Nguyễn Trương Phi - 1813508 .Pdf

TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HỒ CHÍ MINH KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN TRƯƠNG PHI LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ PHÂN TÍCH GENOME CỦA THỰC KHUẨN THỂ NHẰM PHÒNG VÀ T[.]

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN TRƯƠNG PHI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ PHÂN TÍCH GENOME CỦA THỰC KHUẨN THỂ NHẰM PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH

GAN THẬN MỦ Ở CÁ TRA

KỸ SƯ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HỒ CHÍ MINH, 2022

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGUYỄN TRƯƠNG PHI – 1813508

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ PHÂN TÍCH GENOME CỦA THỰC KHUẨN THỂ NHẰM PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH GAN

THẬN MỦ Ở CÁ TRA EXTRACTION AND ANALYSIS OF PHAGE GENOMES TO PREVENT AND TREAT ENTERIC SEPTICEMIA CATFISH

KỸ SƯ NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN

PGS.TS Hoàng Anh Hoàng

TP HỒ CHÍ MINH, 2022

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HCM, ngày….tháng… năm……

NHẬN XÉT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Tên luận văn:

QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ VÀ PHÂN TÍCH GENOME CỦA THỰC KHUẨN THỂ NHẰM PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH GAN THẬN MỦ Ở CÁ TRA

Đánh giá Luận văn

1 Về cuốn báo cáo:

Số tài liệu tham khảo Sản phẩm _

Một số nhận xét về hình thức cuốn báo cáo:

2 Về nội dung luận văn:

3 Về tính ứng dụng:

4 Về thái độ làm việc của sinh viên:

Giỏi/ Khá/ Trung bình

Điểm sinh viên:

Nguyễn Trương Phi:……… /10

Cán bộ hướng dẫn

(Ký tên và ghi rõ họ tên)

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TP HCM, ngày….tháng… năm……

NHẬN XÉT LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

Tên luận văn:

QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ VÀ PHÂN TÍCH GENOME CỦA THỰC KHUẨN THỂ NHẰM PHÒNG VÀ TRỊ BỆNH GAN THẬN MỦ Ở CÁ TRA

Đánh giá Luận văn

5 Về cuốn báo cáo:

Số tài liệu tham khảo Sản phẩm _

Một số nhận xét về hình thức cuốn báo cáo:

6 Về nội dung luận văn:

7 Về tính ứng dụng:

8 Về thái độ làm việc của sinh viên:

Giỏi/ Khá/ Trung bình

Điểm sinh viên:

Nguyễn Trương Phi:……… /10

Người nhận xét

(Ký tên và ghi rõ họ tên)

KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS Hoàng Anh Hoàng

Thời gian thực hiện: Từ 14/02/2022 đến 10/06/2022

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Trương Phi -1813508

Nội dung đề tài:

Đề tài nhằm giải trình tự và phân tích genome của thực khuẩn thể để xem xét tính khả

thi khi áp dụng vào liệu pháp thực khuẩn thể đối với bệnh gan thận mủ Đối tượng nghiên

cứu là hai thực khuẩn thể M18N và M26N ly giải trên vi khuẩn gây bệnh Edwardsiella

ictaluri Kết quả mong muốn tìm được thực khuẩn thể tìm năng để ứng dụng vào liệu

pháp thực khuẩn thể

Kế hoạch thực hiện:

1 Chuẩn bị dụng cụ, vật liệu thí nghiệm

2 Hoạt hóa phage M18N (Drop Assay) và thu Stock Drop M18N

3 Hoạt hóa phage M26N (Drop Assay) và thu Stock Drop M26N

4 Thu Stock Plaque M18N và M26N

5 Tách chiết DNA M18N và M26N

6 Kiểm tra DNA và gửi mẫu giải trình tự

7 Nhận dữ liệu và tiến hành phân tích tin sinh

Xác nhận của Cán bộ hướng dẫn TP HCM, ngày….tháng … năm…

Sinh viên

Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp, thành lập theo Quyết định số ……… ngày ……… của Hiệu trưởng Trường Đại học Bách khoa TP.HCM

Không có thành quả nào mà không cần đến sự giúp đỡ dù ít hay nhiều, trong suốt 4 năm đại học ở trường Đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh, em đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ, chỉ dẫn của thầy cô và bạn bè và sự động viên từ gia đình, để từ đó em

có thể hoàn thành được bài luận văn tốt nghiệp này

Với lòng biết ơn sâu sắc, em xin cảm ơn các quý Thầy Cô khoa Kỹ Thuật Hóa Học – Trường Đại Học thành phố Hồ Chí Minh đã dùng sự nhiệt huyết, đam mê của mình để truyền lại những kiến thức quý báu cho sinh viên chúng em Sau khoảng thời gian học tập

và nghiên cứu đó, em đã hoàn thành bài luận văn tốt nghiệp của mình, “Quy trình giải trình

tự và phân tích genome của thực khuẩn thể nhằm phòng và trị bệnh gan thận mủ ở cá tra”

Để hoàn thành bài luận văn này, em xin được phép bày tỏ lời cảm ơn cùng với sự kính trọng sâu sắc nhất đến PGS.TS.Hoàng Anh Hoàng và ThS.Từ Quang Vinh – người đã tận tình hướng dẫn em trong suốt thời gian hoàn thiện luận văn này

Xin cảm ơn các chị phòng 107B2, phòng thí nghiệm công nghệ sinh học Đại Học Bách Khoa, thành phố Hồ Chí Minh Chị Phạm Ngọc Quỳnh Anh, chị Lê Thị Mỹ Duyên, chị

Tô Huệ Ngọc, cả ba chị đã tận tình hướng dẫn, góp ý về các kỹ thuật thao tác cũng như các quy trình trong phòng thí nghiệm cho em

Mặc dù đã có cố gắng học tập, nghiên cứu trong suốt thời gian qua, song thời gian cũng như kinh nghiệm có hạn nên luận văn này không tránh khỏi các thiếu sót Kính mong nhận được sự góp ý, bổ sung từ quý Thầy Cô và những ai quan tâm đến đề tài này, để luận văn được hoàn thiện và nâng cao hơn nữa

