Nghiên cứu và kết quả về thành phần hóa học cao CLORFORM của cây râu mèo

Nghiên cứu và kết quả về thành phần hóa học cao CLORFORM của cây râu mèo

Trang 15

Chương 2 - NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUÁ

2.1 KHẢO SÁT NGUYÊN LIỆU

2.1.1 Phương pháp thu hái và bảo quản mẫu

Để thực hiện việc nghiên cứu trên cây réu meéo, O stamineus thudc ho

Lamiaccae, chúng tôi đã thu hái cây mọc ở Bình Thắng, Bình An, Dĩ An, Bình

Dương vào tháng 3 trong năm Cây rầu mèo được nhận danh bởi PGS Lê Công Kiệt, Bộ môn Phực vật, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, thành phố Hỗ Chí Minh

Cách lấy và bảo quản mẫu cây có ảnh hưởng đến chất lượng và hầm lượng

các chất trong cây Tùy loại cây, có loại phải cắt lúc tươi, không được để khô, vì

tỉnh dầu sẽ giảm đi; có loại phải dùng khô hoặc sấy khô, bảo quân được sử dụng lâu dài Nhiệt độ và ánh sáng cũng làm thay đối hàm lượng và tính chất của các

chất trong cây, đặc biệt là tỉnh dầu Vì vậy, tốt nhất cây được thu hái vào buối

sáng sớm hay chiểu muộn (lúc mát mẻ, không thu hái vào lúc trưa nóng) Mẫu

thu được cho vào túi bóng màu sẫm, cố gắng không để dập nát

Cây sau khi đem về, rửa sạch và được tách riêng thành 3 phần lá, thân và rễ; loại bỏ lá vàng úa và phần thân non bị dập Rửa sạch, để ráo và trải mông ra phơi ở nhiệt độ phòng, từ 2-3 ngày, sau đó đem sấy ở nhiệt dộ từ 40-60°C cho

đến trọng lượng không đối, xay nhuyễn, bảo quản dể sứ dụng, cho các phần thực

nghiệm trong bài

2.1.2 Xác định độ ẩm và hàm lượng tro

2.1.2.1 Xác định độ ẩm

Cân 100g từng bộ phận lá, thân và rễ Sấy khô & 105°C đến trong lượng

không đổi và cân trọng lượng sau cùng

Tiến hành 3 lượt thí nghiệm như trên và lấy kết quả trung bình

Độ ẩm của các bộ phận cây có kết quả được trình bày trong Bang 2.1

Bắng 2.1- Kết quả độ ẩm của lá, thân và rễ cây râu mèo

Kết quá hàm lượng tro được trình bày trong Bảng 2.2 Mẫu tro được dùng

để xác định định tính sự hiện diện của các ion vô cơ

Nghiên Cứu Vũ Kết Quả

Luận ấn Thạc Sĩ Khoa Học Hóa Học

Bang 2.2- Kết quả hàm lượng tro của lá, thân và rễ cây râu mèo

Hàm lượng tro toàn phần %

2.1.3 Khảo sát sự hiện điện của các ion vô cơ

Chúng tôi chỉ tiến hành xác định sự hiện diện của một số ion vô cơ tiêu

a nw ” “A + + “A tA ” Z ˆ * Z

biểu Kết quá thực nghiệm xác định sự hiện diện của các ion võ cơ bằng các

phan ứng đặc trưng được trình bày ở Bắng 2.3

Bảng 2.3- Kết quả định tính sự hiện điện của các ion vô cơ

Ca” | (NHa)2C 20, Kết tủa trắng | + | + | + Mg’ | NaxHPO,, NHJOH | Kétutia tring dục + | + | +

Fe** NH.,SCN Đỏ máu + + +

Ky|Fe(CN oI Kết tủa xanh berlin

Kết luận: Các kết quả cho thấy trên lá, thân và rễ có các ion vô cơ sau: K”, Na”, Ca?*, Mg”

2.2 Khảo sát sự hiện điện của các cấu tử hữu cơ

2.2.1 Điều chế các loại cao

Trong cây cỏ thường có sự hiện diện của một số cấu tử hữu cơ như: stcrol,

tanin, alcaloid, triterpen, glicosid, flavon, saponin

Luận án Thạc Sĩ Khoa Học Hóa Học Nghiên Cứu Và Kết Quả

ré cây râu mèo

Các dạng cao trên được điều chế theo Sơ đồ I như sau:

Sơ đồ 1- Qui trình điều chế các loại cao

Cao McOH Cao McOlH Cao McOH

- Cô cạn ở áp suất kém

- Trộn với silicagpel

- Tân trích bằng ete dầu hỏa

- Thu hồi dung môi

- Tan trich bing CHCl

- Thu hồi dung môi

2.2.2 Khảo sát định tính các cấu tử hữu cơ

Cây có thường chứa một số cấu tử hữu cơ như: sterol, alcaloid, flavon

Chúng tôi tiến hành định nh sự hiện diện của cúc cấu tử nói trên bằng cúc

thuốc thử đặc trưng hoặc trầm hiện

- Định tính sterol: bằng các thuốc thử Liebermann-Burchard, Salkowski,

- Dinh tinh glicosid: bằng các thuốc thử Tollens, Baljet, Molish, Legal,

Kedle, phan ttng Raymond

- Dinh tính alcaloid: bằng các thuốc thử Bouchardat, Mayer, Hupcr,

Dragendoft, Bertrand

4 2

2.2.2.1 Dinh tinh sterol !7"!

Sterol được xác dinh bdi ede thude thi? Licbermann-Burchard, Salkowski, Rosenheim

Kết quả định tính stcrol trong các bộ phận cây dược trình bày wong Bang 2.4

Bảng 2.4- Kết quả định tính sterol trên các loại cao

Cao CHC, + h C6 sterol Cao MecOll Khony co sterol

Cao CHCI, - Không có stcrol Cao McOll Không có stcrol

Cao CHCl, - - Không có stcrol Cao McOH - - Không có stcrol

Bang két qua dinh tinh Sterol

Trang 19

2.2.2.2 Dinh tinh alcaloid!”>) !77!

Alcaloid được xác định bởi phan ứng trầm hiện với thuốc thử Bouchardat,

Mayer, Hager, Dragendoff, Bertrand

Kết quả định tính được trình bay trong Bang 2.5

Bảng 2.5- Kết quả định tinh alcaloid trong lá, thân và rễ cây râu mèo

Alcaloid

alcaloid

Bang két quả định tính alcaloid

Sơ đồ 2- Định tính glicosid theo phương pháp SOOS

e Dung dịch Na¿ŠO¡ bão had

Cao MeOH + + Có glicosid

Bang két quả định tính glicosid

Kết quá định tính tanin được trình bày trong Bang 2.7

Bằng 2.7- Kết quả định tính tanin trong lá, thân và rễ cây rầu mèo

Cao ete dau hỏa Khéng cé tanin

Cao CHICH, - - Không có tanin

Cao CHCl, Không có tanin

Cao CIICH: - - - KhG6ng co tanin

2.2.2.5 Định tính flavon!?!

Flavon được xác định bởi phần ứng màu với thuốc thử Shibata

Kết quá dinh tinh flavon co trong la, thân và rễ cây râu mèo dược trình bày trong Bảng 2.8

2 nw’, ” + Ũ ⁄ A ` x a A `

Bảng 2.8- Kết quả định tính flavon trong lá, thân và rễ cây râu mèo

Thuốc thử NaOH/EtOH | dd acetat 1% chì bão hòa

2.2.2.6 Dinh tinh saponin B17) 48!

Định tính saponin bằng cách xác định chỉ số tạo bọt của mẫu thử,

Ket qua dink tinh Maven ed trong bi than và rẻ cây rầun mèo dược tình bày rong Bang 2.9

Bắng 2.9- Kết quả định tính saponin trong lá, thân và rễ cây rầu mèo

Cao ete dau hoa - - <lÐ0 | Không có saponin

Trang 23

Bắng 2.10- Kết quả định tính tóm tắt các cấu tử hữu cơ có trong lá , thân và

rễ cây râu mèo

an Dang mau Sterol | Alcaloid | Glicosid | Saponin | Tanin | Flavon

Kết luận: kết quả định tính cho thấy

Cao ete dầu hỏa của lá và thân có chứa sterol

Cao cloroform của lá có chứa sterol, flavon

Cao cloroform của thần có chứa avon,

Cao MeOH cia lá có chứa alcaloid, glicosid, saponin, tanin

Cao MeOH cua than cé chifa alcaloid, glicosid, saponin, tanin, flavon,

Cao MeOH của rễ có chứa alcaloid, tanin, saponin

2.2.3 Khảo sát định lượng các cấu tử hữu cơ

Trong phần này, chúng tôi chỉ xác định hàm lượng một số cấu tử hữu cơ

tiêu biểu như alcaloid, glicosid va lanin trên lá, thân và rễ

2.2.3.1 Định lượng alcaloid!?7) 1421

Để xác định hàm lượng alcaloid, chúng tôi sử dụng hai phương pháp:

phương pháp SCHREIBER và phương pháp JABBAR

Sơ đồ 3- Xác định hàm lượng alealoid theo phương pháp SCHREIBER

Ỳ

-Tẩm v6i NH,OH 50% trong 48h

- Ngdm trong ete etil : cloroform (3:1) trong 24h

- Kiểm hóa với NH,OH 50% đến pH=9- 10

- Tận trích với CHC]:

Dịch CHC |

- Rửa với nước cất

- Làm khan với Na;SOa

- Cô cạn dung môi

- Làm khan dịch alcol n- Buul với Na2SO,

- Cô cạn dung môi ở 40C

e Lam khan vdi

Bảng kết quả hàm lượng alcaloid

Luận án Thạc Sĩ Khoa Học Hóa Học Nghiên Cứu Và Kết Quả

2.2.3.2 Định lượng glicosid Ú 1251 I2)

Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng glicosid theo Sơ đồ 5

Sơ đồ 5- Xác định hàm lượng glicosid trên lá, thân, rễ của cây râu mèo

- Tận trích với ete dầu hỏa (60-90”°C)

- Thu hồi dung môi

- Loại tạp với (CH:COO);Pb 20%

- Rửa với nước cất

- Lam khan v6i Na2SO,

- Cô cạn dung môi

Dịch alcol n- buul Dịch nước

- Làm khan với Na;SOa

Trang 27

Kết quả xác định hàm lượng glicosid được trình bày trong Bắng 2.2

Bang 2.12- Hàm lượng glicosid trong lá, thân và rễ cây râu mèo

Tân trích với ete etil

Dich ete ectil

Két qua him lượng tanin trong lá, thân và rễ được trình bày trong Bảng 2.13

Bang 2.13- Ham lugng tanin trong lá, thân và rễ cây râu mèo

2.2.3.4 Tóm tắt kết quả định lượng một số cấu tử hữu cơ trong lá, thân

và rễ cây râu mèo

Kết quả xác định định lượng các cấu tử hữu cơ trong các bộ phận của cây

râu mèo được tóm tắt trong Bảng 2.14

Bang 2.14- Kết quả định lượng một số cấu tử hữu cơ trong các bộ phận cây

2.3 TRÍCH LY, CÔ LẬP MỘT SỐ CẤU TỬ HỮU CƠ TRONG CÂY RÂU MÈO

2.3.1 Điều chế cao cloroform

Bột lá cây râu mèo (Ikp) cho vào soxhlet và tận trích bằng MeOhH, thu hồi dung môi ở áp suất kém được cao MeOlH (146,5p) Lấy toàn bộ cao trên đem

trộn với bột silicagen đến khi thành bột khô, rời Cho toàn bộ phần cao có trộn

với bột silicagel vào soxhlct và tiến hành trích ly bằng ctc dầu hda (60-90°C)

khoảng 78 giờ Lấy dịch trích được đem thu hồi dụng môi ở áp suất kém, chúng tôi thu được cao ete dầu hỏa (22g) Phần cao MeOH sau khi được trích bằng cle dầu hỏa, để khô tự nhiên cho đến khi trở lại thành bột khô, rời Tiếp tục cho vào

soxhlet để trích bằng CHC]; khoảng 75 giờ đến khi dịch trích không càn màu

vàng hoặc thử trên miếng kiếng Lọc, thu hổi dung môi dưới áp suất kém 6 40°C, dudc cao CHC] Qui trinh điều chế các loại cao được trình bày ở sơ đồ I,

trang 17

Từ Ikg bột lá cây râu mèo, chúng tôi điều chế được 52g cao CHC]:, 22g

cao ete dầu hỏa Cao CHC1; được dùng để chạy sắc ký cội

Luận án Thạc Sĩ Khoa Học Hóa Học Nghiên Cứu Và Kết Quá

Trang 29

2.3.2 Sắc ký cột trên cao cloroform

Cao cloroform thô (12p) được điều chế theo sự đồ 1 Dựa trên kết quả của

⁄ + ” “ ~ + + Ee ~ + > 4 a

sắc ký bản mỏng để tách các hợp chất hữu cơ có trong cao cloroform Chúng tôi

tiến hành dò tìm dung ly thích hợp trên bắn mồng để chạy sắc ký cột silicapel, giải ly bằng các hệ dung ly từ không phân cực đến độ phân cue ting dan: ete dầu hỏa, ete dầu héa- etyl acetat, accton va McOH

Chuẩn bị các lọ để hứng dung môi giải ly ra khỏi cột, mỗi lọ 40ml và cô

can dung môi dưới áp suất kém Tiến hành chấm sắc ký bán móng trên mỗi lọ

thu được và gom những lọ nào cho vết piống nhau để chia thành các phân đoạn

có kết quả sắc ký giống nhau

được tóm tắt trong Bang 2.15

Bắng 2.15- Kết quả sắc ký cột trên cao cloroform

Kết quả tiến hành sắc ký trên cột silicagel thực hiện trên cao cloroform

Phân Hệ dung Cặn thu được Sắc ký bẩn móng

2 60-100 | H-E (98:2) Sdp wang H:E(8:2) Vết nhòa | Không khảo sát

3 | 101-160 | H-E (97:3) | Cặn dầu vàng B Vết nhòa | Không khảo sát

4 161-210 | TEE (95:5) | Can dau vang lì Vết nhòa Không khảo sát

5 | 211-268 | H-E (93:7) | Cặn màu vàng | B:A (91) | Nhiều vết | Không khảo sát

6 | 269-290 | H-E (9:1) B:A (9:1) | Nhiéuvét | Không khảo sát 7T | 291-300 H-E Bột trắng B:A |có2vếtởphía | Khảo sáttiếp

II |2339-351 | H-E(7:3) Cặn xanh B:A(8:2) | Nhiều vết | Không khảo sát

12 | 352-386 | H-E (6:4) Cặn xanh | B:A@:2) | Nhiều vết | Không khảo sát

13 | 387-415 | H:E (5:5) Cặn vàng | B:A (7:3) 3 vết Khảo sát tiếp

14 | 416-456 | H:E (4:6) Can vang xanh | B:A (7:3) Nhiéu vét Không khảo sát

15 | 457-491 | H:E (2:8) | Cain xanhden | B:AG:7) | Vết Không rõ | Khong khảo sát

16 |422-521 — B_ | Can xanh den B:AC7) _ Vết không rõ Không khảo sát

17 522- E:A (1:1) | Can xanh den A Vết không rõ | Không khảo sát

S45

Ghi chú: H: ete dẫu hỏa; E: acetat etil; A: aceton; M: metanol

* Nhận xét: Ở Bảng 2.15, sau khi giải ly bằng các hệ dung ly khác nhau từ

không phân cực đến độ phân cực tăng dẫn trên sắc ký cột silicagel của cao CHC]:, chúng tôi thu được 19 phân đoạn Các phân đoạn có nhiều vết được để

lại chưa khảo sát

b/ Ở phân đoạn 10 của Bảng 2.15, chúng tôi tiến hành sắc ký cột lần hai

với kích thước cột 0,5 x 20 cm Chúng tôi cô lập được môi tỉnh thể màu vàng (kết tỉnh trong cloroform) có khối lượng 5,8mg Sắc ký bằng móng cho một

vết tròn màu vàng, dụng môi giải ly là B:A (9:1) có li -

là Ốy

c/ Ở phân doạn 13 của Bảng 3.15, chúng tôi tiến hành sắc ký cột lan hat

055 và dược đặt tến

kết hợp với sắc ký bắn dây với kỳ thuật khai triển nhiều lần (hệ dung ly

MeOH : CHCI; 99:1) Chúng tôi cô lập được thêm hai chất và dược đặt tên là

O¿ (m = 8,4mg), Os(m= 4,3 mg) Sắc ký bảng mỏng cho thay hai chat c6 Ry

nằm rất sát nhau

Việc khảo sát cấu trúc hóa học và cô lập của các hợp chất O¡, O¿, O3, Oy,

Os được trình bày ở phần 2.4 và phần thực nghiệm

Luận án Thạc Sĩ Khoa Học Hóa Học Nghiên Cứu Và Kết Quá

Nghiên Cứu Và Kết Quả

Nghiên Cứu Và Kết Quả

Trang33 -

2.4 KHẢO SÁT CẤU TRÚC CÁC HỢP CHÃ F SHU DUOC

Sau khi kiểm tra lại độ tinh khiết của các hợp chất thu được bằng sắc ký lớp mỏng, chúng tôi đã gởi mẫu tới phòng thí nghiệm phân tích ở Đại học Y Dược

TOYAMA, Nhật Bản nhờ Th§ Nguyễn Trung Nhân xác định các phổ MS, IR,

'H-NMR, 'C-NMR, HMQC, HMBC, !H, 'H-COSY

2.4.1 Khảo sát cấu trúc của hợp chất O;

2.4.1.1 Đặc điểm của hợp chất 0,

Hợp chất O;¡ thu được từ phân đoạn 7 của Bảng 2.15 có các đặc điểm sau:

a Sắc ký bản mỏng silicagel(Hình 2.1, trang 31) cho một vết tròn duy nhất

có R;=0,63; hệ dung ly benzen:aceton (7,5:2,5); hiện hình bằng acid sulfulric

b Hợp chất O; kết tinh trong alcol metil dưới dạng tỉnh thể màu trắng, nhiệt

độ nóng cháy T„¿= 139-141°C

c Phổ IR ( phu luc s6 1) Vinaxs em’! (KBr) c6 cdc mili đặc trung sau:3415 (-

OH); 2942-2868 (-CH>-, -CH3), 1653 (>C=CH-), 1472, 1370 (-CH,-), 1040 (>CH- O-)

d Phé 'H-NMR, CDCI, (phụ lục số 2, 2a, 2b, 2c, 2d) có các mũi đặc trưng

được cho trong Bảng 2.4.1.1

(),68-2,28 Proton của carbon bio hoa |