Bài 5 sắc ký môn hóa phân tích

 Nhược điểm của chương trình đẳng nhiệt: Nếu nhiệt độ được chọn quá thấp, những peak hòa tan đầu tiên sẽ có khoảng cách rất gần nhau, trong khi đó các cấu... Chương trình Gradient:  Ng

- Sắc kí khí là phương pháp sắc kí mà pha động ở dạng khí chạy liên tục qua pha tĩnh,

các chất được tách ra nhờ tương tác khác nhau với pha tĩnh (pha động là khí mang

với tốc độ dòng không đổi để đưa mẫu qua cột sắc kí, dung dịch mẫu được hóa hơi,

đi vào cột, phân tách ra và được nhận biết bằng đầu dò gắn ở cuối cột)

NHÓM B1 – A5

- Hai bộ phận quan trọng nhất của thiết bị sắc kí khí là hệ thống cột tách và detector

- Hệ thống tiêm mẫu ở hai chế độ: chia dòng và không chia dòng

- Cột trong sắc kí là cột nhồi và cột mao quản

B Thực nghiệm và biện luận kết quả

 Bảng số liệu sơ lược về dung môi và hợp chất cần phân tích:

Tên hợp chất Công thức cấu tạo Khối lượng

phân tử(g/mol)

Nhiệt độ sôi(oC) lưỡng cựcMomen

 Một số yêu cầu khi chọn khí mang:

- Trơ với cấu tử khảo sát

- Có tỷ khối nhỏ (độ nhớt thấp) để làm tăng vận tốc khí mang

- Tồn tại ở dạng tinh khiết hoặc dễ làm cho tinh khiết

- Khi xét quan hệ giữa chiều cao lý thuyết H và vận tốc tuyến tính của dòng khímang, loại khí mang nào cho cực tiểu càng trải rộng càng tốt.

→ Trong bài thực tập chọn khí mang là N2 do không gây nguy hiểm, rẻ tiền, dễ dàng làmtinh khiết, trơ, phù hợp với đầu dò FID Tuy nhiên độ dẫn nhiệt của N2 rất gần với độ dẫncủa nhiều khí và hơi nhiều chất hữu cơ nên dễ gây trường hợp peak sắc kí bị dãn rộnghoặc bị ngược

 Một số yêu cầu về detector trong sắc kí khí:

- Độ nhạy phải đạt từ 10-8 đến 10-15 g chất tan (lí tưởng)

- Độ ổn định và độ lặp lại tốt

- Đáp ứng theo đường thẳng đối với chất phân tích

- Khoảng nhiệt độ từ nhiệt độ phòng tới ít nhất là 400oC

I Thí nghiệm 1 (Ảnh hưởng bản chất chất phân tích và nhiệt độ cột sắc ký đến sự

2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 m in -0.25

- Ta thấy độ phân cực và nhiệt độ sôi tăng dần benzaldehyde < phenol<

benzylalcohol, mặt khác pha tĩnh sử dụng là VF – 5MS tương đối không phân cực,

vì vậy những hợp chất phân tích ít phân cực hơn sẽ được rửa giải trước do tươngtương tác với pha tĩnh yếu hơn nên thời gian lưu ngắn hơn Những chất có nhiệt độsôi thấp hơn thì bị hóa hơi trước nên đi vào cột trước những chất có nhiệt độ sôicao

- Ta có thể dự đoán mũi đầu tiên là mũi của dung môi do dung môi sử dụng là

hexan (không phân cực) gần như không bị giữ lại nên thời gian lưu rất ngắn Cácmũi kế tiếp lần lượt là benzaldehyde, phenol, benzylalcohol

có xu hướng phản ứng với các chất giống nó (minh chứng là phenol và

benzylalcohol có nhóm –OH nên phản ứng được với gốc silanol) Vì vậy nên thời gian giải hấp bị chậm nên peak bị kéo đuôi

 Nhược điểm của chương trình đẳng nhiệt: Nếu nhiệt độ được chọn quá thấp, những peak hòa tan đầu tiên sẽ có khoảng cách rất gần nhau, trong khi đó các cấu

tử bị lưu giữ mạnh sẽ có các peak bị dãn rộng và nằm thấp Ngoài ra nếu nhiệt độ cột hơi thấp thì thời gian phân tích sẽ dài.

