P2 nghiên cứu và kết quả về thành phần hóa học cây trầu không, thuộc họ hồ tiêu

P2 nghiên cứu và kết quả về thành phần hóa học cây trầu không, thuộc họ hồ tiêu

PHAN NGHIEN CUUN

UA KE? 2UA

Phân nghiên cứu trên cây trầu không được thực hiện với phuong phap nhl sau:

¡| CHIẾT : Điều chế các loại cao ete đầu hỏa, cao benzen, cao cloroform va cao alcol etl bing Soxhlet

* PHAN LAP CAC CAUTT niu Ca:

&c Sử dụng sắc ký cột với silica gel 60H dùng cho sắc ký bản móng, Merck,

* Sắc ký bản mỏng loại 25DC-Alufolien 20x20 cm kieselge! 60 FL Merck

% Sdco ký bảa dây loại Art 5715, OC-Fertigplauen; Reselgel 60 F “p58?

Phân Tích và Thí Nghiệm Thành Phố Hồ Chí Minh,

% Bo khéi phd bing may sắc kỹ lồng cao áp ghép khối phổ LC/ MS” : LCQ- FINNIGAN-THERMOQUEST

1 Khảo sát nguyên liệu

1.1 Thu hái và xử lý mẫu

Cây trầu không Piper bettle L (Piperaceae) được nhận đanh bởi PGS Lê

Công Kiệt, Bộ Môn Thực Vật, Trường Đại Học Khoa Học Tư Nhiên Thành Phố

Hồ Chí Minh, được thu hái tại Bà Điểm thuộc Quận 12, Thành phố Hồ-Chí-Minh

vào tháng 4/1999

Cây sau khi đem về được tách riêng thành 3 phần lá, thân và rễ; loại bỏ lá vàng úa và phần thân non bị dập Rửa sạch, để ráo và trải mỏng ra phơi ở nhiệt

độ phòng, từ 2-3 ngày, sau đó đem sấy ở nhiệt độ 60°C- 80°C cho đến khô, xay

nhuyễn, bảo quản để sử dụng cho các phần thực nghiệm trong bài

Kết quả hàm lượng tro được trình bày trong bằng 4 Mẫu tro được dùng để xác

định định tính sự hiện diện của các ion vô cơ

Bảng 4 : Kết quả hàm lượng tro của lá, thân, rễ cây trầu không

1.3 Khảo sát sự hiện điện của các ion vô cơ trong tro

Kết quả thực nghiệm xác định sư hiện diện của các ion võ cơ bằng các phản ứng đặc trưng được trình bày ở bảng 5

Bảng 5 : Kết quả định tính sự hiện diện các ion vô cơ,

MnỶ* | NaOH+H;O; Kết tủa nâu nhạt + + +

Fe | KIFe(CN)] Kết tủa xanh berlin + + +

Ba(NG); Kết tủa trắng + + +

so." môi trường axiL

PO,” | (NH¿;MoO, Kết tủa trắng + + +

Kết luận : Các kết quả cho thấy trên lá, thân và rễ cây trầu không có các ion vô

co sau: K*, Na’, Ca”, Mg’, Fe**, Mn’, Cr, SO va PO,*

2 Khảo sát sự hiện diện của các cấu tử hữu cơ

2.1 Điều chế các loại cao

Trong cây cỏ thường có sự hiện diện của một số cấu tử hữu cơ như sterol,

triterpen, alcaloid, tanin, flavon, saponin, triterpen Dinh tinh su hiện diện của các cấu tử hữu cơ trên bột khô và các loại cao eter dầu hỏa, cao benzen, cao cloroform va cao alcol etil bing các thuốc thử đặc biệt thường cho các phản ứng

có màu hoặc trầm hiện Các dạng cao trên được điểu chế theo sơ đồ 1 như sau :

