điều này có thể do:

- Khả năng chống ung thư có thể bị tác động bởi nhiều cơ chế khác nhau do đó sẽ cần các chất có cấu trúc khác nhau Thí dụ riêng khả năng chống oxi hóa của flavonoit để ngăn ngừa ung thư có thể bị tác động bởi nhiều cơ chế khác nhau (bắt gốc tự do, tạo chelat với ion kim loại, ức chế enzim,…) nên đối với mỗi cơ chế kháng oxi hóa sẽ cần các hợp chất có cấu trúc phù hợp với cơ chế đó

- Nếu thử nghiệm trên cùng loại cơ chế chống ung thư thì vẫn cần có các cấu trúc khác nhau do thử trên các hệ khác nhau

- Và nếu thử theo cùng một phương pháp thì vẫn còn bị ảnh hưởng bởi cấu trúc tổng thể của hợp chất đó Chúng ta không thể bỏ qua cấu trúc chung của hợp chất khi xem xét một nhóm cấu trúc riêng biệt nào đó làm tăng hay giảm hoạt tính Thí dụ một số nghiên cứu cho thấy nhóm đường trong cấu trúc làm giảm khả năng bắt gốc

tự do của flavonoit, tuy nhiên nghiên cứu trên 41 loại flavon của Takako Yokozawa [89] cho thấy nhóm đường có thể làm tăng hoặc giảm khả năng bắt gốc

tự do tùy thuộc vào các nhóm thay thế trong cấu trúc còn lại của flavonoit

Vì vậy khi xem xét mối quan hệ cấu trúc và hoạt tính chúng ta phải quan tâm

đến tất cả các yếu tố này để có thể tránh đưa ra những kết luận mâu thuẫn nhau Tuy nhiên về cơ bản chúng ta có thể quan tâm đến một số yếu tố về cấu trúc có thể mang lại hoạt tính cho flavonoit như sau:

- Vòng C: Những thay đổi ở liên kết đôi C2-C3, nhóm oxo ở vị trí C4, vòng C mở hay là vị trí của vòng B (ở C2 hoặc C3)… có thể tạo ra những hoạt tính khác nhau của flavonoit Tùy thuộc vào cơ chế tác động mà sự thay đổi này có thể làm tăng hoặc cũng có thể không làm thay đổi hoạt tính của hợp chất

- Loại và số lượng các nhóm chức: việc làm tăng khả năng tan trong nước của các nhóm chức sẽ gây khó khăn cho quá trình đi vào tế bào, đôi khi sẽ làm giảm hiệu quả của hợp chất, tuy nhiên trong một số trường hợp điều này lại cần thiết cho quá trình tương tác giữa flavonoit và đích cần đến Vì vậy tùy thuộc vào cơ chế của hoạt động mà ta thay đổi các dạng và số lượng nhóm chức khác nhau để làm tăng / giảm hoạt tính Các nhóm thông thường được sử dụng thay thế hiện nay là hiđroxi

và metoxi

- Vị trí của các nhóm chức thay thế

1.4

1.4 X X XáááC C C ĐĐĐịịịịNH NH NH ĐĐĐốốốI TI TI TƯƯƯợợợNG NGHING NGHING NGHIÊÊÊÊN CN CN CứứứứUUU

Việt Nam là một trong những nước Đông Nam á có trữ lượng quả họ Cam (bưởi, cam, chanh, quýt…) khá cao, khoảng 400.000 tấn / năm nhưng cho đến nay lượng vỏ quả này vẫn còn là một loại rác thải, chưa được sử dụng trong khi ở các nước khác đã sản xuất ra hàng trăm tấn các loại chế phẩm từ các loại bã vỏ này và nước ta vẫn phải nhập khẩu về dưới dạng các sản phẩm đã bào chế Bên cạnh đó, cây

hòe cũng là một loại cây có vùng nguyên liệu khá lớn trong nước, lượng nụ hòe chủ yếu chỉ để làm phẩm màu, sắc uống hoặc cung cấp cho các công ty dược để chiết rutin

Vì vậy, trên cơ sở các tính chất dược lý của flavonoit và nguồn nguyên liệu

có sẵn trong nước mà hoa hòe và vỏ quýt được chọn để nghiên cứu Đây cũng là nguồn nguyên liệu chứa rutin và hesperidin, hai hợp chất đại diện cho hai nhóm flavonol và flavanon có hoạt tính sinh học cao để tiến hành chiết tách và bán tổng hợp các dẫn xuất Xác định các tác dụng sinh học nhằm góp phần nghiên cứu thêm

về các hợp chất này cũng như nâng cao khả năng sử dụng nguồn nguyên liệu thiên nhiên có sẵn trong nước

