Nghiên cứu và kết quả thành phần hóa học nấm linh chi

Nghiên cứu và kết quả thành phần hóa học nấm linh chi

Việc nghiên cứu thành phần hóa học của nấm Linh chỉ được thực hiện trên các phương tiện kỹ thuật sau:

Phân lập các cẩu từ hiểu cơ

Trích pha ran silica gel 60H loại dùng cho sắc ký lớp mỏng, Merck

Sắc ký cột nhanh khô với silica gel 60 (0,040 — 0,063 mm), Merck

Sắc ký lớp mồng, sắc ký điều chế loại 25 DC ~ Alufolein 20 x 20 em, Kiesel gel 60 F554, Merck

Một số thiết bị khác: máy cô quay (thu hổi dung môi đưới áp suất kém) RE-

111 Rotavapor, bếp đun cách thủy, phễu xốp thiy tinh, fiol, hệ thống máy hút

chân không

Khảo sát cấu trúc của hợp chất hóa học

—_ Đo điểm nóng chảy trên khối Maquene, thực hiện tại phòng thí nghiệm

Hóa hữu cơ, Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

— Phổ khối EIMS ghi trên máy khối phổ HP 5989B series HH

~ Phé NMR ghi trên máy Bruker Avance, tần số 500 MHz cho phổ 'H và

125 MHz cho phé "°c

C4c phé IR, MS, 'H-NMR, °C-NMR, DEPT 90, 135 duc do tai Phong Phan

tích cấu trúc, Viện Hóa học, Trung tâm Khoa học Tự nhiên và Công nghệ

Quốc gia, 18 đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội

Trang 19

-2.1 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO

Nam Linh chi (Ganoderma lucidum) duoc nuôi tréng tai huyén Binh Chánh, TP Hồ Chí Minh, được định danh bởi Thầy Lê Duy Thắng, bộ môn Vị

sinh, Khoa Sinh của trường Đại học Khoa học Tự nhiên,

Sau khi loại bỏ những phần sâu bệnh, nấm Lành chỉ được rửa sạch, sấy khô ở 110°C đến khối lượng không đổi, cắt nhỏ, xay nhuyễn, thu được bột nấm khô (997g) Bột nấm khô được trích kiệt bằng ctanol theo phương pháp

ngâm đầm, lọc, cô quay, thu hổi dung môi, thu được cao etanol (62,5 g)

Cao etanol được trích pha rắn trên silica gel, giải ly lần lượt bằng các đơn dung môi từ không phân cực đến phân cực: eter đâu hỏa, cloroform,

acetat etyl và metanol, Dung dich thu được từ cột được hứng vào các lọ (mỗi

lọ 200ml), cô quay, chấm sắc ký lớp mỏng, các lọ có sắc ký lớp mông giống nhau được gom thành một phân đoạn Quy trình điều chế và thu suất các loại

cao được trình bầy trong sơ đồ 1 và bảng 5 Hình sắc ký lớp mồng các loại cao trình bày trong hình 2,

Bảng Ã: Khối lượng và thu suất các loại cao thu được so với bột nấm khô ban đầu

Các loại cao Dang cao | Khối lượng (g) | "Thu suất (%})

Eter dầu hoá A Chấtrấn mầu vàng sậm 2 35 | 0,35

| BierdẩuhỏaB | Ddumaunduds | 94 | 04

Cioroform A - Đâu màu vàng sậm : 2.2 ị 022

Trang 20

-Sơ đồ 1: Quy trình điều chế các loại cao trên nấm Linh chỉ

\

Cao eter dầu hỏa

A (0,4 g)

B (3,5 g)

Giải ly với cloroform

Cô quay thu hồi dung môi

C6 quay thu hồi dung môi

Giải ly với metanol

Cô quay thu hồi dung môi

Cao metanol (21,9 g)

Trang 21

-(C: EA) (5:5)

VN:

EAEBE CA CB E M

Hình 2: Sắc ký lớp mồng trên các loại cao của sơ đô 1

Ghi chú: E.A : cao eter dầu hỏa A

E.B : cao eter dầu hỏa B Œ.A : cao cloroform A C.B: cao cloroform B

E : cao acetat cryl M_ : cao metanol

Hệ dung môi giải ly: cloroform: acetat etyl (1:1)

Thuốc thử hiện hình: acid HạSOu đậm đặc

-Cloroform

Hình 3: Sắc ký lớp mồng trên cao eter dầu hỏa điều chế theo sơ đồ 1

Ghi chú: A : cao alcol

E.A : cao eter dầu hỏa A

E.B : cao eter dau hỏa B

Dung môi giải ly: cloroform

Thuốc thử hiện hình: acid H;SO„ đậm đặc

Trang 23

-2.2 TRÍCH LY, CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ

2.2.1 Sac k¥ cét silica gel trên cao eter dầu hỏa A trong sơ đồ 1

Phan cao eter dau héa A thu được từ sơ đồ 1 (0,4 g) là chất rắn màu

vàng sậm Sắc ký lớp mỏng với thuốc thử hiện hình là acid H;SO¿ đậm đặc,

cho thấy có một vết chính màu nâu nhưng còn bẩn

Tiến hành sắc ký điều chế trên bản silica gel, giải ly bằng cloroform,

kết tỉnh sản phẩm trong dung môi acetat ety], thu được tỉnh thể hình kim màu

trắng, sắc ký lớp mỏng cho một vết tròn duy nhất màu nâu có R;= 0,33 (hình 4) Hợp chất này được đặt tên là GANO.E Phần khảo sát cấu trúc hóa học

của GANO.E được trình bày ở phần sau

2.2.2 Sắc ký côt silica gel trên cao eter dầu hỏa B trong sơ đồ 1

Cao eter dầu hỏa B trong sơ đồ 1 (3,5 ø) ở dạng dầu màu nâu đỏ Cao này được sắc ký cột silica gel, giải ly bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dẫn từ eter dầu hỏa đến metanol Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ (mỗi lọ 100 ml), cô quay Chấm sắc ký lớp mỏng, các lọ có sắc ký lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột được trình bầy

trong bảng 6

Cao ở phân đoạn A¡ của bảng 6 ở dạng dầu vàng nhạt (0,6 g) Sắc ký lớp mỏng cho thấy có một vết tròn mau cam nhưng còn hơi bẩn Tiến hành sắc ký điều chế trên phân đoạn A¡, giải ly bằng eter dầu hỏa: benzen (6:4),

thu được chất ở dạng sáp màu trắng, sắc ký lớp mỏng cho một vết tròn duy nhất màu cam có R;= 0,58 (hình 5) Hợp chất này được đặt tên là GANO.EI

Phần khảo sát cấu trúc hóa học của GANO.EI được trình bày ở phần sau

Trang 24

-Cao ở phân đoạn Bị của bảng 6 (0,3 g), sắc ký lớp mỏng cho thấy có một vết chính nhưng còn bẩn Tiến hành sắc ký điểu chế thu được hợp chất

không màu ở dạng dầu Chấm sắc ký lớp mỏng giải ly bằng dung môi eter

dầu hỏa: benzen (6:4), cho thấy một vết tròn màu vàng có R;= 0,36 (hình 5)

Hợp chất này được đặt tên là GANO.E2 Phần khảo sát cấu trúc hóa học của

GANO.E2 được trình bày ở phần sau

Bảng 6: Kết quả sắc ký cột silica gel trên cao eter dầu hỏa B trong sơ đồ 1

Phân STT | Dungmôi ' Trọng lượng Nhận xét

đạn: ' lọ gidily | cao (g) (Trên sắc ký lớp mỏng)

