lan word hoan chinh ppsx

Ngày nay, kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển, góp phần hạn chế được những nhược điểm trên đồng thời đảm bảo được đặc tính di truyền của các giống lan quý, được nhiều ngườ

MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT

ĐỀ TÀI:

NUÔI CẤY MÔ ĐỊA LAN

XANH CHIỂU

Tp Hồ Chí Minh, tháng 5, 2011

MỤC LỤC PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về loài địa lan 5

1.1.1 Đặc điểm chung 5

1.1.1.1 Đặc điểm phân loại 5

1.1.1.2 Đặc điểm hình thái 5

1.1.1.3 Đặc điểm sinh học và điều kiện chăm sóc 7

1.1.1.4 Các bệnh thường gặp ở địa lan và cách phòng chống 9

1.1.2 Giới thiệu về giống địa lan Xanh Chiểu, ý nghĩa kinh tế 11

1.2 Các phương pháp nhân giống địa lan 14

1.2.1 Nhân giống ngoài tự nhiên 14

1.2.2 Nhân giống trong phòng thí nghiệm 14

1.3 Sơ lược về nuôi cấy mô tế bào thực vật 15

1.4 Hướng nghiên cứu và ý nghĩa thực tiễn của nuôi cấy mô địa lan hiện nay 16

1.4.1 Tạo PLB (protocorm like bodies) từ chồi bên và nhân nhanh: 17

1.4.1.1 Khái niệm về protocorm 17

1.4.1.2 Khái niệm về PLB (protocorm like bodies) 17

1.4.1.3 Khả năng tạo PLB của địa lan 17

1.4.2 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo dòng cây sạch bệnh 19

1.4.3 Lan ra hoa trong ống nghiệm 20

PHẦN 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu : 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1 Tạo PLB (protocorm like body) trực tiếp từ chồi non 24

2.2 2 Nhân nhanh PLB 24

2.2 2.1 Bố trí thí nghiệm 25

2.2.2.2 Chỉ tiêu theo dõi 27

2.2.3 Tạo cây hoàn chỉnh 27

2.2 4 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo giống sạch bệnh 27

2.3 Phương pháp xử lý số liệu 29

PHẦN 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Tạo PLB trực tiếp từ chồi bên 30

3.2 Nhân nhanh PLB 34

3.2.1 Khảo sát thành phần khoáng đa lượng và khoảng nồng độ NAA thích hợp cho việc nhân nhanh PLB 38

3.2.2 Khảo sát môi trường chuẩn cho việc nhân nhanh PLB 40

3.3 Tạo cây hoàn chỉnh 42

3.4 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo giống sạch bệnh 45

PHẦN 4 KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận 50

4.1.1 Tạo nguồn PLB nguyên liệu 50

4.1.2 Nhân nhanh PLB 50

4.1.3.Tạo cây hoàn chỉnh 51

4.1.4 Tách đỉnh sinh trưởng tạo giống sạch bệnh 51

4.2 Kiến nghị 53

PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

LỜI MỞ ĐẦU

Khi đời sống vật chất ngày càng được nâng cao, con người lại có xu thế hướng

về với thiên nhiên để làm giảm bớt đi những căng thẳng mệt nhọc của công việc tất bật, đồng thời góp phần làm đẹp thêm cho đời sống tinh thần của mình Một trong những biện pháp hữu hiệu và phổ biến nhất là thú vui cây cảnh đặc biệt là các loài hoa.

Trong thế giới loài hoa, địa lan (Cymbidium) đã được mệnh danh là “Nữ Hoàng” bởi hình dáng kiêu kì, phức tạp Cái thú chơi lan từ lâu cũng đã trở thành một nghệ thuật Tuy nhiên chơi lan không chỉ dừng lại ở việc chiêm ngưỡng mà cần phải có những yêu cầu kĩ thuật cao trong việc chăm sóc loài hoa vương giả này Không giống như nhiều loài lan khác, “Nữ Hoàng” của chúng ta khá khó tính, nó chỉ thích hợp với những nơi có khí hậu mát mẻ, ôn hòa như Đà Lạt, nơi được thiên nhiên

ưu đãi hơn trên vùng đất nhiệt đới này Với thế mạnh này, Đà Lạt là nơi cung cấp địa lan cho cả nước thậm chí ở nước ngoài, điều đó cũng góp phần đem lại một nguồn thu nhập lớn cho nông dân tại đây.

Tuy nhiên phương pháp trồng lan truyền thống không thể đáp ứng được nhu cầu thị trường do hệ số nhân thấp, giống dễ bị thoái hóa theo thời gian và hơn nữa là khả năng mắt bệnh khá cao gây thiệt hại lớn cho người nông dân.

Ngày nay, kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật đã phát triển, góp phần hạn chế được những nhược điểm trên đồng thời đảm bảo được đặc tính di truyền của các giống lan quý, được nhiều người ưa chuộng Thông qua khảo sát tình hình thực tế, tôi nhận thấy những giống lan có màu xanh như Xanh Ngọc, Xanh Thơm, Xanh Chiểu… đang thu hút thị trường.

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn và điều kiện cho phép, trong phạm vi đề tài này

tôi tiến hành nghiên cứu việc “Nhân nhanh vô tính và tạo giống sạch bệnh ở địa lan

Xanh Chiểu (Cymbidium lowian sp.) in-vitro” nhằm góp phần vào nghề trồng lan ở

Đà Lạt.