Sơ đồ 1: Quy trinh điều chế các loại cao của cây trầu không

~ Phơi dưới ánh nắng mặt trời

-Sấy khô từ 60-80% cho đến khi trọng lượng không đổi

2.2 Khảo sát định tính các cấu tử hữu cơ

Trong cây cỏ thường chứa các hợp chất hữu cơ như: sterol, triterpen, flavon, alcaloid, saponin, glicosid, tanin

húng tôi định tính sự hiện diện của

các cấu tử nói trên bằng các qui trình ly trích và định tính bằng các thuốc thử đặc

trưng tạo màu hoặc kết tủa

+ Định tính sterol bằng các thuốc thử: Liebermann Burchard, Salkowski, Noller

+ Định tính flavon bằng phản ứng Shibata (HCl đậm đặc, bột Mg kim loại và

alcol isoamil )

+ Định tính alcaloid bằng các thuốc thử: Bouchardat, Mayer, Hager,

Bertrand, Dragendorff

+ Định tỉnh glicosid : Sử dụng qui trình trích ly glicosid theo phương pháp

S§OOS có sửa đổi (sơ đồ 2) và định tính bằng các thuốc thử : Tollens, Baljets, Molish Kết quả định tính được trình bày trong bảng 6

Bảng 6 : Kết quả định tính các cấu tử hữu cơ trong lá và thân cây trầu không

Cao eter dầu hỏa

Thân | Cao benzen

Kết luân : Kết quả định tính cho thấy :

* Bột khô cuả lá và thân, cao alcol etil chứa hầu hết các cấu tử hữu cơ như

sterol, triterpen, alealoid, glieosid, tanin, flavon va saponin

* Cao cloroform chứa sterol, triterpen, alcaloid, flavon, glicosid, saponin va

tanin

* Cao eter dau héa va cao benzen chi chifa sterol, triterpen, tanin va glicosid

2 3 Khảo sát đỉnh lương các cấu tử hữu cơ

Dựa vào kết quả định tính đương tính, chúng tôi định lượng một số cấu

tử hữu cơ có chứa trong cây udu không như alcaloid, glicosid, tanin

2.3.1 Đinh lượng alcaloid [35]

Định lượng alcaloid theo hai phương pháp : phương pháp SCHREIBER có

sửa đổi (theo sơ 46 3) va phương pháp STASS-OTTO (theo sơ đồ 4)

Sa d62: Dinh tinh glicosid theo phương pháp SOOS (có sửa đổi)

đồ K 3: Xác định hàm lượng alealoid theo phương pháp SCHREIBE]

- Tam NH,OH 50% trong 48 giờ

~ Ngâm trong eter etil-cloroform (3:1) trong 24 giờ

~ Acid hóa với HaSO 3% đến pH=l

p2

- Tận trích với n-BuOH - Rửa với nước cất

- Làm khan với Na;SO¿ ~ Làm khan với Na;SOx

- C6 cạn dung môi ở áp suất kém ~ Cô cạn dung môi

8ø đồ 4 : Xác định hàm lượng alcaloid theo phương pháp STASS- OTTO

Dich cloroform

~- Rửa với nước

- Làm khan với CaCl,

~ Lọc, cô cạn dung môi

~ Thu héi EtOH ở áp suất kém

~ Loại tạp chất bing acetat chi 20%

2 3 3 Dinh lượng tanin theo phương pháp Takashi Yosida (sơ đồ 6)

Kết quả: Hàm lượng tanin trong bột lá khô là 5,4%

Kết quả định lượng cho thấy lá trầu không có chứa :

alealoid (0,05 %); glicosid (1,2%) va tanin (5,4 %)

Phần Nghiên Cứu và Kết Quả 2

3.1 Điều ché cao eter dau héa và cao cloroform

Bột lá trầu không (2,80 kg) cho vào Soxhlet và tận trích bằng eter dâu hỏa

(60- 90 °C), thu hồi dung môi ở áp suất kém, thu được cao eter dầu hỏa (52 g)

