Nghiên cứu và kết quả về cành NEEM

Nghiên cứu và kết quả về cành NEEM

18

3 NGHIEN CUU

3.1, Xác định thành phần hóa học cơ bản trong cành neem

3.1.1 Phương pháp và nguyên vật liệu

3.1.1.1 Phương pháp

a) Điều chế các loại cao

Ly trích các loại cao từ cành neem bằng các dung môi có độ phân cực tăng dẫn : eter đầu hỏa, cloroforrn, etyl acetat, etanol trong bình Soxhlet ””Í, quá trình ly trích biểu hiện ở sơ đề 1

b) Thu héi dung mdi

Thu hổi dung môi trong máy cô quay dưới áp suất kém, thu được 4 loại cao trích ly : cao eter đầu hỏa, cao cloroform, cao etyÏ acetat, cao etanol,

cì Xác định thành phần hóa học cơ bản của các loại cao

Dùng các thuốc thử biệt tính để xác định thành phần hóa học cơ bẩn trong các

loai cao tif canh neem (bang 1)

19

Bảng 1 : Thuốc thử biệt tính để xác định thành phần hóa học

1 | Sterol Liebermann-Burchard | Mau dé — hong

sang tím

4 | Alcaloid, Hop chat Bouchardat, Mayer Trầm hiện nâu

Hợp chất aldehyd

7 | Chất béo Thấm vào giấy lọc Vết dầu loang trên giấy

lọc

3.1.1.2 Nguyên vật liệu

a) Nguyên liệu

Ninh Thuận, sau đó đem sấy khô ở 6

Cành neem được thu hái vào thán

bột nguyên liệu có độ ẩm 10 - 12%

b) Hóa chất

ø 11 năm 2005, tại huyện Ninh Phước, tỉnh

0°C đến trọng lượng không đổi, xay thành bột,

Dung môi : eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, etanol, diclorometan

Bảng sắc ký silica gel tráng san ; Silica g el Merck Kielselgel 60, F254, 250um

Nuyin The Bach 22 Luin ite đc VÀ

- Dd mẫu thử cho vào ống nghiệm : 2 mi

(5ø cao nhựa hòa tan trong 100m] ELOH đun sôi trong 20 phút)

- HCI đậm đặc thêm từ từ vào thành ống nghiệm =: 1 ml

- Bột Mỹg cho vào ống nghiệm > img

(để yên đến khi hết sai bot)

- Isoamil alcohol cho từ từ vào thành ống nghiệm vừa đủ để tạo mầu

Thuốc thủ Alcaloid

- Điều chế mẫu thử :

Trích 5g mẫu cao nhva vdi dung dich Prollius (etyl eter ~ CHCl;- EtOH 95° - NH,OH dam dic theo ty 16: 25: 8:8: 1) 3 nhiét dé phòng, khuấy Hên tục trong 24

giờ Lọc lấy dịch, chiết và cô cạn thu được mẫu cao thử Hòa tan cao mẫu vừa đủ tan

trong dung dich HCI 1% ờ 80°C trong 1 giờ, lọc thu được dung dịch mẫu thử,

(NaOH, Na, K tatrat hòa tan trong 500m] HO)

Trộn 2 dung dịch với thể tích bằng nhau trước khi sử dụng

- Mẫu thử : 20g cao nhựa trong 200m] H;O

22

"Thuốc thủ FeC];

- Dd mẫu thử 10 ml

- Dd FeCl, 1% trong nước : 2 giọt

Sơ để 1: Ly trích các hoạt chất trong cành neem với các dung môi có độ phân cực khác nhau

Bột cành necem khô

- Chiết trong Soxhlet vdi eter dau hda

- Thu hếi dung môi dụng môi dưới áp suất kém

- Chiết tiếp trong Soxhlet vdi cloroform

- Thu hồi đụng môi dụng môi dưới áp suất kém

Ba

Cao cloroform

đưới áp suất kém - Thu Tin hồi dung môi dung môi |Kết quá định tính) hồi d môi bi Ty x ị wot taht j

- Chiết tiếp trong Soxhlet vdi - Định tính thành phần hóa học etyl acetat 4 cơ bản trong cao cloroform

- Định tính thành phần hóa học - Chiết tiếp trong Soxhlet vdi etanol

yo ban trong cao etyl acetal - Thu héi dung môi dụng môi đưới áp suất kém

Kết quả định tính |

ed

23

3.1.2 Kết quá khảo sát thành phần hóa học cơ bản của cành neem

Các loại cao eter dẫu hóa, cloroform, etyl acetat và etanol của cAnh neem

được điều chế theo so dé 1, được xác định thành phần hóa học cơ bản với các thuốc

thy ghi trong bảng 1 Kết quá được trình bày trong bang 2

Bảng 2 : Kết quả xác định thành phần hóa học cơ bắn của cành neem

Kết quả cho thấy :