Trong cây hòe chứa 6-35% rutin tùy thuộc vào từng phần của cây (nụ hòe 30

- 35%, vỏ quả 0,5%, lá cây 4,4%) Ngoài cây hòe, còn có một số loại cây thuộc các

họ thực vật khác nhau có chứa rutin nhưng với hàm lượng thấp hơn

Khi nói đến hoa hòe, người ta nghĩ ngay đến rutin Rutin là một loại vitamin

P có tác dụng rất quý, giúp tăng cường sức bền của mao mạch (thành mạch máu), làm giảm tính “dòn” và tính thấm của mao mạch Khi thủy phân rutin sẽ cho quercetin, glucozơ và ramnozơ Rutin còn có tác dụng rất tốt trong phác đồ điều trị các bệnh viêm gan siêu vi B, C và giúp tăng cường sức đề kháng cho những người có cơ địa gầy yếu, suy nhược cơ thể, lao sơ nhiễm

Do rutin có hàm lượng khá lớn trong nụ hoa hòe nên chúng tôi tiến hành chiết rutin trong nụ hoa hòe để làm nguyên liệu cho cả quá trình nghiên cứu sau này

1.4444.2.2.2 QuercetinQuercetinQuercetin

Quercetin là một hợp chất phenol được tìm thấy trong nhiều loài cây thiên nhiên, trong nhiều sản phẩm thực phẩm, các loại thuốc nhuộm tự nhiên… [31]

Trong những năm gần đây, quercetin được nghiên cứu rộng rãi trên thế giới

do nó có hoạt tính mạnh so với các loại flavonoit khác Tuy nhiên nguồn quercetin

có sẵn trong thiên nhiên tương đối thấp, đòi hỏi quá trình trích chiết lâu dài và kém hiệu quả Do đó người ta đã tìm phương pháp để có thể tổng hợp quercetin cũng từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên Đó là phương pháp thủy phân rutin, một loại flavonoit có hàm lượng cao trong một số loại cây để tạo ra quercetin Phương pháp này đặc biệt phù hợp với điều kiện của Việt Nam, là nơi trồng nhiều cây Hòe, loại cây có hàm lượng rutin lên đến 30% Vì vậy, chúng tôi chọn phương pháp thủy phân rutin thành quercetin để tạo ra nguyên liệu ban đầu cho các phản ứng tổng hợp tiếp theo

v Một số tác dụng dược lý của quercetin [18][23][24][25][31][52][87]

- Quercetin làm giảm nguy cơ ung thư

Quercetin giúp làm giảm nguy cơ phát triển của ung thư Các thử nghiệm cho thấy quercetin có khả năng ức chế tế bào ung thư vú Người ta còn quan sát thấy không có tình trạng nhiễm độc hay mất trọng lượng ở chuột sau 20 tuần như vài loại thuốc khác Khi sử dụng chung với cisplatin, một loại thuốc chống ung thư hiệu quả

đang được sử dụng, cho thấy làm tăng hiệu quả chống tăng sinh khi thử nghiệm trên dòng tế bào ung thư OVCA 433.[80][81]

Nghiên cứu hơn 200 loại flavonoit cho thấy quercetin làm tăng tuổi thọ của chuột bị bệnh bạch cầu Một số thử nghiệm trong ống nghiệm và trên tế bào cho thấy khả năng ức chế sự phát triển của tế bào bệnh bạch cầu và triển vọng cho thấy

có thể sử dụng quercetin trong điều trị bệnh bạch cầu cấp tính

Một cuộc nghiên cứu cho thấy những người thường xuyên ăn táo ( một loại trái cây chứa nhiều quercetin ) có tỉ lệ ung thư phổi thấp hơn 58% so với những người không thường xuyên ăn táo Những người ăn thực phẩm giàu quercetin và các loại flavonoit khác có tỉ lệ ung thư bao tử, phổi, tụy và vú thấp [97]

- Quercetin giúp ngăn ngừa bệnh tim

Quercetin và rutin có khả năng ức chế sự peroxi hóa LDL (low-density lipoprotein), nguyên nhân gây ra sự nhiễm độc tế bào Quercetin còn có khả năng ức chế sự tích tụ các tiểu huyết cầu gây đông máu, ức chế sự peroxi hóa chất béo, giãn

nở và tăng độ bền thành mạch máu …

- Là chất chống oxi hóa [67]

Quercetin là chất có khả năng bắt gốc tự do và chống lại sự oxi hóa

- Hoạt tính kháng viêm, kháng virut

Đa số các nghiên cứu cho thấy không có bằng chứng nào chứng tỏ quercetin

là chất có thể gây những biến đổi về mặt sinh học Vì vậy, nó được ứng dụng rộng rãi trong các sản phẩm thực phẩm, y học và dược học và được sử dụng trong mỹ phẩm

