(Tiểu luận) tiểu luận tìm hiểu về glutathione

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘITiểu Luận Tìm Hiểu Về Glutathione Phan Hoài Nam nam.ph180351@sis.hust.edu.vn Ngành Kỹ thuật sinh học Chuyên ngành Công nghệ sinh học Giảng viên hướ ng dẫn

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Tiểu Luận Tìm Hiểu Về Glutathione

Phan Hoài Nam nam.ph180351@sis.hust.edu.vn Ngành Kỹ thuật sinh học Chuyên ngành Công nghệ sinh học  

Giảng viên hướ ng dẫn: PGS.TS Qu ả n Lê Hà

Viện: Công ngh ệ  Sinh h ọ c và Công ngh ệ  Th ự c

 ph ẩ m

Ch ữ  ký c ủ a GVHD  

1.1 T ổ ng quan v ề  Glutathione 3

1.1.1 Khái ni ệ m 3

1.1.2 C ấ u trúc hóa h ọ c và tính ch ấ t hóa lý: 3

1.2 Ch ức Năng Trong Cơ Thể  S ố ng 5

1.3 Sinh t ổ ng h ợ   p và quá trình s ả n xu ấ t 8

1.3.1 Sinh t ổ ng h ợ   p 8

1.3.2 S ả n xu ấ t Glytathione: 10

1.4 Ứ  ng d  ụ ng 17

Tài Li ệ u Tham Kh ả o 19

CHƯƠNG 1 Tiểu Luận

Tìm Hiểu Về Glutathione 1.1 T ổ ng quan v ề  Glutathione

1.1.1 Khái ni ệ m

Glutathione (GSH) hay γ -L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine là m  t tripeptit không tham gia vào vai trò c ấu trúc nhưng có vai trò ch ức năng  quan tr  ọ ng (ch ố ng oxi hóa, gi ải đ c t ế  bào …)   v ớ  i t ấ t c ả  các sinh v ậ t nhân chu ẩ n và m  t

s ố  sinh v ật nhân sơ   nh ờ   nhóm sulfhydryl (  –  SH) c ủ a cysteine tham gia vào các

 ph ả n ứ ng kh ử  và liên h ợ   p Vì th ế   nó đượ  c x ế  p vào nhóm thiol (R-SH) và là thiol có kh ối lượ  ng phân t ử  th ấ  p [1]

1.1.2 C ấ u trúc hóa h ọ c và tính ch ấ t hóa lý

1.1.2.1 C  ấ  u trúc hóa h ọ c

 Hình 1 C  ấ  u trúc hóa h ọ c c ủ a Glutathione Ngu ồ n:[4]

Glytathione là m  t tripeptit c ấ u t ạ o t ừ  3 amino axit là: glutamate, cysteine

và glycine Gi ữ a glutamate và cysteine là liên k  ế t γ -  peptide đặ c bi ệ t khi ế n GSH không b ị  phân h ủ y b ở  i h ầ u h ế t các peptidases GSH khó b ị   oxi hóa hơn

các ti ề n ch ấ t c ủ a nó là cysteine và γ -glutamylcysteine [4]

1.1.2.2 Tính ch ấ  t hóa lý

 B ả ng 1 Tính ch ấ  t hóa lý c ủ a Glutathione Ngu ồ n: [3] Công th ứ c chung   C 10 H 17  N 3 O 6 S  

Kh ối lượ  ng mol   307.33 g/mol Tính ch ấ t v ậ t lý B  t r  ắ n màu r  ắ n  Nhi ệt đ  nóng ch ả y 195°C

Đ   hòa tan trong nướ  c 292.5 mg/mL

Đ  hòa tan trong dung môi h ữu cơ    không tan

 Hình 2 Glutathione tinh th ể  Ngu ồ n:[7]

1.2 Ch ứ  c n ăng  trong c ơ   th ể  s ố ng

Trong t ế  bào GSH t ồ n t ại dướ  i 2 d  ạ ng là d  ạ ng b ị  kh ử  thiol (thiol-reduced) (GSH) và d  ạ ng b ị   oxi hóa disulfide (disulfide-oxidized) hay glutathione disulfide (GSSG) Trong đó d  ạ ng GSH là ch ủ  y ế u (hơn 98%)  [5]

