Chuong 3 cnsh phan tu

Trang 1

Chương 3

Kỹ thuật DNA tái tổ hợp và Hệ gen học

Trang 2

Nội dung

 3.1 Giới thiệu về công nghệ DNA tái tổ hợp

và tạo dòng DNA

 3.2 Vector ?

 3.3 Xác định và tạo dòng 1 gen ?

 3.4 Ứng dụng của kỹ thuật DNA tái tổ hợp?

 3.5 Hệ gen học và Tin sinh học

Trang 3

Giới thiệu về công nghệ DNA tái tổ

hợp và tạo dòng DNA

• 1970s tạo dòng gen thành hiện thực

– Clone – một phân tử, tế bào, hoặc sinh vật được nhân

bản từ 1 thực thể khác

• Nhờ sự phát hiện

– Restriction Enzymes – enzymes cắt

– Plasmid DNA Vectors –

– Có thể thao tác và tạo dòng một đoạn DNA

Trang 4

Trang 5

• Restriction Enzymes

– Tìm thấy đầu tiên ở vi

khuẩn – Cắt cầu nối

phosphodiester trên sợi DNA

– Bám, nhận biết và cắt

DNA ở các trình tự đặc

biệt gọi là trình tự nhận

biết hoặc vùng giới hạn

Trang 6

• Restriction Enzymes

– Trình tự nhận biết đối xứng đảo ngược palindromes

– Đầu cố kết (sticky ends) – đầu so le

– Đầu bằng

Trang 7

Trang 9

• Plasmid DNA – DNA sợi đôi dạng vòng tìm thấy đầu tiên ở vi khuẩn

• Có thể dùng như vectors – phân tử DNA có thể

chấp nhận, mang và nhân đôi các đoạn DNA khác

Trang 10

Nối các đoạn

có đầu so le

Trang 12

1 Tách các đoạn DNA mục tiêu (các đoạn chèn)

2 Nối các đoạn chèn với vector DNA tạo phân tử tái tổ hợp (e.g., plasmids)

3 Chuyển vector tái tổ hợp vào bên trong tế bào vi khuẩn hoặc các vật chủ khác để nhân

4 Sàng lọc các tế bào vật chủ mang vector tái tổ hợp

Giới thiệu về công nghệ DNA tái tổ hợp

và tạo dòng DNA

Trang 13

Giới thiệu về công nghệ DNA tái tổ hợp

và tạo dòng DNA

Trang 14

• Biến nạp vào tế bào vi khuẩn

– Tiến trình chuyển vector tái tổ hợp vào bên trong tế bào

vi khuẩn

• Xử lý tế bào vi khuẩn bằng calcium chloride

• Thêm plasmid DNA vào tế bào ủ trên đá

• Làm nóng hỗn hợp tế bào và plasmid DNA

• Plasmid DNA đi vào tế bào vi khuẩn và được nhân lên, biểu hiện

- Biến nạp bằng xung điện electroporation

Trang 15

Trang 16

Trang 17

Trang 19

• Sàng lọc tế bào vi khuẩn tái tổ hợp

– Sàng lọc là tiến trình được thiết kế để dễ dàng xác

định vi khuẩn tái tổ hợp và ngăn chặn sự sinh trưởng của tế bào vi khuẩn không được biến đổi

– Chọn lọc bằng kháng sinh

• Chọn lọc bằng hệ thống xanh trắng Blue-white

Trang 20

ation, Inc.

Trang 21

Các loại vector

Trang 22

Xác định và tạo dòng gen

• Tạo thư viện DNA

– Tập hợp tất cả các đoạn DNA được tạo dòng từ một sinh vật được mang bởi vi khuẩn hay virus

– Sàng lọc để thu nhận các dòng khác nhau mang gen

quan tâm

• Hai loại thư viên

– Genomic DNA libraries

– Complementary DNA libraries (cDNA libraries)

Trang 23

Thư viện bộ gen

• Thư viện bộ gen (Genomic Libraries)

– DNA nhiễm sắc thể từ mô quan tâm được chiết xuất và cắt bởi enzyme

– Vector được cắt bởi cùng enzyme và DNA ligase được dùng để nối các đoạn DNA và vector

– Recombinant vectors được chuyển vào trong tế bào vi khuẩn

– Nhược điểm

• Các đoạn DNA không mã hóa protein (introns) được tạo dòng cùng với exons; phần lớn DNA bộ gen là intron ở eukaryotes, vì vậy thư viện bộ gen chứa các intron