Quercetin có khả năng là nguyên liệu ban đầu trong các chương trình nghiên cứu phát triển về thuốc ảnh hưởng tích cực của quercetin lên các tế bào ung thư đã thúc đẩy nhiều nghiên cứu tổng hợp cũng như thử nghiệm các dẫn xuất của quercetin để nhằm tìm kiếm các tác nhân chống ung thư hiệu quả nhất và đã đạt

được một số kết quả khả quan

1

1.4444.3.3.3 Vỏ quýt và hesperidinVỏ quýt và hesperidinVỏ quýt và hesperidin

Hesperidin thuộc nhóm flavonoit, tìm thấy ở các loài cây thuộc họ cam quýt như quýt, cam, chanh, bưởi… Hesperidin chiếm hàm lượng lớn trong vỏ của cây quýt

Cây Quýt [8]

Quýt là một loại cây được trồng khắp nơi trong nước ta Nhiều nhất tại các tỉnh Nghệ An, Hà Tĩnh, Quảng Trị, Thừa Thiên, Nam Định, Hà Nam, Bắc Kạn, Thái Nguyên, Bắc Giang, Bắc Ninh, …

Về y học, từ múi quýt đến vỏ, hạt, xơ, múi, lá quýt đều là những vị thuốc nổi tiếng Trong thành phần của cây quýt, hesperidin chiếm chủ yếu trong vỏ quýt với hàm lượng khoảng 3,0% tính theo dược liệu khô kiệt Hesperidin từ vỏ quýt có tác dụng làm bền thành mạch, chữa trĩ, lợi mật, kháng nấm, kháng khuẩn và chống ngưng tập tiểu cầu

v Hoạt tính của hesperidin

- Trong chữa trị ung thư:

Một công trình nghiên cứu năm 1997 của Nhật có liên quan đến flavonoit đã

sử dụng diosmin và hesperidin từ quả thuộc họ Cam để theo dõi hiệu quả phòng ung thư đại tràng [89] Hai chất này có bản chất kháng oxi hóa, tác dụng chống viêm và tác dụng ức chế tổng hợp prostaglandin Việc thay đổi quá trình sinh tổng hợp prostaglandin có thể làm biến đổi khả năng sinh ung thư đại tràng ở cả người và

động vật Mặt khác người ta còn thấy diosmin và hesperidin có tác dụng chống biến

dị, làm biến đổi các enzim chuyển hoá thuốc và tác dụng chống khởi phát ung thư giống như các tác nhân ngăn cản hoá học chống ung thư đại tràng khác

- Một số nghiên cứu cho thấy: Hesperidin được sử dụng rộng rãi trong dược phẩm,

mỹ phẩm và thực phẩm Hesperidin là chất có hoạt tính chống oxi hóa, kháng viêm, kháng khối u, làm bền vững thành mao mạch, ngăn ngừa sự chảy máu và

điều chỉnh huyết áp, ức chế các enzim

1

1.4444.4.4.4 HesperHesperHesperetinetinetin

Hesperetin được điều chế bằng phản ứng thủy phân hesperidin trong môi trường axit

v Tính chất dược lý của hesperetin [28][30][36][59]

- Hesperetin là chất chống oxi, có khả năng làm sạch một cách hiệu quả peroxinitrit:

Hesperetin đã được chứng minh là có khả năng làm sạch (ONOO)- hiệu quả

và đáng tin cậy Hesperetin cũng chứng tỏ khả năng bảo vệ tế bào khỏi tác nhân gây hại bởi (ONOO)-

- Hesperetin làm giảm nguy cơ ung thư

Hesperetin làm giảm nguy cơ phát triển ung thư Các nhà khoa học đã nhận dạng vài bioflavonoit từ họ Cam ức chế cytochrom enzim P450 [58] Tác hại của những enzim này rất nghiêm trọng, chúng kích hoạt các procarcinogen : khói thuốc, thuốc trừ sâu, … trở thành những chất sinh ung thư

- Hesperetin có khả năng chữa trị hiệu quả các bệnh về da như viêm da, mụn trứng cá, …

Đối với các bệnh do viêm tuyến nhờn dưới da, mụn trứng cá, … hesperetin đã

được chứng nhận là dược phẩm sử dụng an toàn, có hiệu quả điều trị cao hơn so với các phương pháp chữa trị khác

- Hesperidin, hesperetin giúp ngăn ngừa và chữa trị bệnh tim

Hesperidin và hesperetin làm giảm nguy cơ phát triển của bệnh tim mạch : xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, … gây ra bởi các enzim do khả năng ức chế hoạt

động của các enzim này

- Hesperidin, hesperetin ảnh hưởng lên sự chuyển hóa xương

Hesperidin, hesperetin có khả năng ức chế sự thoái hóa xương Với phát minh này, hesperidin và hesperetin vừa là nguồn dinh dưỡng, vừa là dược phẩm quan trọng cho con người trong việc phát triển xương, phòng và chống bệnh loãng xương [45]