2.2.3 Sắc ký cột silïca gel trên cao cloroform A của sơ đồ 1

Cao cloroform A trong sd dé 1 (2,2g) 6 dang dau mau vang sam Cao này được sắc ký cột silica gel, giải ly bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dân từ eter dầu hỏa đến metanol Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ

(mỗi lọ 100ml), cô quay Chấm sắc ký lớp mỏng, các lọ có sắc ký lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc ký cột được trình bày trong bảng 7

Cao ở phân đoạn A;¡ của bảng 7 ở dạng dầu vàng nhạt (1,2g) Sắc ký

lớp mỏng cho thấy có một vết tròn màu xám nhưng còn hơi bẩn Tiến hành sắc ký điều chế trên phân đoạn A¡, giải ly bằng benzen: cloroform (1:1), thu được chất ở dạng dầu không màu, sắc ký lớp mỏng cho một vết tròn duy nhất màu xám có R;= 0,58 (hình 6) Hợp chất này được đặt tên là GANO.CI Phần

khảo sát cấu trúc hóa học của GANO.CI được trình bày ở phần sau

Bảng 7: Sắc ký cột sflica gel cao cloroform A trong sơ đồ 1

Phân | STT Dung môi | Trọng lượng Nhận xét

đoạn lọ giải ly | cao (8) (Trên sắc ký lớp mỏng)

Có một vết chính màu xám

Bl | 7077 77 CC 03 | Nhiềuvết,Chưakhẩosát

Cl 78107 CM(@55 058 Nhiéu vét Chua khdo sét_

DỊ 108119 CM@Đ 0⁄4 — Nhiều vết Chưa khảo sát

El 120145 C:M (8:2) 0,35 Nhiều vết Chưa khảo sát

2.2.4 Sắc ký côt silica gel trên cao cloroform B của sơ đồ 1

e Cao cloroform B trong sơ đổ 1 (6,6g) ở dạng dầu màu nâu đỏ Cao này được sắc ký cột silica gel, giải ly bằng các hệ dung môi có tính phân cực tăng dần từ benzen đến metanol Dung dịch giải ly được hứng vào các lọ (mỗi lọ 100ml), cô quay Chấm sắc ký lớp mỏng, các lọ có sắc

ký lớp mỏng giống nhau được gom thành một phân đoạn Kết quả sắc

ký cột được trình bày trong bảng 8

e Cao ở phân đoạn A; của bảng 8 có dạng dầu vàng nhạt (0,033g) Sắc

ký lớp mỏng cho thấy có một vết tròn màu đỏ nhưng còn bẩn Tiến hành sắc ký điều điều chế, giải ly bằng cloroform: acetat etyl (9:1), thu được chất ở dạng đầu không màu, sắc ký lớp mỏng cho một vết tròn duy nhất màu đó có R¿ = 0,5 (hình 7) Hợp chất này được đặt tên là GANO.C2 Phần khảo sát cấu trúc hóa học của GANO.C2 được trình bày 6 phan sau

e Cao dé phan doan B; cia bang 8 6 dang dau nau do (1,45g) Sắc ký lớp

mỏng cho thấy nhiều vết tròn màu đỏ nằm rất gần nhau Tiến hành sắc

ký cột silica gel và sắc ký điều chế nhiều lần, giải ly bằng bằng

cloroform: acetat etyl (1:1), thu được chất ở dạng dầu không màu, sắc

ký lớp mỏng cho một vết tròn duy nhất màu đỏ có R;= 0,35 (hình 7)