2 Chương trình Gradient:

 Nguyên tắc:Giữ nhiệt độ không đổi để tách các peak gần nhau và gia nhiệt nhanh

để các chất lưu giữ mạnh ra nhanh hơn

 Cách tính sơ bộ: Dựa vào số liệu giáo trình, bề rộng peak xem như không thay

đổi nhiều và 3 sắc kí đồ, ta chạy các giới hạn ẩn của độ phân giải (tối ưu hóa là 1.5

để có thể phân tách 2 peak mà thời gian lưu không quá dài), giá trị α (tối ưu ở 1.3),k’ khoảng 1 đến 5 Ta có thể dự đoán được chương trình nhiệt lần 1

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 m in -0.5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0uV(x10,000)

peak Ret.Time Area

TailingF

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 m in -0.5

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0uV(x10,000)

peak Ret.Time Area TailingF SeparationF k' Height Resolution T.Plate HETP

3 7.764 187675.1 3.901 6.359 0.263 33644.1 10.433 108948.5 0

 Do hệ số phân bố trong pha tĩnh và pha động của chất phân tích lớn nên mũi đầu tiên cách khá xa mũi dung môi, tuy nhiên vấn đề này thuộc về bản chất chất phân tích nên ta khó có thể tối ưu bằng chương trình nhiệt.

bề rộng các peak không thay đổi đáng kể trong các lần thí nghiệm

Ta có công thức độ phân giải

4× α ×(1+k2 ) Công thức ln k=ln K +ln Vs Vm =−∆ H RT + ∆ S R +ln Vs Vm

với K là hằng số phân bố NERNST Từ phương trình này ta thấy có dạng y = ax+b (x=1/T) ( giả sử ∆ H ,∆ Skhông thay đổi trong khoảng nhiệt độ) Như vậy ta cần 3 dữ liệu (chu trình đẳng nhiệt cho peak 2,3) để thiết lập phương trình

Ta có α= k2

k1 với k2,k1 là các hàm theo nhiệt độ theo chứng minh như trên

Từ k2, nếu biết thời gian lưu chết t0 ta tính được thời gian t R

N2=5.54 t2R

δ2 với δ không thay đổi trong một khoảng nhiệt độ

Từ những yếu tố trên ta có thể tính gần đúng hệ số phân giải R và thời gian lưu của peak 1,2 Từ đó giúp ta tối ưu được chu trình nhiệt, rút ngắn thời gian các chất phân tích

 Qua 2 lần điều chỉnh chương trình nhiệt thì thì thấy chương trình nhiệt khá là tối

ưu và có thể dùng để thực hiện những thí nghiệm tiếp theo

 Ưu điểm của chương trình gradient ta nhận thấy rõ là thời gian phân tích được rútngắn đáng kể, peak chất 1 với chất 2 cách nhau khoảng 0.3 phút, 2 peak sau cáchnhau chỉ khoảng một phút, thời gian lưu được cải thiện đáng kể so với chế độđẳng nhiệt Tỉ lệ giữa chiều cao peak và bề rộng peak luôn ổn định vì thế thuậnlợi cho định lượng Chương trình hóa nhiệt độ cũng có thể giúp rửa sạch một cột

bị nhiễm bẩn các cấu tử có nhiệt độ sôi cao trong những lần tiêm trước

II Thí nghiệm 2 (Ảnh hưởng của tỉ lệ chia dòng đến lượng chất phân tích vào cột;

ảnh hưởng nhiệt độ đầu của cột sắc ký trên khả năng tách trong chế độ tiêm chia dòng và không chia dòng)