- Hesperidin, hesperetin giúp ngăn ngừa và chữa trị bệnh gan

Một số nghiên cứu cho thấy hesperidin và hesperetin được đưa vào sử dụng

để phòng ngừa và chữa trị bệnh gan : viêm gan, xơ gan, ung thư gan

CHƯƠ ƯƠ ƯƠNG 2: PH NG 2: PH NG 2: PHƯƠ ƯƠ ƯƠNG PHáP NGHI NG PHáP NGHI NG PHáP NGHIÊÊÊÊN CứU N CứU N CứU

2.1

2.1 nguyên liệunguyên liệunguyên liệu H H HóóóA CHA CHA CHấấấấTTTT

• NguyênNguyênNguyên liệu liệu liệu

Hoa hòe, vỏ quýt được mua tại chợ bán dược liệu đường Hải Thượng Lãn

Ông, quận 5

• Các hóa chất tổng hợp:Các hóa chất tổng hợp:Các hóa chất tổng hợp:

- Các hóa chất sử dụng trong phản ứng tổng hợp được mua từ các hãng Merck, Aldrich, Sigma

- Các dung môi sử dụng đạt tiêu chuẩn dùng trong tổng hợp hữu cơ và phân tích

• Vật liệu sinh học và hóa chất dùng Vật liệu sinh học và hóa chất dùng Vật liệu sinh học và hóa chất dùng trong các thử nghiệm hoạt tínhtrong các thử nghiệm hoạt tínhtrong các thử nghiệm hoạt tính

Sử dụng ba dòng tế bào ung thư người là MCF-7 (ung thư vú), HeLa (ung thư

cổ tử cung), NCI-H460 (ung thư phổi) trong sàng lọc tính gây độc tế bào (hình 2.1)

do Viện Ung Thư Quốc Gia Hoa Kỳ (NCI – Frederick, MD, USA) cung cấp Đây

là những dòng tế bào được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ sử dụng trong sàng lọc ban đầu và chúng cũng tương ứng với một số dạng ung thư phổ biến hiện nay

Hình 2.1:

Hình 2.1: Các dòng tế bào ung thư thử nghiệm

- Các mẫu thử nghiệm gồm các flavonol, flavanon và các dẫn xuất được tổng hợp theo phương pháp được mô tả trong luận án

- Các hóa chất, môi trường, … đều đạt tiêu chuẩn trong các thử nghiệm sinh học

v Tách chiết rutinTách chiết rutinTách chiết rutin

Rutin là một hợp chất có thể tan được trong nhiều dung môi: nước nóng, etanol, metanol, dung dịch NaOH loãng…Qua nghiên cứu và thử nghiệm, chọn phương án chiết rutin từ nụ hoa hòe trong dung môi etanol 80% bằng phương pháp

đun hồi lưu

v TTTách chiết hesperidin từ vỏ quýtách chiết hesperidin từ vỏ quýtách chiết hesperidin từ vỏ quýt

Hesperidin là một hợp chất có thể tan trong nhiều dung môi, độ tan tăng dần trong các dung môi sau: benzen, clorofom, nước, axeton, metanol, dung dịch NaOH loãng…Qua nghiên cứu tài liệu [10], chọn phương pháp chiết hesperidin từ vỏ quýt bằng dung môi metanol trong soxhlet

2.3

2.3 PH PH PHƯƠƯƠƯƠNG PHNG PHNG PHáááP THP THP THủủủY PHY PHY PHÂÂÂN RUTIN VN RUTIN VN RUTIN Vààà HESPERIDIN HESPERIDIN HESPERIDIN

Quercetin và hesperetin được điều chế bằng phản ứng thủy phân rutin và hesperidin trong môi trường axit

2.4

2.4 PH PH PHƯƠƯƠƯƠNG PHNG PHNG PHáááP TP TP TổổổNGNGNG H H HợợợP CP CP CáááC DC DC DẫẫẫN XUN XUN XUấấấấT T T FLAVONOITFLAVONOITFLAVONOIT

Mục đích của việc tổng hợp các dẫn xuất là để biến đổi cấu trúc của các chất ban đầu nhằm thay đổi tính chất lý hóa, là nguyên nhân làm thay đổi hoạt tính sinh học của chất, từ đó có thể tạo ra các hợp chất có hoạt tính tốt hơn, phù hợp để làm các sản phẩm phục vụ cho các ngành dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm

Theo các tổng kết của Ioan Simiti và Ioan Schwartz [6], các nhóm chức có thể

ảnh hưởng tới hoạt tính sinh học của một hợp chất khi thay đổi cấu trúc của phân tử

là các nhóm hiđroxil, thiol, halogen, nitro, amino, ankyl Khi đưa các nhóm chức này vào phân tử hữu cơ sẽ làm ảnh hưởng tới tính chất lý hóa và dĩ nhiên có ảnh hưởng tới hoạt tính sinh học Sự thay đổi cấu trúc hóa học có thể làm tăng, giảm hoặc có thêm (thay đổi) tác dụng sinh học mới

Với yêu cầu giữ nguyên khung cấu trúc flavonoit, các phương pháp este hóa, ete hóa các nhóm hiđroxil trên khung flavonoit và gắn nhóm halogen vào cấu trúc nhân được lựa chọn để tổng hợp các dẫn xuất khác nhau từ các flavonoit đã có

- TTTổng hợp các dẫn xuất ổng hợp các dẫn xuất ổng hợp các dẫn xuất esteesteeste

Thực hiện phản ứng este hóa nhóm hiđroxil của quercetin, hesperidin và hesperetin bằng tác nhân anhiđrit axetic hoặc các axyl clorua trong môi trường piridin, nhiệt độ phòng (phản ứng thế ái nhân trên C của nhóm cacbonyl)

TTTổng hợp các dẫn xuất ổng hợp các dẫn xuất ổng hợp các dẫn xuất eteeteete

Phản ứng ete hóa được thực hiện bằng phương pháp tổng hợp Williamson:

hoặc: ArO- + (CH3O)2SO2 Ar-O-CH3 + CH3OSO3-

Các flavonoit được tiến hành ete hóa trong môi trường K2CO3, axeton với các tác nhân dimetyl sulfat hoặc ankyl bromua

Tổng hợp các dẫn xTổng hợp các dẫn xTổng hợp các dẫn xuất chứa halogen của hesperetinuất chứa halogen của hesperetinuất chứa halogen của hesperetin

Có nhiều phương pháp có thể sử dụng để tổng hợp các hợp chất halogen, có thể bằng phản ứng trực tiếp với halogen hoặc sử dụng các axit halogen với sự có mặt của các muối halogen như HgCl2, các tác nhân này có độ độc hại cao, ăn mòn mạnh Ngoài ra còn có thể sử dụng KBr-H2O2, KBr-NaBO3, tuy nhiên phương pháp này đòi hỏi điều kiện thí nghiệm phức tạp Vì vậy, phương án halogen hóa hesperetin với KCl, KBr là nguồn cung cấp halogen và xúc tác oxon được sử dụng do oxon(2KHSO5.KHSO4.K2SO4) là tác nhân rẻ tiền, ổn định, không độc hại đối với môi trường, điều kiện phản ứng đơn giản [106]

(0,063-Kết tinh nhiều lần:

Có thể sử dụng kỹ thuật kết tinh nhiều lần trên các hệ dung môi đã chọn lọc 2.6

2.6 PH PH PHƯƠƯƠƯƠNG PHNG PHNG PHáááP XP XP XáááC C C ĐĐĐịịịịNH CNH CNH CấấấấU TRU TRU TRúúúC HC HC HóóóA HA HA HọọọC CC CC CáááC HC HC HợợợP CHP CHP CHấấấấTTTT

Điểm nóng chảy: Điểm nóng chảy:

Điểm nóng chảy đo trên máy Electrothermal IA 9000 series dùng mao quản, nhiệt kế không hiệu chỉnh

Phổ hấp thu tử ngoại (UV): Phổ hấp thu tử ngoại (UV):

Đo trên máy UV/Vis Spectrometer V-530 (Shimadzu) tại Viện Công nghệ Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phổ hồng ngoại (IR):::: Phổ hồng ngoại (IR)

Phổ IR được xác định bằng phương pháp trộn mẫu với KBr Chất thử được trộn với KBr và nghiền mịn trên cối đá mã não, sau đó ép trên máy nén để tạo viên KBr

và đo trên máy Vector 22 Bruker tại Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phổ sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC MS):Phổ sắc ký lỏng ghép khối phổ (LCMS):MS):

Độ sạch và trọng lượng phân tử các hợp chất được đo trên máy Agilent 1100 LC-MSD Trap (dùng kỹ thuật ESI: Electron Spray Ionization mass spectra)của Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR):Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR):ng hưởng từ hạt nhân (NMR):

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC được

đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer (ghi ở 500 MHz cho phổ proton

và ở 125 MHz cho phổ 13C), Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam 2.7

2.7 Cá Cá CáC PHC PHC PHƯƠƯƠƯƠNG PHáP XáC NG PHáP XáC NG PHáP XáC ĐĐĐịNH HOạT TíNH SINH HọịNH HOạT TíNH SINH HọịNH HOạT TíNH SINH HọCCC

(màu tím) (màu vàng)