 Hình 3 C  ấ  u trúc hóa h ọ c c ủ a Glutathione (GSH) và Glutathione disulfide

(GSSH) Ngu ồ n: Internet Trong t ế  bào sinh v ậ t nhân th ự c, h ầ u h ế t (80  –  85%) GSH c ủ a t ế  bào n ằ m trong t ế  bào ch ấ t; 10  –  15% n ằ m trong ty th ể  và m  t t ỷ  l ệ  nh ỏ  n ằ m trong màng

lướ  i n  i ch ấ t [5]

GSH ph ụ c v ụ  m  t s ố  ch ức năng quan trọ ng bao g ồ m [5]:

- Ch ố ng oxy hóa;

- Gi ải đ c xenobiotics và / ho ặ c các ch ấ t chuy ể n hóa c ủ a chúng;

- Đ i ề u ch ỉ nh s ự  ti ế n tri ể n c ủ a chu k  ỳ  t ế  bào và quá trình apoptosis;

- L ưu trữ  và gi ả i phóng cysteine;

- Duy trì ti ềm năng oxy hóa khử ;

- Coenzyme;

- Đ i ề u ch ỉ nh ch ức năng miễ n d  ị ch.

Trong s ố  các ch ứ c n ă ng trên, ch ứ c n ăng chố ng oxi hoá s ẽ   đượ  c nói rõ h ơn

trong bài ti ể u lu ậ n này.

 Hình 4 M  ộ t s ố   ch ắ  c n ăng ch ính c ủ a GSH trong t  ế   bào Ngu ồ n: [1]

Trao đổ i ch ấ t hi ế u khí t ạ o ra hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) H 2 O 2  b ị  kh ử  b ở  i GSH v ớ  i s ự  xúc tác chuy ể n hóa b ở  i enzyme GSH peroxidase (GPx) trong bào

tương và ty thể   để  t ạ o thành H 2 O và GSSG, và b ở  i catalase trong peroxisome GSSG có th ể   đượ  c kh ử  tr  ở   l ạ i GSH b ở  i GSSG reductase (GR) v ớ  i proton H+ c ủa NADPH, do đó hình thành m t chu trình oxy hóa kh ử

Các peroxit h ữu cơ (ROOH) có thể   b ị   kh ử   b ằ ng GPx ho ặ c GSH S-transferase (GST).

GSH cũng đóng m t vai trò quan tr  ọ ng trong vi ệ c truy ề n tín hi ệ u oxy hóa

kh ử  protein.

Trong quá trình oxy hóa, dư lượ  ng cysteine c ủ a protein có th ể  b ị  oxy hóa thành axit sulfenic (Prot-SOH), có th ể  ph ả n ứ ng v ới GSH để  t ạ o thành protein

h ỗ n h ợ   p disulfua Prot-SSG (glutathionyl h óa), do đó có thể  b ị  kh ử  tr  ở   l ạ i

Prot-SH thông qua glutaredoxin (Grx) ho ặc sulfiredoxin (Srx) Đây là mt cơ chế  

để  b ả o v ệ  các thiols protein nh ạ y c ả m kh ỏ i quá trình oxy hóa không th ể   đả o

ngược và cũng có thể   dùng để   ngăn ngừ a m ất GSH trong các điề u ki ệ n oxy hóa Kh ả   năng chuy ể n GSSG thành GSH c ủ a t ế  bào có th ể  b ị  gián đoạ n do quá trình t ổn thương oxy hóa , d  ẫn đế n tích t ụ   GSSG Để   ngăn chặ n s ự  thay

đổ i cân b ằ ng oxy hóa kh ử , GSSG có th ể   đượ  c v ậ n chuy ể n tích c ự c ra kh ỏ i t ế    bào ho ặ c ph ả n ứ ng v ớ  i protein sulfhydryl (Prot- SH) để  t ạ o thành disulfide h ỗ n

h ợ   p (Prot-SSG).

Các g ố c t ự  do trong t ế  bào c ũ ng đượ  c lo ạ i b ỏ  b ở  i ph ương tr  ình:

GSH + R  -   → 0,5 GSSG + R  H Thi ế u h ụ t trong c ơ thể  ng ườ  i có th ể  d  ẫ n đế n m  t s ố  b ệ nh lý nh ư  [1]:

- Suy gi ả m mi ễ n d  ị ch gây ra m  t s ố  b ệ nh nh ư: HIV, vi êm gan C, viên loét đạ i tràng, x ơ phổ i …  

- Ti ể u đườ  ng type II;

- Ung th ư  

1.3 Sinh t ổ ng h ợ  p và quá trình s ả n xu ấ t 1.3.1 Sinh t ổ ng h ợ  p

Quá trình sinh t ổ ng h ợ   p Glutathiol g ồm hai bướ  c c ần năng lượ  ng t ừ  ATP

và s ự  xúc tác c ủ a enzyme [4].

Bướ  c 1 (ph ả n ứ ng 1): K  ế t h ợ   p gi ữ a glytamate và cysteine để   t ạ o ra γ

-glutamylcysteine Quá trình này đượ  c xúc tác b ở  i enzyme glutamate cysteine ligase (GCL) hay còn đượ  c g ọ i là γ -glutamylcysteine synthetase Enzyme s ẽ  

s ử  d  ụng năng lượng ATP để  hình thành liên k  ế t amide gi ữ a nhóm γ -carboxyl

c ủ a glutamate và nhóm amin c ủ a cysteine.

Bướ  c 2 (ph ả n ứ ng 2): enzyme glutathione synthetase xúc tác cho ph ả n ứ ng

thêm glycine vào γ - glutamylcysteine để  t ạ o ra GSH và cũng cầ n s ử  d  ụng năng lượ  ng ATP.

Quá trình này x ả y ra bên trong t ế  bào Khi c ầ n chuy ể n GSH t ừ  t ế  bào này sang t ế  bào khác GSH ph ả i b ị  phân c ắ t b ở  i enzyme γ -glutamyl transpeptidase

thườ  ng có m ặ t và c ố   đị nh trên màng t ế   bào t ạ o ra glutamate và cysteinylglycine Sau đó dipeptit cysteinylglycine s ẽ  b ị  phân c ắ t b ở  i b ấ t k  ỳ  

 peptidase nào để  t ạ o ra cysteine và glycine Sau đó, glutamate, cysteine và glycine đượ  c di chuy ể n đế n t ế  bào nh ậ n b ở  i các ch ấ t v ậ n chuy ể n axit amin c ụ  

th ể   và đượ  c s ử  d  ụng để  sinh t ổ ng h ợ   p GSH [4].

1.3.2 S ả n xu ấ t Glytathione

1.3.2.1 Quá trình s ả n xu ấ  t truy ề  n th ố  ng [8]

Harington và Mead đã mô tả  quá trình t ổ ng h ợ   p hóa h ọ c c ủa GSH vào năm

1935, quá trình này đã được thương mạ i hóa vào nh ững năm 1950 Tuy nhiên,

vì ch ỉ  có d  ạ ng L phù h ợ   p v ề  m ặt sinh lý nên các phương pháp thay th ế   để  s ả n

xu ấ t GSH là nhu c ầ u t ấ t y ế u.

S ự  phát hi ệ n quá trình sinh t ổ ng h ợ   p t ự  nhiên GSH c ủ a Bloch (1949), con

đường đượ  c m ở   ra cho vi ệ c s ả n xu ấ t GSH b ằ ng enzym và vi sinh v ậ t.

1.3.2.2 Quá trình s ả n xu ấ  t b ằ  ng enzyme

S ơ đồ  quá trình s ả n xu ấ t GSH b ằ ng enzyme [7]:

Quá trình t ổ ng h ợ   p b ằ ng enzyme là quá trình r  ấ t gi ố ng quá trình t ổ ng h ợ   p

t ự  nhiên, h ứ a h ẹn năng suấ t cao vì ch ỉ  c ầ n các nguyên li ệ u t ố i thi ể u như amino

axit, enzyme và ATP , điều này giúp đơn giả n hóa quá trình tinh ch ế  [8] Tuy nhiên cho đế n nay vi ệ c chuy ể n sang quy mô s ả n xu ấ t công nghi ệ  p v ẫ n

chưa thự c hi ện đượ  c do s ả n xu ấ t ATP r  ấ t t ố n kém và thi ế u các h ệ  th ố ng tái

t ạ o ATP hi ệ u qu ả Tuy nhiên, s ự  t ổ ng h ợ   p enzym c ủ a GSH tr  ở   l ại như m t

ch ủ   đề  nghiên c ứ u (ví d  ụ : Chen và c  ng s ự  2013; Li và c  ng s ự  2010) M  t công b ố  g ần đây củ a Zhang et al (2017) cho th ấ y k  ế t qu ả   đầ y h ứ a h ẹ n là 8,76

g / L GSH trong 5 gi ờ   b ằ ng cách s ử  d  ụng glutathione synthetase đa chức năng

c ủ a Streptococcus sanguinis và h ệ  th ố ng tái t ạ o polyphosphat ATP ở   quy mô

1 mL [8].

1.3.2.3 Quá trình s ả n xu ấ  t b ằ  ng VSV

Hi ệ n nay các lo ại VSV để  s ả n xu ấ t GSH ở   quy mô công nghi ệ  p là các loài

n ấm men, đặ c bi ệ t là hai gi ố ng là Candida utilis và Saccharomyces cerevisiae [8].

Ở  các ch ủ ng hoang dã c ủ a hai gi ố ng này, n ồng đ   GSH đã khá cao , dao

đ ng trong kho ả ng 0.1-1% tr  ọng lượ  ng khô Ưu điể m c ủa phương pháp lên

men nh ờ   n ấ m men là kh ả   năng  phát tri ển và tăng mật đ  t ế  bào nhanh v ớ  i môi

trườ  ng lên men thông thườ  ng r  ẻ  ti ề n Do nhu c ầ u s ả n xu ấ t công nghi ệ  p này càng cao do ứ ng d  ụ ng r   ng rãi c ủ a GSH , người ta đã  lai t ạ o và đang cả i bi ế n các ch ủ ng n ấ m men b ằ ng k  ỹ  thu ậ t di truy ề n như  [9]:

- Lai t ạ o các ch ủ ng n ấ m men;

 Hình 8 Qúa trình sinh t  ổ  ng h ợ   p GSH trong n ấ  m men.

 Ngu ồ n: [8]

- Gây đ t bi ế n ng ẫ u nhiên b ằ ng tác nhân: v ậ t lý (tia UV, tia t ử  ngo ại…) ; hóa h ọ c ( EMS, NMU, NEU…) và sinh học như: virut…  

- S ử  d  ụ ng k  ỹ  thu ậ t gen:

 Hình 9 Lai các bào t  ử   n ấm men đơn bôi  (n) b ằ  ng các vi thao tác Ngu ồ n: [9]

 Hình 10 Lai các dòng đơn tính nả  y m ầ m t  ừ   bào t  ử  Ngu ồ n: [9]

 Hình 11 S  ử   d  ụ ng k   ỹ   thu ậ t gen t  ạ o ch ủ ng tái t  ổ   h ợ   p Ngu ồ n: [9]

- S ử  d  ụ ng k  ỹ  thu ậ t ti ế n hóa:

Vi ệ c c ả i bi ế n n ấ m men b ằ ng k  ỹ  thu ậ t ti ến hóa, còn đượ  c g ọi là “ s ự  ti ế n hóa

có định hướ  ng trong phòng thí nghi ệ m ” là m t cách ti ế  p c ận đượ  c s ử  d  ụ ng

r   ng rãi d  ự a trên cơ chế  ch ọ n l ọ c t ự  nhiên K  ỹ  thu ật đượ  c th ự c hi ệ n thông qua

vi ệ c áp d  ụ ng có ki ể m soát áp l ự c ch ọ n l ọ c lên qu ầ n th ể  VSV , để  chon ra các

ch ủ ng ti ế n hóa v ớ  i các ki ể u hình c ụ  th ể Điể m m ạ nh c ủ a chi ến lượ  c này là

 Hình 12 S  ử   d  ụng điề  u ki ệ n ch ọ n l ọ c kh ắ  c nghi ệ t v ớ  i t  ế    bào sinh dưỡ  ng ho ặ c bào t  ử    để   ch ọ n

l ọ c Ngu ồ n: [9]