- Cao eter đầu hỏa chứa chất béo gồm dầu béo và sắp

-_ Cao cloroform chứa sterol, một ít tanin và chất béo

- Cao etyl acetat chifa m6t it steral,

- Cao etanol chứa đường khử, lượng nhỏ tanin, một ít sterol va amin

Dựa vào kết quả khảo sát sơ bộ trên , chúng tôi tiến hành khảo sát thành phần

hóa học của cao cloroform,

Lian win thaw ag

Trong 14 phần đoạn trên, phân đoạn số 12 xuất hiện tỉnh thể, SKLM phân đoạn 12 này, thấy xuất hiện vết tương đối rõ Tiến hành sắc ký cột phân đoạn 12, giải ly với hệ dung môi là CHCI; : MeQOH (7:3), dung dịch qua cột được hứng vào

các lọ, mỗi lọ 20ml Theo đõi bằng SKLM, các lọ có SKLM giống nhau được gộp chung lại thành mội phân đoạn, cô quay thu hổi dung môi Kết quả thu được một tỉnh thể mầu trắng Kết tỉnh nhiều lần tính thể này trong dung môi CHC]; thu được một

chất, ký hiệu là L1

Sau đó „ tiến hành sắc ký cột nhiều lần kết hợp với sắc ký lớp móng điều chế trên các phân đoạn cho những vết rõ trên SKLM, giải ly với những hệ dung môi khác nhau, thu được các chất ký hiệu là L2, L5, L7, Lễ

3.2.2 Kết quả và biện luận

3.2.2.1.Chất L1

Chất L1 thu được ở phân đoạn 12, là tỉnh thể màu trắng , hình vảy, tan trong

hé dung méi CHCL : MeOH Œ:1), nhiệt độ nóng cháy 295-296°C

SKLM trên hợp chất L1, giải ly bằng hệ dụng môi CHC]; : MeOH (8:2), thuốc thử hiện hình là acid sulfuric đặc, sấy bảng ở IIÓ°C, cho một vết duy nhất màu tím

có giá trị Rf=0,2

Kết quả từ SKLM cho thấy hop chat Li tương đối phân cực, dựa vào phổ

NMR, ching tdi dự đoán rằng L1 là một glycosid,

Phé 'H-NMR (phụ lục số 1) cho thấy cé mét proton olefin {8, 5,34 (1H, d, J=

5,0 Hz, H-6)], 1 proton cla carbon mang 1 oxigen [4, 3,40 (LH, m, H-3)}] va 1 proton anomer [64 4,42(1H, d, J=7,5, H-1’)] Điều này phù hợp với kết quả phổ '°C.NMR thông qua cặp mỗi cộng hưởng của 2 carbon olefin [õc 140/3, C-5) và 122,3(1C, C-6)], | carbon mang 1 oxigen [6¢ 76,4 (1C, C-3)] va mét carbon anomer [8¢ 101,1

Ge, C-1 4

Phé'°C-NMR két hap v6i DEPT-NMR (phu luc sé 2, 3) : Ở vùng trường cao

cho thay các mũi cộng hướng 79,3 (loại carbon >CH-OH) ; 76,3 (loại carbon >CH-

OH) ; 73,6 Qoại carbon >CH-O) ¡ 7Ô,20ogi carbon >CH-OH) và 62,1 (loại carbon — CH;-OH) Như vậy L1 thuộc loại glycosid và phần đường là glucoz

Như vậy kết quả phổ cho biết L1 là một glycosid gồm 2 phần : phần aglicon

có số liệu phổ giống với B-sitosterol và phần đường có số liệu phổ giống với glucoz,

vì vậy chúng tôi chọn phố của các hợp chất trên để đối chiếu Kết quả so sánh được

27

Bảng 3 : Kết quả so sánh phổ 'ÌC-NMR kết hợp với 135 DEPT-NMR của hợp

chất LI với các hợp chất B-sitosterol , D-glucose

3.2.2.2 Chất L2

Hợp chất L2 là tỉnh thể bình kim, mầu trắng, tan trong CHCI; SKLM trên L2

và giải ly bằng dung môi CHCI;, thuốc thử hiện hình là H;ạSO;¿ đặc, cho một vết tròn

rõ, mầu tím

Nhiệt độ nóng chảy 138-129°C, không hấp thụ ánh sáng tử ngoại

Đựa vào SKLM nhận thấy hợp chất L2 phân cực trung bình

Phổ lH-NMR (phụ số lục 4) cho mũi cộng hưởng ứng với 1 proton olelin [õu 3,3 (1H, d, J=5,0 H¿, H-6)], 1 proton của alcol nhị cấp [êu 3,5 (1H, m, H-3)] cùng với cdc nhém metylen va metyl dưới đạng mũi đơn và mỗi đa Ở vùng trường cao từ Ó,6- 2,4 ppm Đây là những mũi đặc trưng của sierol,

Phổ 'H-NMR của L2 giống với phổ chuẩn của -sitosterol Ngoài ra, đồng sắc ký lớp mỏng 1.2 với J-sitosterol chuẩn trên cùng một bắn mỏng cho cùng RỂ,

Từ các dữ kiện trên, có thể kết luận L2 là f-sitosterol, một sterol được tìm thấy phổ biến trong thực vật

B-SiHosterol

dittin wiles (bac +

A pus Bre The Bach #

29

3.2.2.3 Chất L5

Hợp chất L5 thu được từ phân đoạn 8 của cao cloroform là chất bột vô định

hình , màu vàng, tan trong cloroform

SKLM trén LS, giải ly với hệ dung môi là CHCl; : MeOH (95:5), thuéc tht?

hién hinh 14 acid H,SO, dam đặc, thu được một vết tròn mau nầu

Phổ 'H-NMR (phụ lục số 7) cho tín hiệu 2 proton phương hương [ỗn 5,85 (2H,

s, H-2, H-6)] Do hai proton này đối xứng nhau nên nhân thơm sẽ trí hoán ở Vi tri 1,3,4,5,

Điều này phù hợp với phổ C — NMR (phụ lục số 8): cho tín hiệu 2 carbon

của nhân thơm ở vị trí 107,4 ppm (C-2 và C-6) là hai carbon còn mang proton ; 3 carbon của nhân thơm có mang nhóm -OH : 157,4 ppm (C-3 và C-5) ; 134,1 ppm (C- 4) và 1 carbon của nhân thơm gắn trực tiếp với nhóm C=O là 120,3 ppm (C-]) Ngoài ra, trên phổ 'H -NMR còn có 3 proton của nhóm metyl mang oxigen [ö„ 3,82

(3H, s, H-8)] tương ứng với một tín hiệu trên phố '“C-NMR là 56,5 (1C, -OCH3)

Hơn nữa, trên phổ '°C —NMR còn có một tín hiệu ở 186,9ppm tương ứng với C của ester COO-

Dựa vào các dữ kiện trên , chúng tôi nhận thấy L5 có số liệu phổ gần giống với số liệu phổ của hợp chất metyl gallat

Chúng tôi chọn phổ mô phỏng của metyl gallat để so sánh với L5

30

Kết quả so sánh được trình bay 6 bang 4, cho thấy có sự tương hợp về khung

sườn và loại carbon giữa L5 và metyl gallat

Vậy, chúng tôi để nghị L5 chính là metyl gallat

8

HạÒO ; 0

HO 5 4 OH

OH Metyl gallat

Bằng 4 : Bảng so sánh phổ '“C-NMR của L5 với hợp chất metyl gallat

3.2.2.4 Chất L8

Hợp chất L8 thu được từ kết quả sắc ký cột trên cao chioroform, sẵn phẩm

L8 là chất bột màu trắng, tan trong CH¿C; đun nóng và kết tỉnh lại khi để nguội

SKEM trên L§ và giải ly bằng dung môi CHạC;, hiện hình bằng hơi iod thấy một vết mầu nâu tím,

Phổ 'H-NMR (phụ lục số 12) cho thấy hầu như toàn bộ tín hiệu proton nằm

trong vùng trường cao 0,9-1,6 ppm, dự đoán hợp chất hợp chất L8 no, béo có mạch

carbon đài Ngoài ra, L8 còn cho tín hiệu proton của alcol nhất cấp lỗn 3,64 (2H, t,

H-D], hai proton của nhóm metylen [ôn 1,562H, m, H-2)], ba proton của nhóm

metyl [lồ 0,88 (3H, t, H-32)] Hơn nữa, L8 còn cho rất nhiều tin hiéu proton cha

nhóm metylen ở vùng 1,2-1,36 ppm nên L8 có thể là một alcol no, béo

Kiểm tra trên phố 'ÌC-NMR (phụ lục số 13), thấy toàn bộ tín hiệu eda carbon

chỉ xuất hiện ở vùng trường cao : biểu hiện cho tín hiệu của carbon no Hơn nữa, L§ con có tín hiệu carbon tại 63,1 ppm tương ứng với carbon mang oxigen Trên phổ