Nguyên tắc: các chất nghiên cứu có tác dụng chống oxi hóa theo cơ chế dập tắt gốc tự do sẽ làm giảm màu của dung dịch DPPH Xác định khả năng này bằng cách đo độ hấp thu của dung dịch khảo sát ở bước sóng có hấp thu cực đại tại 517

nm

2.7.1.2

2.7.1.2 Xác định sản phẩm Xác định sản phẩm Xác định sản phẩm của quá trình per của quá trình per của quá trình peroxioxioxi hóa lipi hóa lipi hóa lipitttt [82] (thực hiện tại

Bộ môn Dược lý-Hóa sinh, Trung tâm Sâm và Dược liệu TP.HCM, Viện Dược liệu)

Xác định khả năng ức chế peroxi hóa lipit thông qua việc xác định hàm lượng malonyl dialdehyt (MDA) theo phương pháp của Makarova

Nguyên tắc: MDA là sản phẩm của quá trình peroxi hóa lipit màng tế bào MDA có khả năng phản ứng với axit thiobarbituric (TBA) để tạo thành phức hợp trimethin (màu hồng) có đỉnh hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm Phản ứng này thực hiện trong môi trường pH = 2-3, ở nhiệt độ 90-100oC trong vòng 15 phút Các chất chống oxi hóa sẽ ức chế quá trình peroxi hóa lipit màng tế bào, ngăn chặn sự tạo thành MDA Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ với hàm lượng MDA

O

H MDA

2.7.2

2.7.2 P P Phương pháp xác định hương pháp xác định hương pháp xác định khả năng kháng nấm, kháng khuẩnkhả năng kháng nấm, kháng khuẩnkhả năng kháng nấm, kháng khuẩn

Các mẫu được thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm tại phòng Sinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên – Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam bằng phương pháp của Vanden Bergher và Vlietlinck [94] trên phiến

96 giếng theo hai bước:

Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính,

Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn

Kháng sinh đối chứng bao gồm: ampicilin đối với vi khuẩn Gr(+), tetracyclin

đối với vi khuẩn Gr(-), nystatin đối với nấm sợi và nấm men Kháng sinh pha trong DMSO 100% với nồng độ thích hợp: ampicilin 50mM, tetraxylin : 10mM, nystatin: 0,04mM

Các chủng vi sinh vật thử nghiệm bao gồm:

- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922)

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923)

- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212)

Staphylococcus aureus

- Nấm sợi: Aspergillus niger, Fusarium oxisporum

- Nấm men: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae

Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:

- Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Saboraud dextrose broth cho nấm, vi khuẩn trong môi trường Trypcase soya broth

- Môi trường thí nghiệm: Eugon broth cho vi khuẩn, myco phil cho nấm 2.7.3

2.7.3 TTThử nghiệm khả năng gây độc tế bào theo phương pháp SRBhử nghiệm khả năng gây độc tế bào theo phương pháp SRBhử nghiệm khả năng gây độc tế bào theo phương pháp SRB [3](thực hiện tại Phòng Thí nghệm Sinh học phân tử- Bộ môn Di truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia TP.HCM)

Nguyên tắc: sử dụng phương pháp Sulforhodamin

B (SRB) là một phương pháp nhuộm màu đơn giản và

nhạy để xác định độc tính tế bào của một chất SRB là một

thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với

các phần tích điện dương của protein Lượng thuốc nhuộm

liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào

Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịch trong suốt có màu hồng Mật

độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng tế

O O

O

OO

-OH

Sulforhodamin B

bào Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu đối chứng phản ánh độc tính tế bào của chất thử

Tự nhiên - Đại học Quốc gia TP.HCM)

Tế bào chết theo hai cơ chế - apoptosis (chết theo chương trình) và necrosis (hoại tử) Hoại tử xảy ra khi tế bào bị những tổn thương cơ học Còn sự chết theo chương trình là hiện tượng “tự tử” của tế bào, được điều hòa chặt chẽ ở mức độ gen Quá trình này xảy ra chậm hơn hoại tử, từ vài giờ đến vài ngày, phụ thuộc vào chất cảm ứng Hình thái tế bào apoptosis biến đổi theo ba giai đoạn Đầu tiên, tế bào bị mất tính bám, tròn lại và tách khỏi giá đỡ, mất nước và co lại, có hiện tượng nảy chồi ở màng sinh chất, thể tích tế bào giảm, nhiễm sắc chất cô đặc, ADN trải qua

đợt phân cắt đầu tiên tạo nên những phân mảnh rất lớn có kích thước từ 50-200 kbp

ở giai đoạn giữa, ADN tiếp tục bị phân cắt mạnh và đặc hiệu bởi các DNase được hoạt hóa bởi caspase, tạo các phân mảnh có kích thước là bội số của 180 bp ở giai

đoạn cuối, màng tế bào vỡ, hiện tượng ly giải tế bào xảy ra Trong điều trị ung thư, mục tiêu nhắm đến là khởi phát quá trình chết theo chương trình (apoptosis) chuyên biệt ở tế bào của khối u

Quá trình cảm ứng apoptosis của tế bào được xác định bằng quy trình tách chiết ADN phân mảnh, đây không phải là một phương pháp định lượng, nhưng là một phương pháp định tính đặc biệt đáng tin cậy để xác định hiện tượng apoptosis: trong quá trình apoptosis ở tế bào động vật có vú, endonuclease được hoạt hoá sẽ phân cắt cấu trúc chromatin tại liên kết giữa các nucleosome thành những đoạn nhỏ

có kích thước là bội số của 180 - 200 bp (hình 2.2) Những đoạn ADN này được tách chiết từ tế bào và phân tách thành thang ADN khi điện di trên gel agaroza với thuốc nhuộm ethidium bromua

Hình 2.2:

Hình 2.2: Hiện tượng ADN phân mảnh ở tế bào apoptosis 2.7.5

2.7.5 Phương pháp xác định mật độ điện tích Phương pháp xác định mật độ điện tích Phương pháp xác định mật độ điện tích và hệ số phân bố dầu/nướcvà hệ số phân bố dầu/nướcvà hệ số phân bố dầu/nước

Tối ưu hóa cấu trúc hình học của phân tử được tính toán bằng các phương pháp cơ học phân tử, sử dụng trường lực MM+ và sau đó được tối ưu hóa lại bằng phương pháp bán thực nghiệm (semi-empirical) PM3, đây là phương pháp tính toán cơ học lượng tử nhằm mô tả thuộc tính của nguyên tử và phân tử được sử dụng cho các phân tử hữu cơ và nhiều nguyên tố nhóm chính Mật độ điện tích được tính toán bằng phương pháp bán lượng tử gần đúng PM3 trong phần mềm Hyperchem release 7.5 Hệ số phân bố dầu/nước (logP) được tính bằng chương trình ChemOffice 2008 version 11.0

Giá trị độc tính tế bào IC50 (àM) được chuyển đổi thành giá trị log(1/IC50) dùng trong xây dựng phương trình QSAR Phân tích ‘QSAR-ngẫu nhiên’ (QSAR-Contingency) trên phần mềm MOE được sử dụng để phân tích sơ bộ mối quan hệ giữa các thông số mô tả phân tử và hoạt tính sinh học [64] Phân tích bình phương tối thiểu từng phần (Partial Least Squares PLS) được tiến hành trên các thông số mô tả phân tử và được đánh giá chéo bằng phân tích Leave-One-Out (LOO) [9]

- Diện tích tô pô bề mặt phân cực phân tử (TPSA):

Diện tích tô pô bề mặt phân cực phân tử (TPSA – topological polar surface area) đ−ợc xác định bằng tổng diện tích bề mặt của các mảnh cấu trúc phân cực [29]

- Hệ số phân bố dầu nước (logP): (Tổng quan, trang 20)

Hệ số được sử dụng như là một thông số xác định khả năng di chuyển của thuốc xuyên qua các màng tế bào [64]

Theo đó, đường kính phân tử của hợp chất này là 3 (Å)

- Số lượng các liên kết có khả năng quay (opr_nrot):

Các liên kết có khả năng quay được xác định và sử dụng như là thông số mô tả cấu trúc phân tử Liên kết có khả năng quay được định nghĩa là các liên kết đơn không vòng và nối với các nguyên tử không phải hiđro [68]

CH CHƯƠ ƯƠ ƯƠNG 3: THựC NGHIệM NG 3: THựC NGHIệM NG 3: THựC NGHIệM

3.1

3.1 X X Xửửửử L L Lýýý nguyênnguyênnguyên LI LI LIệệệệUUU

Nụ hoa hòe khô và vỏ quýt được mua ở khu vực bán dược liệu đường Hải Thượng Lãn Ông, quận 5, TP.HCM rồi được đem sàng để loại tạp đất cát, loại bỏ cành, lá… chỉ giữ lại nụ hoa và vỏ quýt, đem sấy khô ở nhiệt độ 50- 60oC, độ ẩm 8% Sau đó đem nghiền thành bột mịn, bảo quản trong hũ thủy tinh kín đặt ở nơi mát, tránh ánh sáng và tránh hút ẩm trở lại để dùng cho quá trình nghiên cứu tiếp theo

3.2

3.2 CHI CHI CHIếếếếT T T flavonoitflavonoitflavonoit từ nguyên liệu từ nguyên liệu từ nguyên liệu – thủy phân tạo dẫn xuấtthủy phân tạo dẫn xuấtthủy phân tạo dẫn xuất

v Chiết rutinChiết rutinChiết rutin từ hoa hòetừ hoa hòetừ hoa hòe (ký hiệu rutin là Ru) (ký hiệu rutin là Ru) (ký hiệu rutin là Ru)