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1.1Đặc điểm chung

1.1.1.1Đặc điểm phân loại [8]

1.1.1.2Đặc điểm hình thái [15]

Về hình thái bên ngoài, lan Cymbidium là những loài thân thảo, đa niên, đẻ

nhánh hàng năm tạo thành những bụi nhỏ

Có loài rễ mọc bám trên vỏ cây, mặt đất (bì sinh hay phụ sinh); có loài rễ ăn sâu

Hình 1.1 Hình thái cây địa lan

trong bọng cây, trong đất mùn (địa sinh hay thực sinh) Rễ mới thường chỉ mọc ở câycon, cây mẹ khó ra rễ mới mà chỉ thấy phân nhánh từ củ rễ.

Thân ngầm của chúng (căn hành) thường ngắn, nối những củ lan với nhau Các

củ lan thực chất là những cành ngắn của căn hành Củ già, khi bị tách khỏi căn hành

cũ, có thể mọc ra đoạn căn hành mới, từ đó mọc lên những cây con Do đó người ta

xếp Cymbidium vào nhóm lan đa thân cây (sympodial).

Củ lan (giả hành) thường có dạng con quay hay dạng hột xoài, đường kính từ 1

cm đến 15 cm, củ thường tươi và được bọc trong các bẹ lá

Lá thường có hai dạng: dạng vảy đính theo một đoạn căn hành và dạng thựcđính trên giả hành Lá thực thường có cuống lá, giữa bẹ lá và cuống lá có một tầngphân cách Khi phiến lá rụng, vẫn còn đoạn bẹ ôm lấy giả hành Vài loài không cócuống lá

Tùy theo từng loài mà phiến lá rất khác nhau, có gân dọc nổi rõ hay chìm trongthịt lá Một số loài ít chịu rợp có phiến lá màu xanh vàng, còn lại thường là xanh đậm.Bản lá và độ dày của lá thay đổi tùy theo từng loài: các loài sống ở trảng trống có láhẹp và dày hơn các loài ưa bóng rợp Lá có dạng dải, dạng mũi mác, dạng phiến Đầu

lá nhọn hay chia thành 2 thùy Kích thước của bản lá biến động từ 0,5 cm đến 6 cm.Chiều dài lá thay đổi từ 10 cm đến 150 cm

Chồi hoa thường xuất hiện bên dưới giả hành, trong các nách lá, tách các bẹ già,đâm ra bên ngoài Thông thường, mỗi giả hành chỉ cho hoa một lần Chồi hoa thườngxuất hiện đồng thời với chồi thân, những chồi hoa no tròn hơn, còn chồi thân hơi dẹp.Các lá đầu tiên ở chồi thân mọc đâm ra 2 phía hình đuôi cá, còn ở chồi hoa các lá baohoa luôn ôm chặt quanh phát hoa

Cọng phát hoa không phân nhánh, dựng đứng hay buông thõng Chiều dài củaphát hoa từ 10 đến hơn 100 cm Cành hoa mang từ vài đến vài chục búp hoa xếp luônphiên theo đường xoắn ốc Búp hoa khi đã đủ lớn, bắt đầu dang xa khỏi cọng hoa,xoay nửa vòng tròn để đưa cánh môi xuống dưới rồi bắt đầu nở Thoạt nhìn, hoa

Cymbidium có 5 cánh gần giống nhau, thực ra chỉ có 2 cánh hoa ở bên trong, còn lại là

3 lá đài ở bên ngoài, có cấu trúc và màu sắc giống cánh hoa Cánh hoa thứ 3 chuyên

hóa thành cánh môi, màu sắc rực rỡ hơn, xẻ thành 3 thùy tạo ra dạng nửa hình ống 2thùy bên ôm lấy trụ, thùy thứ 3 có dạng bầu hay nhọn tạo thành hình đáy thuyền, làmchỗ đậu cho côn trùng khi đến hút mật và thụ phấn cho hoa Giữa cánh môi có 2 gờdọc song song màu vàng Tận cùng bên trong có dĩa mật và đôi khi có những tuyến tiết

mùi hương Hoa Cymbidium lưỡng tính, nhị đực và nhụy cái cùng gắn chung trên một

trụ nhị - nhụy (hay trục hợp nhụy) hình bán trụ hơi cong về phía trước Nhị ở trêncùng, mang 2 khối phấn màu vàng, có gót dính như keo Khối phấn được đậy bởi mộtnắp màu trắng ngà dễ mở rời Hộc chứa phấn khối của trục hợp nhụy cách với nuốmnhụy bởi một cái gờ (mỏ) nổi lên Cấu trúc này bắt buộc trong tự nhiên hoa

Cymbidium chỉ thụ phấn được nhờ côn trùng.

Sau khi thụ phấn, hoa xoay dần về vị trí cũ, bầu noãn phình lên tạo thành quả.Quả lan là một nang có 3 góc, bên trong có chứa hàng trăm ngàn hạt Khi chín, quả mởtheo 3 đường góc và gieo vào không khí những hạt như bụi phấn màu vàng lụa Khirơi vào nơi có điều kiện ẩm độ, ánh sáng thích hợp và có nấm cộng sinh tham gia, hạt

sẽ nẩy mầm phát triển thành cây mới

Địa lan có hai loại: hoa lớn (standard) và hoa nhỏ (miniature) sau này nhữngnghệ nhân đã ghép ra một loại là hoa vừa (novelty) được ghép từ hoa lớn với hoa nhỏ ,và những loại hoa rũ buông thồng (pendulous) được ghép ra hầu hết từ giống địa lan

Gấm Ngũ Hổ (devonianum) hay cây Lộ Hồi (aloifolium).

