Nghiên cứu tính đa dạng họ cúc (asteraceae) ở một số xã thuộc khu vực phía nam tỉnh thanh hóa và phía bắc tỉnh nghệ an

Tuy nhiên cho đến nay các nghiên cứu về dược học và đặc điểm gen phân loại, thành phần hóa học tinh dầu của loài cây này còn rất hạn chế, đặc biệt tại Việt Nam chưa có nghiên cứu cụ thể

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả là đồng tác giả với các cộng sự khác

Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, đặc biệt là

trình tự gen RpoC và trình tự RbcL cây Đại diệp Đằng (Tinomiscium petiolare) tại Thanh Hóa là những kết quả đầu tiên đƣợc công bố tại Việt Nam, một phần cũng đã đƣợc công bố trên tạp chí Proceedings on Applied Botady, Genetics and Breeding với sự đồng ý và cho phép của các đồng tác

giả và có 08 trình tự gen đƣợc công bố trên ngân hàng gen quốc tế

Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ các công trình nghiên cứu nào khác

Thanh Hóa, ngày 12 tháng 06 năm 2021

Tác giả

Nguyễn Thị Liên

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành tới TS Lê Đình Chắc - Trưởng Bộ môn Sinh học, người thầy đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất, giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn với tôi trong suốt thời gian thực hiện và hoàn thành luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô Bộ môn Sinh học, Ban chủ nhiệm Khoa KHTN Trường Đại học Hồng Đức Thanh Hóa Tôi xin cảm ơn

sự giúp đỡ của Phòng Quản lý Sau đại học và Ban lãnh đạo Trường Đại học Hồng Đức, Thanh Hóa đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập và làm nghiên cứu

Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ quý báu của BGH trường THPT Quảng Xương 1, chị em trong tổ chuyên môn Sinh học – CN nhà trường Tất cả các anh, chị em và các bạn lớp K12 cao học Thực vật học Cuối cùng, tôi muốn tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến tất cả người thân trong gia đình đã luôn sát cánh bên tôi, quan tâm, động viên và tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành luận văn này!

Trân trọng cảm ơn và cảm ơn!

Thanh Hóa, ngày 12 tháng 06 năm 2021

Tác giả

Nguyễn Thị Liên

MỤC LỤC

Trang

M ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Phạm vi nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

Chương 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3

1.1 Cây Đại diệp đằng 3

1.1.1 Đặc điểm phân loại và hình thái của loài Đại diệp đằng 3

1.1.2 Một số công dụng của cây Đại diệp đằng 3

1.1.3 Nghiên cứu về cây Đại diệp đằng tại Việt Nam và trên thế giới 4

1.2 Mã vạch dna (DNA Barcode) 4

1.2.1 Giới thiệu DNA barcode 4

1.2.2 Các đặc điểm cơ bản của trình tự barcode 5

1.2.3 Một số trình tự được sử dụng DNA barcode ở thực vật 6

1.3 Ứng dụng của mã vạch DNA trong nhận biết cây dược liệu 9

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU 11

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11

2.1 Đối tượng nghiên cứu 11

2.2 Nội dung nghiên cứu 11

2.3 Vật liệu, hóa chất và thiết bị 11

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu 11

2.3.2 Hóa chất, máy móc và thiết bị 12

2.4 Phương pháp nghiên cứu 13

2.4.1 Phương pháp thu mẫu 13

2.4.2 Các phương pháp sinh học phân tử 13 2.4.3 Phương pháp xác định trình tự nucleotide của đoạn gen RpoC, RbcL 17

2.3 Phương pháp tách chiết tinh dầu và xác định thành phần hóa học tinh dầu

rễ cây Đại diệp đằng 17

2.5 Phương pháp chiết xuất và nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu 18

2.5.1 Xử lý mẫu nguyên liệu 18

2.5.2 Phương pháp cất tinh dầu 18

2.5.3 Phương pháp cất cuốn hơi nước 18

2.5.4 Phương pháp xử lý tinh dầu 19

2.6 Phương pháp phân tích thành phần hóa học tinh dầu và dầu béo bằng hệ thống máy sắc ký khí GC-MS 20

2.7 Xử lý các số liệu thu được 20

2.8 Yêu cầu đối với kết quả phân tích 20

2.9 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa của tinh dầu rễ cây Đại diệp đằng 21

2.9.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu rễ cây Đại diệp đằng 21

2.9.2 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu rễ cây Đại diệp đằng 22

3.1 Kết quả phân tích đặc điểm hình thái Đại diệp đằng (Tinomiscium petiolare) 24

3.2 Kết quả phân tích đoạn gen RpoC và RbcL của cây Đại diệp đằng 28

3.2.1 Kết quả tách chiết DNA tổng số từ lá Đại diệp đằng 28

3.2.2 Kết quả nhân bản, xác định và phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen RpoC 28

3.2.3 Kết quả nhân bản, xác định và phân tích trình tự nucleotide của đoạn gen RbcL 36

3.3 Kết quả phân tích thành phần hóa học tinh dầu rễ cây Đại diệp đằng 43

3.4 Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật và chống oxy hóa của tinh dầu rễ cây Đại diệp đằng 46

3.4.1 Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu rễ cây Đại diệp đằng 46 3.4.2 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu rễ cây Đại diệp đằng 46 KẾT LUẬN 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 PHỤ LỤC P1

Bảng 3.2 Kết quả so sánh các trình tự RpoC phân lập đƣợc với các trình tự

RpoC đã công bố trên gen bank 34

Bảng 3.3 Kết quả so sánh giữa các trình tự RbcL phân lập đƣợc với trình tự

RbcL đã công bố trên gen bank 41Bảng 3.4 Thành phần hóa học tinh dầu rễ Đại diệp đằng 43Bảng 3.5 Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu rễ Đại diệp đằng 46Bảng 3.6 Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của tinh dầu rễ Đại diệp đằng 47

DANH MỤC HÌNH

Trang

Hình 3.1 Ảnh chụp cành cây Đại diệp đằng 24

Hình 3.2 Ảnh chụp lát cắt ngang thân cây Đại diệp đằng 25

Hình 3.3 Ảnh chụp mặt trên lá cây Đại diệp đằng 26

Hình 3.4: Ảnh chụp hình thái rễ cây Đại diệp đằng 27

Hình 3.5: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen RpoC từ hai mẫu Đại diệp đằng 29

Hình 3 6: Kết quả so sánh các trình tự gen RpoC thu đƣợc tại Bến En và Pù Luông Hình 3.7 Sơ đồ cây so sánh quan hệ di truyền của các trình tự RpoC thu đƣợc với các trình tự RpoC đã công bố trên gen bank 35

