Chương 10 Các Phương Pháp Tách.pdf

CHƯƠNG 10 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHƯƠNG 10 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH 10 1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PHƯƠNG PHÁP TÁCH SẮC KÝ 10 1 1 Đại cương về phương pháp sắc ký Lịch sử phát triển của phương pháp Có nhiều tài li[.]

CHƯƠNG 10 CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH

10.1 CƠ SỞ LÝ THUYẾT CỦA PHƯƠNG PHÁP TÁCH SẮC KÝ

10.1.1 Đại cương về phương pháp sắc ký

Lịch sử phát triển của phương pháp

Có nhiều tài liệu công bố về lịch sử phát triển của phương pháp, tuy nhiên mốc thời gian được nhiều người thừa nhận là 1903 nhà thực vật học người Nga Michael Txvet đã lần đầu tiên công bố tách được các chlorophyl từ lá cây với hệ sắc ký gồm pha tĩnh là chất hấp phụ CaCO3, pha động là ete dầu hỏa

Năm 1941 Tiselius phát triển các kỹ thuất tách sắc ký và chỉ ra các phương pháp phân tích tiền lưu, phân tích thế đẩy và phân tích rửa giải Cũng trong năm này, 1941 Martin, A J P và Synge, R.L.M đã trình bày lý thuyết sắc ký lỏng-lỏng (sắc ký phân bố) Do có công đóng góp các tác giả đã nhận giải Nobel 1952

Vào những năm 1970, sắc ký khí phát triển, cùng với nó, sắc ký lỏng cũng nâng cao hiệu quả của phương pháp; các vật liệu làm pha tĩnh không ngừng được cải tiến, từ

đó hiệu lực của các phương pháp sắc ký đạt được những thành tựu đáng kể như tách được các hỗn hợp các chất cực kỳ giống nhau (thí dụ các nguyên tố Đất hiếm), các ankaloid, các hydrocacbon trong các mẫu dầu….Ngày nay trong sắc ký lỏng chất nhồi được cải tiến, kích thước hạt giảm xuống tới 1,5-1,7µm, có khả năng chịu áp suất và nhiệt độ tốt, hình thành các phương pháp cực kỳ hiệu quả (Ultra Performance Liquid Chromatography - UPLC) có thể tách nhanh các hợp chất khó trong thời gian vài chục giây Gần đây, phương pháp siêu tới hạn (Supercritical fluid Chromatography -SFC) và điện di mao quản ra đời để phù hợp với đa dạng các chất phân tích, đặc biệt các chất có khối lượng phân tử lớn như protein, enzym trong các mẫu sinh học làm tăng khả năng của sắc ký

Thí nghiệm của Txvet và khái niệm về hệ sắc ký

Năm 1903 Txvet là một nhà thực vật học ngươic Nga, có một thí nghiệm vô cùng độc đáo và tìm ra một phương pháp tách mới mang tên chromatography mà ta vẫn gọi

là sắc ký

Thí nghiệm được tiến hành bằng cách hoà tan diệp lục trong ete dầu hỏa, sau đó nạp một lượng nhỏ vào cột đã nhồi bột CaCO3 Tiếp theo, cho liên tục ete dầu hỏa tinh khiết đi qua; sau một thời gian nhất định diệp lục đã tách thành các giải riêng biệt Sau này, người ta biết được đó là các a-chlorophyl, b - chlorophyl, a- xantophyl, b- xantophyl

Khi các chất phân tích được nạp vào chất nhồi CaCO3 còn gọi là pha tĩnh, lúc đầu các cấu tử phân bố ở đầu cột một cách bất kỳ, xen kẽ Ái lực của từng cấu tử với

pha tĩnh là khác nhau Các chất có ái lực liên kết với pha tĩnh lớn hơn sẽ có thời gian lưu lại pha tĩnh lâu hơn, ngược lại, các chất có ái lực với pha tĩnh yếu hơn, lưu lại pha tĩnh ít hơn hay có thời gian trong pha động nhiều hơn