Khi đã có chủng VSV ngườ  i ta lên men và thu h ồ i, tinh s ạ ch s ả n ph ẩ m theo

sơ đồ  sau [7]:

Ch ủng, phương pháp cấp dưỡ  ng, ngu ồn cơ chất như hình sau  [8]:

Sau khi có sinh kh ố i n ấ m men ta ti ế n hành thu h ồ i và tinh sach s ả n ph ẩ m,

d  ự a theo tài li ệ u [10]:

Bướ  c 1: D ịch sau lên men đượ  c ly tâm ở   t ốc đ  3000-5000rpm trong th ờ  i gian 5- 10 phút để  tách sinh kh ố i n ấ m men.

Bướ  c 2: Phá t ế  bào b ằng nướ  c nóng: 1 ph ầ n sinh kh ố i n ấm men đượ  c tr   n cùng 6-10 ph ần nướ  c sôi, khu ấ y tr   n ở   t ốc đ  300-350rpm, khi nhi ệt đ  chi ế t

xu ất đạ t 85-90 °C ủ  trong 10- 15 phút Sau đó làm mát chiế t xu ất đế n nhi ệt đ    phòng.

Bướ  c 3: Ly tâm d  ị ch chi ế t xu ấ t 3000-5000rpm trong th ờ  i gian 5-10 phút

lo ạ i b ỏ  xác n ấ m men, thu d  ị ch có ch ứ a GSH;

Bước 4: Điề u ch ỉnh đ  pH b ằ ng cách thêm axit vào d  ịch sau ly tâm đế n pH

t ừ  2.5- 3.5 để  k  ế t t ủ a m  t s ố  t ạ  p ch ấ t, ổn đị nh GSH và ch ố ng oxi hóa.

Bướ  c 5: Vi l ọ c v ới kích thướ  c l ỗ  màng 0.1-1 µm thu d  ị ch l ọ c;

Bướ  c 6: S ắc ký trao đổ i Ion, s ử  d  ụ ng nh ự a cationit Zeo-karb, gi ả i h ấ  p ph ụ  

th ị   đượ  c d  ị ch l ỏ ng giàu GSH;

Bướ  c 7: H ấ  p th ụ   m  t l ầ n n ữ a trên ch ấ t h ấ  p ph ụ   cao phân t ử  (polymeric adsorbent separates), r  ử a b ằng nướ  c tinh khi ết thu đượ  c d  ịch GSH đ   tinh khi ế t cao;

Bước 8: cô đặ c chân không v ớ  i áp su ấ t chân không 0,098Mpa và nhi ệt đ  

55 - 65°C, hàm lượng GSH thu đượ  c có th ể  lên t ớ  i 400 mg/ml;

Bướ  c 9: k  ế t tinh b ằng các thêm Virahol or ethanol cho đế n khi n ồng đ  

dung môi đạ t 60-80%, nhi ệt đ  k  ế t tinh t ừ  0-4°C, pH: 2.90 - 3;

Bướ  c 10: r  ử a tinh th ể  v ớ  i acetone 70-90%

Bướ  c 11: s ấ y chân không v ớ  i áp su ấ t 0,098Mpa và nhi ệt đ  55 - 65°C.

1.4 Ứ  ng d ụ ng

M ỗi năm có hơn 200 tấ n GSH tinh th ể  nguyên ch ất đượ  c s ả n xu ấ t trên th ế  

gi ớ  i Doanh thu h ằng năm trên toàn thế  gi ớ  i c ủ a các s ả n ph ẩ m n ấ m men có

ch ứ a GSH và GSH đượ  c s ả n xu ấ t và tinh ch ế  t ừ  n ấm men vượ  t m ố c 9 t ỷ  USD

vào năm 2019  [8].

Dưới đây là bả ng m  t s ố   ứ ng d  ụ ng c ủ a GSH trong m  t s ố   ngành công nghi ệ  p [8]:

 Hình 14 Ứ  ng d  ụ ng c ủ a Glutathione trong m ộ t s ố   s ả n ph ẩ  m