Hình 3.8: Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen RbcL từ hai mẫu Đại diệp đằng với cặp mồi RbcL -F/RbcL -R 36

Hình 3.9 Kết quả so sánh trình tự RbcL thu đƣợc với trình tự RbcL đã công bố trên gen bank 40

Hình 3.10 Sơ đồ cây so sánh quan hệ di truyền của các trình tự RbcL thu đƣợc với các trình tự RbcL đã công bố trên gen bank 42

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BioEdit và DNAstar: Phần mềm Tin sinh học phân tích dữ liệu DNA Blast : Basic Local Alignment Search Tool

BE : Bến En

CTAB : Cetyl trimethyllammonium Bromide

RpoC : RNA polymerase C subunit gene

RbcL : Rubilose - 1,5 - bisphosphate cacboxylase/oxygenase Large

PCR : Polymerase chain reaction

PL : Pù Luông

MỞ ĐẦ

1 Đ t vấn ề

Việt Nam với 75% diện tích tự nhiên là vùng đồi núi, chịu sự ảnh hưởng của khí hậu nhiệt đới gió mùa; do đó, Việt Nam đã trở thành một trong những quốc gia có hệ thực vật rừng vô cùng phong phú và đa dạng, đặc biệt là các loài cây dược liệu

Nằm trong vùng phân bố của loài tại Việt Nam (trong đó có Thanh Hóa)

được ghi nhận là có phân bố của loài cây Đại diệp đằng (Tinomiscium petiolare) (PHH, 2003) Tuy nhiên cho đến nay các nghiên cứu về dược học

và đặc điểm gen phân loại, thành phần hóa học tinh dầu của loài cây này còn rất hạn chế, đặc biệt tại Việt Nam chưa có nghiên cứu cụ thể về đặc điểm gen phân loại, thành phần hóa học tinh dầu của cây Đại diệp đằng Đây cũng là một trong những nguyên nhân làm cho Đại diệp đằng tại Việt Nam nói chung, Thanh Hóa nói riêng chưa được biết đến nhiều Trên thực tế, đã có một số công trình nghiên cứu trên thế giới về cây Đại diệp đằng gần đây đã cho thấy, Đại diệp đằng là một trong những cây dược liệu quý, có nhiều công dụng trong y học, tuy nhiên các nghiên cứu này chưa đề cập đến đặc điểm gen phân loại, thành phần hóa học của loài này Do đó, việc nghiên cứu về gen phân loại, thành phần hóa học tinh dầu của loài cây này là cần thiết nhằm cung cấp thêm tư liệu khoa học cho loài cây này

Cây Đại diệp đằng (Tinomiscium petiolare) thuộc họ Tiết Dê

(Menispermaceae) Tại Trung Quốc, các nhà Y học cổ truyền đã sử dụng Đại diệp đằng để chữa đau phong tê thấp, bị tê liệt ở trẻ em sau di chứng, phình đại, viêm cột sống, trị vết thương hở … Ngoài ra, rễ và thân Đại diệp đằng còn được sử dụng để điều trị phong thấp đau xương, đau mắt đỏ, đau lưng, …

lá được dùng trị ngoại thương xuất huyết

Xuất phát từ giá trị dược học nhiều mặt của cây Đại diệp đằng, đồng thời với mục đích cung cấp thêm tư liệu hóa loài cây dược liệu này, phục vụ khai thác và phát triển nguồn gen cây dược liệu quý thuộc danh lục cây thuốc

quý ở Việt Nam và Thanh Hóa, chúng tôi chọn “N n cứu c ểm hình

thái, gen phân loại và tinh dầu cây Đại diệp ằng (Tinomiscium petiolare)

tạ T an Hóa” làm đề tài nghiên cứu

2 Mục t u n n cứu

Phân tích được đặc điểm hình thái, đặc điểm trình tự một số gen phân loại và thành phần hóa học tinh dầu rễ cây Đại diệp đằng, phục vụ cho việc bảo tồn và phát triển nguồn gen cây Đại diệp đằng tại Thanh Hóa

3 Phạm vi nghiên cứu

Trong phạm vi nghiên cứu, đề tài tập trung phân tích đặc điểm hình thái, thành phần hóa học tinh dầu và bước đầu tạo dữ liệu phân loại học phân

tử dựa trên cơ sở phân tích đặc điểm của đoạn gen RpoC và gen RbcL phân

lập được, phục vụ nhận diện cây Đại diệp đằng tại Thanh Hóa

4 Ý n ĩa k oa ọc và t ực t ễn

Kết quả phân tích các đặc điểm về hình thái, thành phần hóa học tinh dầu

rễ cây Đại diệp đằng và sự phân bố cũng như những đặc điểm sinh học khác của cây Đại diệp đằng cung cấp thêm dữ liệu để được tư liệu khoa học cho cây Đại diệp đằng tại Thanh Hóa Đặc biệt là các trình tự nucleotide của đoạn gen

RpoC và gen RbcL phân lập từ cây Đại diệp đằng là những dữ liệu khoa học

quý giúp nhận diện cây Đại diệp đằng bằng công nghệ gen Kết quả nghiên cứu vừa có ý nghĩa về khoa học và vừa có nhiều ứng dụng trong thực tiễn

C ươn 1 TỔNG Q AN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨ

1.1 Cây Đạ d ệp ằn

1.1.1 Đặc điểm phân loại và h nh thái c a loài Đại diệp đằng

Theo Phạm Hoàng Hộ; Nguyễn Tiến Bân và Đỗ Tất Lợi, Đại diệp đằng

(Tinomiscium petiolare) được xếp trong họ tiết dê Menispermaceae [1], [2], [3]

Bộ Mao Lương (Ranunculales)

Họ Tiết Dê (Menispermaceae)

Chi Tinomiscium

Loài T Petiolare

Tên khác: Ðại Diệp Đằng; Vác căn, …

Tên khoa học: Tinomiscium Petiolare Miers ex Hook f et Thoms (T

tonkinense Gagnep.)

Tên Việt Nam: Đại diệp đằng (Vác can) thuộc dạng dây thân gỗ, sống lâu năm, thân có kích thước tương đối lớn Lá có hình xoan hay hình tim ở phía đuuôi phiến lá có mũi hơi nhọn

1.1.2 Một số công dụng c a cây Đại diệp đằng

Theo nghiên cứu của một số nhà Đông y trên thế giới, cây Đại diệp đằng hiện được sử dụng như là một loại dược liệu để hỗ trợ điều trị một số loại bệnh mạn tính như sau:

Về dược lý, Đại diệp đằng có vị cay, hơi đắng; được sử dụng trong việc

bổ gân cốt, hoạt huyết thông lạc, tán ứ giảm đau Ngoài ra, cũng theo đông y, Đại diệp đằng còn được sử dụng trong việc chữa đau do phong thấp và các di chứng bại liệt trẻ nhỏ, chữa đau hầu họng, viêm kết mạc, vàng da, viêm thể hạch cấp tính Mặt khác Đại diệp đằng còn được sử dụng trong việc điều trị bong gân, gãy xương, trật khớp Lá Đại diệp đằng được dùng theo cách tán thành bột hòa rượu đắp lên chỗ bong gân trật khớp, vết thương do dao kiếm

Rễ Đại diệp đằng ở dạng tươi được sử dụng bằng cách dã nát lấy nước trị đau mắt đỏ, tim đập nhanh … [25], [29]

1.1.3 Nghiên cứu về cây Đại diệp đằng tại Việt Nam và trên thế giới

Hiện nay, việc nghiên cứu xác định trình tự gen RpoC và RbcL của loài Đại diệp đằng còn hạn chế, đặc biệt là trình tự RpoC của loài cây này chưa được công bố trên gen bank, trong khi đó, trình tự RbcL của loài cây này chưa

thực sự quan tâm nhiều, đặc biệt là ở Việt Nam Thực tế cho thấy, các công trình nghiên cứu trong và ngoài nước về loài cây này chủ yếu là đặc điểm hình

thái, sinh thái, phân bố và một số gen phân loại như RbcL, MatK, tuy nhiên, các công trình nghiên cứu, phân tích, so sánh trình tự gen RpoC và gen RbcL,

phân tích thành phần hóa học tinh dầu rễ loài Đại diệp đằng có giá trị dược học quý này chưa được công bố Điều này cho thấy, việc nghiên cứu về đặc điểm

gen RpoC; gen RbcL và thành phần hóa học tinh dầu rễ loài cây này là cần

thiết, có ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn lớn

1.2 Mã vạc dna (DNA Barcode)

1.2.1 Giới thiệu DNA barcode

Kỹ thuật DNA barcode (DNA mã vạch) được nghiên cứu vào năm 1993 bởi (Arnon, 1993) [26], [27], tuy nhiên, thời điểm này DNA mã vạch chưa được quan tâm của đông đảo các nhà khoa học, do đó vấn đề này gần như không được đề cập đến trong việc phân loại học phân tử Ngày nay, với sự bùng nổ của sự phát triển khoa học, đặc biệt là Sinh học phân tử và Công nghệ sinh học, do đó thuật ngữ “DNA barcode” không chỉ được nhắc đến nhiều mà DNA barcode còn được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phân loại học phân tử trong giới sinh vật Kỹ thuật này được cho là có độ tin cậy cao về phân loại học trong sinh vật, bên cạnh phân loại học hình thái, giải phẫu Về nguyên lý, kỹ thuật DNA barcode là dựa vào việc sử dụng một trình tự DNA khoảng (400-800 bp) như là một tiêu chuẩn để nhận dạng và xác định quan hệ

di truyền chủng loài của các nhóm sinh vật một cách nhanh chóng và chính xác Do vậy, kỹ thuật DNA bacode (mã vạch DNA) không chỉ giúp các nhà phân loại học phân loại các loài sinh vật một cách chính xác thông qua mối quan hệ di truyền của các chỉ thị DNA khác nhau, mà còn nâng cao năng lực

kiểm soát, đánh giá sự đa dạng sinh học trong giới sinh vật Ngoài ra, kỹ thuật này còn có ứng dụng cao trong nhiều ngành khoa học và cuộc sống như trong khoa học pháp y, y tế, nghiên cứu y dược, sản xuất và kiểm soát chất lượng thực phẩm…

DNA barcode được nhóm tác giả Hebert và cộng sự (2002) tiến hành nghiên cứu một cách hệ thống, khi nhóm tác giả này tiến hành trên đối tượng

là bộ cánh vảy, kết quả của nghiên cứu đã xác định được mối quan hệ di truyền của các cá thể từ 200 loài với độ chính xác đạt tới 100% bằng cách sử

dụng gen ty thể cytochrome c oxidase tiểu đơn vị I (COI) [17], [19] Sau đó,

đã có nhiều các công trình nghiên cứu và định danh loài bằng chỉ thị DNA, tất

cả đều cho kết quả với độ chính xác cao trên các đối tượng là động vật có xương sống như: chim, cá, … và một số động vật không xương sống như ốc tiền, nhện và một số loài côn trùng thuộc bộ Cánh cứng Tại thời điểm này, hệ thống chỉ thị DNA đang được quan tâm nghiên cứu một cách nghiêm túc của các nhà khoa học nhằm thiết lập mối quan hệ chủng loài cho các nhóm sinh vật khác như vi khuẩn, sinh vật nguyên sinh, tảo, nấm và thực vật đã thu được hiệu quả đáng kể

1.2.2 Các đặc điểm cơ bản c a tr nh tự barcode

Phương pháp phân loại hình thái có tính lịch sử và có độ chính xác tương đối cao, tuy nhiên phương pháp này cũng gặp không ít khó khăn khi gặp các loài đồng hình, hoặc một số loài có phạm vi phân bố rộng, đây cũng là điều mà nhiều công trình nghiên cứu về hính thái trong việc xác định chủng loài đã có nhiều tranh luận của các nhà khoa học [9] Do đó, phương pháp phân loại học phân tử được xem là phương pháp tối ưu trong việc xác định, phân loại các loài nói trên, và đã được đông đảo các nhà khoa học trên thế giới ủng hộ bởi tính khách quan và độ tin cậy trong việc định loài Về bản chất, phương pháp này dựa trên các dữ liệu thông tin về các trình tự DNA có tính bảo thủ cao trong hệ gen (DNA) trong nhân và ngoài nhân hoặc các sản phẩm protein (đối với các trình tự có thể mã hóa các loại

protein đặc thù) Tùy mục đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các trình tự DNA khác nhau trong hệ gen hoặc các sản phẩm protein khác nhau của hệ gen [15] để phân lập và làm chỉ thị phân tử Thực tế cho thấy, phân loại học phân tử (Molecular taxonomy) có tính chính xác cao, đặc biệt trong việc phát hiện loài mới hoặc những loài đồng hình mà phân loại hình thái còn gặp nhiều khó khăn về các chỉ số hình thái

Đối với động vật, ngoài việc sử dụng các trình tự chỉ thị DNA trong gen nhân, thì phần lớn các nghiên cứu về chỉ thị DNA, đều sử dụng một vùng DNA ngắn của gen ty thể mã hóa cytochrome oxidase subunit I (COI) làm chỉ thị DNA [18], [26]

Đối với thực vật, khi nghiên cứu vấn đề này, người ta chủ yếu sử dụng các chỉ thị trong hệ gen lục lạp, đặc biệt là vùng DNA nằm giữa các gen hay

còn gọi là RbcL (Internal Transcribed Spacer) [5], [14], [16] Với những ưu

điểm của hệ gen lục lạp, hiện nay, nhiều vùng gen lục lạp đã được nghiên cứu

và đề xuất là chỉ thị DNA trong việc xác định quan hệ di truyền của thực vật

Thứ ba, đoạn DNA chỉ thị cần phải chứa đủ thông tin phát sinh loài để

có thể dễ dàng định danh loài vào các nhóm phân loại (chi, họ,…)

Thứ tư, có khả năng áp dụng với các mẫu vật thô, với vị trí cặp mồi nhân gen có độ bảo thủ cao, dễ dàng thực hiện phản ứng khuếch đại và đọc trình tự DNA

1.2.3 Một số tr nh tự được sử dụng DNA barcode ở thực vật

1.2.3.1 Vùng gen nhân mã hóa ribosome

Trình tự rDNA là hệ thống gồm nhiều gen mã hóa RNA của ribosome Các rDNA mang trình tự vừa có tính đa dạng vừa có tính bảo thủ thích hợp

để phân biệt các loài gần gũi Trong tế bào, rDNA được sắp xếp lặp lại ngẫu nhiên bao gồm các đoạn DNA mã hóa ribosome 18S, 5,8S, 28S và xen giữa

các trình tự không mã hóa RbcL1, RbcL2 (internal transcribed spacers) nằm

ở hai đầu của vùng mã hóa 5,8S Về đặc điểm, vùng mã hóa ba ribosome

18S, 5,8S, 28S của ba gen rDNA có tính bảo thủ hơn hai vùng RbcL2 Một

trong những tính năng đáng chú ý nhất của rDNA là từng đơn vị trong hệ thống đa gen mã hóa RNA không tiến hoá độc lập, mà chúng có sự ảnh hưởng lẫn nhau và có mức ổn định cao hơn trong loài nhưng khác biệt giữa các loài khác nhau

Đối với trình tự RbcL được xem là một trong những công cụ hữu ích

nhất để đánh giá quan hệ phát sinh chủng loài ở cả thực vật và động vật vì tính phổ biến của nó trong tự nhiên và độ chính xác trong phân loại học phân

tử Với đặc điểm và vai trò của rDNA mà hiện nay các nhà khoa học sử dụng chúng như là một chỉ thị hữu hiệu để xác định quan hệ di truyền và phát sinh chủng loài của thực vật nói riêng, sinh vật nói chung, [19], [23] [24]

1.2.3.2 Gen lục lạp

Cơ quan di truyền trong tế bào thực vật có ở: nhân, ty thể và lạp thể Trong đó, các trình tự DNA ở mỗi cơ quan có các đặc trưng khác nhau và chức năng khác nhau Đối với gen ty thể và lục lạp thì sự biểu hiện các đặc tính không tuân theo các quy luật Menden, Moocgan… và thường di truyền theo kiểu đơn gen theo dòng mẹ thực vật, gen lạp thể có dạng vòng và kích thước vào khoảng 120-165 kilobase (kb); chứa khoảng 130 gen, phụ thuộc vào từng giống, trung bình khoảng 150kb cây thuốc lá

bộ gen lục lạp có kích thước khoảng 160kb, trong tế bào lá thuốc lá có thể chứa 100 lục lạp, mỗi lục lạp chứa khoảng 100 bản sao của bộ gen plastid Vậy có khoảng 10000 bộ gen plastid/tế bào [13] các cây khác nhau, loại tế bào khác nhau sẽ có số lượng lục lạp trong mỗi tế bào không giống

nhau, đặc điểm này phụ thuộc vào điều kiện chiếu sáng của môi trường và loài Do đó, số lượng gen lục lạp cũng khác nhau trong từng loại tế bào, từng loại cây khác nhau, tuy nhiên, các trình tự DNA đặc thù cho từng loài của gen lục lạp có vai trò lớn trong việc xác định mối quan hệ di truyền của các nhóm thực vật khác nhau Điều này có vai trò quan trọng trong việc xây dựng danh lục các loài thực vật nói chung, thực vật dược nói riêng [7]

Sự tồn tại của DNA lục lạp được phát hiện đầu tiên vào năm 1962 và được công bố trình tự đầu tiên vào năm 1986 khi nhóm nghiên cứu Nhật Bản giải trình tự DNA lục lạp của thuốc lá và liverwort Kể từ đó, hàng triệu DNA lục lạp đã được giải trình tự, nhưng chủ yếu là đại diện thực vật trên cạn và các loài tảo So với gen nhân, sự di truyền của các gen lạp thể của tế bào chất có những đặc trưng riêng và gần như tương tự nhau ở các loài thực vật khác nhau về chức năng Điều đặc biệt quan trọng là gen lạp thể cũng có khả năng đột biến, điều này đóng góp lớn trong việc phân loại học phân tử và tạo ra tính đa dạng trong màu sắc của lá Do vậy, trong cùng một tế bào lá có thể có cả hai loại lạp thể màu lục và màu trắng Sự phân phối ngẫu nhiên và không đều của hai loại lạp thể này qua các lần nguyên phân sinh ra hiện tượng lá có các đốm trắng, có khi cả một mảng lớn tế bào lá không có diệp lục, như ở lá vạn niên thanh Bộ gen của lạp thể (cpDNA) chloroplast DNA hay ctDNA [13], [21] Ngoài việc, cpDNA chứa các gen mã hóa rARN và nhiều tARN lạp thể, nó còn mã hóa một số prôtêin màng lạp thể có chức năng quan trọng trong việc truyền êlectron ở quá trình quang hợp

Về cấu trúc, DNA lục lạp có dạng kép, vòng và kích thước khoảng

120-170 nghìn bp, chiều dài khoảng 30-60pm, khối lượng khoảng 80-130000000

dalton [13]

Trong gen lục lạp nhiều đoạn có kích thước khoảng 2000-10000 bp, không mã hóa, nhưng có vai trò quan trọng trong việc xác định quan hệ

chủng loài [8] Phần này được gọi là trình tự bảo thủ, trình tự này chứa các nucleotid bền vững, khó bị các tác nhân lý, hóa học tác động gây đột biến,

do đó đoạn nucleotid này hầu như không bị biến đổi trong quá trình tiến hóa Do vậy các nhà phân loại học phân tử đã sử dụng các trình tự này ở các loài thực vật khác nhau trong việc xây dựng mã vạch DNA, thông qua việc phân tích trình tự nucleotid của các trình tự nói trên để xác định mối quan hệ họ hàng giữa các loài trong sinh giới hiện nay

Thực tế, có rất nhiều trình tự trong hệ gen lục lạp được sử dụng xây

dựng mã vạch DNA như: matK, RpoC, [8], [15]

Trong quá trình nghiên cứu, các nhà khoa học đã phát hiện ra ba trong 4

tiểu đơn vị của RNA polymerase lục lạp là do các trình tự RpoC, RpoC1, RpoC2 mã hóa Điều này được cụ thể hóa bằng nghiên cứu của Tsumura và

đtg (1996) trên họ Dipterocarpaceae, nghiên cứu này đã cho thấy trình tự

RpoC là thích hợp để nghiên cứu phát sinh loài Do đó, hiện nay RpoC là một

trong những trình tự được sử dụng nhiều trong nghiên cứu phát sinh chủng loài, đặc biệt là khi nghiên cứu các loài có quan hệ gần gũi hoặc loài đồng hình [19], [22]

Những biến đổi ở gen lục lạp (cpDNA) đã và đang được sử dụng trong nghiên cứu về tiến hóa ở thực vật Với đặc tính bảo thủ của cpDNA trong việc thay thế cho các nucleotide đã tạo điều kiện cho sự so sánh những thay đổi ở phạm vi rộng trong phân loại phân tử ở thực vật, [4], [21]

1.3 Ứn dụn của mã vạc DNA tron n ận b ết cây dược l ệu

Mã vạch DNA rất hữu ích trong việc tìm mối quan hệ giữa các mẫu mặc dù chúng hầu như không giống nhau về hình thái Do đó, việc nhận biết chính xác cây dược liệu bằng mã vạch DNA là vô cùng quan trọng và cần thiết, điều này không những xác định đúng loài dược liệu mà còn góp phần phát hiện ra những sản phẩm dược liệu có nguồn gốc thực vật dược

dả mạo trên thị trường góp phần bảo vệ sức khỏe cộng đồng Mặt khác, mã vạch DNA còn giúp đánh giá đúng nguồn gốc xuất xứ thực vật dược, từ đó

đánh giá đúng giá trị dược liệu của các nhóm thực vật dược khác nhau, hoặc cùng nhóm thực vật dược nhưng trong những điều kiện sinh thái khác nhau Hiện nay trên thế giới về cơ bản đã hoàn thành được việc xây dựng

mã vạch DNA để nhận diện sâu bệnh ở cây ăn trái, từ đó làm cơ sở cho việc chuyển giao thiết bị, công nghệ phù hợp cho các nhân viên hải quan của nhiều quốc gia để họ có thể xác định và ngăn cản sự lan truyền của trái cây nhiễm sâu bệnh

Thực tế cho thấy, hiện nay nhu cầu về việc sử dụng các sản phẩm dược liệu

có nguồn gốc thực vật là vô cùng lớn tại mỗi quốc gia trên thế giới, do đó việc xác định và định danh đúng các loài thực vật dược không chỉ làm căn cứ khoa học để đánh giá chất lượng sản phẩm mà còn giúp các nhà dược học và các nhà nghiên cứu đánh giá đúng giá trị của các loài thực vật dược Đồng thời cũng nhờ

có mã vạch DNA mà đã phát hiện ra được nhiều loài thực vật dược quý hiếm và mối quan hệ di truyền của các loài thực vật dược, đây là điều rất quan trọng trong việc nghiên cứu các đặc tính của sự đa dạng di truyền, phát sinh loài và phát sinh vùng địa lý cũng như bảo vệ các loài có nguy cơ tuyệt chủng

Mã vạch DNA, cũng góp phần phát hiện ra nhiều sản phẩm trên thị trường

có nguồn gốc thảo dược là sự giả mạo do việc nhập các nguyên liệu thảo dược không đúng để sản xuất thuốc cũng như các sản phẩm hỗ trợ sức khỏe hoặc các sản phẩm mỹ phẩm khác Từ đó cho thấy, việc xây dựng mã vạch DNA nói chung, DNA cho dược liệu nói riêng là vô cùng quan trọng và góp phần không

nhỏ trong việc bảo vệ và phát triển đa dạng sinh học và sức khỏe con người [8]

C ươn 2 ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, VẬT LIỆU

VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Đố tượng nghiên cứu

Cây Đại diệp đằng (Tinomiscium petiolare) tại Thanh Hóa

2.2 Nội dung nghiên cứu

i) Nghiên cứu đặc điểm hình thái cây Đại diệp đằng tại Thanh Hóa

ii) Phân tích đặc điểm phân loại học phân tử thông qua trình tự

nucleotide của hai đoạn gen RpoC và RbcL phân lập từ cây Đại diệp đằng

Thanh Hóa

iii) Phân tích thành phần hóa học tinh dầu và thử kháng khuẩn, chống oxy hóa của tinh dầu rễ Đại diệp đằng

2.3 Vật l ệu, óa c ất và t ết bị

2.3.1 Vật liệu nghiên cứu

Mẫu cây Đại diệp đằng Đại diệp đằng (Tinomiscium petiolare) tại Thanh Hóa được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu

Kháng sinh chuẩn

- Gentamycin cho vi khuẩn Gr (-), doxycyclin cho vi khuẩn Gr (+) và nystatin cho nấm sợi và nấm men Kháng sinh được cung cấp bởi Viện kiểm nghiệm Tp HCM

- Từ dung dịch mẹ pha dung dịch gốc bằng nước cất vô trùng Từ dung dịch gốc pha loãng ½ đến nồng độ cần dùng: gentamycin (16-8-4 IU/mg), doxycyclin (0,4-0,2-0,1 IU/mg) và nystatin (12-6-3 IU/mg)

Nấm sợi (mốc): Asperghillus niger ATCC 9763, Fusarium oxysporum ATCC

2.3.2 Hóa chất, máy móc và thiết bị

Các hóa chất sử dụng trong sinh học phân tử như: Tris HCl, EDTA, phenol, ethanol (100%), agarose thuộc các hãng: Biolabscasc, Merck, Sigma của các nước nước Đức, Mỹ, Anh

Trang thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm: bộ nguồn điện di NanoPAC - 500 của Cleaver Scientific, Anh, bộ điện di DNA Cleaver Scientific, Anh, máy PCR eppendorf, Đức, máy UV Shimadzu UV 1800, Nhật Bản, một số thiết bị khác như lò vi sóng (Electrolux của Việt Nam), tủ sấy (Nuaire của Mĩ), tủ lạnh -20oC (Panasonic của Nhật Bản), tủ lạnh -85oC (Nuaire của Mĩ), pipetman, bể ổn nhiệt, máy ly tâm nồi khử trùng và một số thiết bị khác

Các dung môi hóa chất sử dụng trong nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu rễ Đại diệp ằng

STT T n dun mô , óa c ất T ôn số kỹ t uật Ghi chú

1 Hexane Merck, độ tinh sạch > 99% Sẵn sàng

2 Methanol Merck, độ tinh sạch > 99% Sẵn sàng

3 Dichloromethine Merck, độ tinh sạch > 99% Sẵn sàng

2.4.1 Phương pháp thu mẫu

Thu thập mẫu Đại diệp đằng Đại diệp đằng (Tinomiscium petiolare) tại

Thanh Hóa, sau đó sử dụng lá có độ tuổi thích hợp để tiến hành tách DNA Mẫu lá sau khi thu về được làm sạch bằng cồn và nước cất sau đó được cho vào túi nilon, buộc kín rồi đưa về phòng thí nghiệm bảo quản ở -80oC để tách chiết DNA phục vụ nghiên cứu Rễ tươi được sử dụng để tách chiết tinh dầu

và xác định thành phần hóa học tinh dầu

Định danh loài tại Bộ môn Thực vật học, Khoa Khoa học Tự nhiên ĐH Hồng Đức Người định danh TS Đỗ Ngọc Đài

2.4.2 Các phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp tách chiết DNA tổng số

DNA tổng số được tách chiết từ lá non của các mẫu Đại diệp đằng Đại

diệp đằng (Tinomiscium petiolare) thực hiện theo phương pháp CTAB

Chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số theo các bước như sau:

Bước 1: Lấy 200mg lá non nghiền trong nitơ lỏng (- 1960

C) thành bột mịn Bổ sung vào mẫu 6ml đệm rửa có thành phần (EDTA 5mM, pH = 8,0; Tris - HCl 100mM, pH = 8,0; NaH2PO4 0,4%; sorbitol 350mM; nước) Chia

ra ống eppendorf 1,5ml Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút

ở 4°C, bỏ dịch, thu cặn ( Bước này lặp lại 2 lần)

Bước 2: Thêm vào mỗi ống 500 pl đệm chiết (bao gồm các thành phần: EDTA 20mM, pH = 8,0; Tris - HCl 100mM, pH = 8,0; CTAB 4%; NaCl 1,4M; nước), mix nhẹ ủ ở nhiệt độ 65°C trong vòng 30 phút (15 phút đảo nhẹ ống 1 lần) Sau khi ủ xong, lấy ra để ở nhiệt độ phòng 5 phút

Bước 3: Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4°C Thu dịch pha trên chuyển sang ống eppendorf 1,5 ml mới

Bước 4: Bổ sung thêm 500pl C : I (24 cloroform: 1 isoamyl) để loại protein và tạp chất, đảo đều ống trong 15 phút Li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4°C Hút cẩn thận 500pl dịch trong ở pha trên sang ống eppendorf 1,5pl mới (bỏ tủa) Bước này lặp lại 2 lần

Bước 5: Thêm 500pl isopropanol, mix nhẹ, tủa DNA ở -20°C để qua đêm Sau đó li tâm trong 15 phút, với tốc độ 12000 vòng/phút ở 4°C, loại dịch thu tủa

Bước 6: Bổ sung 500pl cồn 70 độ Li tâm 10 phút, 12000 vòng/phút ở 4°C, loại bỏ dịch thu tủa (lặp lại 2-3 lần) Làm khô ở nhiệt độ phòng rồi hòa tan DNA trong 50pl nước cất 2 lần đã khử trùng Bảo quản ở tủ -200C đến khi sử dụng

Phương pháp nhân gen bằng kĩ thuật PCR

Bước 1: Nhân gen RpoC, RbcL bằng kỹ thuật PCR

Tham khảo công bố của Peter và cộng sự (2011) và bảng các cặp mồi

DNA Barcode [26], [27], [28] cặp mồi RpoC-F/RpoC-R; cặp mồi F/RbcL-R được tổng hợp có trình tự nucleotide thể hiện ở bảng 2.1

RbcL-Bảng 2 1: Trình tự nucleotide của hai cặp mồi PCR khuếch đại đoạn gen

(2009)

(2009)

Trong đó, đoạn gen RpoC được khuếch đại bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu RpoCf/RpoCr với kích thước dự kiến là khoảng 500 nucleotide Đoạn gen RbcL có kích thước khoảng 600 nucleotide

Phản ứng PCR được tiến hành với thành phần phản ứng được trình bày ở bảng 2.2

Bước 2: Phương pháp chạy điện di kiểm tra sản phẩm PCR

Chuẩn bị khuôn đổ gel đã cài sẵn răng lược Hòa tan 0,8 gam agarose trong 100ml TAE 1X trong bình thủy tinh chịu nhiệt, đun sôi trong lò vi sóng khoảng 2 phút sau đó bỏ ra, lắc đều cho agarose tan rồi tiếp tục đun trong lò vi sóng khoảng 30 giây nữa, để agarose nguội đến khoảng 60oC thì đổ vào khuôn đổ gel Đợi khoảng 15 phút cho gel đông thì bỏ răng lược

ra Đặt bản gel trong bể điện di, đổ đệm TAE 1X vào bể điện di cho đến khi mức đệm cao hơn mặt gel từ 1 - 2 mm Trộn 7pl DNA với 4pl dye, tra

vào một giếng nhỏ trên gel Điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 110 V trong khoảng 30 phút

Bước 3: Nhuộm gel trong ethidium bromide 1% và chụp ảnh dưới ánh sáng đèn cực tím

Bản gel được lấy ra khỏi máy điện di, nhẹ nhàng lấy riêng phần gel agarose cho vào hộp chứa dung dịch Ethidium bromide Sau đó nhuộm trong 10 phút Rồi lấy bản gel ra, ngâm trong nước 2 - 3 phút Đem vào máy quan sát dưới đèn tử ngoại (UV) và chụp ảnh

Phương pháp tinh sạch sản phẩm PCR

Sau khi nhân được gen RpoC, tiếp theo cần thu nhận gen ở dạng tinh

sạch và không lẫn gel agarose

Quá trình tinh sạch được thực hiện theo Kit GenJET PCR Purification của hãng Thermo Scientific gồm các bước sau:

Bước 1: Điện di sản phẩm khuếch đại gen, cắt băng gel cho vào ống eppendorf 1,5ml

Bước 2: Bổ sung dung dịch bám (binding solution), tỉ lệ 1 : 1 về thể tích Bước 3: Ủ ở nhiệt độ khoảng 50-60o

C cho đến khi gel tan hoàn toàn Bước 4: Hút dịch sang cột thôi gel, li tâm 12000 vòng/phút trong 2 phút ở 4oC, loại bỏ dịch

Bước 5: Bổ sung 700 pl dung dịch rửa (wash solution) vào cột, li tâm

2.4.3 Phương pháp xác định tr nh tự nucleotide c a đoạn gen RpoC, RbcL

Trình tự nucleotide của đoạn gen RpoC được xác định lại bằng máy

giải trình tự ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer, sử dụng bộ Kit BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing với cặp mồi đặc hiệu Trình

tự gen đó được phân tích, so sánh và lập cây phát sinh chủng loại bằng các chương trình Bioedit, BLAST, DNAstar

2.3 P ươn p áp tác c ết t n dầu và xác ịn t àn p ần óa ọc

t n dầu rễ cây Đạ d ệp ằn

- Hệ thống chiết shoxlet, chiết hồi lưu

- Hệ thống máy siêu âm loại 10L và 20L

- Hệ thống chiết tinh dầu và dầu béo

- Hệ thống sấy

- Hệ thống quay cất chân không

- Các trang thiết bị dụng cụ cần thiết khác

STT T n vật tư, t ết bị T ôn số kỹ t uật Tìn trạn

2 Bộ cất tinh dầu vi lượng Thủy tinh Đức Tốt

3 Máy khuấy từ RH Basic IKA Labortechnik Tốt

2.5 P ươn p áp c ết xuất và n n cứu t àn p ần óa ọc t n dầu

2.5.1 Xử lý mẫu nguyên liệu

Toàn bộ mẫu nguyên liệu tươi (rễ) sau khi thu hái về được phân loại, xử

lý loại bỏ tạp, sau đó rửa sạch và để khô, giữ lạnh trong tủ lạnh trước khi tiến hành các bước tiếp theo

2 Tạp chất Không lẫn các loại tạp chất nhìn thấy được

3 Thời gian xử lý mẫu Nguyên liệu sau khi được đưa ra khỏi tủ lạnh

cần được xử lý luôn trong ngày

Ngâm ủ nguyên liệu: Nguyên liệu thực vật phục vụ cho nghiên cứu được

cân chính xác khối lượng và ngâm ủ với nước cất theo tỉ lệ 4/1 (w/m) trong bình thủy tinh

2.5.2 Phương pháp cất tinh dầu

- Trước khi tiến hành chưng cất tinh dầu cần kiểm tra hệ thống chưng cất, bộ làm lạnh để đảm bảo quá trình chưng cất đạt hiệu suất cao nhất và không làm ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu thu được

- Đưa nguyên liệu đã xử lý vào bình cầu và lắp nối với thiết bị chưng cất

- Hệ thống làm lạnh và gia nhiệt được duy trì ổn định trong suốt quá trình chưng cất

- Tiến hành chưng cất trong 48 giờ, thời gian được tính từ lúc hỗn hợp sôi đến khi tắt bếp

2.5.3 Phương pháp cất cuốn hơi nước

Phương pháp chưng cất cuốn hơi nước là phương pháp cổ điển thông dụng nhất để dùng chưng cất các chất hữu cơ tự nhiên dễ phân hủy ở nhiệt độ

cao, khi thêm nước vào hỗn hợp, nhiệt độ sôi của hỗn hợp giảm xuống, cho phép các chất hóa học hóa hơi ở nhiệt độ thấp hơn Nguyên lý của quá trình này là hỗn hợp 2 chât lỏng không hòa tan khi được chưng cất sẽ có nhiệt độ sôi thấp hơn nhiệt độ sôi riêng phần của từng chất lỏng, do đó các hợp chất hóa học trong tinh dầu được chưng cất lôi cuốn cùng hơi nước sẽ có nhiệt độ sôi dưới 100o

C, thấp hơn nhiều so với nhiệt độ sôi của tinh dầu, như vậy sẽ tránh được sự phân hủy bởi nhiệt Sau đó hỗn hợp hơi được làm lạnh, ngưng

tụ, tách thành hai pha là pha nước và pha hữu cơ dễ dàng cho quá trình tách tinh dầu

Cụ thể: Các mẫu nguyên liệu thực vật được cắt nhỏ, tiến hành ngâm ủ với 2L nước trong 5-6 giờ, sau đó được chưng cất bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước trong vòng 48 giờ bằng thiết bị chưng cất Clavenger với tốc độ cất 2-3 mL/phút Tinh dầu được tách và thu ở phần ngưng, loại nước bằng

Na2SO4 khan, đựng trong chai thủy tinh kín, lưu trữ trong tủ lạnh đến khi phân tích

2.5.4 Phương pháp xử lý tinh dầu

Loại nước, cân tinh dầu và loại bỏ chất béo

+ Sau khi kết thúc quá trình chưng cất tinh dầu, tiến hành loại bỏ nước trong tinh dầu và cân lượng tinh dầu để xác định được hàm lượng tinh dầu thu được, sau đó tinh dầu được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các bước tiếp theo

+ Đối với những tinh dầu chứa nhiều acid béo cần thêm bước xử lý loại chất béo như sau: Mẫu tinh dầu (0,5 mL) được cho vào bình cầu, thêm 10 mL hexane, thêm 5 mL NaHCO3 5%, lắp sinh hàn hồi lưu, khuấy qua đêm, sau đó chuyển toàn bộ lượng dung dịch sang phễu chiết để tách pha Lấy phần dịch hữu cơ ra, rửa lại bằng dung dịch NaCl 5% với 3 lần, mỗi lần 5 mL Dung dịch thu được đem phân tích trên hệ thống sắc ký khí (GC-MS) theo chương trình đã xây dựng được

2.6 P ươn p áp p ân tíc t àn p ần óa ọc t n dầu và dầu béo bằn ệ t ốn máy sắc ký k í GC-MS

Hệ thống sắc ký khí được tối ưu hóa các thông số:

- Nhiệt độ buồng ion hóa 230 oC

- Tinh dầu được pha với dung môi dichloromethane ở nồng độ 3%, lọc qua màng lọc PTFE 0.45 μm sau đó được đưa vào máy với các thống số đã được tối ưu

2.7 Xử lý các số liệu t u ược

Chỉ số khóa thời gian lưu RI (retention time indices) của từng cấu tử được xác định bằng phần mềm dựa theo chỉ số khóa thời gian lưu của dãy đồng đẳng n-ankanes chạy cùng chương trình Hàm lượng của các chất trong mẫu thử được tính toán dựa vào diện tích peak trên sắc ký khối phổ thu được

So sánh phổ khối của các peak thu nhận được với thư viện phổ W09N08, HPCH1607, thư viện online NIST Chemistry WebBook [30] và sử dụng phần mềm khóa thời gian lưu, phần mềm xử lý kết quả MassFinder 4.0

2.8 Yêu cầu ối với kết quả phân tích

- Các chất trong mẫu phân tích (tinh dầu, dầu béo) được tách rời ra khỏi nhau

- Không bị nhiễm tạp chất từ bên ngoài

- Xác định được chính xác hàm lượng, thành phần các chất có trong mẫu phân tích (tinh dầu, dầu béo)

2.9 P ươn p áp t ử hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa của tinh dầu rễ cây Đại diệp ằng

2.9.1 Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn c a tinh dầu rễ cây Đại diệp đằng

Pha dịch vi sinh vật: Dùng que khuấy vô trùng lấy 01 quai khuẩn lạc của chủng vi sinh vật hòa tan vào 10 ml nước muối sinh lý vô trùng trộn đều bằng máy trộn vortex thu được huyền dịch vi sinh vật Đánh giá nồng độ vi sinh vật bằng cách so sánh với chuẩn 0,5 McFarland (đo ở λ=550nm) được huyền dịch nồng độ 150x106 CFU/mL

Môi trường: Saboraud 4% Dextrose Agra (SDA; Merck, Damstadt, CHLB Đức) cho nấm men và nấm mốc Tryptic Soy Agar (TSB-Merck) cho

vi khuẩn

Pha mẫu với DMSO 10% trên phiến 96 giếng (template plate) theo nồng độ giảm dần (log2 cho 5 thang nồng độ) Nhỏ mẫu từ phiến template lên phiến 96 giếng (phiến test) và bổ sung dịch vi sinh vật để được giải nồng độ mẫu từ 200-100-50-25,5-12,5 µg/mL (lặp lại 3 lần ở mỗi nồng độ) với mẫu cao thô (cao chiết) và 50-25-12,5-6,25µg/mL với mẫu chất tinh sạch; để trong

tủ ấm ở 370C trong 24h đối với vi khuẩn và 300C trong 48h đối với nấm

Mẫu đối chứng: sử dụng NaCl 0,9% tương ứng với thể tích mẫu là mẫu chứng âm tính (-) và chứng dương tính (+) là các kháng sinh chuẩn

Mẫu được xác định có hoạt tính thì không có sự phát triển của vi sinh vật ở ít nhất một nồng độ mẫu thử nghiệm so với chứng âm (khi nuôi cấy lại

ở nồng độ này kiểm tra trên đĩa thạch giá trị CFU<5) Mẫu có biểu hiện hoạt tính được test ở dãy nồng độ mẫu khác nhau để xác định được nồng độ ức chế tối thiểu MIC (µg/mL) là nồng độ thử nghiệm thấp nhất mà vi sinh vật

bị ức chế

Mẫu được xác định có hoạt tính khi giá trị MIC ≤ 200 µg/mL đối với mẫu cao chiết và ≤ 50µg/mL đối với mẫu tinh sạch

2.9.2 Phương pháp thử hoạt tính chống oxy hóa c a tinh dầu rễ cây Đại diệp đằng

Phân tích khả năng bẫy các gốc tự do tạo bởi DPPH (1,1

diphenyl-2-picrylhydrazyl; Brand-williams et al 1995, Shela et al 2003, Kumar et al

2013) đây là phương pháp được công nhận để xác định nhanh hoạt tính chống oxy hóa Chất thử được hòa tan trong dimethyl sulfoxide (DMSO 100%) và DPPH được pha trong ethanol 96% Sự hấp thụ của DPPH ở λ= 515 nm được xác định sau khi nhỏ DPPH vào dung dịch mẫu thử trên phiến vi lượng 96 giếng Kết quả thử nghiệm được thể hiện là giá trị trung bình ít nhất 3 phép

thử lặp lại ± độ lệch chuẩn (p ≤ 0.05)

Mẫu được pha trong DMSO 100% với nồng độ 4mg/ml đối với dịch chiết thô và 1 mg/ml đối với mẫu tinh sạch Sử dụng flavonoid 1mM hoặc axit ascorbic 5mM trong DMSO 10% làm đối chứng

Mẫu được nhỏ trên phiến vi lượng 96 giếng với dung dịch DPPH để được nồng độ cuối của mẫu thử trong phản ứng từ 200 µg/mL đến 12,5 µg/mL (đối với mẫu chiết thô) và từ 50 µg/mL đến 3,1 µg/mL (mẫu tinh sạch)

Ủ ở 370C trong 30 phút và đo mật độ quang (OD) ở bước sóng λ= 515

nm trên thiết bị đo quang (Infinite F50, Tecan, Thụy Sỹ)

Đán á k ả năn trun òa các ốc tự do (Scavenging capacity, SC%)

Giá trị trung bình SC (%) ở các nồng độ mẫu được đưa vào chương trình xử lý số liệu Excel theo công thức:

được tính dựa trên % trung hòa gốc tự do so với mẫu trắng (Blank) và chứng

âm tính

Mẫu có biểu hiện hoạt tính chống oxy hóa trên DPPH được thực hiện các bước tiếp theo để tìm giá trị IC50 (µg/mL, µM/mL) Giá trị IC50 nồng độ của chất thử mà tại đó trung hòa được 50% các gốc tự do, được xác định bằng

phần mềm TableCurve AISN Sofware (Jandel Scientific, USA) qua giá trị

SC% và dãy các nồng độ chất thử tương ứng

2.10 Thờ an và ịa ểm nghiên cứu

2.10.1 Thời gian nghiên cứu

Từ tháng 6 năm 2020 đến tháng 5 năm 2021

2.10.2 Địa điểm nghiên cứu

Nghiên cứu tại phòng Thí nghiệm Sinh học hiện đại Trường Đại học Hồng Đức