Mặt khác, do dung môi được bơm vào cột liên tục, khi các chất ở pha động chúng

di chuyển cùng pha động, ngược lại khi các chất ở pha tĩnh, chúng không di chuyển Vì vậy các chất có sự chênh lệch về thời gian ở pha tĩnh cũng như pha động, sẽ dẫn đến khác nhau về tốc độ di chuyển, từ đó các chất tách khỏi nhau Đó là cơ sở của phương pháp tách sắc ký Hình 10.1a mô tả quá trình tách 2 chất ở các thời điểm khác nhau, trong đó cột 1 là thời điểm ban đầu, mới nạp chất váo cột, 2 chất chưa tách Các cột 2,

3 là các thời điểm sau đó, các chất dần tách khỏi nhau và đến cột thứ 4 thì 2 chất đã tách hoàn toàn Hình 10.1b là sắc đồ tương ứng của các cột tách

Người ta thường nạp chất phân tích vào cột có khối lượng khoảng một vài phần trăm dung lượng hấp thu cuả cột để đảm bảo cho cân bằng phân bố chất tan xảy ra nhanh hơn

Hình 10.1 : Quá trình tách sắc ký với 2 chất

Trong trường hợp các chất có tính chất rất giống nhau, lực liên kết của các chất với pha tĩnh không khác nhau nhiều, điều đó dẫn đến thời gian ở pha tĩnh cũng như pha động rất giống nhau, tốc độ di chuyển gần giống nhau Để các chất có quãng đường di chuyển khác nhau đáng kể, quá trình hấp thu và giải hấp thu phải thực hiện nhiều lần hay nói cách khác là chiều dài của cột phải đủ lớn Khi đó, thời gian di chuyển càng lớn, sự khác biệt về quãng đường di chuyển sẽ càng lớn

Gọi là một hệ sắc ký khi chức năng tách của cột đã được thực hiện qua các thành phần của hệ Khi ta đưa chất phân tích vào hệ sắc ký, trước hết chất phân tích phải tan được trong pha động Từ pha động chất phân tích chuyển sang pha tĩnh và sau đó chất phân tích lại lại chuyển về pha động Quá trình đó được lặp đi lặp lại hàng ngàn, thậm chí hàng triệu lần Pha tĩnh đứng yên, pha động di chuyển qua pha tĩnh, và các chất phân tích phân bố giữa hai pha Các chất có ái lực khác nhau với pha tĩnh cũng như pha động

nên di chuyển với tốc độ khác nhau và tách khỏi nhau Vì vậy hệ sắc ký phải gồm: chất

phân tích, pha tĩnh và pha động Tất nhiên để đưa được mẫu vào hệ, cho pha động chạy,

ghi nhận sự di chuyển của các chất là vấn đề kỹ thuật thực nghiệm, vấn đề thiết bị chúng ta sẽ xét ở phần sau

Từ thí nghiệm trên, có thể đưa ra định nghĩa về sắc ký như sau:" Sắc ký là quá

trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên hai pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau"

10.1.2 Phân loại các phương pháp sắc ký

Có hai kiểu phân loại các phương pháp sắc ký; thứ nhất là phân loại theo hệ pha Các phương pháp sắc ký không kể hoạt động theo cơ chế nào nhưng hệ sắc ký gồm pha tĩnh rắn hoặc lỏng tiếp xúc với pha động cũng lỏng hoặc rắn

Đối với kiểu phân loại này có sắc ký Khí- Rắn; Sắc ký Khí -Lỏng, sắc ký

Lỏng-Lỏng; Lỏng -Rắn…

Hình 10.2 Phân loại các phương pháp sắc ký theo hệ pha

Thứ hai là phân loại theo cơ chế, các phương pháp sắc ký có 4 loại với 4 cơ chế;

đó là: Sắc ký hấp phụ; Sắc ký phân bố (L-L hoặc L-R), Sắc ký trao đổi ion và Sắc ký rây phân tử Đối với các hệ sắc ký với các chất phân tích cũng như pha tĩnh phức tạp

(thí dụ silicagel biến tính), cơ chế tách có thể gồm nhiều loại trong liên kết giữa các chất