Chương 1: Tổng quan tài liệu 2

1.1 Bệnh gan thận mủ 2

1.2 Vi khuẩn gây bệnh Edwardsiella ictaluri 3

1.3 Liệu pháp thực khuẩn thể 4

1.3.1 Lược sử về thực khuẩn thể 4

1.3.2 Tổng quan về liệu pháp phage 4

1.3.3 Vòng đời và cơ chế lây nhiễm chung của phage 5

1.4 Các nghiên cứu liệu pháp thực khuẩn thể trong và ngoài nước 6

1.5 Quy trình chung 9

1.6 Tạo thư viện và giải trình tự 10

1.6.1 Chuẩn bị thư viện 10

1.6.2 Giải trình tự Illumina 12

1.7 Mục tiêu đề tài 14

Chương 2: Vật liệu và phương pháp 15

2.1 Vật liệu 15

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ 16

a) Hóa chất và môi trường 16

b) Dụng cụ và thiết bị 18

2.3 Phương pháp 19

2.3.1 Chuẩn bị thực khuẩn thể và đối tượng xâm nhiễm 19

2.3.2 Hoạt hóa bằng Drop Assay 20

2.3.3 Plaque Assay 21

2.3.5 Tách chiết genome thực khuẩn thể 25

2.3.6 Lắp ráp trình tự và phân tích genome (Trình tự genome thô hình cầu) 27

Chương 3: Kết quả và thảo luận 30

3.1 Kết quả hoạt hóa và tăng sinh thực khuẩn thể 30

3.1.1 Kết quả hoạt hóa thực khuẩn thể 30

3.1.2 Kết quả thu stock thực khuẩn thể 32

3.1.3 Kết quả đo mật độ DNA bằng NanoDrop 33

3.1.4 Kết quả điện di 34

3.2 Kết quả giải trình tự và phân tích tin sinh 34

3.2.1 Kết quả giải trình tự 34

3.2.2 Kiểm tra và xử lý dữ liệu thô 35

3.2.3 Lắp ráp hệ gene 35

3.2.4 Chú giải cấu trúc 36

3.2.5 Chú giải chức năng 38

3.2.6 Phân tích phát sinh loài 43

3.2.7 Tính an toàn của thực khuẩn thể 44

3.3 Kết luận và kiến nghị 45

3.3.1 Kết luận 45

3.3.2 Kiến nghị 45

Phụ lục 46

Hình 1.1 Cá tra giống nuôi có các dấu hiệu của ESC như bụng phình to và mắt xuất

hiện (mắt đỏ) do cổ trướng2 2

Hình 1.2 Các triệu chứng của bệnh ESC2 3

Hình 1.3 Số lượng tích lũy trình tự genome của Edwardsiella phage từ năm 2012 đến nay, dữ liệu trích từ cơ sở dữ liệu Nucleotide của NCBI 8

Hình 1.4 Biểu đồ boxplot về chiều dài genome của Edwardsiella phage, dữ liệu trích từ cơ sở dữ liệu Nucleotide của NCBI 7

Hình 1.5 Quy trình chuẩn bị thư viện bằng NEBNext® Ultra™ II DNA Library Prep Kit24 10

Hình 1.6 Quy trình giải trình tự Illumina 12

Hình 2.1 Khảo sát thời gian xâm nhiễm của M18N34 15

Hình 3.1 Kết quả Plaque Assay của Stock Drop M26N (trái) và M18N (phải) 30

Hình 3.2 Kết quả Plaque Assay Stock Plaque M26N (trái) và M18N (phải) 32

Hình 3.3 Kết quả đo nồng độ DNA M18N (trái) và M26N (phải) 33

Hình 3.4 Kết quả điện di kiểm tra M18N và M26N 34

Hình 3.5 Độ bao phủ của genome sau lắp ráp của M18N (trái) và M26N (phải) 35

Hình 3.6 So sánh sự tương đồng giữa M18N và M26N 37

Hình 3.7 Kết quả sau khi hoán vị vòng với vị trí bắt đầu là terminase large subunit 37

Hình 3.8 Genome của M18N và M26N 38

Hình 3.9 Phân bố độ dài các orf của M18N (trái) và M26N (phải) 38

Hình 3.10 Kết quả chú giải chức năng M18N (vòng trong) và M26N (vòng ngoài) Error! Bookmark not defined. Hình 3.11 Các phage có số lượng orf tương đồng với phage M18N (vòng trong) và M26N (vòng ngoài) thông qua kết quả BLASTP 41

Hình 3.12 Cây phát sinh loài M18N-M26N dựa trên gene terminase 43

Bảng 1.1 Các nghiên cứu giải trình tự genome Edwardsiella phage 8

Bảng 1.3 Kích thước fragment insert mong muốn và sau khi chuẩn bị thư viện 24 11

Bảng 1.4 Số vòng PCR thích hợp để tạo thư viện 11

Bảng 2.1 Công thức pha 200 ml LB agar 16

Bảng 2.2 Công thức pha đệm SM 16

Bảng 2.3 Thành phần môi trường TSB 17

Bảng 2.4 Các hóa chất sử dụng 18

Bảng 2.5 Danh sách thiết bị sử dụng 18

Bảng 2.6 Các dụng cụ sử dụng 19

Bảng 2.7 Dùng PCI để tinh sạch DNA 26

Bảng 3.1 Mật độ phage ở các mẫu stock và nồng độ DNA thu được 30

Bảng 3.2 Kết quả Plaque Assay Stock Drop M18N và M26N 31

Bảng 3.3 Kết quả Plaque Assay Stock Plaque M18N và M26N 32

Bảng 3.4 Kết quả kiểm tra hàm lượng DNA bằng NanoDrop 33

Bảng 3.5 Thông tin kết quả giải trình tự từ KTEST 34

Bảng 3.6 Kiểm tra, dự đoán coverage của dữ liệu 35

Bảng 3.7 Kết quả lắp ráp SPAdes 36

Lưu đồ 1.1 Quy trình chung 9

Lưu đồ 2.1 Quy trình hoạt hóa phage bằng Drop Assay 20

Lưu đồ 2.2 Quy trình thực hiện Plaque Assay 22

Lưu đồ 2.3 Quy trình Tạo stock phage bằng Plaque 23

Lưu đồ 2.4 Quy trình tách chiết genome thực khuẩn thể 25

Lưu đồ 2.5 Quy trình phân tích genome 27

Bệnh gan thận mủ: ESC, 19

BLAST nucleotide: blastn, 45

BLAST protein: BLASTP, 55

Comprehensive Antibiotic Resistance

multiplicity of infection: MOI, 61

National Center for Biotechnology

Ribonucleic acid: RNA, 22 Save Our Souls: SOS, 23 Science Education Alliance-Phage Hunters: SEA-PHAGES, 45

Tryptic Soy Agar: TSA, 34 Tryptic Soy Broth: TSB, 33, 34 Virulence Factor Database: VFDB, 45

Bệnh gan thận mủ là bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ký sinh trên trong nội tạng

của cá và gây tỉ lệ chết cao Hiện nay liệu pháp thực khuẩn thể có thể được xem là một liệu pháp tự nhiên, an toàn Trong bài luận văn này, đối tượng khảo sát cho liệu pháp là hai thực khuẩn thể M18N và M26N đã được phân lập trước đó từ mẫu bùn ở Cần Thơ, Việt Nam Để đánh giá tính khả thi khi áp dụng vào liệu pháp thực khuẩn thể đối với hai thực khuẩn thể này, hai thực khuẩn thể này được giải trình tự genome và phân tích tin sinh bằng các công cụ tin sinh hiện đại Kết quả phân tích tin sinh cũng như những kết quả khảo sát tính xâm nhiễm trong thực nghiệm cho thấy chúng tiềm năng áp dụng vào liệu pháp thực khuẩn thể

Enteric Septicemia Catfish appeared for the first time in the world in 1976 and appeared in Vietnam at the end of 1998, and became a particularly dangerous disease for export catfish farming in the Delta Mekong River The disease is caused by

Edwardsiella ictaluri bacteria on the viscera of fish and causes high mortality

Because the pathogen is bacteria, antibiotic therapy is most often used, formerly considered the most effective and optimal therapy, but now due to multi-antibiotic resistance in bacteria causing disease and the consequences on ecosystems as well as human health, so finding an alternative and sustainable therapy is extremely urgent The battle for survival between bacteria and phage has been going on for a long time and bacteria are always in a passive position against phage So we can exploit to create a sustainable and safe method of disease prevention and treatment

To evaluate the potential of a bacteriophage in therapy, it is necessary to undergo many evaluation experiments, such as surveying the infecting host spectrum, determining the cycle, time of dissolution, and the ability to carry antibiotic resistance genes, genes toxins to see if bacteriophages can be used in therapy Then bioinformatics as a tool to help us a limit, have an initial view of the phage, then perform more specific experiments to investigate the application of that phage in therapy

To analyze bioinformatics about an object, we first need to have data about that object, genome or genome is a kind of universal data, carrying all information about the object when we decode it Therefore, we will first sequence the phage and then conduct

an analysis with modern bioinformatics tools to identify the coding products from the genome and related phage species to see if they are present follow the lysogenic pathway to lyse bacteria rapidly? Besides, does the genome contain any antibiotic resistance genes or toxic genes? After answering those questions, we will know that bacteriophages cannot be applied in phage therapy or will be a potential object for

further investigation in future experiments

Bệnh gan thận mủ xuất hiện lần đầu tiên được ghi nhận trên thế giới vào năm 1976

và xuất hiện ở Việt Nam vào cuối năm 1998, và trở thành bệnh đặc biệt nguy hiểm đối với nghề nuôi cá da trơn xuất khẩu ở vùng Đồng bằng sông Cửu Long Bệnh do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri ký sinh trên trong nội tạng của cá và gây tỉ lệ chết cao

Vì đối tượng gây bệnh là vi khuẩn nên liệu pháp kháng sinh thường được sử dụng hơn cả, trước đây liệu pháp này được xem là liệu pháp tối ưu và hiệu quả nhất nhưng hiện nãy do tình trạng kháng đa kháng sinh ở vi khuẩn gây và những hệ lụy về hệ sinh thái cũng như sức khỏe con người nên việc tìm một liệu pháp thay thế và bền vững là

vô cùng cấp bách Cuộc chiến sinh tồn giữa vi khuẩn và thực khuẩn thể đã diễn ra từ lâu

và vi khuẩn luôn ở thế bị động trước thực khuẩn thể Cho nên ta có thể khai thác để tạo nên một phương pháp phòng và trị bệnh bền vững và an toàn

Để đánh giá tiềm năng của một thực khuẩn thể trong liệu pháp cần trải qua nhiều thí nghiệm đánh giá, như khảo sát phổ vật chủ xâm nhiễm, xác định chu kỳ, thời gian sinh tan, khả năng mang gene kháng kháng sinh, gene độc tố để xem thực khuẩn thể có thể ứng dụng trong liệu pháp hay không Khi đó tin sinh học như là một công cụ giúp ta giới hạn, có cái nhìn ban đầu về thực khuẩn thể, từ đó thực hiện các thí nghiệm đặc hiệu hơn nhằm khảo sát tính ứng dụng của thực khuẩn thể đó trong liệu pháp

Muốn phân tích tin sinh về một đối tượng, đầu tiên ta cần có những dữ liệu về đối tượng đó, bộ gene hay genome chính là một loại dữ liệu phổ quát, mang tất cả thông tin về đối tượng khi ta giải mã được nó Cho nên đầu tiên ta sẽ giải trình tự thực khuẩn thể sau đó tiến hành phân tích bằng các công cụ tin sinh hiện đại nhằm xác định các sản phẩm mã hóa từ bộ gene, loài liên quan của thực khuẩn thể để xem chúng có đi theo con đường sinh tan để ly giải vi khuẩn nhanh hay không? Bên cạnh đó trong bộ gene có chứa gene kháng kháng sinh hay gene độc tố nào hay không? Sau khi trả lời được các câu hỏi

đó, ta sẽ biết được thực khuẩn thể không thể áp dụng trong liệu pháp thực khuẩn thể hoặc sẽ là đối tượng tiềm năng để nghiên cứu sâu hơn trong thực nghiệm sau này

Chương 1 Tổng quan tài liệu 1.1 Bệnh gan thận mủ

Bệnh gan thận mủ trên cá tra tên tiếng anh là Enteric Septicemia Catfish (ESC) là

một bệnh chính thường gặp ở các trang trại chăn nuôi cá tra phía Bắc nước Mỹ và các quốc gia Đông Nam Á với tỷ lệ gây chết cá lên đến 90%1 ESC lần đầu tiên được ghi nhận như là một bệnh truyền nhiễm ở những ao chăn nuôi cá tra vào năm 1976 từ mẫu vật của Alabama và Georgia gửi đến Phòng Thí Nghiệm Nghiên Cứu Bệnh Ở Cá tại trường đại học Auburn, Alabama phía đông-nam Mỹ2 ESC lần đầu tiên được công bố

trên tạp chí khoa học vào năm 1979 với tác nhân gây bệnh là do vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri, được định danh lần đầu vào năm 1981

Cá tra khi mắc bệnh thường có những hành vi như chỉ bơi theo vòng tròn, xoắn ốc hay tự xoay vòng và đuổi theo đuôi của mình Hành vi bất thường này là do hệ thống thần kinh bị suy nhược bởi vì não bị tổn thương, viêm (viêm màng não, viêm não màng não) Cá bị ảnh hưởng có thể trở nên lờ đờ và bơi chậm lại gần mép ao, hoặc chúng có thể treo mình lơ lửng trong nước với đầu hướng lên và đuôi hướng xuống Cá da trơn bị ESC có xu hướng bỏ ăn ngay sau khi bị nhiễm bệnh

Hình 1.1 Cá tra giống nuôi có các dấu hiệu của ESC như bụng phình

to và mắt xuất huyết (mắt đỏ) do cổ trướng2

Hình 1.2 Các triệu chứng của bệnh ESC2

Bên cạnh đó khi cá nhiễm bệnh thường có những dấu hiệu bên ngoài như bị tích tụ chất lỏng ở cổ gây sưng phù ở cổ, sưng bụng và xuất huyết (mắt đỏ), có vết loét nhỏ màu đỏ-trắng bao phủ da (Hình 1.2 A) hay có các chấm đỏ (chấm xuất huyết) xuất hiện dưới hàm dưới hoặc vùng bụng Gan thường có các khu vực tái nhợt do mô bị hoại tử hoặc xuất hiện các đốm đỏ và trắng nói chung (Hình 1.2 B) Thận và lá lách cũng có thể

bị trương phình, khoang cơ thể chứa đầy dịch màu vàng rơm (cổ trướng) (Hình 1.2.C) Các đốm xuất huyết có thể được tìm thấy trong cơ, ruột và mỡ của cá Ruột thường chứa đầy dịch máu

1.2 Vi khuẩn gây bệnh Edwardsiella ictaluri

Bệnh gan thận mủ (ESC) xảy ra khi vật chủ nhạy cảm (cá da trơn) gặp phải mầm

bệnh Edwardsiella ictaluri, là một vi khuẩn Gram âm thuộc bộ Enterobacteriales, trong

các điều kiện môi trường có lợi cho sự sinh sôi của mầm bệnh và gây căng thẳng cho vật chủ Căng thẳng có thể được gây ra bởi một số yếu tố như đánh lưới, nhốt chặt (thả quá nhiều), chế độ ăn uống không phù hợp, hàm lượng clorua thấp trong nước ao và chất lượng nước kém (hàm lượng oxi thấp, hàm lượng amoniac và nitrit cao) Tỷ lệ tử vong khi bùng phát dịch ESC trong ao có thể thay đổi từ ít hơn 10 phần trăm đến hơn

C

50 phần trăm Cá giống là đối tượng chủ yếu bị ảnh hưởng nhưng con trưởng thành cũng

có thể không chống chọi được với nhiễm trùng và bị bệnh Mặc dù căng thẳng có thể làm tăng nguy cơ nhiễm trùng, nhưng nó không phải là điều kiện tiên quyết cho mầm bệnh có độc lực cao này mà chính tình trạng miễn dịch của từng cá thể trong quần thể

Vào đầu những năm 1980, liệu pháp trị liệu sử dụng phage đã được nghiên cứu mạnh mẽ chủ yếu là do sự tăng kháng đa kháng sinh (MDR) ở vi khuẩn gây bệnh và mong muốn tìm một phương pháp thay thế sử dụng thuốc kháng sinh hóa học5

1.3.2 Tổng quan về liệu pháp phage

Năm 1896, khám phá đầu tiên được báo cáo bởi M E Hankin, sau khi quan sát

thấy tính kháng khuẩn của một tác nhân giống như virus chống lại Vibrio cholerae ở

Ganges River, Ấn Độ6 Bản chất của phage được xác định rõ ràng qua việc quan sát khả năng sinh tan vi khuẩn nuôi cấy được báo cáo đầu tiên bởi Frederick Twort và Felix d’Herrelle, vào 1915 và 19176 Chính Felix d’Herrelle là người đặt tên cho yếu tố giống virus này là bacteriophage và ngay sau đó áp dụng điều trị ở người sau khi khám phá ra Liệu pháp phage trở thành liệu pháp tiên phong chống lại các bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn trước khi sự ra đời của kháng sinh phổ rộng lên ngôi và được sử dụng phổ biến ở các nước trong Thế chiến thứ hai Tuy ghi nhận được những kết quả khả quan lúc đầu nhưng những hiểu biết ít ỏi về phage và những kết quả công bố mâu thuẫn với nhau thời

bấy giờ đã làm liệu pháp tiềm năng nay đi vào lãng quên, nhường chổ cho thời kỳ lên ngôi của kháng sinh7

Tuy nhiên đầu những năm 1980 là thời kỳ mà liệu pháp phage được quan tâm và bắt đầu nghiên cứu mạnh mẽ trở lại do sự xuất hiện tượng MDR, vi khuẩn kháng đa kháng sinh, cho nên việc tìm kiếm một liệu pháp có thể thay thế các chất kháng sinh hóa học được xem là một vấn đề cấp bách Như một hệ quả tất yếu, liệu pháp phage được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đời sống như nuôi trồng nông – lâm, thủy sản, an toàn thực phẩm, động vật học, sản xuất thực phẩm công nghiệp8

1.3.3 Vòng đời và cơ chế lây nhiễm chung của phage

Phage có cấu trúc rất đa dạng và phức tạp khi được quan sát dưới kính hiển vi điện

tử truyền suốt Có hai bộ phận chính ở phage điển hình (họ Caudovirales), bao gồm một

vỏ capsid bao bọc vật liệu di truyền ở dạng Deoxyribonucleic acid (DNA) hoặc Ribonucleic acid (RNA) và một cái đuôi đa dạng về hình dáng, cấu trúc giúp bám giữ với những vật chủ đặc hiệu

Phage có thể trải qua hai chu trình khác nhau: chu kỳ sinh tan và chu kỳ tiềm tan Phage bám vào vật chủ vi khuẩn đặc hiệu nhờ vào receptor trên bề mặt vi khuẩn và tiêm vật liệu di truyền vào trong tế bào Tế bào chủ cung cấp những phân tử cấu tạo và các enzyme cần thiết cho sự nhân đôi của phage bên trong tế bào chủ Những protein của phage được phiên mã như endolysin và holin giúp ly giải tế bào chủ từ bên trong tạo điều kiện cho những phage mới thoát ra ngoài Holin là những protein nhỏ được tổng hợp và gửi ra lưu giữ ở màng tế bào của vật chủ giúp endolysin phân giải peptidoglycan

ở thành tế bào Sau đó ở môi trường ngoài, phage sinh tan có thể tiếp tục lây nhiễm và phá hủy tế bào lân cận

Việc sử dụng lượng lớn phage sinh tan là một lợi thế khi áp dụng trong điều trị, tuy nhiên phage sinh tan có phổ vật chủ hẹp và tác động đặc hiệu đến loài của vi khuẩn Sự thiếu sót này có thể được khắc phục bằng cách sử dụng phage cocktail Trong chu kỳ tìm tan, phage không ngay lập tức sinh tan ngay, thay vào đó nó sẽ chèn genome của mình vào chromosome của tế bào vật chủ ở một vị trí đặc biệt Phage DNA này ở trong genome của tế bào vật chủ được gọi là prophage, tế bào vật chủ chứa prophage được gọi

là lysogen Prophage nhân đôi cùng với genome của tế bào vật chủ, tạo nên một trạng thái ổn định

Nhược điểm của việc sử dụng loại phage này là khi chúng được thêm vào genome của vật chủ rồi thì chúng có thể nằm im hoặc gây biến đổi kiểu hình của vật chủ Chu trình tìm tan sẽ tiếp tục vô định cho đến khi vi khuẩn vị stress hay môi trường không thuận lợi Tín hiệu bắt đầu rất khác nhau giữa các phage nhưng prophage thường bắt đầu khi sự phản hồi tín hiệu Save Our Souls (SOS) của vi khuẩn được kích hoạt vì kháng sinh, stress oxi hay DNA bị tổn thương9 Khi chu trình tìm tan kết thúc, phage DNA được biểu hiện và chu kỳ sinh tan bắt đầu Sự thay đổi chu trình này diễn ra nhờ những phân tử tín hiệu đặc biệt tùy thuộc vào từng loại vi khuẩn, chẳng hạn như ở loài Bacillus, phage DNA được cho là sẽ đáp ứng lại những phân tử protein nhỏ gọi là “arbitrium” để quyết định chu kỳ sinh tan hay tìm tan10

Ý nghĩa của cơ chế sinh học này rất quan trọng và giải thích khi chỉ một phage gặp một lượng vi khuẩn vật chủ thích hợp thì chúng có xu hướng kích hoạt chu kỳ sinh tan Cho đến khi lượng vật chủ còn lại ít, thì các phage sẽ chuyển sang chu kỳ tìm tan để chờ thời cơ khi quần thể vi sinh vật phát triển trở lại và chúng sẽ tiếp tục chu kỳ sinh tan

1.4 Các nghiên cứu liệu pháp thực khuẩn thể trong và ngoài nước

Dựa trên cơ sở dữ liệu của Nucleotide của National Center for Biotechnology

Information (NCBI), tính tới hiện tại chỉ mới có 16 trình tự genome Edwardsiella

phage được giải trình tự toàn bộ genome, chứng tỏ lĩnh vực về liệu pháp phage ứng

dụng trên đối tượng Edwardsiella vẫn còn rất mới mẻ Với độ dốc đồ thị tăng theo mỗi năm, cho thấy trong tương lai genome Edwardsiella phage sẽ còn tiếp tục được khám

phá và nghiên cứu nhiều hơn trong tương lai

Theo dữ liệu trên NCBI, độ dài trung bình của Edwardsiella phage là 78 kp, 75%

độ dài genome phân bố trong khoảng từ 38 – 90 kp, độ dài trung vị là 43 kp Cho thấy

genome của Edwardsiella phage thường tương đối nhỏ, có thể dễ dàng tách chiết và giải

trình tự cũng như phân tích, ứng dụng

Theo ghi nhận, những nghiên cứu đầu tiên về việc giải trình tự genome Edwardsiella

phage là vào đầu năm 2013, Yasuike và cộng sự11,12 đã công bố trình tự của ba phage

xâm nhiễm và ly giải Edwardsiella tarda lần lượt là MSW-3, KF-1 và IW-1, mở ra cơ

hội để tìm hiểu về cơ chế tương tác giữa phage và vật chủ cũng như tiềm năng ứng dụng liệu pháp phage trong nuôi canh thủy sản Tiếp theo đó là hàng loạt những công bố giải trình tự bộ gene của tác giả Yasuike và các tác giả khác về việc giải genome của

Edwardsiella tarda và Edwardsiella ictaluri nhằm tiềm ra liệu pháp thực khuẩn thể

phòng và trị bệnh gan thận mủ

3 6

10 11

13 16

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

Hình 1.3 Số lượng tích lũy trình tự genome của Edwardsiella phage từ

năm 2012 đến nay, dữ liệu trích từ cơ sở dữ liệu Nucleotide của NCBI

Ở Việt Nam, genome Edwardsiella phage được công bố đầu tiên vào năm 2018 bởi

Hoàng và cộng sự13, khi phân lập MK7 từ mẫu gan, thận của cá tra MK7 là phage ly giải được công bố đầu tiên và đặc hiệu đối với một đối tượng gây bệnh trên cá tra

Bảng 1.1 Các nghiên cứu giải trình tự genome Edwardsiella phage

Năm công bố Tên phage Vật chủ Nguồn phân lập Tác giả

2013

MSW-3, KF-1

E tarda

Nước biển, Nhật Bản

Ao thủy sản, USA Carrias14

2015 Pei26, PEi20 E tarda Mô cá và nước

nuôi cá, Nhật Bản Yasuike16

Hình 1.4 Biểu đồ boxplot về chiều dài genome của Edwardsiella

phage, dữ liệu trích từ cơ sở dữ liệu Nucleotide của NCBI

1.5 Quy trình chung

Vì giống phage M18N và M26N đã được được phân lập vào bảo quản từ năm 2021 Nên khi thực hiện luận văn này phage cần được hoạt hóa để kiểm tra và kích thích lại khả năng khả năng xâm nhiễm bằng Drop Assay Stock phage sau khi khi thực hiện Drop Assay (Stock Drop) dùng để khảo sát tính nồng độ đĩa Webbed plate (đĩa có mật

độ plaque 3000-4000) thích hợp từ đó tiến hành tạo Stock phage bằng các đĩa Webbed plate Sau khi thu được stock phage của M18N và M26N, tiến hành trích xuất genome phage bằng phương pháp tinh sạch DNA PCI21 Mẫu genome sau đó được gửi đến Trung tâm dịch vụ xét nghiệm kỹ thuật cao KTEST22 để giải toàn bộ genome của M18N và M26N bằng kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới (Next generation sequencing, NGS) trên

hệ thống MiniSeq (Illumina) với chiều dài đoạn giải 2x150bp Sau khi nhận được trình

tự thô genome, tiến hành các bước phân tích tin sinh

Lưu đồ 1.1 Quy trình chung về tách chiết genome và phân tích tin sinh

1.6 Tạo thư viện và giải trình tự

1.6.1 Chuẩn bị thư viện

Mẫu DNA được tiến hành tạo thư viện (phân cắt bởi các fragmentase, gắn adapter, index và nhân bản bằng Polymerase chain reaction - PCR) bằng bộ kit NEBNext ΜLtra

II DNA Library Prep kit for Illumina (NEB) Quy trình tạo thư viện được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất23 Các thư viện sau đó được giải trình tự bằng NGS trên hệ thống MiniSeq (Illumina) với chiều dài đoạn giải 2x150 bp Dữ liệu giải trình tự được tinh sạch trình tự apdater và các trình tự chứa nucleotide không xác định

Hình 1.5 Quy trình chuẩn bị thư viện bằng NEBNext®

Ultra™ II DNA Library Prep Kit24

Trước tiên cần có 500 pg – 1 ug DNA đã được phân mảnh bằng sóng siêu âm hoặc enzyme NEBNext dsDNA fragmentase, mặc dù bộ kit có thể sử dụng với một lượng nhỏ DNA đầu vào nhưng nên sử dụng lượng nhiều nhất có thể để tối thiểu số vòng PCR cần thiết

Bước đầu tiên chuẩn bị thư viện là Ending Repair và dA-Tailing Ở bước này, DNA được làm đầu bằng (blunt) và được phosphorylate hóa, một Adenin được thêm vào đầu 3’ của mỗi đoạn fragment Bước kế tiếp là gắn Adaptor, ở bước này Adaptor với một T-overhang được gắn vào hai đầu của fragment đã được gắn đuôi dA Nếu lượng DNA ban đầu thấp hơn 100 ug, lượng Adaptor nên được giảm bớt để tránh nguy cơ tạo thành adaptor-dimer

Để loại bỏ những fragment với các kích thước không mong muốn, ta tiến hành sàng lọc kích thước Vì khi phân mảnh, sợi DNA bị phân tách thành các fragment có kích thước khác nhau, để thu được những fragment có độ dài phù hợp và có gắn Adaptor ta

sử dụng những hạt từ tính

Bảng 1.2 Kích thước fragment insert mong muốn và sau khi chuẩn bị thư viện 24

Kích thước fragment insert 150 bp 200 bp 250 bp 300-400

(insert + adaptor + primers) 270 bp 320 bp 370 bp 480 bp 600 bp

750-800

bp

Bước cuối cùng của chuẩn bị thư viện là khuếch đại thư viện bằng PCR Không chỉ giúp tăng kích thước thư viện mà còn sàng lọc những phân tử đã được gắn adapter ở mỗi đầu Đối với các thư viện đa hợp, chỉ số hoặc barcode có thể được sử dụng ở bước này nếu NEBNext Adaptor and Primer được sử dụng Số vòng PCR tùy thuộc vào lượng DNA input ban đầu

Bảng 1.3 Số vòng PCR thích hợp để tạo thư viện

Lượng DNA đầu vào

* Số chu kỳ được xác định cho kích thước thư việc được chọn

** NEBNext adaptors chứa một thiết kế cắt ngắn độc đáo

Các thư viện được xây dựng với các NEBNext adaptors yêu cầu tối thiểu 3 chu kỳ khuếch đại để thêm hoàn toàn các trình tự adaptor cho quy các trình phía sau

Sau phản ứng PCR, sử dụng từ trường để loại bỏ các những thành phần không gắn vào hạt bean, sau bước này sẽ thu được DNA-library gắn vào hạt bean và sẵn sàng cho quy trình giải trình tự

1.6.2 Giải trình tự Illumina

Công nghệ Illumina sequencing dựa theo ý tưởng của Shankar Balasubramanian,

và David Klenerman từ những năm 90 của thế kỷ trước25, và được thực hiện bởi Turcatti

và cộng sự26 Giải trình tự Illumina cũng là một phương pháp giải trình tự tổng hợp, nhưng ngược với 454 sequencing, nó sử dụng sự kết thúc hóa học thuận nghịch của các chất tương tự nucleotide27 Công ty Solexa được thành lập vào năm 1998 Sau 8 năm

Hình 1.6 Quy trình giải trình tự Illumina

nghiên cứu và phát triển và hợp nhất với công ty công nghệ cụm phân tử Manteia vào năm 2004 và công ty phân tích dữ liệu Lynx Therapeutics vào năm 2005, Solexa có thể tung ra DNA được trình tự đầu tiên của họ, Máy Genome Analyzer, ra thị trường vào năm 2006 Một năm sau Solexa được Illumina mua lại

Quy trình giải trình tự của Illumina sequencing bao gồm các bước cũng giống như như sau:

1 Chuẩn bị thư viện DNA bằng các phân mảnh DNA sử dụng kỹ thuật nebulization, tạo đầu bằng enzyme và gắn adaptor hai đầu DNA

2 Quá trình khuếch đại DNA được thực hiện trên bề mặt thủy tinh của một flowcell bằng cách sử dụng solid-phase bridge PCR28,29 Tại đây, các đoạn DNA có cạnh bộ tiếp hợp được liên kết với một bề mặt được bao phủ bởi oligonucleotide

3 Thay đổi chu kỳ kéo dài của và bst polymerase và biến tính bằng cách sử

dụng formamide tạo ra các bản sao của đoạn DNA khuôn mẫu và sự cố định đảm bảo rằng tất cả các amplicon có nguồn gốc từ một khuôn mẫu được nhóm lại với nhau trên bề mặt Mỗi cụm bao gồm ~ 1.000 bản sao của mẫu

4 Quá trình giải trình tự được bắt đầu bằng cách lai một đoạn mồi trình tự Nhóm chặn 3’-O-azidometyl đảm bảo rằng chỉ một base được kết hợp Ở mỗi chu kỳ, một loại base được liên kết với các nucleotide bị biến đổi về mặt hóa học bởi DNA polymerase đã sửa đổi27 và một trong bốn nhãn huỳnh quang cho phép phát hiện các DNA khác nhau26,27

5 Sau khi thu được bốn hình ảnh ở các kênh khác nhau, chu trình giải trình tự kết thúc với sự phân cắt hóa học và giải phóng nhóm fluorophore ở các cụm

và nhóm chặn, cho phép kết hợp base ở chu kỳ giải trình tự tiếp theo Sau đó, hình ảnh được chuyển đổi thành các tệp trình tự bằng cách phân tích hình ảnh, nhận biết base và lọc bỏ các trình tự chất lượng kém Đầu ra là các tệp giải trình tự

bằng Illumina ở định dạng *.fastq Do việc sử dụng polymerase và nucleotide đã sửa

đổi, lỗi giải trình tự thường gặp nhất đối với Illumina sequencing được báo cáo là do sự thay thế30,31 Độ dài đọc của Illumina bị giới hạn bởi các yếu tố, chẳng hạn như sự phân

cắt không hoàn toàn của nhóm fluorophore hoặc nhóm chặn gây ra sự phân rã và giảm tín hiệu32,33

1.7 Mục tiêu đề tài

Mục tiêu của đề tài là thu nhận và đánh giá genome của phage về khả năng sử dụng vào liệu pháp thực khuẩn thể Đầu tiên phage được chọn sẽ mang đi tinh sạch và trích xuất DNA, sau đó khi nhận được dữ liệu giải trình tự thô, dữ liệu sẽ được mang đi xử lý bằng các công cụ tin sinh, trải qua các bước lắp ráp và ghi chú chức năng của các gene trên genome Dựa trên cơ sở đó, phage sẽ được so sánh với các chủng liên quan trên bản

đồ phát sinh loài để suy đoán đặc tính tương tác với vật chủ của phage và khả năng ứng dụng vào liệu pháp thực khuẩn thể

Chương 2: Vật liệu và phương pháp 2.1 Vật liệu

Hai mẫu phage được phân lập chung với 13 mẫu phage khác từ 30 mẫu bùn khác nhau từ 13 mẫu bùn có sự xuất hiện của thực khuẩn thể xâm nhiễm vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri34 Tuy thời gian lây nhiễm khảo sát được khá cao (100 phút) trong

bộ 5 phage khảo sát hoạt tính xâm nhiễm (M5N, M7N, M9N, M14N, M18N), nhưng bù lại phổ xâm nhiễm của M18N là rộng nhất trong số 13 phage khi cho xâm nhiễm 5 dòng

vi khuẩn E ictaluri Bên cạnh đó M26N cũng cho plaque khá rõ 4 trong 5 chủng vi

khuẩn khảo sát Mẫu stock phage đươc trữ trong SM-Glycerol sao cho nồng độ Glycerol cuối cùng từ 10-15%, trữ ở -70oC

Chủng vi khuẩn dùng trong luận văn này là chủng Edwardsiella ictaluri E1 của

Khoa Bệch học Thủy sản phân lập và được Phòng thí nghiệm công nghệ sinh học đại

học Bách Khoa cung cấp Chủng E ictaluri E1 được phân lập từ mẫu thận và gan của

cá tra bị bệnh ở tỉnh Cần Thơ Theo khảo sát với nồng độ 105 CFU/mL chủng này gây nên bệnh gan thận mủ ở cá tra với lượng cá chết 50% sau 1 giờ khuếch tán trong nước35

Chủng vi khuẩn này đã được dùng để khảo sát một số thực khuẩn thể xâm nhiễm E

ictaluri ở Việt Nam nhằm tìm ra liệu pháp phage thích hợp điều phòng và trị bệnh gan

thận mủ ở cá da trơn

Hình 2.1 Khảo sát thời gian xâm nhiễm của M18N34

2.2 Hóa chất, thiết bị và dụng cụ

a) Hóa chất và môi trường

Môi trường thạch đĩa LB (Luria-Bertani) agar: dùng để đổ đĩa vi khuẩn và thực

khuẩn thể dùng trong Plaque Assay và Drop Assay Công thức để pha 200 ml môi trường

LB agar như sau:

Bảng 2.1 Công thức pha 200 ml LB agar

đổ vào đĩa agar đặt trong tủ cấy tránh để agar bị đông khi đổ môi trường ra đĩa Sau khi

đổ môi trường xong chờ agar khô rồi bảo quản trong túi nhựa ở nhiệt độ phòng sẵn sàng

Môi trường TSB (Tryptic Soy Broth) để nuôi giống vi khuẩn làm vật chủ E

ictaluri E1 cho phage xâm nhiễm Môi trường TSB sử dụng có thành phần như sau:

độ phòng sẵn sàng sử dụng để tạo stock vi khuẩn

Môi trường TSA (Tryptic Soy Agar) dùng để tạo lớp thạch trên trong Plaque

Assay và Tạo Stock Phage, giúp cố định và ổn định phage khi để chúng tương tác với vật chủ, hình thành các plaque rõ ràng Để chuẩn bị TSA, cân 3% (w/v) môi trường TSB

và 0.4% (w/v) agar Hòa tan agar trong lò vi sóng khoảng 18 phút, sau đó hấp tiệt trùng

120oC, 20 phút Sau khi sấy khô 70oC khoảng 30 phút, môi trường TSA nhanh chóng được rót vào các ống nghiệm nhỏ (100 x 13mm) Sau đó các ống nghiệm nhỏ chứa TSA được đem đi hấp tiệt trùng một lần nữa Sau khi nguội ta có TSA 0.4% được bảo trong

tủ mát ở nhiệt độ phòng sẵn sàng sử dụng trong Plaque Assay và Tạo Stock Phage

PCI (Phenol – Cloroform - Isoamyl Acohol) là hỗn hỗn dung dịch được dùng

trong tách chiết DNA nhằm biến tính protein, tinh sạch DNA và phân tách 2 pha: pha dung môi (phenol) đáy và pha lỏng (cloroform) trên36 DNA được giữ trong pha lỏng trong khi protein biến tính bị giữ lại trong pha dung môi, vai trò của isoamyl acohol là phá hệ nhũ tương (bọt) khi ly tâm tách lớp PCI được pha theo tỉ lệ các thành phần tương ứng 25:24:1 theo thể tích, việc pha PCI được thực hiện trong tủ hút và trang bị đầy đủ

đồ bảo hộ vì cả ba chất thành phần đều rất độc37–39

Đệm TAE 1X dùng trong quá trình điện di giúp trung hòa điện tích DNA khiến

DNA di chuyển thuần nhờ kích thước phân tử ngoài ra tránh hiện tượng điện phân nước ảnh hưởng đến sự di chuyển của DNA Thành phần của đệm TAE 1X bao gồm 40 mM Tris-acetate và 1 mM EDTA40

Fisher Phân cắt RNA của vật chủ khi tinh sạch

Fisher

Tạo môi trường cho DNase I và RNase NT1 hoạt động

di và xác định kích thước genome điện di

tinh sạch DNA

stock phage

9 Tủ -70oC Bảo quản DNA

2.3 Phương pháp

2.3.1 Chuẩn bị thực khuẩn thể và đối tượng xâm nhiễm

Mẫu phage M18N và M26N do Hoài Nhân và cộng sự phân lập34, và bảo quản trong

tủ âm 70oC được trích ra 10 μL mỗi phage chuẩn bị cho Drop Assay để hoạt hóa phage

Để chuẩn bị stock vi khuẩn, lấy 500 μL vi khuẩn E ictaluri E1 giống bảo trong tủ

lạnh 4oC đem đi cấy chuyền vào ống falcon đựng 30 ml môi trường TSB đã chuẩn bị trước, thao tác trong tủ cấy vô trùng Sau khi cấy chuyền, khuẩn được nuôi trên máy lắc

1500 rpm, 24 giờ sẵn sàng cho thí nghiệm Thao tác cấy chuyền vi khuẩn được thực hiện

trước 1 ngày thực hiện thí nghiệm và sau 6 lần cấy chuyền cần cấy chuyền lại ống giống

để tránh hiện tượng thoái hóa giống

2.3.2 Hoạt hóa bằng Drop Assay

Sau quá trình đông sâu phage cần được hoạt hóa để thực hiện chu trình sinh tan trên vật chủ Quy trình thực hiện Drop Assay được thể hiện như lưu đồ trên, ống TSA 4%

đã chuẩn bị trước sẽ được đun nóng trên bếp 250oC trong 18 phút để agar nóng chảy hoàn toàn, sau đó hạ nhiệt xuống 42oC để agar vẫn giữ trạng thái lỏng nhưng không ảnh hưởng đến vi khuẩn Nhanh chóng cho 200 μL Stock vi khuẩn đã cô đặc 2 lần trong ống eppendoff và ống TSA 42oC, nhanh chóng đổ đĩa lên đĩa LB agar đã chuẩn bị trước và

kẻ ô vào mặt sau của đĩa để nhỏ drop

Đợi 5 phút để thạch đông lại, trực tiếp lấy từ ống Stock Phage giống không pha loãng nhỏ 2 μL/giọt lên đĩa thạch, mỗi ô một giọt Sau đó ủ 24 giờ ở nhiệt độ phòng để

Lưu đồ 2.1 Quy trình hoạt hóa phage bằng Drop Assay

Sau khi ủ, quan sát các plaque xuất hiện trên bề mặt thạch, mỗi plaque tương ứng với 1 phage đã được hoạt hóa Ta tiến hành thu các phage đã được hoạt hóa, ta tiến hành thu lớp thạch trên trong các ô đã kẻ sẵn, cứ 3 ô cho vào một ống eppendoff SM 900 μL

và vortex 5 phút Sau đó tiến hành ly tâm 10 000 rpm, 4 độ C, 5 phút và dùng xi lanh thu dịch nổi nhằm loại bỏ lớp gel Cho dịch thu được đi qua màng lọc 0.22 um thu vào các ống eppendoff 1.5 mL, thao tác thu dịch lọc thực hiện trong tủ cấy Các ống eppendoff này (Stock drop phage) được bảo quản trong tủ mát 10oC, sẵn sàng được sử dụng để khảo sát mật độ phage bằng Plaque Assay và Tạo stock phage bằng Plaque (Stock Plaque)

2.3.3 Plaque Assay

Plaque Assay là một kỹ thuật cơ bản thao tác trên đối tượng thực khuẩn thể Kỹ thuật dựa trên nguyên lý khi một thực khuẩn thể xâm nhiễm, ly giải tế bào vật chủ và lây lan rộng trên môi trường thạch sẽ tạo ra các đốm tròn gọi là “plaque” trên môi trường thạch Những plaque này có thể được quan sát bằng mắt thường và có thể đếm được nếu mật độ plaque thưa và rõ nét Thời gian xuất hiện và đường kính của plaque là tùy thuộc

và từng loại phage cũng như độ rõ nét của plaque sẽ liên quan đến kiểu phage đó là sinh tan hay tiềm tan Vì mỗi plaque xuất hiện trên thạch tương ứng với 1 phage trong dung dịch nên ta có thể dùng Plaque Assay để ước tính mật độ phage trong mẫu

Để thực hiện Plaque Assay ta cần chuẩn bị ống TSA đã được đun nóng và hạ nhiệt

và vi khuẩn đã được cô đặc 2 lần như chuẩn bị ở Drop Assay, bên cạnh đó là mẫu phage

từ Drop Assay hay Stock Plaque cần khảo sát mật độ phage Để có thể dễ điếm được số lượng plaque xuất hiện ta sẽ tiến hành pha loãng bằng ống eppendoff chứa 900 μL SM buffer đã chuẩn bị trước Tiến hành pha loãng thập phân, nồng độ 10-1 tiến hành trong

tủ cấy để tránh nhiễm ống gốc Các nồng độ 10-2 đến 10-8 thực hiện bên ngoài Các nồng

độ trên, mỗi nồng độ cho 100 μL vào 1 ống TSA riêng và cùng với đó là 200 μL vi khuẩn cho vào mỗi ống, vortex hỗn hợp và nhanh chóng đổ đĩa và ủ trong 6-8 giờ tại

30oC Sau khi ủ xong tiếng hành đếm lượng plaque xuất hiện và tính mật độ phage trong mẫu, thường sẽ dùng đĩa tạo 20 – 200 plaque để tính Công thức tính mật độ phage như sau:

Mật độ phage (pfu/mL) = Số plaque (pfu)

Thể tích mẫu phage cho vào (μL)× bậc pha loãng × 103 μL/mL Lưu đồ 2.2 Quy trình thực hiện Plaque Assay

2.3.4 Tạo stock phage bằng Plaque

Sau khi khảo sát và tính toán mật độ phage của Stock Drop, ta sẽ chọn ra nồng đồ pha loãng thích hợp để thu Webbed Plate (đĩa có mật độ 3000 - 4000 plaque) nhằm tạo stock phage để giải trình tự Vì ta cần nhiều phage nhất có thể để giải trình tự, nếu chọn các đĩa plaque sau (như 10-7, 10-8) vì số plaque ít nên sẽ thu được ít phage, nếu chọn các đĩa plaque đầu (như 10-1, 10-2) thì phage sinh tan mới vài vòng đã hết vi khuẩn nên cũng

sẽ thu được ít phage Ta vừa phải bảo đảm chu kỳ sinh tan và số lượng vòng sinh tan nhiều nhất có thể

Quy trình thực hiện Tạo stock phage bằng plaque được thể hiện như trên Đầu tiên cũng giống như Plaque Assay và Drop Assay, ta cần chuẩn bị ống TSA đã đun nóng và

hạ nhiệt đến 42oC, lần lượt cho 200 μL Stock Drop phage đã pha loãng đến nồng độ Webbed Plate và 200 μL Stock vi khuẩn đã cô đặc 2 lần vào ống TSA Tiến hành đổ đĩa

Lưu đồ 2.3 Quy trình Tạo stock phage bằng Plaque