1.1.1.3Đặc điểm sinh học và điều kiện chăm sóc

Đa số địa lan ra hoa vào mùa đông và mùa xuân, một số ít loại ra hoa vào mùa

Hình 1.2 Cấu trúc hoa lan

hè Tuy nhiên để cho lan sinh trưởng tốt và ra hoa cần có những điều kiện môi trườngthuận lợi [14].

 Nhiệt độ

Địa lan cần nhiệt độ thay đổi ngày nóng , đêm lạnh Ban ngày 80-90ºF 32ºC) ban đêm 50-60º F (10-15ºC) Địa lan có thể chịu nóng tới 100ºF và lạnh tới 30ºFmiễn là không đóng băng, ngoài ra nếu không có sự cách biệt giữa ngày và đêm tốithiểu từ 15-20ºF (13-16ºC), hầu như địa lan sẽ không ra hoa

 Bón phân

Khi mùa phát triển cho cây con, cần bón phân NPK 30-10-10 mỗi tuần một lần,chỉ dùng 1/4 của công thức của nhà chế tạo để tránh cây khỏi bị cháy lá Khi cuốitháng 8 dùng phân bón NPK 6-30-30 hay 10-52-10, cuối tháng 11 ngưng tưới phân,chỉ tưới nước thường, tưới thêm phân sẽ làm cho nụ hoa bị nóng có thể bị rụng hay bịcó tật

Khi cây đang có nụ, không nên di chuyển từ nơi này sang nơi khác hoặc đemvào trong nhà, lan không ưa sự thay đổi nhiệt độ thái quá và bất chợt, sự thay đổi độtngột sẽ làm cho nụ hoa sẽ vàng và rụng đi.

1.1.1.4Các bệnh thường gặp ở địa lan và cách phòng chống [11]

Địa lan tuy đẹp và đem lại lợi nhuận cao cho người nông dân nhưng đây khôngphải là một loại cây dễ chăm sóc bởi có nhiều bệnh tật xảy ra, nguyên nhân là do:

 Môi trường không thích hợp

- Nóng quá: cây bị còi cọc, lá vàng vọt, hoa mau tàn

- Lạnh quá: cây không lớn, èo ọt

- Nhiệt độ thay đổi đột ngột: hoa bị thúi và rụng

- Nắng quá: lá cháy, úa vàng, khô

- Thiếu ánh nắng: cây èo ọt, lá rũ

- Thiếu nước: cây khô, lá thuôn lại

- Dư nước: thối củ, thối rễ (80% bệnh tật của địa lan là do dư nước)

- Ẩm độ thấp: củ bẹ nhăn nhúm

- Ẩm độ cao: là điều kiện để sinh vật gây bệnh tấn công

- Dư thừa phân bón: cháy lá, cháy rễ

- Thiếu đạm: cây không lớn, lá vàng dần

- Thừa đạm: lá xanh mướt, dài và mềm dễ bị sâu bệnh tấn công

- Thiếu lân: lá ngắn và nhỏ

- Thừa lân:cây thấp, lá ít, hoa nhỏ.

- Thiếu kali: lá soăn, không ra hoa

- Thừa kali: cây không lớn, lá nhỏ

b Bệnh do vi khuẩn

Bệnh thối nâu: Vết bệnh màu nâu nhạt, hình tròn, mọng nước, về sau chuyểnsang màu nâu đen Bệnh gây hại trên lá, thân, mầm gây nên hiện tượng thối (có mùi

khó chịu) Nguyên nhân bệnh do khuẩn Erwinia carotovora gây ra.

Bệnh thối mềm: Vết bệnh có dạng bất định, ủng nước, màu trắng đục, thườnglan rộng theo chiều rộng của phiến lá Trong điều kiện ẩm độ cao sẽ gây hiện tượngthối úng Trong điều kiện khô ráo, mô bệnh khô, teo tóp và có màu trắng xám Bệnh

do vi khuẩn Pseudomonas Glagioli gây ra.

c Bệnh do vi nấm

Bệnh đen thân cây con: Vết bệnh xuất hiện ở gốc thân hoặc cổ rễ, có màu nâu,sau đó lan dần làm khô đoạn thân gần gốc và cổ rễ, vết bệnh chuyển sang màu đen Láchuyển sang màu vàng, cong dị hình Cây con bị bệnh thường chết sau 2-3 tuần, trong

căn hành thường có vệt màu tím hay hồng nhạt Bệnh do nấm Fusarium oxysporum

gây ra

Bệnh đốm lá: Vết bệnh thường có hình thoi hoặc hình tròn nhỏ màu xám nâu,xuất hiện ở mặt dưới lá Bệnh làm vàng lá, dễ rụng, cây sinh trưởng kém Bệnh do nấm

Cercospora sp gây ra.

Bệnh thán thư: Vết bệnh thường có hình tròn nhỏ, màu nâu vàng, xuất hiện từmép lá, chóp lá hoặc giữa phiến lá, kích thước trung bình 3-6mm Giữa vết bệnh hơilõm có màu xám trắng, xung quanh có gờ nhỏ màu nâu đỏ, trên mô bệnh có nhiều

chấm nhỏ màu đen Bệnh do nấm Colletotrichicm gloeosrioides gây ra.