Bã còn lại được tẩm bằng NaOH 3M, để yên trong 24 giờ rồi trích bằng cloroform trong Soxhlet để có cao cloroform Cao eter dầu hỏa được điều chế thành cao eter dầu hỏa phần không xà phòng hóa Qui trình điều chế được trình bày trong sơ đồ 7

Sơ đồ 7 : Qui trình điều chế cao eter dầu hổa phần không xà phòng hóa

và cao cloroform từ lá cây trâu không

Bột lá khô | 2,8kg

- Trích bởi eter đầu hỏa

~ Thu hồi đung môi

~ Rửa bằng nước cất - Thu hồi dung môi

- Lam khan bing Na,SO, - Làm khan bằng Na;SO,

- Lọc,thu hồi dụng môi

Bang7: Két qua sắc ký cột trên cao eter đầu héa phan không

xà phòng hóa của lá cây trầu không

th nh | Le | —- Sắc ký ban mdng xẩr Gh

: mete? Db cao @) | Hệ dungly |'`'R, “| chú

2 101-200 | Eter dầu- Benzen | 0,60 CoH nhiéu vét 0

3.2 Sde k¥ e6t trén can eter diu héa phan không xà phòng hóa

Cao eter dau héa phần không xà phòng hóa (14 gr) diéu ché theo so dé 7,

được hòa tan trong eter dầu hổa Nạp dung dịch vào đầu cội, sử dụng lần lượt các

bệ dụng ly từ không phân cực đến phân cực ; eter đầu hỏa, benzen, clotoform, alcol meUl, Mỗi lọ thu 30 mì hệ dụng ly Tiến hành sắc ký bản mống để gom các

lọ giống nhau thành các phần đoạu Kết quả sắẮc ký cột trên cao eter dau được

tính bày ở bảng 7,

Nhân xét: Ở bảng 7, sau sắc ký cột, thu được 10 phân đoạn Các phân đoạn

có sắc Ký bản mồng nhiều vết chúng tôi chưa khảo sát,

Riêng d phan đoạn 3, giải ly bằng eter dầu hỏa, benzen (8:2) thu được sẵn

phẩm có dạng bột mâu trắng; sắc ký bán mỏng cho thấy 2 vết cách xa nhau nên chúng tôi áp dụng phương phấp kết tỉnh phân đoạn nhiểu lần với dung môi n-

heptan, thu duce ngột tỉnh thể hình kim, không màn, có trọng lượng Ò,2g SẮc ký bản mỏng trên tỉnh thể này cho niột vết trên duy nhất có Ry= 0,53 trong hệ dung

ly benzen- cloroform (1 : 1) nên đặt tên là Pưer Á, Việc khảo sát cấu tnic hoa

hoc cia hep chat Piper 4 dugc tinh bay trong phan 4.1

3,3 Sắc kỷ cột trén cag cloroform

Cao cloroform thô (13g) điều chế theo: sơ để 7, được sắc ký cốt silca gel, giải ly bằng các hệ dụng ly từ không phân cực đến phân cực : eter dần hỏa,

henzen, cloroform, alcol meul M&i fo 50 mì hệ dung ly Tiển hành sắc ký ban

mỏng để gom các lọ giống nhau thành từng phân đoạn Kết quả sắc ký cột trên

cao cloroforma được trình bày trong bang Š,

3 Nhận xét : Ở bảng 8, sắc ký cột thu được 13 phần đoạn Các phân đoạn có

sắc ký bản móng nhiều vết được để lại, chưa khảo sất

Bang8: Kết quả sắc ký cột trên cao cloroform của lá cây

1 1-50 Eter dau héa 0,5 B: CHCl, nhiều vết | 0

a/ Phân đoạn 5 giải ly bằng cter dầu hỏa ; benzen (5:5), sắc Ký bản raông cho

thấy 2 vết đậm rất rõ ràng, cách xa nhau nên chúng tôi áp dụng phương pháp sắc

ký bảng dầy để tách hai chất này ra rồi kết tình lại nhiền lần bang CHC,

Kết quả thu được bai loại tình thể mâu phớt Vàng

Một tính thể có trọng lượng 9,07g;, sắc ký bản mỏng cho một vết tròn duy nhất có Rr= 0,43 trong hệ dung ly cloroform- acetat etil (1: Ð, được đặt tên là Piper B,

