Báo Cáo Tiểu Luận.pdf

Microsoft Word Báo cáo ti?u lu?n docx ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TIỂU LUẬN MÔN HỌC KỸ THUẬT SẢN XUẤT SINH KHỐI VI SINH VẬT ĐỀ TÀI SỬ DỤNG VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS ĐỂ S[.]

ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

KỸ THUẬT SẢN XUẤT SINH KHỐI VI SINH VẬT

MỤC LỤC

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Chương 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Tổng quan về ngành chăn nuôi gà ở Việt Nam 1

1.2 Các bệnh đường ruột phổ biến ở gà 2

Bệnh viêm ruột hoại tử 2

Bệnh bạch lỵ 3

Bệnh Cầu trùng 4

Bệnh Thương hàn 4

1.3 Giới thiệu probiotic 5

1.4 Sơ lược về tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên gia cầm 5

Chương 2 TÁC NHÂN VI SINH VẬT 8

2.1 Khái quát về chủng Bacillus Amyloliquefaciens 8

2.2 Lợi ích mang lại của Bacillus Amyloliquefaciens 10

Chương 3 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT 11

3.1 Quy trình sản xuất chế phẩm 11

3.2 Chuẩn bị dịch bắp lên men 12

3.3 Lên men và thu bào tử 12

3.4 Đánh giá mối nguy 14

Chương 4 Tổng kết 15

Tài liệu tham khảo 16

là probiotic ở gà, một nguồn cung dinh dưỡng không thể thiếu ở nước ta Hiện nay

có nhiều dòng sản phẩm probiotic khác nha trên thị trường quốc tế, nhưng dòng probiotic đặc hiệu cho gà vẫn còn chưa được phát triển nhiều ở Việt Nam

Bài luận này giới thiệu về quy trình sản xuất probiotic từ bào tử của B

amyloliquefaciens, đây là một chủng giống vi khuẩn an toàn, đã được sử dụng trong

lên men thực phẩm từ lâu Một số nghiên cứu cho thấy chủng vi khuẩn này có khả năng cạnh tranh và tiêu diệt các chủng vi khuẩn gây bệnh, đặc biệt là một số chủng

vi khuẩn gây bệnh ở gà như vi khuẩn Clostrium perfringens gây bệnh viêm ruột hoại

tử, ảnh hưởng đến năng suất thịt gà của nước ta hằng năm Ngoài ra nghiên cứu cho thấy chủng vi khuẩn còn giúp tăng sức đề kháng, ổn định đường ruột giúp cho gà tăng trọng, có một tìm năng lớn trong phát triển probiotic cho gà, một lĩnh vực nước ta đã

bỏ ngỏ từ khá lâu

1

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về ngành chăn nuôi gà ở Việt Nam

Chăn nuôi gà là một nghề truyền thống và lâu đời tại Việt Nam, theo số liệu thống kê sản lượng gà nuôi lấy thịt ở Việt Nam tăng theo mỗi năm đến năm 2022 sản lượng là gần 1200 tấn cho thấy nhu cầu về thịt gà rất cao [1] Ngoài ra gà còn nguồn cung cấp trứng, một sản phẩm được sử dụng phổ biến

Hình 1.1 Sản lượng (tấn) thịt gà theo từng năm [1]

Hiện nay, nhu cầu tiêu thụ gà tăng mạnh nên xuất hiện nhiều trang trại gà ở quy mô công nghiệp Tuy nhiên, những vấn đề phát sinh từ quá trình nuôi gà liên quan đến

vệ sinh an toàn thực phẩm đang có chiều hướng gia tăng Việc lạm dụng các chất kháng sinh, hormone trong quá trình chăn nuôi gà đã dẫn đến mất vệ sinh an toàn thực phẩm ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khỏe con người tiềm ẩn nhiều nguy cơ gây dị ứng, ung thư, rối loạn giới tính, ngộ độc cấp tính…[2], [3]

Do đó để sản xuất động vật an toàn, bắt buộc phải có thức ăn an toàn, đồng nghĩa với việc loại bỏ kháng sinh, hormone [4] Việc làm này dẫn đến giảm năng suất và lợi nhuận trong chăn nuôi Vì vậy, để phát triển chăn nuôi gà bền vững, nhất thiết phải

có phương pháp chăn nuôi kiểu mới trong đó, giải pháp chăn nuôi sạch và năng suất cao luôn được người chăn nuôi tìm kiếm

2

1.2 Các bệnh đường ruột phổ biến ở gà

Đường ruột là một trong những cơ quan nội tạng đóng vai trò quan trọng bậc nhất trong sự phát triển của gà Nếu gà bị đường ruột và không được giải quyết kịp thời thì có thể gây những tổn thất nặng nề cho người chăn nuôi Một số bệnh đường ruột

do vi khuẩn phổ biến gây thiệt hại lớn đến nền công nghiệp chăn nuôi gà có thể kể đến như: viêm ruột hoại tử, bạch lỵ, cầu trùng, thương hàn