Bệnh thối hạch: Xuất hiện trên gốc thân, vết bệnh màu vàng nhạt, chuyển dầnsang màu vàng nâu, thân cây teo tóp, lá vàng, nhăn nheo, cây sinh trưởng yếu, bệnh

nặng sẽ gây chết cây Bệnh do nấm Sclerotium rolfsu gây ra.

Bệnh đốm vòng trên cánh hoa: Vết bệnh nhỏ, màu đen hơi lõm, hình tròn có

vân đồng tâm Bệnh gây hại chủ yếu trên hoa làm hoa kém màu sắc và mau tàn Trên

mô bệnh thường có lớp nấm màu đen, gặp điều kiện nóng ẩm kéo dài sẽ gây ảnh

hưởng đến cả bộ lá Bệnh do nấm Alternaria gây ra.

Bệnh đốm nâu trên cánh hoa: Vết bệnh ban đầu là một chấm nhỏ màu nâu, hơilồi, về sau lan rộng thành đốm lớn màu nâu nhạt Bệnh làm hoa mất giá trị Bệnh do

nấm Curvularia eragotidis gây ra.

Bệnh thối đen ngọn: Vết bệnh ban đầu là một điểm nhỏ, ủng nước, có màu nâuđen Bệnh gây hại chủ yếu trên lá non, ngọn và chồi cây lan làm cho đỉnh bị thối nhũnlan dần xuống dưới làm lá và cuống lá bị thối, dễ rụng Bệnh có thể gây thành dịch

trong điều kiện ẩm độ cao với nhiệt độ khoảng 20ºC Bệnh do nấm Phytopthora palmivora gây ra.

Bệnh đốm lá: Ban đầu vết bệnh là một đốm nhỏ màu vàng hơi lõm, phát triểndần theo chiều dọc của lá và về sau có hình bầu dục, ở giữa có màu trắng xám, xungquanh có màu nâu đen Giữa mô bệnh và mô lành có một quầng màu nâu đỏ Bệnh do

nấm Phyllosticta sp gây ra.

Ngoài ra, trên cây hoa lan còn có một số dạng bệnh khác như bệnh tàn cánh hoa

do nấm Botrytis cinerea, bệnh thối trắng rễ do nấm Rhizoctonia solani, bệnh đốm vàng

do nấm Cercospora dendrobii gây ra… Còn có một số bệnh gây ra bởi các nguyên

nhân điều kiện môi trường hoặc dinh dưỡng khoáng

Virus gây khằn cây: làm cho cây không phát triển bình thường, lá trở nên dày

hơn, có màu xanh đậm, mặt lá gồ ghề, phiến lá cứng.

Bệnh do virus không có thuốc đặc trị Khi thấy trong vườn có những cây lan cóbiểu hiện trên, cần phải cách ly để chăm sóc riêng nếu cây bị nhiễm nhẹ Trong trườnghợp cây bị nhiễm nặng cần phải đốt bỏ để tránh lây lan sang các cây khoẻ mạnh Cầnchú ý là phải khử trùng dụng cụ sau mỗi lần tách chiết một cây và quan tâm đến côngtác phòng trừ rầy rệp, làm vệ sinh mặt chậu và vườn lan thường xuyên

e Bệnh do côn trùng

Bọ trĩ (Thrips palmi và Dichromothrips Corbetti): Là loại côn trùng nhỏ, có

màu vàng nhạt Chích hút trên lá non để lại những đốm vuông màu vàng sáng, sauchuyển dần sang màu nâu đen Chích hút trên cánh hoa để lại những vết chích trongsuốt và có một chấm vàng ở giữa

Nhện đỏ: Là một dạng ve ký sinh, di chuyển nhanh, lúc nhỏ có màu vàng cam,khi trưởng thành có màu đỏ Khi chích hút chúng để lại trên lá, hoa những đốm nhỏmàu nâu Thường phổ biến trong những vườn lan thiếu chăm sóc hoặc bị khô hạn kéodài

Rệp: Đây là loại côn trùng gây hại phổ biến trên nhiều vườn lan, thường tập

trung chích hút ở lá non, chồi non, đầu rễ, phát hoa, chồi hoa, làm cho cây phát triểncòi cọc, hoa bị rụng cuống hoặc không nở Rệp chích hút tạo thành những vết vàngnâu hoặc thâm đen Sản phẩm bài tiết của chúng tạo điều kiện cho nấm than đen pháttriển, nhất là trong điều kiện mưa ẩm kéo dài Phổ biến nhất là:

Rệp xanh đen: Pleotrichophorus chrysanthemi Theobald

Rệp nâu đen: Macrosiphoniella sanbornici Gillette.

Rệp xanh: Coloradoa rufomaculata Wilson Sâu hại: Có nhiều loại sâu hại, nhưng thường gặp là sâu khoang (Spodoptera sp.), thường cắn phá chồi non, phát hoa non.

Ốc sên, Nhớt: là các loài nhuyễn thể, thường tập trung cắn phá vào ban đêm.Các đoạn rễ non, cây non, chồi, phát hoa là những mục tiêu cắn phá chính của các loàinhuyễn thể

Ngoài một số biện pháp sử dụng thuốc hoá học trên nên kết hợp với các biệnpháp canh tác khác nhằm tạo điều kiện tốt nhất cho cây sinh trưởng và phát triển nhưthường xuyên làm vệ sinh vườn trại, vệ sinh mặt chậu, mặt luống trồng hoa lan, chechắn đủ lượng ánh sáng cần thiết, giữ đủ ẩm và thoát nước tốt, đối với địa lan nên kêchậu cao hơn mặt đất 10-15 cm

1.1.2Giới thiệu về giống địa lan Xanh Chiểu, ý nghĩa kinh tế

Địa lan Xanh Chiểu có tên khoa học là Cymbidium lowian sp Đây là một giống

lan lai tạo hiện đang được trồng ở một số vườn lan ở Đà Lạt

Với một cánh môi đỏ tía quý phái nổi bậc trên nền 5 cánh hoa màu xanh thanhnhã ửng đỏ nâu, nét đẹp của Xanh Chiểu thực sự thu hút người yêu hoa (Hình 1.2)

Thực tế cho thấy giống địa lan Xanh Chiểu cho năng suất cao hơn hẳn do khảnăng đâm chồi mạnh Trung bình sau 5 năm nuôi trồng từ cây mô, một chậu hoa XanhChiểu có thể cho ra 6 đến 8 cành, trong khi một số giống lan khác như Xanh Thơm,Tím Hột chỉ cho khảng từ 4 đến 5 cành Bên cạnh đó, giống lan này cũng có khả năngkháng bệnh tốt hơn, nhờ đó mà ít gây thiệt hại cho người nông dân

Với những ưu điểm trên, Xanh Chiểu có đủ khả năng đáp ứng nhu cầu thị

trường và đem lại lợi nhuận lớn cho người nông dân

1.2 Các phương pháp nhân giống địa lan

1.2.1 Nhân giống ngoài tự nhiên [7]

a Nhân giống vô tính

Địa lan là một giống lan đa thân, ở mỗi gốc của giả hành thường có ít nhất mộtmắt ngủ nên có thể tách mỗi giả hành thành một đơn vị để trồng

b Nhân giống hữu tính

Có hai phương pháp thụ phấn ở hoa lan:

- Sự tự thụ phấn: khi phấn của hoa rơi vào chính nuốm của hoa ấy Khảnăng này khó xảy ra trong tự nhiên do nhụy và nhị của hoa lan bị ngăn cách

- Sự thụ phấn chéo: khi phấn của hoa này rơi vào nuốm của hoa khác trêncủa cây khác cùng loài (thường xảy ra trong thiên nhiên do côn trùng thực hiện), hoặckhác loài khác giống (thường do con người thực hiện)

Nếu sự thụ phấn có kết quả thì có thể ngay trong ngày hoặc sang ngày hôm sau,các phiến hoa xụ lại nhưng không rụng (nếu sự thụ phấn được thực hiện nhân tạo,người ta thường bao ni lông trùm hoa lại để tránh sự thụ phấn khác do côn trùng,nhưng không bịt kín miệng vì hầm hơi sẽ làm hư trái)

Sau khi thụ phấn, bầu noãn từ từ trương phù to ra thành trái Mỗi trái có thểchứa hàng ngàn đến cả triệu hạt

Trong thiên nhiên, muốn hạt lan nảy mầm thì hạt phải được nhiễm một loại nấm

kí sinh (thường là nấm Rhizoctonia).

1.2.2 Nhân giống trong phòng thí nghiệm

a Nhân giống vô tính

Dựa vào tính toàn thế của thực vật, các cây lan in vitro được tạo ra với số lượng

lớn và đồng nhất từ một đỉnh sinh trưởng hay một chồi ngủ của cây mẹ ngoài tự nhiên

b Nhân giống hữu tính

Các hạt lan được hình thành sau quá trình thụ phấn, sau một thời gian có thểđược gieo trồng trong điều kiện vô trùng ở phòng thí nghiệm Nhờ môi trường nuôi

cấy có đầy đủ chất dinh dưỡng và chất điều hòa sinh trưởng nên các hạt lan non có thểnảy mầm mà không cần đến lúc già Do đó hiệu quả nảy mầm cao hơn hẳn ngoài tựnhiên.

- Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương

thức nuôi cấy các bộ phận của thực vật trên môi trường xác định trong đều kiện vôtrùng Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý là tế bào thực vật có tính toàn thế, nghĩa làmột mô, một cơ quan hoặc một tế bào của bất kỳ bộ phận nào của cây đều có thểphát triển thành một cây hoàn chỉnh nếu được nuôi trong môi trường thích hợp [7]

- Tạo ra số lượng lớn cây trồng, đảm bảo tính đồng nhất về mặt di truyền

- Phục tráng được các giống đã bị nhiễm bệnh

- Bảo quản ngân hàng gen các giống cây trồng

- Điều kiện cơ bản trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

vô trùng này bao gồm vô trùng môi trường nuôi cấy và cả sự đảm bảo sao cho mẫucấy được hoàn toàn vô trùng

- Nước: nước dùng trong môi trường nuôi cấy là nước cất hoặc nước khửion

- Đường: tạo nguồn carbon giúp mô tổng hợp nên carbohydrat cho cây màkhông phải do quang hợp của mô tạo nên; đường sử dụng phổ biến là saccharose(1-6% w/v), glucose (2% w/v)

- Các muối khoáng đa lượng: nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi một lượng nhấtđịnh các nguyên tố đa lượng như C, H, O, N, P, K, S, Ca, Mg

- Các muối khoáng vi lượng tham gia vào các quá trình sinh hóa trong tếbào, tham gia vào trung tâm hoạt tính của enzyme, tăng tính chống chịu của thực

vật đối với điều kiện môi trường bất lợi Các nguyên tố vi lượng thường dùng là

Fe, B, Cl, Mo, Cu, Ni, Zn, Mn…

- Vitamin: chủ yếu là acid nicotinic, thiamin HCl (B1), pyridoxin HCl (B6),glycine, myo-inositol…

- Các chất điều hòa tăng trưởng: có bốn nhóm quan trọng trong nuôi cấy mô

tế bào thực vật là auxin (IAA, IBA, NAA, 2,4D), cytokinin (BA, TDZ, kinetin),gibberillin (GA3), acid abcisic

- Agar (thường được sử dụng trong môi trường đặc): là một polysaccharidelàm từ rong biển Agar tan ở 1000C và khi nguội sẽ đặc lại Hàm lượng sử dụng từ5-10g/l

 Nhiệt độ, ánh sáng và pH ảnh hưởng đến môi trường nuôi cấy

- Nhiệt độ: nhiệt độ của phòng nuôi cấy thường được điều chỉnh ổn định từ22-25ºC, ở mỗi tế bào thực vật khác nhau thì nhiệt độ nuôi cấy cũng khác nhau

- Ánh sáng có ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái của cây nuôi cấy.Các yếu tố ảnh hưởng bao gồm cường độ, chu kỳ, thành phần quang phổ ánh sáng.Cường độ ánh sáng từ 1000-2500 lux được dùng phổ biến trong nuôi cấy nhiều loạimô

- pH: sự ổn định pH môi trường là yếu tố duy trì trao đổi chất trong tế bào.Murashige và Skoog (1962) nhận thấy rằng độ pH 5,7-5,8 thích hợp để duy trì sựhòa tan các chất khoáng trong môi trường MS Để điều chỉnh pH môi trường có thểdùng NaOH 1N và HCl 1N

 Các yêu cầu cơ bản của kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật

- Khi thiết lập phòng nuôi cấy mô thực vật phải đảm bảo được tính liên tụcthuận lợi cho các thao tác, các giai đoạn trong suốt quá trình nuôi cấy mô

- Đảm bảo được tính vô trùng của sản phẩm cuối cùng

- Chuẩn bị môi trường đúng cách, chọn đúng môi trường cho từng loại thựcvật và từng giai đoạn nuôi cấy

- Chọn và xử lý mô thích hợp trước khi cấy

Hình 1.3 Protocorm

1.4 Hướng nghiên cứu và ý nghĩa thực tiễn của nuôi cấy mô địa lan hiện nay

1.4.1 Tạo PLB (protocorm like bodies) từ chồi bên và nhân nhanh [2]

1.4.1.1 Khái niệm về protocorm

Protocorm là một cơ quan dự trữ nhỏ được

hình thành từ phôi đang nảy mầm Hạt này chứa một

phôi rất nhỏ chứa tương đối ít tế bào, phôi này mang

một chồi tận cùng và vòng bao ngoài có dạng củ rễ

(Melchior Treub, 1890)

Morel (1960-1963) đã quan sát thấy các chồi

thân của Cymbidium và Dendrobium có đường kính

khoảng 1mm và áo vài lá sơ khởi sẽ sinh ra một

protocorm có rễ

1.4.1.2 Khái niệm về PLB (protocorm like bodies)

PLB là một cấu trúc đặc biệt tương ứng với giai đoạn chuyển tiếp và pháttriển mạnh mẽ của phôi thành cây con Nói cách khác, PLB là thuật ngữ để chỉ những

cấu trúc giống với protocorm và có nguồn gốc từ nuôi cấy in vitro Thuật ngữ này

được đưa ra đầu tiên bởi Morel trong bài báo tiếng Anh của ông về nuôi cấy chồi đỉnh

Điểm sinh trưởng của PLB có cấu trúc chưa đầy đủ và dường như thiếu cácphần khởi đầu của lá trong một thời gian Các tế bào bề mặt của PLB duy trì tiềm năngcủa các tế bào phôi, từ đây chúng dễ dàng khởi phát tạo nhiều điểm sinh trưởng bấtđịnh

Như vậy, PLB là một cấu trúc sinh cơ quan Trong một vài trường hợp, người

ta có thể thu phôi từ PLB Tuy nhiên, việc phát sinh phôi từ PLB là ngẫu nhiên

1.4.1.3 Khả năng tạo PLB của địa lan

Nguyên liệu khởi đầu cho việc hình thành PLB thường được sử dụng là chồinon Các chồi này chưa hình thành lá hoàn chỉnh, có kích thước khoảng 1-6 cm

Nguyên nhân của việc sử dụng chồi non là do chúng có mang một mô phân sinh đỉnhvà mô phân sinh bên dưới một số lớp lá, các mô phân sinh này thường được bao bọcbởi 2-3 lớp lá sơ khởi thuận lợi cho việc hình thành PLB.

Sau khám phá của Morel và được bổ sung bởi các công trình nghiên cứu giảiphẫu của Champagnat và cộng sự (1966), nhiều nhà khoa học trên thế giới đã đã

nghiên cứu về sự phát triển của protocorm của Cymbidium trong nuôi cấy mô.