Cho 60,0 gam dược liệu (bột nụ hoa hòe) và 600 ml dung môi etanol 80% (5 lần) vào bình cầu 1000 ml, đun hồi lưu ở nhiệt độ sôi của dung dịch và khuấy bằng máy khuấy trong 120 phút Lọc, sau đó gộp các dịch chiết lại, loại bớt dung môi dưới áp suất thấp Làm lạnh để kết tinh rutin, lọc, rửa sạch bằng nước lạnh rồi đem phần rutin thu được sấy khô ở 80oC thu được rutin thô Làm tinh rutin bằng cách cho kết tinh lại 3 lần trong dung dịch etanol 80%

Thực hiện quá trình chiết nhiều lần để thu được khoảng 500g rutin sử dụng cho nghiên cứu

v Thủy phân rutin thành quercetinThủy phân rutin thành quercetinThủy phân rutin thành quercetin (ký hiệu Q) (ký hiệu Q) (ký hiệu Q)

Lấy 15,0 g rutin tinh và 750 ml axit H2SO4 2% cho vào bình cầu 1000 ml,

đun hồi lưu cách thủy trên máy khuấy từ trong 90 phút Sau đó đem lọc và rửa với nước cho đến khi hết axit trên phễu lọc buchner Phần trên lọc thu được đem sấy ở

105oC đến khối lượng không đổi thu được quercetin thô Kết tinh sản phẩm liên tục

3 lần trong etanol để thu được 10,6g quercetin tinh

Quá trình thủy phân được tiến hành nhiều lần để thu được 100g quercetin dùng cho các phần thí nghiệm sau

v Tách chiết hesperidin từ vỏ quýtTách chiết hesperidin từ vỏ quýtTách chiết hesperidin từ vỏ quýt (ký hiệu hesperidin là HD)(ký hiệu hesperidin là HD)(ký hiệu hesperidin là HD)

Bột vỏ quýt (20g) sau khi đã loại bỏ chất béo, tinh dầu bằng ete dầu hỏa trong soxhlet được làm khô và tiếp tục chiết với metanol Dung dịch chiết được cô loại bớt dung môi, làm lạnh Kết tủa được lọc, rửa bằng metanol lạnh để thu được hesperidin thô (0,4g)

Hesperidin chiết xuất được tinh chế bằng cách kết tinh 4 lần trong metanol Tiến hành lặp lại quá trình nhiều lần để thu được 200g hesperidin sử dụng trong các phản ứng và thử nghiệm sau này

v Thủy phân hesperidin thànhThủy phân hesperidin thànhThủy phân hesperidin thành hesperetin hesperetin hesperetin (ký hiệu HT) (ký hiệu HT) (ký hiệu HT)

Lấy 5,0 gam hesperidin tinh, 100 ml metanol và 5 ml H2SO4 96% cho vào bình cầu Hỗn hợp được đun hồi lưu cách thủy và khuấy nhẹ bằng khuấy từ trong 6 giờ Sau đó hỗn hợp được lọc qua phễu lọc hút chân không, dung dịch lọc được cho vào phễu chiết với 400 ml etyl axetat, rửa bằng 100 ml dung dịch NaCl 15% (1 lần),

150 ml nước cất (3 lần), cuối cùng được làm khô bằng Na2SO4, dung môi sau đó

được loại dưới áp suất thấp Sản phẩm thu được đem sấy chân không ở 80oC đến khối lượng không đổi, thu được hesperetin thô Đem kết tinh lại 3 lần trong metanol thu được hesperetin tinh

Tiếp tục quá trình thủy phân hesperidin để thu được khoảng 50g hesperetin dùng cho quá trình nghiên cứu sau này

3.3 TổNG HợP CáC DẫN XUấT CủTổNG HợP CáC DẫN XUấT CủTổNG HợP CáC DẫN XUấT CủA A A QUERCETINQUERCETINQUERCETIN

3333 3.13.13.1 Tổng hợp các dẫn xuất este của quercetinTổng hợp các dẫn xuất este của quercetinTổng hợp các dẫn xuất este của quercetin

Sơ đồ Sơ đồ 3333.1:.1:.1: Tổng hợp các dẫn xuất este của quercetin

a) n-butylisoxyanat, piridin, nhiệt độ phòng b) Thiophen-2-cacbonyl clorua, piridin, nhiệt độ phòng c) Benzoyl clorua, piridin, nhiệt độ phòng

d) 4-morpholin-cacbonyl clorua, piridin, nhiệt độ phòng e) Propionyl clorua, piridin, nhiệt độ phòng

f) Anhiđrit axetic, piridin, nhiệt độ phòng