Nhìn vào sơ đồ phân loại trong hình 10.2 chúng ta thấy sắc ký lỏng rất đa dạng, trong phân tích, sắc ký lỏng hiệu năng cao –HPLC gồm nhiều phương pháp khác nhau, trong đó sắc ký HPLC lỏng rắn gồm rất nhiều phương pháp Đó là sắc ký lỏng pha đảo, sắc ký lỏng pha thường, sắc ký trao đổi ion v.v Phương pháp HPLC pha đảo (reversed phase high performance liquid chromatography) được sử dụng nhiều nhất, ta sẽ xét các phương pháp này ở phần sau

10.1.3 Các lực liên kết trong hệ sắc ký

a) Lực liên kết ion

Trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm hoạt động là ion, đó là các phân tử có khả năng phân ly tạo thành các ion tạo nên các trung tâm hoạt động ion Chúng tham gia liên kết với các ion chất phân tích trong dung dịch theo lực tương tác tĩnh điện gọi là liên kết ion Để giữ các anion chất phân tích trong dung dịch, pha tĩnh cần có các trung tâm cation trên bề mặt, và ngược lại, để giữ các cation chất phân tích trong dung dịch, pha tĩnh cần có các trung tâm anion

Cũng tương tự, pha động cũng có các trung tâm hoạt động là các ion, chúng tham gia tương tác với chất phân tích và pha tĩnh Chúng có khả năng phân li trong dung dịch tạo thành các cation và anion Thí dụ khi rửa giải các ion kim loại trên cột cationit, ta

có thể dùng pha động là dung dịch HCl loãng

Các phương pháp tách sắc ký thường gặp có tham gia của các liên kết ion gọi là sắc ký ion, sắc ký cặp ion

b) Lực phân cực

Trong phân tử chất phân tích, chất rửa giải trong pha động cũng như các phân tử trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm phân cực Chúng có thể là các lưỡng cực điện cố định, cũng có thể là những lưỡng cực điện do cảm ứng Chúng tham gia liên kết với các phân tử phân cực khác bằng lực liên kết phân cực Sự phân cực trong các phân tử đôi khi rất nhỏ và sự chênh lệch về độ phân cực cũng rất nhỏ Tuy nhiên, sự chênh lệch này

là yếu tố rất quan trọng để độ bền liên kết khác nhau, đó là điều cần thiết để phân chia chúng trong các phép tách sắc ký

Thí dụ: các chất Cresol (o- m-, p-, cresol) chỉ khác nhau về vị trí của nhóm CH3- trong phân tử Chính nhờ sự khác nhau về vị trí này làm cho mật độ electron trong phân tử của các cresol khác nhau tạo nên một sự khác biệt nhỏ về độ phân cực, từ đó lực liên kết phân cực với pha tĩnh khác nhau, là nguyên nhân chênh lệch về thời gian lưu trong quá trình sắc ký

c) Lực phân tán (lực Van-de-van)

Lực này có bản chất tĩnh điện, tuy nhiên không hề có cực điện trong mạng lưới phân tử, cũng không liên quan tới phân tử lưỡng cực cảm ứng hay cố định Tương tác phân tán điển hình là giữa các mạch hydrocacbon, nó là tương tác phân tử

Thí dụ: n-heptan là chất lỏng chứ không phải khí vì sự tương tác giữa các phân

tử n-heptan là lực phân tán đủ lớn để giữ chất này ở trạng thái lỏng Để tách các hydrocacbon người ta có thể dùng hydrocacbon khác làm pha tĩnh

d) Lực tương tác đặc biệt

Lực tương tác đặc biệt là lực tạo thành do các liên kết hydro, liên kết cho nhận mà có

Sự hình thành liên kết giữa các nguyên tử hydro và các nguyên tử có độ âm điện cao như O, N, F tạo thành liên kết hidro Khi tham gia liên kết, các electron còn gọi là

"đám mây electron" chuyển dịch sang nguyên tử có độ âm điện cao Như vậy các nguyên

tử của nguyên tố có độ âm điện càng cao, liên kết hydro càng bền chặt Người ta nhận thấy năng lượng liên kết giảm theo dãy sau đây:

F H F > O H O > N H N > C H C

Như vậy lực tương tác của các phân tử trong hệ sắc ký gồm : lực ion, lực phân cực, lực phân tán và lực tương tác đặc biệt Các lực này đối với các chất khác nhau có giá trị khác nhau và quyết định đối với quá trình tách sắc ký

Cũng lưu ý rằng bề mặt pha tĩnh không hoàn toàn đồng nhất, nó có thể có nhiều loại nhóm chức khác nhau Mỗi nhà máy có quy trình sản xuất riêng, kết qủa là thành phần và số lượng các nhóm chức trên bề mặt pha tĩnh có khác nhau Thí dụ với sắc ký pha đảo, bề mặt của pha tĩnh là các nhóm ODS - otadecylsilan Đây là kết quả của phản ứng giữa nhóm Silanol - OH và Clorosilan hữu cơ Tuy nhiên không phải tất cả

cả các nhóm silanol đều được thay bằng các nhóm ODS cho nên bên cạnh nhóm ODS còn có cả nhóm -OH chưa thay thế, là nhóm phân cực và ngoài ra còn các tạp chất kim loại Như vậy là tương tác giữa pha tĩnh và phân tử chất phân tích có thể bao gồm các lực tương tác ion, phân cực, lực phân tán, tương tác đặc biệt ở các mức độ khác nhau

10.1.4 Một số đại lượng cơ bản trong sắc ký

Hệ số phân bố

Một cấu tử A cho tiếp xúc với pha động và pha tĩnh, sẽ phân bố giữa hai pha theo

tỷ số nồng độ nhất định, như vậy, nó có hệ số phân bố riêng, nói một cách khác cân bằng phân bố được thiết lập, có phương trình;

AS ⇌ Am (10.1)

Hệ số phân bố được định nghĩa là tỷ số của nồng độ chất phân tích giữa hai pha

(10.2) Trong đó [A]S - Nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh

[A]m - Nồng độ chất phân tích trong pha động

Mối liên hệ giữa hệ số phân bố và tốc độ di chuyển của chất trong hệ sắc ký

Chất phân tích A muốn di chuyển được phải ở pha động

Gọi fA là phần thời gian của chất A ở pha động

(10.3) Biến đổi phương trình 1.5 (chia phân số cho [A]m.Vm) ta có:

Thời gian lưu t R và thời gian lưu hiệu chỉnh t R '

Thời gian lưu tR là thời gian tính từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tới khi pic đạt giá trị cực đại

L/u = tm là thời gian cấu tử không lưu giữ trên cột, còn gọi là thời gian chết

tRA = tm (1+ KDA ) = tm (1 + k’ ) (10.6) Thời gian lưu hiệu chỉnh t'R là thời gian lưu không tính tới thời gian chết

t'

RA = tRA - tm = tm.k' Þ k'= = (10.7)

Thể tích lưu V R và thể tích lưu hiệu chỉnh V R '

] [

] [

m

S D

1

f =

V1+K

V

m

S DA

/

A

V

V K

A

1

f = 1+k

) 1 ( /

A A

k

u u

+

=

' A RA

A

L(1+k )L

s m

V V

' R m

tt

/ R m

VV

Số milimol A trong pha động [A]m Vm

fA = =

Số milimol A trong toàn cột [A]m Vm + [A]s Vs

Thể tích lưu VR là thể tích của dung dịch rửa giải tính từ khi bắt đầu bơm mẫu vào cột tới khi pic đạt giá trị cực đại

Gọi F là tốc độ chảy của pha động, ml/ phút

Thể tích lưu VR được tính theo công thức:

VRA= tRA.F ; Vm = tm F; thay vào (10.8) ta có

VRA = Vm (1+ k'A) (10.8) Thể tích lưu hiệu chỉnh V'R là thể tích lưu để loại đi thể tích trống của cột

V'RA = VR - Vm

= Vm.k'A = KDA.VS (10.9) Thể tích lưu riêng Vg là thể tích đặc trưng riêng cho cấu tử, là thể tích dung dịch rửa giải để rửa chất phân tích trong một đơn vị trọng lượng hay thể tích của pha tĩnh V’RA/ Vs = KDA = Vg

Hệ số tách

Hệ số tách a là đại lượng đánh giá khả năng tách 2 chất bằng phương pháp sắc

ký Nó phụ thuộc vào hệ số phân bố của chúng và là tỷ số của hệ số phân bố của 2 chất; một chất phân tích A và một chất khác B hoặc một chất chuẩn

Điều kiện cần thiết để hai chất A và B tách khỏi nhau là a ¹ 1

a = KDA / KDB = k'A / k'B ¹ 1 (10.10) Nói một cách khác hệ số phân bố của hai chất A và B giữa pha tĩnh và pha động phải khác nhau Mặt khác từ số thể tích lưu riêng của hai chất, t'RA / t'RB cũng chính là tỷ số của hệ số phân bố

Vậy có thể tóm tắt là :

Đĩa lý thuyết

a) Khái niệm đĩa lí thuyết

Đĩa lí thuyết là phần nào đó của cột mà ở đó cân bằng được thiết lập Theo quan niệm của Martin và Synge, cân bằng phân bố được thiết lập nhanh chóng, tức thời Tuy nhiên điều này gặp khó khăn khi giải thích hiện tượng giãn rộng vùng mẫu, hiện tượng pic sắc ký không cân đối Amundson và Lapidus và sau đó là Van Deemter cho rằng đĩa được hình thành khi đạt cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại, các tác giả đã đưa ra thuyết tốc độ chúng ta sẽ đề cập ở phần sau b) Sắc đồ và tính số đĩa lý thuyết

Sắc đồ là đường biểu diễn sự phụ thuộc diện tích (S) hoặc chiều cao (h) tín hiệu

đo được có thể là độ hấp thụ quang, cũng có thểt là độ dẫn điện, hoặc tần số xung điện… liên quan chặt chẽ tới nồng độ chất phân tích có trong mẫu vào thời gian Các tín hiệu

này được gọi là "pic"sắc ký Định lượng các chất phân tích dựa vào diện tích píc sắc ký

là chính xác nhất Ngày nay, hầu hết các máy sắc ký hiện đại đều được trang bị phần mềm để tính diện tích của píc một cách tự động

Có thể hiểu rằng phần nào đó của cột được gọi là đĩa lí thuyết khi cân bằng phân

bố chất phân tích tại để được đáp ứng

Gọi N là số đĩa lí thuyết, s là độ lệch chuẩn; s ~ Đối với cột sắc ký n càng lớn pic càng hẹp; thời gian lưu tỉ lệ với số đĩa lí thuyết n, tR ~ n, nên ta có thể viết: hay N = ( tR / s)2 (10.11) Mặt khác w = 4s hay s = w / 4

Số đĩa lí thuyết n có thể viết lại là:

Hình 10.3 Xác định số đĩa lý thuyết từ sắc đồ một cấu tử

Trong sắc ký lỏng cột nhồi, số đĩa lý thuyết được tính tương đối dựa vào chiều dài cột và chiều cao đĩa lý thuyết, H~ 2-3dp

Thí dụ 10.1: Tính số đĩa lí thuyết, N của cột sắc ký và chiều cao đĩa lí thuyết, H biết

thời gian lưu tRA = 280s, tRB = 300s, độ rộng pic wA = 14s, wB =15s, thời gian chết,

tm=10s Cột có chiều dài L = 3,2 m

Giải : Đối với pic A : N = 16 2 = 6400

Đối với pic B : N = 16 2 = 6400

Số đĩa lí thuyết của cột đối với cả hai chất là 6400

ö ç è

æ 14 280

÷ ø

ö ç è

æ 15 300

Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử khỏi nhau trong một phép tách sắc

ký Hai cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để, độ phân giải càng cao Độ phân giải được đánh giá qua các đại lượng đặc trưng là: thời gian lưu, tRA, tRB, và độ rộng píc

WA,WB

trong để : tRB - tRA = DtR là sự chấnh lệch thời gian lưu (cũng có thể dùng thể tích lưu VRA- VRB) của 2 cấu tử A và B Đại lượng này được so sánh với tổng bán chiều rộng píc, đo bằng giây hoặc ml nói lên khả năng tách của cột

Khi R=1, hai cấu tử A và B mới tách khỏi nhau đạt 95% nghĩa là còn 2,5% cũa

A ở trong B , 2,5% B ở trong A Khi R= 1,5 thì hai cấu tử A và B để tách khỏi nhau đạt 99,8 % có nghĩa là còn 0,1% A ở trong B và ngược lại