Hợp chất này được đặt tên là GANO.C3 Phần khảo sát cấu trúc hóa học của GANO.C3 được trình bày Ở phần sau

e Cao 6 phân đoạn C¡ của bảng 8 ở dạng dầu vàng nhạt (0,03g) Sắc ký

lớp móng cho thấy có một vết tròn màu đỏ nhưng còn bẩn Tiến hành

sắc ký điểu điều chế, giải ly bằng bằng cloroform: metanol (9:1), thu được chất ở dạng dầu không màu, sắc ký lớp mỏng cho một vết tròn

duy nhất màu đồ có R;= 0,3 (hình 7) Hợp chất này được đặt tên là

Trang 27

-GANO.C4 Phần khảo sát cấu trúc hóa học của GANO.C4 được trình

Phân | STT | Dungmôi | Trọng lượng Nhận xét

đoạn lọ giải ly cao (g) (Trên sắc ký lớp mỏng)

a 15 CAG) 033 CO MOL VEt chinh mau dd

DI 107-242) C:M (9:1) 2,4 Nhiều vết Chưa khảo sát

- EI s - 203-302 Ì C:M (8:2) - w _ Nhiều vết Chưa khảo sát -

Ghi chú: C: cloroform, A: acetat etyl, M: metanol

- Trang 28 -

(C:A) (9:1)

Hình 4: Sắc ký lớp mỏng cao eter dầu hỏa A và hợp chất GANO.E

Ghi chú: E.A : cao eter đầu hỏa A trong sơ đỗ Ì

E : hợp chất GANOE

Hệ dung môi giải ly: cloroform: acetat ety] (9:1)

Thuốc thử hiện hình: acid HạSO¿ đậm đặc

Dung môi giải ly: eter dầu hóa : benzen (6:4)

Thuốc thử hiện hình: acid HạSO¿x đậm đặc

Hình 6: Sắc ký lớp mồng hợp chất GANO.C1

Ghỉ chú : C.A: cao clorofom A

C1 : hợp chất GANO.C1

Dung môi giải ly: benzen: cloroforrm (1:1)

Thuốc thử hiện hình: acid H;SO¿ đậm đặc

-CB C2 C3 C4

Hình 7: Sắc ký lớp mỏng cao cloroform B và các hợp chất GANO.C2, C3, và C4

Ghỉ chú: CB : cao cloroform B của sơ đồ 1

C2 : hợp chat GANO.C2

C3 : hợp chất GANO.C3

C4 : hợp chất GANO.C4

Hệ dung môi giải ly: cloroform: acetat etyl (1:1)

Thuốc thử hiện hình: acid H;SOx đậm đặc

-2.3 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HOÁ HỌC CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC

2.3.1 Khảo sát cấu trúc hoá học hợp chất GANO.E

Hợp chất GANO,E thu được từ cao eter đầu hóa Á trong sơ đồ 1 có các đặc

22

điểm như sau:

Tinh thể hình kim, màu trắng

TỦ, 174 - 175°C (kết tỉnh trong dung môi acetat ety]),

Sắc ký lớp mồng giải ly bằng hệ dung môi cloroform: acetat etyl (9:1),

thuốc thử hiện hình là acid H;ạSO¿ đậm đặc, sấy bản cho một vết đuy nhất

mâu nâu với giá trị R¿= 0,3 (hình 4)

Phé MS, El (phụ lục 1): c6 mz = 398 là mối M”, hợp chất có khối lượng

phân tử M = 398, Thư viện phổ để nghị hợp chất này có cấu trúc (22#)-

3a-ergosta-7,22-dien-3/-ol với độ tương hợp là 99%,

Phé IR, KBr (phy lục 2), v cm): 3443 (O-H); 2957 ~ 2872 (C-H); 1638 (C=C); 1042 (C-O)

Phổ ‘H-NMR (CDCh) (phu luc 3): số liệu phổ kết hợp với so sánh tài

liệu”! được trình bay trong bang 9

Phé “C-NMR (CDCI) két hợp với phổ DEPT 90 và 135 (phụ lục 4, 5):

hợp chất có 28 carbon với độ dịch chuyển hóa học trình bày trong bang 10

Biên luận cấu trúc

Kết quả trên các phổ: IR (3443 cm”); C-NMR (71,07 ppm); 'H-

NMR (3,61 ppm) cho thấy phân tử GANO.E có chứa nhóm -ÓH

Phổ '”C-NMR có bốn mũi cộng hướng với độ dich chuyển hóa học lần

lượt là ppm: 139,57 (>C=); 135,68 (=CH-); 131,89 (=CH-); 117,46 (=CH-) va

Trang 33

-phổ 'H-NMR có mỗi ö = 5,23 ppm (1 H); õ = 5,18 ppm (1 H); ỗ = 5,17 ppm (1

H) thể hiện có ba proton olefin (C=CH)