DEPT (phụ lục số 14) hoàn toàn không có carbon tứ cấp, chỉ có 1 carbon là —CH:ạ và

toàn bộ carbon còn lại là —CH; Vậy L8 là một alcol no, mạch thẳng

Để xác định tiếp số € của alcol béo này, dựa vào phố 'H để xác định số nhóm

~CH;- Trên phổ !H có một nhóm CH¡¿ ở 3,64 ppm là nhóm methylen của -CH;-OH, tiếp đó là một nhóm -CH; ở 1,56 ppra, một nhóm -CH; ở 0,88 ppm Các nhóm -CHạ- còn lại đều ở vùng 1,19-1,36 ppm vdi cường độ là 58, tương ứng có 29 nhóm -CH¡- Như vậy tổng cộng L8 có 32C (31 nhóm -CH;- và 1 nhóm -CH¡)

Nhận thấy L§ có số liệu phể gần giống với số liệu phổ của hợp chất

1-dotriacontanol, nên chọn hợp chất này để so sánh với L8

Kết quả so sánh được trình bày trong bảng 5, cho thấy có sự tương đồng về cấu trúc

Vậy dé nghị hợp chất L§ là 1-Dotriacotanol (CH:(CHạ);o¿CH:OH) có công thức hóa học như sau :

33

Bảng 5: Bảng so sánh các alcol béo với hop chat LS

EELS 38 29,54 25,90 22,80

14,10 63,00 32,83 31,96 29,79 29,66 29,48

14/11 63,00 32,83 31,95 29,71 29,66 29,48

14,11 63,08 32,83 341/93 29,70 29,62 29,46

14,11 63,12 32,82 31,92 29,70 29,62 29,43

14,11 63,13 32,96 31,96 29/73 29,65 29,49

14,04 63.14 32,63 31,99 29,77 29,66 29,46

proton của các nhóm metylen còn lại ở vùng 1,2-1,6 ppm

Phổ ÖC kết hợp với DEPT (phụ lục số 10, 11) cho tín hiệu của nhóm -COO tại 179,9 ppm, một nhóm metylen tại 34,3 (-CH;-C=Ở), một nhóm metyl tại 14,3 (- CH¡), các tín hiệu € còn lại đều ở vùng trường cao, trên phố DEPT cho thấy chí có một nhóm methyl, còn lại là các nhóm mmethylen

Dựa vào các đữ kiện trên, dự đoán L7 là một acid no, bóo

Để xác định chính xác số C của L7, dựa vào các íín hiệu trÊn phổ proton để xác định số nhóm -CHạ L7 có một nhóm -CH, 6 2,35ppm là của nhóm

~CH;-COOH, tiếp theo là 1 nhóm -CH¿- tại 1,63 ppm và 1 nhóm -CH; tại ổ 0,88ppm Còn tại vùng 1,25-1,33 ppm là các nhóm -CH¿- còn lại với cường độ là 26 tương đương với 13 nhóm - CH¿- Như vậy L7 có tổng cộng 15 nhóm ~CH-, ¡ nhóm

(29,41 24,80 22,71

14,11

178,50 33,83 31/57 29,03 28,86 24,53 (22,57 13,79

37

3.3 Thử nghiệm hoạt tính sinh học của cành neem

Dịch trích cành neem được đem thử nghiệm tác dụng trên một số các vì khuẩn như sau

- _ Thử nghiệm tác dụng của mẫu trên một số nấm bệnh trên cơ thể con người

mà hiện nay chưa có thuốc đặc trị hiệu quả như : Candida-a, Trichosporon-a

- _ Thử nghiệm tác dụng của mẫu trên một số vi khuẩn tạo mủ trong và ngoài cơ thể tạo viêm loét và gây bệnh đường ruột đã kháng lại thuốc trụ sinh như các loai Staphylococcus aureus, Salmonella typhosa

Quá trình thử nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa - Lý - Vi Sinh, Viện Pasteur, Thành phố Hồ Chí Minh

Phương pháp thử nghiệm : phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch và đo đường kính vòng ức chế

Vật liệu thử nghiệm : Đục lỗ trên thạch MH có đường kính 6mm

Nông độ vi khuẩn : 1,0 x10* cfu/ml

Nông độ thử nghiệm : pha loãng mẫu thử (C, , C¡ , C;, Cạ , Ca)

C, : dịch trích nguyên chất, lượng dùng thử nghiệm 25yl

C¡ : 1 thể tích Cọ + 1 thể tích alcol 90°, lượng dùng thử nghiệm 25]

C; : 1 thể tích C; + 1 thé tích alcol 90, lượng dùng thử nghiệm 25ul

C3: 1 thể tích C; + ] thể tích alcol 907, lượng dùng thử nghiệm 251

Ca: 1 thể tích C¿ + 1 thể tích alcol 90”, lượng dùng thử nghiệm 25H]

Ching vi khuẩn thử nghiệm : Candida albicans, Staphylococcus aureus, Salmonella typhosa duge nudi cay trong 24h trong mdi truéng Mueller Hinton Agar

Kết quả thử nghiệm được trình bày trong bang 7