• Đa số sinh vật có bộ gen lớn, vì vậy việc dò tìm gen quan tâm rất khó khăn

Trang 24

Genomic Libraries

Trang 25

cDNA Libraries

• cDNA Libraries

– mRNA từ các mô quan tâm được tách chiết

– Chuyển sang DNA sợi đôi bởi enzyme phiên mã ngược

– Chuyển vector vào tế bào vi khuẩn

Trang 26

Libraries

Trang 27

Libraries

Trang 28

cDNA Libraries

• cDNA Libraries

– Thuận lợi

• Tập hợp tất cả các gen đang biểu hiện trong tế bào hoặc

mô từ mRNA tách chiết

Trang 29

• Sàng lọc thư viện để tìm gene quan tâm

– DNA biến tính sẽ dính vào màng dưới dạng DNA sợi đơn

– Màng được ủ với mẫu dò (probe)

• Đoạn DNA bổ sung với đoạn gen quan tâm– Mẫu dò kết hợp với trình tự bổ sung trên màng

Trang 30

• Film sẽ được tráng rửa tạo ra hình ảnh

– Film được so sánh với đĩa nuôi cấy vi khuẩn để xác định dòng vi khuẩn nào chứa plasmid tái tổ hợp với gene

quan tâm

Trang 31

on Education, Inc.

Trang 32

on Education, Inc.

Trang 34

• Polymerase Chain Reaction

– Phát triển những năm 1980s bởi Kary Mullis

– Kỹ thuật nhân bản một đoạn DNA đặt biệt trong thời gian

ngắn– Tiến trình

• DNA mục tiêu hòa với nucleotides (dATP, dCTP, dGTP,dTTP), buffer, và DNA polymerase

• Primers được bổ sung– short single-stranded DNA

oligonucleotides (20–30bp long)

• Phản ứng đặt trên máy luân nhiệt (thermocycler)

Trang 35

Polymerase Chain Reaction

• Tiến trình

– Chu kỳ gồm 3 giai đoạn

• Biến tính

• Kết hợp (lai giữa primer và sợi khuôn)

• Kéo dài (elongation)

– Cuối mỗi chu kỳ, lượng DNA tăng gấp đôi

– Lặp lại 20–30 lần

Trang 36

Trang 37

• Loại DNA polymerase sử dụng rất quan trọng

– Taq DNA polymerase – phân lập từ vi khuẩn Thermus

aquaticus sống ở suối nước nóng

• Thuận lợi PCR

– Nhân bản hàng triệu bản sao từ DNA mục tiêu với lượng ban đầu rất nhỏ trong thời gian ngắn

• Ứng dụng

– Tạo mẫu dò DNA

– Nghiên cứu biểu hiện gen

– Xác định sự nhiễm virus, vi khuẩn

– Chẩn đoán

– Xác định DNA từ mô ở hiện trường gây án

Trang 38

• Tạo dòng bằng PCR

– Nhanh và hiệu quả

– Disadvantage

• Biết thông tin về gene để thiết kế primer

– Bổ sung trình tự nhận biết của enzyme cắt vào primer – Sử dụng TA vector

• Taq polymerase thêm 01 adenine vào đầu 3’ của sản

phẩm PCR

Trang 39

rson Education, Inc.

Tạo dòng Gene bằng PCR

Trang 40

009 Pearson Education, Inc.

Ứng dụng DNA tái tổ hợp

Trang 41

• Điện di và tạo bản đồ gen

- Điện di Gel Electrophoresis

Trang 42

Trang 43

Agarose gel

Cathode

-Anode

+

Trang 44

Thiết bị điện di

Precast Ready Agarose Gel

Power Supplies

Trang 45

Agarose Gel

• Vật liệu xốp từ rong biển đỏ

• Hoạt động như một cái sàng để tách các

đoạn DNA; các mảnh nhỏ di chuyển

nhanh hơn các mảnh lớn

• Nồng độ ảnh hưởng đến tốc độ di

chuyển

– Nồng độ thấp: lổ lớn thuận lợi cho

DNA kích thước lớn di chuyển

– Nồng độ cao: lổ nhỏ, thuận lợi cho

DNA kích thước nhỏ

1% agarose

2% agarose

Trang 46

Thuốc nhuộm giữ mẫu

• Mẫu DNA được nạp vào gel SAU KHI bể chứa đầy dung dịch đệm, phủ kín gel

• Chứa một chất đậm đặc,

chẳng hạn như glycerol, để cho phép mẫu “ổn định"

trong giếng.

• Chứa một hoặc hai thuốc nhuộm theo dõi, di chuyển trong gel và cho phép theo dõi quá trình điện di đã tiến hành đến đâu

Trang 47

– Giải trình tự tự động trên máy tính

Trang 49

on Education, Inc.

Trang 50

Southern blotting

Trang 51

Gene microarrays

Trang 52

Gene Microarrays Analysis

Tiêu đề	Chương 3 cnsh phan tu
Trường học	Pearson Education, Inc.
Chuyên ngành	Biology
Thể loại	Tài liệu hướng dẫn
Năm xuất bản	2009

Định dạng
Số trang	52
Dung lượng	4,09 MB