So sdnh céc sé liéu cia phd C-NMR cia hop chất GANO.E với

(22E)-Sa-ergosta-7,22-dien-38-ol °! trinh bay trong bang 10 thay c6 sv tring khớp

-Bang 9: So sánh phổ "H-NMR giữa GANO.E với (22E)-5u-Ergosta-7,22-dien-38-oi”?!

GANG (8 ppm)

(22E}-5a-E.rgosta-7,22- đien-3/-ol [2°18 ppm)

Bảng 10: So sánh phổ '*C-NMR giữa GANO.E với (22E)-5a-Ergosta-7,22-dien-3[-oll2°!

-2.3.2 Khảo sát cấu trúc hợp chất GANO,EI

Hợp chất GANO.E1 thu được từ phân đoạn A, cha bang 6 có đặc điểm sau: Chất ở dạng sáp màu trắng

Sắc ký lớp mồng giải ly bằng hệ dung môi eter đầu hóa: benzen (6:4),

thuốc thử hiện hình là acid HạSO¿ đậm đặc, sấy bản cho một vết duy nhất

màu cam với giá trị R; = 0,63 (hình 5)

Phổ MS, E (phụ lục 6): có m¿ = 53§ là mũi MỸ, hợp chất có khối lượng phân tử M = 538 phù hợp với công thức phân tử C;;Hạ¿O; Ngoài ra phổ dé còn có mỗi z2 = 509 (M-C)Hs)”

Phé IR, KBr (phụ lục 7), v cm”: 2921 - 2848 (C-H); 1737 (C=O);, 1625 (C=C); 1174 (C-O)

Phổ !H-NMR (CDCH) (phụ lục 8): số liệu phổ kết hợp với so sánh tài

Hiệu?! được trinh bay trong bang 11

Phổ C-NMR có bốn mũi cộng hướng với độ dịch chuyển hóa học lần lượt là Šppm: 139,54 œC=); 135,70 (=CH-); 131,94 (=CH-); 117,36 (CH) va

phổ 'H-NMR có mũi § = 5,22ppm (1 H); 5,18 ppm (2 H) thể hiện có 3 proton

olefin (C=C)

Ngoài ra phố 'H-NMR cho thấy có mili ba 6 Sppm = 2,25 Biết là nếu

có sư hiện dién của nhóm CHạ-CO sẽ có tín hiệu cộng hưởng mỗi đơn tại

Trang 37

-Sppm = 2,1 Vay tín hiệu nói trên cho thấy nhóm -OH gắn vào C-3 đã được ester hoá bởi một mạch đài, khối phổ cho thấy mỗi mẹ với mư¿ = 538

Phổ MS với m⁄¿ = 538 [M”] để nghị đó là HạC -(CH;);-O-aglycon mà không phải là HO-agliycon Sự hiện điện của mạch carbon đài còn được củng

cố bởi các tín hiệu cộng hưởng có cường độ mạnh tai dppm = 22,7; 25,1; 27,6; 29,1; 29,4; 29,6 va 34,8 (-CH,-CO-0-)

So sánh các số liệu của phé C-NMR cla hop chdt GANO.E1 vdi

(22E)-3f-acetoxiergosta-7,22-dien trinh bay trong bang 12 thdy cé sw tring khớp ở phần khung ergostan

-Bảng 11: Se sánh phổ H-NMR giữa GANO.E1 với (22E)-30-Acetoxiergosta-7,22-dien "9!