Theo Fonnesbech (1972), sự kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng cho phép

ta định hướng việc phát sinh cơ quan của thực vật theo ý muốn Sau khi cấy vào môi

trường thích hợp, đỉnh sinh trưởng của Cymbidium sẽ phục hồi khả năng tăng trưởng

và phát triển thành dạng protocorm Tiếp theo là quá trình tăng sinh tạo các protocormbất định mới Sự phát triển bình thường của các PLB sẽ dẫn đến sự tạo thành của mộthay nhiều chồi non có lá từ các điểm sinh trưởng bất định Các rễ đầu tiên tạo nên từphần dưới của thân

Như vậy, việc phát sinh PLB chịu ảnh hưởng nhiều bởi môi trường nuôi cấyvà các chất điều hòa sinh trưởng trong môi trường:

- Việc tạo PLB và sự phát triển của các chồi cũng có thể thực hiện với môitrường cấy đơn giản Homes và cộng (1972) đã quan sát thấy rằng PLB trong điều kiệnnuôi cấy yếm khí nhẹ (nhấn chìm hoàn toàn PLB trong môi trường lỏng) sẽ ức chế cácđiểm sinh trưởng và phát triển theo chiều hướng sinh ra một số lượng lớn các PLB Sựthay đổi nồng độ saccharose cũng ảnh hưởng đến sự phát sinh cơ quan Nồng độsaccharose từ 1,6-2% thuận lợi cho sự tăng trưởng và tăng sinh PLB trong môi trườnglỏng Ở nồng độ cao (10% trở lên) sẽ ức chế sự tăng trưởng, lúc đó PLB biểu hiện cácđặc tính của các cơ quan dự trữ, bao quanh bởi tinh bột và lipid Còn sacchrose ở nồng

độ thấp sẽ làm chậm sự tăng trưởng

- Trên các môi trường đơn giản đầu tiên được sử dụng, sự tăng trưởng củaPLB tương đối chậm Sự gia tăng tỉ lệ tăng trưởng chỉ đạt được khi môi trường nuôicấy được bổ sung các acid amin, vitamin, các chất điều hòa tăng trưởng và có thể thêmnước dừa, chất trích thảo mộc Các môi trường khoáng sử dụng cho nuôi cấy lan cóhàm lượng SO42- tương đối cao, như môi trường Knudson (1946), Wimber (1963,1965) hoặc của Homes (1972)

- Môi trường nuôi cấy của Fonnesbech (1972) có tỉ lệ tăng trưởng cao khimôi trường có nồng độ cytokinin và auxin lần lượt là 10-6M và 10-5M, bổ sung thêm

100 mg/l myo-inositol, vitamin (thiamin, pyrodoxin, nicotinic) và các acid amin.Auxin ở nồng độ 10-5M thuận lợi cho sự phát triển của các PLB Ngược lại, cytokininở nồng độ 10-5M gây nên sự kéo dài các chồi và kiềm hãm sự phát triển của các PLB.Những sự kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng khác nhau với nồng độ thay đổi chophép chúng ta quan sát sự tạo rễ trực tiếp từ các PLB hoặc phát sinh nhiều lông hút

1.4.2 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo dòng cây sạch bệnh

Một trong những điều kiện cần thiết cho việc nhân giống là cây con phải sạchvirus Nhiều nghiên cứu cho thấy rằng cây được nuôi cấy từ các mô phân sinh đỉnh và

mô phân sinh bên được bao bọc bởi một số lá sơ khởi không hoàn toàn sạch virus Các

nghiên cứu của Morel (1960) trên Cymbidium cho thấy chỉ khi nuôi cấy một đỉnh sinh

trưởng với 2 tiền phát khởi lá mới thu được cây con sạch virus [12] Một số nguyênnhân giúp mô phân sinh ngọn không bị nhiễm virus là:

- Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ thống mô dẫn mà hệ thống này không có ở

mô phân sinh ngọn

- Trong sự phân chia các tế bào mô phân sinh ngọn không cho phép sao chép cácthông tin di truyền của virus

- Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng mô phân sinh ngọn mạnh hơn các vùngkhác trong cây

- Nồng độ auxin cao ở đỉnh sinh trưởng có thể ngăn cản quá trình sao chép củavirus

Khi cấy đỉnh sinh trưởng Cymbidium chỉ có vùng xung quanh tiền phát khởi

lá u lên và cuối cùng tạo thành protocorm Các protocorm tạo thành được tách ra vàcấy chuyền vào môi trường mới để thành lập các protocorm bất định từ các protocormban đầu, nếu không được cấy chuyền chúng sẽ phát triển thành chồi và ra rễ [12]

1.4.3 Lan ra hoa trong ống nghiệm

Kích thích ra hoa trong ống nghiệm là một hướng nghiên cứu mới, khá lý thúvà nhiều ứng dụng thực tiễn Đây là đề tài thu hút nhiều nhà khoa học trên thế giới,nhiều loài thực vật đã được chọn làm đối tượng cho nghiên cứu này trong đó có

Cymbidium như Cymbidium niveomarginatum Mark (Kostenyuk và cộng sự, 1999), Cymbidium ensifolium var misericors (Chang Chen và Chang Wei-Chin, 2003) [3].

Trong điều kiện môi trường in vitro, chúng ta có thể chủ động điều chỉnh các

yếu tố vật lý (cường độ ánh sáng, quang kỳ, độ ẩm, nhiệt độ…), các yếu tố hóa học(nồng độ đường, chất khoáng, vitamin…) và đặc biệt là các yếu tố về tỉ lệ chất điềuhòa tăng trưởng thực vật Các yếu tố này có ảnh hưởng sâu sắc đến việc phát sinh hìnhthái của thực vật

Ứng dụng:

- Về mặt di truyền, khả năng mở bộ gen điều khiển ra hoa trên thực vật nuôi cấy

in vitro giúp cho việc lai tạo, chọn lọc và nhân giống thực vật trở nên dễ dàng, tiết kiệm thời gian; tìm kiếm khả năng mở bộ gen về số lượng hoa và màu sắc hoa dễ dànghơn

- Ra hoa in vitro từ cây gieo hạt giúp bỏ qua bước kiểm tra DNA trong tổ hợp lai

để phỏng đoán đặc tính hoa của thực vật

Hình 1.4 Mô hình cắt dọc đỉnh sinh trưởng chồi lan

- Ứng dụng này giúp dễ kiểm tra hình dạng, màu sắc và cấu tạo hoa in vitro và

kiểm tra sớm những biến dị độc đáo của thực vật Từ đó, việc tuyển chọn giống có thể

tiến hành ngay ở công đoạn in vitro, không chờ đến việc nở hoa thực nghiệm

PHẦN 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Vật liệu

trường Đại học Đà Lạt

 Dụng cụ:

- Cốc thủy tinh chia vạch, bình định mức, pipette (ống hút có chia độ), ốngđong…

- Kẹp dài, dao cấy inox, giấy cấy vô trùng

- Túi nilon kích cỡ 6×12 và 12×20 cm, dùng để nuôi cấy mô, có thể chịu đượcnhiệt độ cao trong nồi hấp

 Máy móc:

 Môi trường nuôi cấy

 Môi trường K chứa đa lượng Knudson C (phụ lục) và các thành phần cơ bảnkhác

 Môi trường M (do phòng thí nghiệm cung cấp) chứa đa lượng M (phụ lục), acidcitric (125 mg/l) và các thành phần cơ bản khác

Môi trường được giữ yên 5 ngày để kiểm tra sự nhiễm trước khi cấy

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tạo PLB (protocorm like body) trực tiếp từ chồi non

a Thu thập và xử lý mẫu

- Trong thí nghiệm này mẫu ban đầu được sử

dụng là chồi non của cây địa lan Xanh Chiểu khỏe

mạnh, sạch bệnh Chồi có kích thước từ 5-7 cm,

chưa có lá hoàn chỉnh

- Việc thu mẫu được tiến hành trong những

ngày nắng để hạn chế vi sinh vật xâm nhiễm sâu vào

bên trong

- Trước khi tách lấy mẫu, xịt cồn 700 xung

quanh mẫu cần lấy; khử trùng dao dùng để tách

mẫu

- Cẩn thận tách lấy chồi non từ tận gốc, tránh cắt phạm vào phần gốc

- Sau khi thu mẫu tại vườn, chồi non được đem về phòng thí nghiệm để khửtrùng

- Các bước khử trùng:

 Rửa qua mẫu dưới vòi nước máy

 Rửa tiếp bằng xà bông

 Rửa lại dưới vòi nước cho sạch xà bông

 Ngâm mẫu trong dung dịch Hypochlorite sodium (Javel) 1% và lắc đềutrong 15 phút

 Rửa sạch mẫu bằng nước vô trùng 5 lần trong tủ cấy vô trùng

- Tiếp theo mẫu được đặt trên giấy cấy vô trùng, dùng kẹp dài và dao nhọn táchtừng lớp lá của chồi Dưới một số lớp lá, ta sẽ thấy các chồi ngủ nhỏ (chứa mô phânsinh bên được bao bọc trong 2-3 lớp lá nhỏ), các chồi này sẽ được tách và nuôi cấytrên môi trường để kích thích việc phát sinh PLB Tuy nhiên trước khi tách lấy chồingủ, phải ngâm qua cồn 700 trong 10 giây và rửa lại bằng nước vô trùng Đỉnh sinh

Hình 2.1 Chồi non của địa lan

trưởng được bao bọc bởi 2-3 lớp lá cũng được xử lý tương tự trước khi tách.

b Bố trí thí nghiệm

Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng lên sự phát sinh PLB

BA (mg/l)

NAA (mg/l) 0.1 0.3 0.5

 Số mẫu mỗi bịch: 1 mẫu

 Số mẫu mỗi nghiệm thức: 1 × 10 = 10 mẫu

 Tổng số mẫu của thí nghiệm: 10 × 9 = 90 mẫu

- Mẫu sau khi xử lý được cấy vào môi trường

c Chỉ tiêu theo dõi

- Tỉ lệ mẫu hình thành PLB

- Hình thái và số lượng PLB trên một cụm

thích hợp cho việc nhân nhanh PLB

- PLB hình thành từ chồi non được cắt làm 2 hoặc 3 (tùy kích cỡ PLB), sau đó cấy vào môi trường

 Thể tích mỗi nghiệm thức: 250 ml

 Số bịch (12×20) mỗi nghiệm thức: 7 bịch

 Số mẫu mỗi bịch: 6 mẫu

 Số mẫu mỗi nghiệm thức: 6 × 7 = 42 mẫu

 Tổng số mẫu của thí nghiệm: 42 × 8 = 336 mẫu

b Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng trên môi trường K lên sự phát sinh PLB

Dựa trên kết quả của thí nghiệm trên tôi tiếp tục khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trường trên môi trường K, từ đó tìm ra môi trường chuẩn cho việc nhân nhanh PLB

BA (mg/l)

 Số mẫu mỗi bịch: 6 mẫu

 Số mẫu mỗi nghiệm thức: 6 × 6 = 36 mẫu

 Tổng số mẫu của thí nghiệm: 36 × 20 = 720 mẫu

2.2.2.2 Chỉ tiêu theo dõi