Bg thuc tap hoa sinh 2 351

BÀI 1: NHỮNG ĐIỀU CẦN BIẾT KHI LÀM XÉT NGHIỆM HÓA SINH 1.VAI TRÒ CỦA XÉT NGHIỆM HÓA SINH: Xét nghiệm đóng vai trò quan trọng trong Y học cũng như trong nghiên cứu thay đổi sinh lý, b

TRƯỜNG ĐẠI HỌC VÕ TRƯỜNG TOẢN

XÁC NHẬN CỦA BCN KHOA DƯỢC

Hậu Giang – Năm 2015

BÀI 1: NHỮNG ĐIỀU CẦN BIẾT KHI LÀM

XÉT NGHIỆM HÓA SINH

1.VAI TRÒ CỦA XÉT NGHIỆM HÓA SINH:

Xét nghiệm đóng vai trò quan trọng trong Y học cũng như trong nghiên cứu thay đổi sinh

lý, bệnh lý của những hằng số hóa sinh trong cơ thể người, đặc biệt đóng góp vào việc dự phòng, chẩn đoán và theo dõi điều trị

Ngày nay sự phát triển của khoa học kỹ thuật áp dụng trong khoa học xét nghiệm, chẩn đoán đã giúp cho việc đánh giá kết quả nhanh, nhạy, chính xác và định lượng nhiều chất có nồng độ thấp (mg, ng)

Kết quả xét nghiệm hóa sinh là yếu tố khách quan phản ánh diễn biến bên trong cơ thể Tuy nhiên những kết quả xét nghiệm hóa sinh còn ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố do môi trường tác động, tình trạng của cơ thể biến thiên sinh học (tuổi, giới tính, hoạt động dinh dưỡng,…), diễn biến bệnh lý, tác động của các phương pháp điều trị (dùng thuốc, truyền dịch ), cách lấy mẫu, bảo quản mẫu, phương pháp xác định, tính kết quả

Do vậy, đánh giá một kết quả xét nghiệm hóa sinh cần phải phân tích, tổng hợp, suy luận trên cơ sở sinh lý, bệnh lý và quá trình điều trị

2 NHỮNG YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM HÓA SINH:

Kết quả xét nghiệm hóa sinh bị ảnh hưởng bởi những yếu tố sau:

ra sau đó ly tâm hoặc gạn hút lấy hết huyết thanh Huyết thanh định lượng cần tránh vỡ hồng cầu

- Máu toàn phần hoặc huyết tương:

Cũng theo cách lấy mẫu máu nhưng ống nghiệm cần phải cho chất chống đông như Natri citrate, heparin, natrioxalat Liều lượng chất chống đông tùy thuộc vào số ml máu cần lấy Nếu cần lấy huyết tương, cần ly tâm ngay, phần lắng cặn là các huyết cầu, tách lấy phần nổi là huyết tương

- Thời gian cho phép bảo quản máu hoặc huyết tương, huyết thanh tùy thuộc vào chất định xét nghiệm Ngoài ra tùy theo chất sinh học cần định tính, định lượng, phải cho thêm chất bảo quản như: Định lượng Glucose máu, phải cho thêm Natri Fluorur để tránh thủy phân glucose 3.2 Nước tiểu:

Nước tiểu lấy một lần và phải xét nghiệm ngay, nếu để thời gian lâu mới xét nghiệm thì cần phải bảo quản trong tủ lạnh (-20oC) hoặc bằng các chất bảo quản tùy theo yêu cầu kỹ thuật Khi lấy nước tiểu yêu cầu bệnh nhân bỏ một ít nước tiểu đầu

Lấy nước tiểu 24 giờ để xét nghiệm:

- Nhiều chất được xét nghiệm cần phải lấy nước tiểu 24 giờ như glucose, urê, protein Yêu cầu bình đựng nước tiểu phải sạch và khô, vô trùng và bảo quản ở -20oC hoặc dùng chất bảo quản như: acid HCl, toluene, dung dịch thymol/alcol ethylic 1% …

- Cách lấy nước tiểu 24 giờ: vào giờ qui định, ví dụ: 6 giờ sáng, bệnh nhân đi thật hết, bỏ phần nước tiểu này Sau đó lấy nước tiểu liên tục cho đế 6 giờ sáng hôm sau Tất cả nước tiểu của các lần đi tiểu đi tiểu lấy đựng vào một bình sạch và có chất bảo quản theo yêu cầu kỹ thuật Mẫu gửi đi kèm theo phiếu ghi các chi tiết cần thiết: Thể tích nước tiểu 24 giờ, tuổi, cân nặng, nam – nữ, chế độ ăn uống, thuốc điều trị, chẩn đoán

4 HỆ THỐNG ĐƠN VỊ QUỐC TẾ SI:

Hiện nay, các phòng thí nghiệm sinh hóa đều sử dụng đơn vị quốc tế thay cho đơn vị cũ

Do đó, yêu cầu đối với người làm xét nghiệm là phải biết đổi đơn vị

- Đối với hoạt tính enzyme thì tính ra đơn vị quốc tế Hoặc tính xúc tác của enzyme được biểu thị bằng mol/giây (mol/s) tức là số mol cơ chất được biến đổi trong thời gian 1 giây bởi lượng enzyme có trong một lít dung dịch sinh vật Đơn vị này được gọi là katal ( kí hiệu là kat), ước

số là kat và nkat,…

Một đơn vị quốc tế về enzyme ký hiệu:

UI = 1 mol/min = 16,67 nmol/s = 16,67 nkat

- Với nước tiểu và các chất tiết khác thì tính ra mol/lit hay mol/ 24 giờ

BẢNG CHUYỂN ĐỔI ĐƠN VỊ

STT Chất thử Đơn vị cũ Hệ số

chuyển cũ sang mới

Hệ số chuyển mới sang cũ

Đơn vị mới

Hóa chất dùng trong PTN là rất độc hoặc bỏng da, hoặc dễ cháy nổ Những mối nguy

hiểm luôn luôn chờ chực bên ta Do đó, chúng ta cần phải có những biện pháp an toàn, phải khéo léo và biết cách xử lý khi có sự cố xảy ra Có thể nói sự an toàn PTN liên quan đến 2 nguồn:

- Nguy hiểm do hóa chất

- Sự lây nhiễm do các sinh vật phẩm

5.1 An toàn về cháy nổ:

An toàn về cháy nổ là quan trọng hàng đầu trong PTN, do đó cần có sẵn các dụng cụ phòng chữa cháy như: Bình chữa lửa, vòi xịt nước

5.2 Các qui định trong phòng thí nghiệm:

- Nếu hóa chất bị rơi vào mắt, da phải rửa thật nhiều nước Với mắt phải rửa trong 15 phút, các tiến trình làm sạch phải tùy thuộc vào từng loại hóa chất

- Không được hút thuốc, ăn uống, trang điểm

- Tóc dài, áo quần lụng thụng cần phải bó gọn

- Phải rửa tay sau khi tiếp xúc với hóa chất và trước khi rời PTN để ăn uống

- Loại bỏ các dụng cụ thủy tinh nứt, mẻ

- Các đồ dùng thủy tinh đựng chất độc hay ăn mòn cần phải ngâm với nước hay alcol trước khi đặt chung với đồ thủy tinh bẩn khác

- Hóa chất PTN không được dùng làm thuốc

5.3 Thao tác với hóa chất:

Khi sử dụng hóa chất đòi hỏi phải thật cẩn thận

- Tất cả những hóa chất dễ cháy và độc hại phải được thao tác trong một vùng thông gió, tốt nhất là trong tủ hút

- Dung dịch ăn da như axit, kiềm, muối thủy ngân phải được thao tác trong tủ hút

- Dùng các dụng cụ bảo hộ cá nhân có hiệu quả

- Khi pha axit đậm đặc phải pha vào trong nước

- Sau khi làm xong phải lau chùi chỗ làm việc cẩn thận

- Với các tác nhân hóa học nguy hiểm phải dùng găng tay, mặc áo choàng

- Khi có nguy cơ cho mắt, mũi, miệng phải dùng kính an toàn, mask

- Mọi dụng cụ bảo vệ phải được cởi ra khi rời khỏi phòng làm việc

BÀI 1: HÓA HỌC LIPID, GLUCID, PROTID

Lắc đều, quan sát khả năng hòa tan trong các dung môi khác nhau và giải thích

2 KHẢO SÁT CHOLESTEROL: Phản ứng Liebermann

Những nhị đường có có chứa nhóm –OH bán acetal tự do cũng cho phản ứng này

R-CHO + 2Cu(OH)2 → R-COOH + Cu2O + 2H2O

1.1.2 Tiến hành: ( Phản ứng Fehling)

Lấy 5 ống nghiệm lần lượt cho vào mỗi ống:

0,5 ml Fehling A (dung dịch CuSO4 )

0,5 ml Fehling B ( NaOH và Na, K tartrat)

Trộn đều, đun cách thủy sôi 5 phút, quan sát màu rồi thêm:

Đây là phản ứng cho mọi loại đường

to

2 KHẢO SÁT POLYSACARID: Khảo sát tinh bột

+ Nguyên tắc:

Tinh bột không tan trong nước lạnh, trong nước nóng tạo thành dung dịch keo gọi là dung dịch hồ tinh bột Hồ tinh bột cho phản ứng Molish, không cho phản ứng khử, với Iod tạo dung dịch màu xanh tím

+ Tiến hành:

a) Làm phản ứng Fehling (Tương tự như phần khảo sát monosacarid và disaccarid) b) Làm phản ứng Molish (Tương tự như phần khảo sát monosacarid và disacarid ) c) Tinh bột với Iod:

Cho vào ống nghiệm 1ml hồ tinh bột, thêm vài giọt Iod , màu xanh xuất hiện, đun sôi vài phút trên ngọn đèn cồn cho đến mất màu xanh, làm lạnh dưới vòi nước, màu xanh lại xuất hiện Giải thích

Riêng prolin và hydroxyprolin cho với ninhydrin phức chất màu vàng

+ Tiến hành: Lấy 3 ống nghiệm

Lắc đều, quan sát sự thay đổi màu trong 3 ống

 Trầm hiện protein bằng acid:

BÀI 2: PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE, AMYLASE

TRONG HUYẾT THANH VÀ TRONG NƯỚC TIỂU

1.PHƯƠNG PHÁP ĐO QUANG :

Trong xét nghiệm hóa sinh, những phương pháp phân tích định lượng dựa vào phương pháp đo quang nhất là kỹ thuật quang phổ được sử dụng rất phổ biến Các kỹ thuật này bao gồm: Phương pháp đo màu bằng quang kế và quang phổ kế, quang phổ hấp thụ nguyên tử, phương pháp dùng quang kế ngọn lửa, quang phổ huỳnh quang bao gồm cả hóa phát quang và phân cực huỳnh quang, phương pháp đo độ đục và độ huyền phù, phương pháp khúc xạ

Tùy theo đối tượng phân tích, yêu cầu về độ nhạy, trang bị và điều kiện kinh tế, người

ta sẽ chọn một trong các kỹ thuật trên Đối với các phòng thí nghiệm và xét nghiệm thông thường, kỹ thuật đo quang dùng máy quang kế và quang phổ kế, được áp dụng phổ biến Đây là phương pháp hóa lý có nhiều ưu điểm: Nhanh chóng, tiện lợi và có thể làm hàng loạt và không cần phải tách riêng chất cần phân tích, mẫu và nồng độ chất phân tích nhỏ Nhiều phương pháp khác cũng áp dụng các phương pháp nói trên trong phát hiện các thành phần chất phân tích như: Phưng pháp điện di, phương pháp sắc ký

1.1 Sự hấp thụ ánh sáng:

Khi chiếu một chùm tia sáng có cường độ Io vào một cuvete có chiều dài 1, đựng dung dịch một chất hòa tan thì một phần của chùm tia sáng bị dung dịch hấp thụ, một phần bị phản xạ hoặc khuếch tán, phần còn lại có cường độ It đi ra khỏi cuvete Theo định luật Lambert - Beer : ta có: E = lC, Độ hấp thụ E tỷ lệ thuận với nồng độ C

It = Io10- lC (1)

Đặt : T: Độ truyền qua, ta có:

T = It /Io = 10-  lC (2)

Thường tỉ số này được biểu diễn dưới dạng %T: %T = I /Iox 100 (%)

Khi nồng độ của hợp chất trong dung dịch tăng, ánh sáng bị dung dịch hấp thụ nhiều hơn

và ánh sáng truyền qua giảm %T tỉ lệ nghịch với log nồng độ C Để tiện người ta đặt :

1.2 Cấu tạo các loại máy:

Có hai loại máy thường được dùng để đo độ hấp thụ màu:

- Máy quang kế dùng kính lọc: Trong đó nguồn sáng đơn sắc được chọn lọc nhờ các kính lọc màu

- Máy quang phổ kế: tia đơn sắc được tạo ra nhờ một lăng kính hay một cách tử

Nguồn sáng Khe chắn Bộ đơn sắc Hệ thống Q/học Curet Bộ ghi Bộ đọc

Glucose + O2 + H2O GOD Acid gluconic + H2O2

2H2O2 +4-aminophenazon + phenol POD Quinonimin + 4 H2O

- Glucose oxydase : 15.000 UI/L

- Glucose chuẩn 5,5 mmol/l

Trộn đều, ủ 37oC trong 5 phút Đọc máy đo quang ở bước sóng 500 nm đối chiếu với ống trắng

 Ý nghĩa của ống trắng: Giúp loại trừ mật độ quang của thuốc thử trước phản ứng

+ Tăng sau khi ăn, xúc động mạnh

+ Giảm khi nhịn đói lâu ngày

* Bệnh lý:

+ Tăng trong bệnh đái tháo đường, cường giáp trạng, u thần kinh, thiểu năng gan

+ Giảm trong thiểu năng tuyến yên, tuyến thượng thận, dùng quá nhiều insulin

 Đối với glucose/ nước tiểu:

* Bình thường:

- Không có glucose trong nước tiểu

- Có thể có glucose trong nước tiểu dạng vết khi mang thai

* Bệnh lý: glucose niệu xuất hiện khi bị các bệnh đái đường, cường tuyến yên, tuyến giáp, tuyến vỏ thượng thận, bệnh đái đường do ngưỡng tái hấp thu glucose của thận thấp

3 ĐỊNH LƯỢNG AMYLASE DÙNG PHƯƠNG PHÁP ĐO MÀU CƠ CHẤT VÀ TINH BỘT:

3.1 Nguyên tắc:

- Xác định hoạt độ của enzym bằng phương pháp so màu dựa vào phản ứng màu xảy ra giữa

iod và tinh bột thừa chưa bị thủy phân trong môi trường phản ứng

3.2.Chuẩn bị dụng cụ:

- Dụng cụ lấy máu tĩnh mạch

- Máy ly tâm

- Nồi chưng 37oC

- Máy đo quang

- Các dụng cụ thông thường trong PTN

Trong 2 ống nghiệm khác cho vào:

Amylase (W) = (Et/Ec)x Cc , Ec: Mật độ quang của ống chứng

Et: Mật độ quang của ống thử

3 5.Nhận định kết quả:

- Trị số bình thường

- Amylase huyết thanh: 14  7 W

- Amylase nước tiểu: 65  20 W

- Amylase máu và nước tiểu tăng rất cao (gấp 10 đến 30 lần) trong viêm tụy cấp hoặc viêm tụy do tắt đường dẫn wirsung do giun hay do u chèn ép

- Amylase tăng nhưng thấp hơn trong viêm tụy mãn, ung thư tuyến tụy, tắt ruột, loét dạ

dày

- Amylase tăng vừa trong bệnh quai bị

4 ĐỊNH LƯỢNG HOẠT ĐỘ AMYLASE BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐO MÀU DÙNG

CƠ CHẤT LÀ 2 -CLORO -4- NITROPHENIL:

4 1 Nguyên tắc:

- Enzym - amylase làm biến đổi cơ chất CNPG3 thành 2-cloro-4-nitrophenol (CNP) Chất này làm tăng độ hấp thụ Sự gia tăng mật độ quang trong một phút tỷ lệ với hoạt độ của enzym - amylase có trong mẫu thử

- Các dụng cụ thông thường của PTN

4.2.3 Thuốc thử, kit hóa chất định lượng - amylase

4.3.1.Cài đặt chương trình đo:

+ Điều kiện đo:

+ Phương phâp đo: động học enzym

+ Bước sóng: 405 nm

+ Cuvete loại 1cm

+ Ống trắng: nước cất

4.3.2 Tiến hănh đo chuẩn vă thử:

Trong 3 ống nghiệm, cho văo:

Thuốc thử, mẫu đo ( TTrắn Trắng l) Chuẩn Thử

- - Amylase trong huyết thanh vă huyết tương:  81 U/l

- - Amylase trong nước tiểu:  340 U/24h

Thay đổi trong câc trường hợp bệnh lý (Xem phần trín)

BÀI 3: ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN, URE, CREATININE, ACID URIC

1 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN HUYẾT THANH (Phương pháp Biuret)

Trộn đều và đọc mật độ quang học, bước sóng 546 nm sau 10 phút ủ

1.3 Tính kết quả:

Nồng độ chất thử = E thử / E chuẩn x nồng độ chuẩn (60 g/l)

1.4 Nhận định kết quả:

- Nồng độ protein huyết thanh bình thường từ 62 - 80g/l

- Tăng trong u tủy, mất nước, nôn nhiều, tiêu chảy, thiểu năng vỏ thượng thận

- Giảm trong hội chứng thận hư nhiễm mỡ, suy dinh dưỡng, xơ gan, đái tháo đường

2 ĐỊNH LƯỢNG URÊ (Phương pháp Ure UV):

2 1 Nguyên tắc:

Định lượng ure bằng phương pháp enzym theo phương trình phản ứng sau:

Ure + H2O Urease 2NH3 + CO2

2 NH3+ 2Ketoglutarate + 2 NADHH+ GDH 2L-Glutamate +2NAD+ + 2H2O GDH : Glutamat dehydrogenase

- Sự giảm độ hấp thụ ánh sáng của NADHH+ tỷ lệ với nồng độ urê trong phẩm vật

- Mẫu thử: huyết thanh, nước tiểu pha loãng 1/100

2.2 Thuốc thử:

Theo kit hóa chất

Đệm TRIS pH 8,1 (20oC): 50 mmol/l

 Cetoglutarat: 15 mmol/l Urease  1000 U/l Glutamat dehydrogenase  5,4 KU/l NADH 0,18 mmol/l

2.3 Tiến hành:

Thuốc thử Nước cất Dung dịch chuẩn 50mg/dl (8,32 mmol/l) Mẫu thử

- Ure trong huyết thanh: 15 - 40mg/dl hoặc từ 2,50 - 7,49 mmol/l

- Ure trong nước tiểu: 20 - 35g/24 giờ hoặc 333 - 583 mmol/24 giờ

2.6 Biện luận:

- Ure máu tăng sinh lý trong chế độ ăn thịt, giảm trong chế độ ăn rau

- Tăng bệnh lý trong các trường hợp: sỏi thận, viêm thận cấp, suy thận

- Giảm trong trường hợp xơ gan giai đoạn cuối

3 ĐỊNH LƯỢNG CREATININ (phương pháp Jaffe, động học) 3.1 Nguyên tắc:

Creatinin phản ứng với acid picric trong môi trường kiềm tạo thành picrat creatinin có màu vàng cam Cường độ màu tỷ lệ thuận với creatinin

3.2 Thuốc thử: Theo kit hóa chất

- NaOH: 187,8 mmol/l

- Phosphat: 7,5 mmol/l

- Picric acid: 8,73 mmol/l

- Standard: 176,8 mol/l (2mg/dl) 3.3 Tiến hành:

Thuốc thử Nước cất Dung dịch chuẩn (2mg/dl hoặc176,8 mol/l) Mẫu thử

3 5 Nhận định kết quả:

3.5.1 Giá trị bình thường:

- Creatinin huyết thanh: + Nữ giới: 0,5- 1mg/dl (44- 88 mol/l)

+ Nam giới: 0,6- 1,3 mg/dl (53- 115 mol/l) + Trẻ em: 0,4- 1mg/dl (35- 88 mol/l)

- Creatinin nước tiểu: 0,8 -1,8 g trong 24 giờ ( 7,02-15,9 mmol/24 giờ)

3 5.2 Thay đổi bệnh lý: Creatinin tăng trong suy thận , viêm thận cấp, mãn, sỏi thận

4 ĐỊNH LƯỢNG ACID URIC:

4.1 Phương pháp Phosphotungstic acid

Nước tiểu pha loãng 1/2

Acid uric máu 0,025g/dl (1,48 mmol/l)

Na2CO3 17%

Nước cất

Thuốc thử phosphotungstic

1 3,8 0,2

1

1 2,8 0,2

1

1 2,8 0,2 Lắc đều đọc quang phổ kế  = 546 nm

4.1.3 Tính kết quả:

CT = (ET /Ec) x CC x độ pha loãng

CT = (ET / Ec)x 0.025 x 2 (g/dl) hoặc 1,48 x 2 (mmol/l)

Lưu ý: Muốn tính nồng độ acid uric trong nước tiểu, lấy CT nhân với lượng nước tiểu của bệnh nhân trong 24 giờ.