Peak # t R (min) Diện tích Chiều cao Bề rộng peak (min)

 Sắc kí đồ B: các peak tách nhau chưa tốt, peak 1 và 2 còn chồng chập nhau do sự

thay đổi nhiệt độ từ 300C lên 700C làm cho các chất tách nhau chưa tốt, tuy nhiênthời gian lưu của peak 3 giảm xuống do sự tăng nhiệt độ

 Sắc kí đồ C: các peak tách nhau tốt và thời gian lưu được cải thiện nhờ việc sử

dụng phương pháp tiêm chia dòng, tuy nhiên diện tích peak giảm xuống so với sắc

kí đồ 1 do lượng chất đi vào cột nhỏ hơn so với sắc kí đồ 1

R2/1= 2(6,543−6,438)

Ngoài ra đường nền của sắc kí đồ khá cao Nguyên nhân có thể là do hàm lượng vếtcủa nước làm mất tác dụng của pha tĩnh gây ra đường nền cao và xuất hiện nhữngpeak ma Hàm lượng vết của chất hữu cơ cũng có thể gây hiện tượng này khi sử dụngđầu dò FID dẫn đến độ nhạy thấp

 Hai chế độ tiêm:

 Tiêm chia dòng: Thích hợp cho mẫu có các cấu tử phân tích có nồng độ lớn hơn0.1% mẫu Một dòng chảy mạnh của khí mang lôi kéo mẫu qua buồng trộn, ở đó

có sự hóa hơi hoàn toàn và hòa trộn tốt Tại điểm chia dòng, một phần nhỏ của hơi

đi vào trong cột sắc kí còn phần lớn đi qua van chia dòng đến lỗ thông khí thải →Tránh được hiện tượng quá tải của cột

 Tiêm không chia dòng: Thích hợp cho phân tích lượng vết những cấu tử có nồng

độ nhỏ hơn 0.01% mẫu và cách tiêm này có khoảng 80 % mẫu được giới thiệu vào cột

- Đối với chế độ không chia dòng với nhiệt độ đầu là 30oC (nhiệt độ đầu thấp hơnnhiệt độ sôi của dung môi) thì dung môi sẽ ngưng tụ trên đầu cột cùng với nhữngcấu tử khác sau đó bốc hơi tái phân bố lại chất phân tích (hay còn gọi là hiệu ứngdung môi) nên độ phân giải của 2 peak đầu tốt hơn.

→Nếu chọn nhiệt độ thích hợp cho các cấu tử có điểm sôi thấp thì các cấu tử có điểm sôicao sẽ bị lưu giữ lâu trong cột tách dẫn đến peak của chúng bị dãn rộng Ngược lại nếuthực hiện việc tách ở nhiệt độ cao thì các cấu tử có điểm sôi cao sẽ rửa giải nhanh và có

độ phân giải tốt, nhưng các cấu tử có điểm sôi thấp thì bị tách chậm và có độ phân giảikém, thậm chí nhiều peak bị chập lên nhau

Những cấu tử lưu giữ mạnh có thể được nhanh chóng rửa giải nếu chọn nhiệt độ cao hơn,

và cũng cải thiện khả năng dò tìm chúng Tuy nhiên, nếu làm như vậy thì các cấu tử cùng

bị rửa giải tăng lên dẫn đến các peak cũng sít gần nhau và sẽ làm mất độ phân giải chocác peak ở đầu sắc ký đồ

III Thí nghiệm 3:Sử dụng dung dịch chuẩn đơn để định danh peak theo chương trình nhiệt tối ưu đã chọn:

Resolutio

5.0uV(x10,000) Chrom atogram

Màu hồng: Benzaldehyde

Màu đen: mix 3

peak Ret.Time Area Tailing F Separation F k' Height Resolution T.Plate HETPBenzaldehy