Khi tăng chiều dài cột, số đĩa lí thuyết tăng:

tR µ N , chiều rộng pic tỷ lệ với

R µ hay R µ

Thí dụ khi tăng gấp đôi chiều dài cột, độ phân giải mới R' sẽ là: R' = R

Cách làm tăng độ phân giải

a) Dựa trên sự thay đổi cấu trúc cột:

Có 4 biện pháp gồm: tăng chiều dài cột, sử dụng chất nhồi có kích thước hạt nhỏ hơn, đồng đều hơn, thay đổi pha tĩnh, giảm đường kính cột

b) Dựa trên thay đổi vận hành cột

Vận hành cột ở điều kiện tối ưu sẽ thu được hiệu quả tách cao nhất gồm: tối ưu hoá tốc độ pha động (tỷ lệ dung môi, pH, thêm phụ gia …), giảm lượng mẫu, giảm nhiệt

độ cột (GC), thay đổi thành phần pha động (LC)

Thí dụ 10.2: a) Tính độ phân giải R của phép sắc ký biết rằng thời gian lưu và chiều

rộng pic giống thí dụ 10.1 b) Cũng với các dữ kiện giống như ở thí dụ 10.1, thay đổi chiều dài của cột từ 320cm lên 400cm Tính độ phân giải?

(

vụ cho nghiên cứu khoa học Thí dụ trong sản xuất nông nghiệp, phương pháp góp phần tách và định lượng các dinh dưỡng trong sản phẩm; phân tích các độc tố, như thuốc bảo

vệ thực vật, các kim loại nặng trong thực phẩm, nước uống …

Trong chữa bệnh, sắc ký góp phần xét nghiệm các mẫu bệnh phẩm, thí dụ phân tích các thuốc kháng sinh Phân tích các dược phẩm, dược liệu …

Sắc ký cũng phục vụ đắc lực trong quan trắc môi trường, đánh giá tác động của môi trường tới đời sống con người Thí dụ tách và định lượng hàm lượng các chất độc hại trong không khí

10.1.6 Thuyết tốc độ, phương trình Van Deemter

Theo thuyết này, yếu tố tốc độ của pha động có vai trò cực kỳ quan trọng đối với hiệu quả tách sắc ký Sự giãn rộng vùng mẫu mà nguyên nhân sâu xa là hệ số khuyếch tán của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh bị ảnh hưởng nhiều bởi tốc độ pha động Ngoài ra, đường kính hạt nhồi, kỹ thuật nạp cột , cũng ảnh hưởng rất nhiều tới

sự dãn rộng vùng chất phân tích, ảnh hưởng tới độ rộng của píc thu được trong sắc đồ Các tác giả đưa ra đại lượng đặc trưng cho độ giãn rộng của vùng chất phân tích là chiều cao đĩa lý thuyết, H Chiều cao đĩa lý thuyết được cấu thành do 3 yếu tố H1, H2, H3 là 3 đại lượng độ giãn rộng thành phần

(

2 / ) 77 , 16 65 , 15 (

) 350 375 ( + -

,1

R

H2 Là đại lượng khuyếch tán theo chiều dọc Nó được hình thành do sự khuyếch

tán của chất phân tích về hai ðầu của cột, phụ thuộc vào tốc ðộ của pha ðộng, hệ số

khuyếch tán của chất phân tích trong pha động, đường đi của chất phân tích, được biểu

diễn bằng phương trình: H2 = B/ u

Trong đó B = 2 g Dm là đại lượng đặc trưng cho hệ số khuyếch tán của chất phân

tích trong pha động và hệ số đường đi của nó Trong điều kiện nạp cột tốt, đường đi của

chất phân tích không quá khúc khuỷu, g =1; Dm là hệ số khuyếch tán của chất phân tích

trong pha động, như vậy, H2 có thể viết là:

H2 = 2 g Dm / u

H3 là đại lượng đặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng, là yếu tố phụ thuộc nhiều

vào tốc độ hấp thu và giải hấp Quá trình này phụ thuộc vào cả pha tĩnh và pha động, vì

vậy H3 có thể viết:

H3 = (CS + Cm) u

trong đó CS là hệ số đặc trưng cho sự chuyển khối của chất phân tích trong pha tĩnh phụ

thuộc vào pha tĩnh, nó có giá trị nhỏ, khi tốc độ dòng, F ³ 1ml/phút, CS » 0

CS = K df2 / DS ;

Trong đó K là hệ số, DS là hệ số khuyếch tán của chất phân tích trong pha tĩnh,

df2 - là chiều dày pha tĩnh

Cm là hằng số đặc trưng cho sự chuyển khối của chất phân tích trong pha

động, phụ thuộc vào pha động

Cm = b dp / Dm

Trong đó b là hệ số thực nghiệm, có giá trị 0,5-1, Dm là hệ số khuyếch tán của

chất phân tích trong pha động

Tổng hợp lại, H có biểu thức tổng quát là:

Hình 10.4 Đường cong Van Deemter

Đối với cột mao quản, A trong phương trình Van Deemter bằng zero, Golay đã đề nghị

phương trình:

= B/u + (Cs+Cm)u (10.16) Trong đó, r là bán kính cột mao quản, f(k), g(k) là các hằng số

Biểu diễn mối quan hệ trên bằng đồ thị ta có giản đồ trên hình 1

Thí dụ 10.3: Một phép phân tích sắc ký khí dùng cột mao quản dài 30 m, chạy một chất

chuẩn ở vận tốc khác nhau cho các số liệu dưới đây:

Vận tốc , u (cm/s) số đĩa( n )

0,5 50000

1,0 50000

Xác định các thông số B, C và số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu đó, cho A = 0

Giải: Chiều cao của đĩa lý thuyết ở cả 2 vận tốc trên là:

2 m

D

.ug(k).d3

2D

.uf(k).r24

1u

Phương pháp sử dụng pha tĩnh là các chất rắn hoặc lỏng còn pha động là khí mang nên gọi là ký khí Phương pháp này phù hợp với các chất dễ bay hơi, đặc biệt là các mẫu môi trường, thí dụ các hydrocacbon thơm đa vòng, thuốc trừ sâu v.v Sự phân

bố của các chất giữa pha tĩnh và pha động là khí tương tự như trong sắc ký lỏng đã phân tích ở trên

Pha tĩnh trong sắc ký khí

Pha tĩnh sử dụng trong sắc ký khí có hai loại là rắn và lỏng

Pha tĩnh rắn gồm các chất có diện tích bề mặt lớn, có khả năng hấp phụ được các chất

phân tích dễ bay hơi Đó là oxit nhôm, silicagel, than Pha tĩnh rắn được áp dụng ít, đặc biệt là phân tích vết, không phù hợp với các detector hiện đại

Pha tĩnh lỏng là các hợp chất hữu cơ có khối lượng phân tử lớn, đáp ứng những 3 yêu

cầu chính sau:

+ Lực tương tác giữa pha tĩnh với chất phân tích có khả năng tăng độ chọn lọc của phép tách sắc ký, nghĩa là liên kết mạnh với chất này nhưng yếu với chất kia và do vậy làm chênh lệch về hệ số phân bố, tăng hệ số tách

+ Ít bay hơi, không phân huỷ ở nhiệt độ làm việc của cột

+ Không có những phản ứng bất thuận nghịch giữa chất phân tích và pha tĩnh

Để chọn pha tĩnh lỏng trước hết một quy tắc vẫn được áp dụng là “quy tắc tương tự” - Các chất tương tự nhau sẽ hoà tan vào nhau, tuy nhiên cũng phải lựa chọn sao cho chất phân tích có hệ số phân bố vừa phải Ở đây có thể thông qua độ phân cực của chất phân tích và pha tĩnh Một cách đánh giá độ phân cực theo hệ thức Rohrschneider Một số chất thường sử dụng làm pha tĩnh:

Các hydrocacbon Với hydrocacbon không phân cực, pha tĩnh không phân cực, hoặc

phân cực thấp sẽ có tác dụng hấp thu tốt Squalane là một loại dầu, có công thức phân

tử C30, thường được sử dụng làm pha tĩnh và được xem như pha tĩnh có độ phân cực thấp nhất Công thức cấu tạo của Squalane như sau:

Các este: Đây là các chất hữu cơ có khối lượng phân tử khoảng 200-300, độ phân cực

thấp Đó là các phtalat: Diphenylphtalat, o.C6H4(COOC2H5)2, nhiệt độ làm việc

100-1600C

Các ankol: Đối với các chất phân tích có độ phân cực cao thì pha tĩnh là các ankol phù

hợp hơpn Đây là các chất phân cực do các nhóm hidroxyl có độ phân cực cao nên các

pha tĩnh này ưa nước Sử dụng rộng rãi nhất là polyetylenglycol, có cấu trúc: HO(-CH2

-CH2-O)n-CH2-CH2-OH, nhiệt độ làm việc tới ~ 2500C, nó có tên thương mại Carbowax® 20M, phân tử lượng trung bình 20000

Các polyme silicon: Các polyme silicon được sử dụng rộng rãi nhất làm pha tĩnh do tính

đa dạng của các nhóm chức Tuỳ theo độ phân cực của các nhóm chức mà người ta chế tạo được các pha tĩnh có độ phân cực khác nhau để phù hợp với chất phân tích

Loại được sử dụng rộng rãi nhất là Dimetylpolysiloxan có nhiệt độ làm việc 325

- 3500C Nó có tên thương mại là OV-1 hoặc DB-1 Tuy nhiên các nhóm chức -CH3 có thể thay thế bằng rất nhiều nhóm chức khác từ độ phân cực thấp đến cao, thí dụ phenyl, -Cl, -F hoặc-CN v.v Với 5% diphenyl và 95% dimetylsiloxane, tên thương mại là DB-

5 hoặc HP-5; silicon có 35% diphenyl 65% dimethyl gọi là DB-35 hoặc HP-35 Trên đây là cấu trúc phân tử một số pha tĩnh

Bảng 10.1 thống kê một vài loại cột có độ phân cực khác nhau của hãng HP:

Bảng 10.1 Một vài loại cột sắc ký khí trên thị trường

Loại cột Đặc tính

kỹ thuật

Đối tượng Phân tích

Thành phần pha tĩnh

Dược phẩm 35% diphenyl +65% dimethyl-siloxane DB-35, SPB-35 SPB608, AT35 HP-210 45-250oC Aldehyd, cơ-clo,

Cơ-photpho, BVTV 50%triflopropyl 50% dimethylsiloxane + DB 210 Rtx-200

HP-1301 20-280

oC Ancol, h/c oxygen Thuốc BVTV, aroclor 6%cyanolopropyl-phenyl +

94% dimethylsiloxane

DB 1301, DB624 Rtx-1301 HP-20M 40-250oC Ancol, h/c thơm, dung

môi Polyethylene Glycol (PEG) BP-20, Carbowax 20M Sau khi chế tạo được pha tĩnh lỏng, người ta đưa chúng lên bề mặt của chất mang

là các vật liệu vô cơ bền với nhiệt và hoá chất như: đất lưỡng nguyên, silicagen hoặc silicagen silan hoá, trong đó silicagen được sử dụng rộng rãi nhất

Detector được sử dụng nhiều nhất trong sắc ký khí là ion hóa ngọn lửa (ionization flame detedtor- FID)

Hình 10.5 Thiết bị sắc ký khí

a- Sơ đồ chức năng máy sắc ký khí

b- Sơ đồ nguyên lý detector FID

Nguyên lý làm việc của detector là chất phân tích sau khi tách, đi vào detector

bị ion hóa trong ngọn lửa có nhiệt độ khoảng 2000OC Các ion di chuyển về phía các điện cực trái dấu đặt gần ngọn lửa, làm xuất hiện dòng điện là tín hiệu phân tích cần đo

Có thể tóm tắt hoạt động của máy sắc ký khí như sau: Khí mang được bơm đi qua cột liên tục trong khi cột được duy trì ở một nhiệt độ nhất định; Khi bơm mẫu vào cột qua đầu cột, các chất trong mẫu được tách khỏi nhau trong cột Các chất đã được tách lần lượt đi vào detector, chuyển thành tín hiệu điện và bộ phận xử lý tín hiệu đánh giá và ghi lại cho mục đích định tính và định lượng mẫu phân tích