* Miệt tỉnh thể có trọng lượng Ö,06g; sắc ký bán mỏng cho một vết tròn

duy nhat cé Ry = 6,68 trong hệ dung fy cloroform- acetat tif (1:1) dude dat tén là

Piner C

bf Phan doan tf gidi ly bing cloroform, thu duge ddu, sie k¥ ban mdng cho thấy một vết tròn, hơi kéo đài Ấp dụng phương pháp sắc ký bảng dây trên phan

đoạn l1 thu được một chải đầu, có trạng lượng Ô,03g Sắc ký bản mồng trên

chat dau này cho một vết tròn duy nhất có Ry = 0,60 tong hệ dung ly cloroform- acetat et (2: B), được đặt tên lA Piper D

Việc khảo sát cấu trúc hóa học của các hợp chất Pør 8, Pụer C và Piper

Ñ được trình bày trong phần 4,

4, Xháo sát cấu trúc hóa học của các hợp chất thụ được

4.1 Khảo sát cấu trúc hóa học của hợp chất Piper A

Hop chat Piper A thụ được trong phân đoạn 3 bằng 7, do sắc kỹ cột trên cao

eter dau héa phan không xà phòng hóa Hợp chất nây có đặc điểm sau ;

SAC KY BAN MONG SILICA GEL CUA PIPER A

Hệ dung ly Henzen : Cloroform (1: 1)

Thuếc thứ hiện hình Acid phosphormolibdic ˆ

Bảng 9: So sánh phổ “C NMR ¡ DEPT NMR của hợp chất Piper A

với chất mẫu B -Sitosterol [ 36 ]

* Phd hồng ngoại có các mũi hấp thu đặc trưng sau đầy (phụ lục 1}

* Phố "iC NMR va phO NMR DEPT dude trinh bay trong bang 9 (phổ đỗ

được trình bày trong phụ hạc 3 ,4),

Biên luận cấu trúc của hơn chất Piner Á

Phố lC NMR và phổ DEPT NMR cho thấy có 1 mũi @ vùng 140,57 ppm

là loại carbon tử cấp và Ì mũi ở vùng 121.49 ppơưi là loại =CH, các kết quả này cho thấy Piper Á có chứa 1 nối đôi đang CsCẴH Kết hợp với điểm nóng chảy của

Piper Á là 139 PC cũng giống như điểm nóng chây của B_Silosterol (138-1407C)

nên chúng tôi chọn B_ Sitosterol làm mẫu chuẩn để so sánh

Kết quả so sánh phê lậu: NMR của hợp chải Piper A với B_SHosierol được

trình bày ở bảng 9 Kết quả cho thấy các mũi cộng hưởng táo NMR vi DEPT

của hợp chất Piper A đều phù hợp với phổ của Ø_ Sitosterol mẫu, nên chúng tôi

để nghị cơ cấu của hợp chất Piper A là 0_Sitosterol có công thức như sau :

4 2 Khảo sát cấu trúc hóa hoc của hợp chất Piper B

Hợp chất Piper B thu được trong phân đoạn 5 bầng 8, do sắc ký cột trên cao cloroform Hợp chất có đặc điểm sau :

* Hợp chất có dạng bột, màu phớt vàng

* Điểm nóng chảy 130°C (so với lý thuyết 129 — 130°C)

* Sắc ký bảng mỏng : cho một vết với Rr= 0,43 trong hệ dung ly cloroform-

acetat etil (5:5)

l

* Phổ hồng ngoại V cm” (KBr) (phụ lục 5) : 2940 (CH,CHạ); 1634; 1611; 1583 (-¢-N của amid tam cấp) ; 1252(-C-N )