 Thứ tự rửa giải: benzaldehyde, phenol, benzylalcohol

 Hai peak sắc kí của benzaldehyde, phenol khá gần nhau

 Ta thấy benzaldehyde tương tác với pha tĩnh yếu nhất, nhiệt độ sôi thấp nhất nên

đi ra sớm nhất Tiếp theo là phenol và cuối cùng là benzylalcohol Mặt khác vì nhiệt độ sôi của benzaldehyde và phenol khá gần nhau, nếu ta tăng nhiệt đồ đầu càng nhanh thì hai peak càng gần nhau

 Chọn phenol để định danh vì trong sắc kí đồ chỉ có 2 peak bị kéo đuôi (ta có thể

dự đoán được đó là phenol và benzylalcohol vì có tương tác với nhóm silanol),

benzandehyde không bị kéo đuôi Mặt khác, phenol có nhiệt độ sôi thấp hơn sẽ được rửa giải trước nên tiết kiệm được thời gian phân tích thay vì dùng

benzylalcohol

IV Thí nghiệm 4 (độ lập lại của tiêm mẫu bằng tay- việc sử dụng chất nội chuẩn)

1 Không dùng nội chuẩn:

Tiêm lặp 3 lần 1μL hỗn hợp phenol và benzylalcohol trong hexan

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 m in -0.5

- Thời gian lưu:

Thời gian lưu trung bình: t Rtb = h 1+h2+h33 =6.417+6.467+6.4123 ≈ 6.432

2 Dùng nội chuẩn:

Ta xem phenol là chất nội chuẩn

 Tỉ lệ diện tích của phenol so với benzyl ancol:

Diện tích A Chiều cao H Thời gian lưu tR

 Từ số liệu trên ta thấy sau mỗi lần, diện tích, chiều cao của peak thay đổi rất lớn

Do đó độ lệch chuẩn của 2 giá trị này rất cao Trong khi đó thời gian lưu thay đổi không đáng kể

 Nguyên nhân là do sau mỗi lần tiêm, lượng dung dịch mẫu đưa vào khác là khác nhau Vì lượng dung dịch mẫu đưa vào là rất thấp ( tính theo micro lít) do đó chỉ cần một lượng nhỏ thay đổi cũng sẽ gây ra sai lệch rất lớn

 Tuy nhiên giá trị thời gian lưu lại không thay đổi nhiều vì thời gian lưu ảnh hưởng không nhiều bởi sự sai lệch của mỗi lần tiêm Thời gian lưu bị ảnh hưởng lớn bởi chu trình nhiệt và cột sắc ký Còn sự sai lệch trên chỉ ảnh hưởng rất ít, không đángkể

 Tính toán từ các giá trị tỉ lệ diện tích, chiều cao, thời gian lưu của phenol (nội chuẩn) với benzyl ancol, nhận thấy sai số đã giảm rất nhiều so với sai số diện tích, chiều cao, thời gian lưu Như vậy việc thêm nội chuẩn vào hiệu quả trong việc làmgiảm sai số khi tiêm lượng mẫu không chính xác Các giá trị tỉ lệ này gần như thayđổi nhỏ (với độ lệch chuẩn rất thấp) Chứng tỏ phenol là chất nội chuẩn khá tốt cho dung dịch benzyl ancol Tuy nhiên vẫn chưa là tốt nhất vì các tỉ lệ này vẫn có

 Trong thí nghiệm này thì các peak phải lấy một khoảng cố đinh như nhau (peakcủa phenol lấy từ 6.3 đến 7.3 còn peak của benzylalcohol lấy từ 7.8 đến 8.8) Tuynhiên không được lấy peak quá nhiều vì khi đó thì bề rộng peak thay đổi dẫn đếndiện tích peak thay đổi làm cho phép định lượng không chính xác nữa

 Nếu chọn đỉnh của mũi sắc kí làm điểm gốc 0 thì dựa trên trục tọa độ chỉ nên lấy

-2 đến +-2 là phù hợp

C Tài liệu tham khảo:

D Phụ lục: