Nghiên cứu quy trình tinh sạch và khả năng ức chế enzyme α -glucosidase của flavonoid từ lá cóc đỏ (Lumnitzera littorea)

Từ lá của cây Cóc đỏ thu hái ở rừng ngập mặn Cần Giờ, 5 hợp chất flavonoid đã được cô lập, bao gồm naringenin (1), quercetin (2), quercitrin (3), myricetin (4), myricitrin (5). Cấu trúc của các hợp chất này được xác định thông qua các phương pháp phổ nghiệm. Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất cô lập được khảo sát, trong đó naringenin có hoạt tính cao nhất với giá trị IC50 là 1.87 µg/ml và cao hơn chất đối chứng dương acarbose (IC50 = 138.20 µg/ml).

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ KHẢ NĂNG ỨC CHẾ ENZYME α - GLUCOSIDASE CỦA FLAVONOID TỪ LÁ CÓC ĐỎ

(LUMNITZERA LITTOREA)

Trương Thị Thùy Đang*, Huỳnh Tấn Lộc, Bùi Thanh Tùng,

Lê Linh Ngọc, Nguyễn Thị Thu Hồng, Nguyễn Thị Lệ Thủy

Trường Đại học Mở TP Hồ Chí Minh *Tác giả liên hệ: 1553010031dang@ou.edu.vn

TÓM TẮT

Từ lá của cây Cóc đỏ thu hái ở rừng ngập mặn Cần Giờ, 5 hợp chất flavonoid đã được cô lập, bao gồm naringenin (1), quercetin (2), quercitrin (3), myricetin (4), myricitrin (5) Cấu trúc của các hợp chất này được xác định thông qua các phương pháp phổ nghiệm Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất cô lập được khảo sát, trong đó naringenin có hoạt tính cao nhất với giá trị IC50 là 1.87 µg/ml và cao hơn chất đối chứng dương acarbose (IC50 = 138.20 µg/ml)

Từ khóa: Cóc đỏ, cây rừng ngập mặn, flavonoid, enzyme α-glucosidase

FLAVONOIDS FROM LEAVES OF LUMNITZERA LITTOREA AND IN

VITRO α - GLUCOSIDASE INHIBITORY ACTIVITIES

Truong Thi Thuy Đang*, Huynh Tan Loc, Bui Thanh Tung,

Le Linh Ngoc, Nguyen Thi Thu Hong, Nguyen Thi Le Thuy

Ho Chi Minh City Open University

*Corresponding Author: 1553010031dang@ou.edu.vn

ABSTRACT

From the Lumnitzera littorea leaves, collected at Can Gio mangrove forest, five compounds, including naringenin (1), quercetin (2), quercitrin (3), myricetin (4), myricitrin (5) were isolated Their structures were elucidated by extensive analysis of the spectroscopic data The α-glucosidase inhibitory activity of isolated compounds was evaluated All of them exhibited strong inhibitory activity There are two compounds, naringenin, quercetin were the most potent with IC50 values of 1.87 µg/ml và 3.42 µg/ml, higher than the positive control acarbose( IC50 = 138.20 µg/ml)

Keywords: Lumnitzera Littorea, mangrove plant, flavonoid, α-glucosidase

inhibitory activity

ĐẶT VẤN ĐỀ

Cây Cóc đỏ (Luminitzera littorea) là

(Combretaceae) phân bố ở rừng ngập

mặn Ở Việt Nam, chi Lumnitzera gồm

hai loài là Cóc đỏ (Lumnitzera littorea)

và Cóc trắng (Lumnitzera racemosa)

Hoạt tính kháng khuẩn của các loại cao

chiết như n-haxane, ethylacetate và

methanol từ lá của loài cây này có khả

năng kháng lại sáu loài vi khuẩn gây bệnh ở người Bên cạnh đó trong dân gian chiết xuất từ lá được dùng để chữa nấm vòm họng ở trẻ con Ngoài ra, lá còn được sử dụng như một phương thuốc để chữa bệnh tiêu chảy ở xứ nóng, bệnh viêm ruột, loét miệng Đái tháo đường (hay còn gọi là tiểu đường) là bệnh trạng khi lượng đường trong máu tăng quá cao Bệnh đái tháo

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học đường chia làm hai loại: loại 1 và loại

2 Trong đó bệnh tiểu đường loại 2

chiếm đến 90% nguyên nhân chủ yếu

là do rối loạn insulin trong cơ thể Mặt

khác, enzyme α-glucosidase cũng là

một yếu tố gây nên bệnh tiểu đường

Enzyme α-glucosidase là một enzyme

đường ruột phá vỡ liên kết α -1,4

polysaccharides thành α-glucose dẫn

đến mức đường trong máu cao Mục

tiêu nghiên cứu cô lập một số hợp chất

flavonoid có khả năng ức chế enzyme

α-glucosidase từ lá cây Cóc đỏ

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu

Lá cây Cóc đỏ (Lumnitzera littorea)

trưởng thành, có màu xanh đậm, không

bị sâu, được thu hái tại rừng ngập mặn

Cần Giờ từ tháng 8/2017 đến tháng

8/2018 Cây được định danh khoa học

bởi tiến sĩ Phạm Văn Ngọt, Khoa Sinh

trường Đại học Sư Phạm

Phương pháp nghiên cứu

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR

(125 MHz) được đo trên máy Bruker

AM500 FT-NMR Spectrometer và phổ

ESI-MS được thực hiện trên +IDA

TOF MS Sắc ký cột được thực hiện

với cột silica gel 60 F254 (Merck,

Darmstadt, Đức) có kích thước hạt là

0,040-0,063 mm (240-430 mesh),

silica gel pha đảo, sephadex LH-20 để

cô lập chất

Enzyme α-glucosidase (EC 3.2.1.20)

thu nhận từ Saccharomyces cerevisiae

(750 UN) và

p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside được mua từ công ty

hóa chất Sigma (Mỹ) Acarbose và

dimethyl sulfoxide được mua từ công

ty hóa chất Merck (Đức) Các loại hóa

chất khác đều đạt mức độ tinh khiết

phân tích

Quy trình chiết và cô lập chất

Mẫu lá cây tươi Cóc đỏ (Lumnitzare

littorea) được thu hái lá trưởng thành

tại rừng ngập mặn Cần Giờ, sau đó loại

bỏ những lá hư hỏng sâu bệnh, rửa sạch loại đất cát, phơi khô và xay nhuyễn Bột (7.8000 g) được chiết xuất hoàn toàn bằng ethanol ở nhiệt độ phòng bằng phương pháp ngâm Từ 7.8 kg nguyên liệu khô sử dụng phương pháp ngâm dầm ở nhiệt độ phòng, thu được

880 g cao tổng Với 400 g cao tổng ethanol này được áp dụng cho quá trình chiết pha rắn silic, được tách chiết liên

tục với n-hexan, etyl axetat, etyl

axetat:methanol (1:1) và cuối cùng là metanol Sau khi cô quay, bốn chất chiết xuất thu được, n-hexan (100.87 g), etyl axetat (36.45 g), etyl axetatetanol (1:1) (85.12 g) và methanol (150.43 g)

Từ cao ethanol chiết pha rắn lần lượt

với các loại dung môi n-hexane, EA,

EA:Me (1:1) thu được 4 phân đoạn cao

n-hexane (cao A), cao ethyl acetace

(cao B), cao EA:Me (1:1) (Cao C), cao methanol (cao D) Chiết xuất cao C được cô lập bằng phương pháp sắc ký cột silicagel với hệ dung môi EA:Me lần lượt là 9:1, 4:1, 1:1, 0:1 Sau đó thu được 7 phân đoạn nhỏ được ký hiệu từ C1-C8 Phân đoạn C2 được tái sắc ký trên silicagel với hệ CHCl3- MeOH lần lượt với tỷ lệ là 1:1, 9:1, sau đó với Sephadex LH - 20 với methanol để thu

được hợp chất (4) 10 mg Phân đoạn

C3 được tái sắc ký trên silicagel- hệ dung môi CHCl3- MeOH lần lượt với

tỷ lệ là 1:0, 9:1 và sau đó với Sephadex

LH - 20 với methanol để thu được hai

hợp chất (1) 30 mg và (2) 15 mg Phân

đoạn C4 được tái sắc ký trên silicagel với hệ CHCl3-MeOH lần lượt với tỷ lệ

là 1:0,0;1 cho ra 9 phân đoạn (C4.1- C4.9) sử dụng phương pháp sắc ký và sắc ký lớp mỏng được áp dụng cho

phân đoạn này để thu được hợp chất (5) (C4.4) 3 mg, (3) (C4.9) 1 g

Khảo sát hoạt tính ức chế enzyme

α-Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học

glucosidase

Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase

được khảo sát trên tất cả các loại cao

chiết và hợp chất cô lập theo phương

pháp của Apostolidis và cộng sự [4

p-nitrophenyl-α-D-glucopyranosid]

(pNPG) được sử dụng làm cơ chất Cơ

p-nitrophenyl-D-glucopyranosid sẽ bị enzyme

α-glucosidase thủy phân chuyển hóa

thành α-D-glucose và p-nitrophenol

(pNP) Hoạt tính ức chế α-glucosidase

được tính bằng phương trình sau:

A

A A

control

sample control 

Giá trị IC50 được tính từ phương trình tuyến tính thể hiện sự phụ thuộc giữa phần trăm ức chế hoạt tính của enzyme với nồng độ cao chiết

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Biện luận cấu trúc hợp chất cô lập

Quá trình nghiên cứu thành phần hóa thực vật của cây Cóc đỏ đã cô lập và xác định cấu trúc của 5 hợp chất flavonoid Cấu trúc của những hợp chất này được trình bày trong Hình 1

Hình 1 Cấu trúc các hợp chất flavonoid cô lập từ lá cây Cóc đỏ

Hợp chất (4): Dữ liệu phổ 1H-NMR chỉ

ra rằng có một tín hiệu mũi đơn tại độ

dịch chuyển δ 12.49 (1H, s) của nhóm

OH kiềm nối tại vị trí C-5 Hai tín hiệu

proton mũi đôi ghép meta tại vị trí δ H

6.18 (1H, d, 2.0 Hz) và 6.37 (1H, d, 2.0

Hz) của H-6 và H-8, tương ứng với

vòng A của 5,7-dihydroxyflavonoid

Ngoài ra, tín hiệu tại vị trí δ H 7.24 (2H,

s) đặc trưng cho nhóm 3,4,5–

trisubstituted phenyl đối xứng Dữ liệu

phổ 13C-NMR của (4) cho thấy 13 tín

hiệu bao gồm một tín hiệu của nhóm

carbonyl tại vị trí δC 175.8 (C-4), sáu

tín hiệu carbon sp2 gắn dị nguyên tố tại

δC 163.97), 160.8 5), 156.1

(C-9), 146.9 (C-2), 135.9 (C-3, 4), và

145.8 (C-3, 5), và 3 tín hiệu methine

carbon tại δC 107.2 (C-2, 6), 98.2 (C-6) và 93.2 (C-8), và 2 tín hiệu carbon

bậc IV tại δC 103.0 10) và 120.8

(C-1) Vì vậy, hợp chất (4) chính là myricetin

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR

của hợp chất (4) và (2) là tương tự, tuy

nhiên thay vì có 2 proton đối xứng trên

vòng B của hợp chất (4) thì hợp chất

(2) cho 3 tín hiệu ở δ H 7.67 (1H, d, 2.0 Hz), 7.54 (1H, dd, 2.0 Hz, 8.5 Hz) và 6.88 (1H, d, 8.5 Hz) Dữ liệu phổ 13C

NMR của (2) cho thấy 15 tín hiệu bao

gồm một tín hiệu của nhóm carbonyl tại vị trí 175.9 (C-4), bảy tín hiệu carbon sp2 gắn dị nguyên tố tại 164.0(C-7), 161.0 (C-5), C-9), 146.8 (C-2), 135.8 (C-3), 147.7 (C-4), và

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học 145.1 (C-3) và 5 tín hiệu methine

carbon tại 8), 98.2 6), 120.0

(C-6), và 115.6 (C-5), 115.1 (C-2), và 2

tín hiệu carbon bậc IV tại C-10 và

122.0 (C-1) Từ các dữ liệu phổ 1H và

13C NMR của hợp chất (2) cho thấy

rằng đây là cấu trúc của quercetin

Dựa vào phổ cộng hưởng từ hạt nhân

1H-NMR của hợp chất (1) và (4) là

tương tự, tuy nhiên thay vì có 1 cặp 2

proton đối xứng trên vòng B của (4),

(1) cho 2 cặp 2 proton đối xứng trên

vòng B tín hiệu ở δ H 7.31 (2H, d, 8.5

Hz) và 6.78 (2H, d, 8.5 Hz), và tín hiệu

của một hệ AMX tại H 5.43 (dd, J =

13.0, 3.0 Hz, H-2), 2.68 (dd, J = 17.0,

3.0 Hz, Hax-3) và 3.25 (dd, J = 17.0 Hz,

13.0 Hz, Heq-3) Dữ liệu phổ 13C NMR

của (1) cho thấy 15 tín hiệu bao gồm:

một tín hiệu của nhóm carbonyl tại vị

trí C 196.5 (C-4), bốn tín hiệu trong

vùng 157-167 của carbon sp2 gắn với

dị nguyên tố (C-5, C-7, C-9 và C-4’), 8

tín hiệu từ C 95.0 đến 129.0 của

carbon vòng thơm và 2 tín hiệu tại C

78.5 và 42.0 đặc trưng của C-2 và C-3

của khung flavanone Do đó, hợp chất

(1) được kết luận là naringenin

Dữ liệu phổ 1H và 13C-NMR của hợp

chất (3) có khung flavonoid tương tự như hợp chất (2) Trên phổ 1H-NMR,

tín hiệu proton anomer tại vị trí δ H 5.25

(1H, d, 1.5 Hz, H–1), bốn tín hiệu proton của nhóm CH-OH trong vùng 3.1 – 4.0 ppm và một tín hiệu methyl

tại vị trí δ H 0.82 (3H, d, 6.0 Hz, H-6) cho thấy sự hiện diện của một đường rhamnose Dữ liệu phổ 13C-NMR cho

thấy có 21 tín hiệu carbon, bao gồm δ C

177.7 (C-4), 164.4 (C-7), 161.2 (C-5),

157.3 (C-9), 156.5 (C-2), 148.5 (C-4), 145.2 (C-3), 134.2 (C-3), 121.1 (C-6), 120.7 (C-1), 115.6 5’), 115.4 2’), 104.0 10), 98.7 6), 93.6 (C-8) và tín hiệu của đường rhamnose tại

δC 101.8 (C-1), 71.2 (C-4), 70.6

(C-5), 70.4 (C-2), 70.0 (C-5), 17.5

(C-6) Tín hiệu carbon anomeric xuất

hiện tại vùng từ trường cao hơn với δ C

101.9 cho thấy rằng hợp chất (5) là hợp

chất flavonoid có gắn nhóm một nhóm

O–glycosyl Từ các dữ liệu phổ 1H và

13C NMR của hợp chất (3), cho thấy

rằng đây là cấu trúc của quercitrin

Kết quả sát hoạt tính ức chế enzyme

α-glucosidase

Bảng 1 Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của cao chiết từ lá Cóc đỏ Cao

chiết

Nồng độ

IC 50

(µg/mL)

Cao

ethanol

%ức chế

99.12 

0.14 > 100 > 100 > 100 < 0.10

n-Hexane

37.37 

0.32

57.30 

0.84

71.17 

0.34 > 100 0.21 Ethyl

acetate

5.34 

0.58

25.62 

0.43

50.53 

0.32

91.46 

1.00

85.53 

0.80

95.00 

0.20 > 100 < 0.10

KẾT LUẬN

Năm hợp chất flavonoid đã được cô

lập, bao gồm Myricetin (4),

Naringenin (1), Quercetin (2),

Myricitrin (5), Quercetrin (3) và đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất cô lập được khảo sát, trong đó hai hợp chất

Giải thưởng Sinh viên nghiên cứu khoa học Euréka lần 20 năm 2018 Kỷ yếu khoa học naringenin, quercetin có hoạt tính cao

nhất với giá trị IC50 lần lượt là 1.87

µg/ml và 3.42 µg/ml Kết quả này là

tiền đề quan trọng cho các nghiên cứu

tiếp theo mang tính ứng dụng như sản xuất các sản phẩm thực phẩm chức năng hỗ trợ trong phòng và điều trị bệnh tiểu đường

TÀI LIỆU THAM KHẢO

ANDREA D.S, 2012 Diabetes: what you need to know Copyright Australian

Diabetes Council, 6-90

LÊ CÔNG KHANH, 1986 Rừng ngập mặn và rừng nhiệt đới trên đất chua phèn

Nhà xuất bản Thành phố Hồ Chí Minh, trang 40-80

NGUYỄN KIM PHI PHỤNG, 2007 Phương pháp cô lập các hợp chất hữu cơ

Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP.HCM, trang 20-53

PHẠM HOÀNG HỘ, 1999 Cây cỏ Việt Nam, quyển 2 Nhà xuất bản Trẻ, trang

110