* Phổ 1H NMR(CDC]; 200 MHz) (phụ lục số 6) §ppm : 7,36 (1H, mũi đa, H-3);

6,97 (1H, mũi đôi, H-7) ; 6,88 (1H, mũi đồi, H-11) ; 6,78 (1H, mũi đôi, H-10); 6,75 (1H, mũi đa,H-4) ; 6,73 (1H, mũi đa, H-5 ) ; 6,40 (1H, mũi đôi, H-2); 5,97 (2H, mũi đơn, H-12) ; 3,61(2H, mũi rộng, H-13) ; 3,55(2H, mũi rộng, H-17); 1,62 (6H, mii da, H-14 , H-15 , H-16)

* Phổ C NMR kết hop v6i DEPT NMR (CDCl) (phu lục số 7, 8) ðppm :

165,3 (C=O ,C-1), 148,1 (C tứ cấp,C-8);, 148,0 (C tứ cấp,C-9) ; 142,3 (loại -

CH, C-3) ; 138,1 (loại -CH, C-5); 130,9 (loại C tứ cấp, C-6) ; 125,2 (loại-CH, C-4) 122,4 (-CH, C-I1), 119,9 (loại -CH, C-2); 108,3 (loại -CH, C-10 ) ; 105,5 (loại -CH, C-7); 101,1 (loại -CHạ-, C-12) ; 46,8 (loại -CH;- C-17) ; 43,1 (loai -CH;-, C-13); 26,6 (loại -CH;, C-16) ; 25,5 (loại -CH¿ạ-, C-14) và 24,5 (loại -CH;, C-15)

Biên luân cấu trúc của Piper B :

Do hợp chất Piper B có điểm nóng chảy và các kết quả phổ ly Be va

DEPT NMR có sự trùng khớp với hợp chất Piperin [37] Sự so sánh trình bày ở

Phân Nghiên Cứu và Kết Quả

30

SAC KY BAN MONG SILICA GEL CUA PIPER B

Hệ dung ly Cloroform : Acetat etil (1:1)

Thuốc thw hién hinh Acid phosphormolibdic

bảng 10, vậy chúng tôi để nghị hợp chất Piper B thu được chính là Piperin với công thức hóa học như sau :

Hiệu suất

Piperin C¡;H,O;N

Điểm nóng chay; 129- 130°C

: 9/0025 % tính trên mẫu lá cây khô

Bảng 10 : So sánh phổ '*C và DEPT NMR của hợp chat Piper B

với chất chuẩn Piperin [37]

4.3 Khao sat cfu tric hóa học của hợp chất Piner Ở

Hop chat Piper C thu dude trong phan doan 5 bang 8 do sde Ký cột trên cao

cloroform có các đặc điểm sau :

® Hợp chất có đạng bội, mầu phốt vàng

; Suy SỞ v, Qo ate a” af _

* Điểm nóng chấy 166C (so với lý thuyết 166 đếu 168°C)

* Sade k¥ ban vất Ký Bàn móng cho một vềt với Ry = 0.68 trong hé dung ly cloroforn- acetat mang cho mét vét vi By =: 6 : ộ eil( 5:5)

mữi đa, -CHạ NT ,H-13); 17§QH, mũi đa, -CHMe;, H-14); 0/86 (6H,

mũi đôi, H-15 và H-.!Ó@),

* Phố” © INIMR kết hợp với ĐEPT NAIR (CDCH) (phụ hịc số 11,12) âppmi : 165/2A 7 C=O@,C-D); 148,1 (C tứ cấp, C-§), 148,0 (C tứ cấp, C-6); 142,3 (=CH, C-3); 138,1 (áCH, C- 5); 120,9 (C nứ cấp, € - 6); 125,2 (CH ,C-4); 122,A (=CH, C-EL); 119,7 (2 CH, C-2)}; 108,3 (= CH, C-10) , 105.5 (GCH, C-7); 161,1(CH¿-O.,