Bảng 1 Một số bệnh đường ruột do vi khuẩn phổ biến ở gà

Bệnh viêm ruột hoại tử

Bệnh viêm ruột hoại tử trên gà là một bệnh nhiễm trùng cấp tính do vi khuẩn

Clostrium perfringens gây hoại tử nghiêm trọng trên niêm mạc ruột [5]

Hình 1.2 Ruột gà bị hoại tử [9]

Là bệnh truyền nhiễm ở gà con dưới 3 tuần tuổi, gây do vi khuẩn Salmonella

Pullorum Đặc trưng là phân gà trắng, bết dính quanh hậu môn và nhiều nốt hoại tử

màu trắng xám trên các cơ quan nội tạng [6]

Hình 1.3 Gà bị bệnh bạch lỵ [9]

Biểu hiện: Gà chết bắt đầu từ 4 ngày tuổi, nhiều nhất vào ngày thứ 5 và giảm dần đến ngày thứ 8 Gà bệnh biểu hiện ủ rũ, giảm hay bỏ ăn, hở rốn, túm lại một chỗ Gà sẽ chết nếu không can thiệp bằng kháng sinh [6]

4

Bệnh Cầu trùng

Bệnh cầu trùng do Eimeria spp gây ra Bệnh lây lan chủ yếu qua đường tiêu hóa do

gà ăn phải nang của cầu trùng có trong thức ăn, nước uống bị nhiễm mầm bệnh

Hình 1.4 Gà bị bệnh cầu trùng [9]

Bệnh làm tăng số gà còi, giảm tốc độ lớn cho toàn đàn, gây chết cao ở gà con, làm giảm sản lượng trứng ở gà đẻ Cầu trùng có thể gây bệnh ở gà mọi lứa tuổi nhưng hay gặp ở gà 10 - 30 ngày tuổi Triệu chứng: Gà bị đi ỉa, phân lẫn máu Gà gầy rộc nhanh, thiếu máu: mào, da nhợt nhạt Gà ủ rũ, bỏ ăn, nằm tụm đống kêu khác lạ [7]

Bệnh Thương hàn

Thương hàn gà do vi khuẩn Salmonella gallinarum và Salmonella pullotum gây ra

Bệnh thường xảy ra ở thể cấp tính ở gà con và thể mãn tính ở gà lớn Thường khi bệnh lan truyền trong đàn gà, cần tiêu huỷ cả đàn nên thiệt hại kinh tế là rất lớn

Hình 1.5 Gà bị bệnh thương hàn [9]

Triệu chứng: Ở gà con, gà bị tiêu chảy, phân trắng xuất hiện chất nhầy, đặc biệt là vùng lông xung quanh hậu môn dính phân bết lại Túi lòng đỏ không tiêu có mùi hôi

5

khắm, trong có chứa chất nhầy màu trắng Ở gà trưởng thành, thường có biểu hiện tiêu chảy phân loãng màu xanh, khát nước, mào nhợt nhạt [8]

1.3 Giới thiệu probiotic

Probiotic là các vi sinh vật sống, khi được sử dụng với số lượng đủ sẽ mang lại lợi ích sức khỏe cho vật chủ Việc sử dụng men vi sinh trong gia cầm đã tăng đều đặn trong những năm qua do nhu cầu gia cầm không kháng sinh ngày càng cao

Mười tám loại probiotic thường được sử dụng tại USA đã được đánh giá nghiêm ngặt

về vai trò của probiotic trong hiệu suất và sức khỏe đường ruột của gia cầm trong điều kiện sản xuất thương mại hiện có [11] Kết quả cho thấy bổ sung men vi sinh có thể có tác dụng sau:

 Sửa đổi hệ vi sinh vật đường ruột,

 Kích thích hệ thống miễn dịch,

 Giảm các phản ứng viêm,

 Phòng ngừa sự xâm lấn mầm bệnh,

 Tăng cường về hiệu suất tăng trưởng,

 Thay đổi khả năng tiêu hóa của ileal và toàn bộ hệ số tiêu hóa rõ ràng của đường, và

 Giảm amoniac và urê

Do đó, men vi sinh có thể phục vụ như một sự thay thế tiềm năng cho các chất kích thích tăng trưởng kháng sinh trong sản xuất gia cầm

1.4 Sơ lược về tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên gia cầm

Vì nhu cầu về gà và các sản phẩm về gà ngày càng cao cùng với đó là nhu cầu nâng cao năng suất một cách tự nhiên và “sạch” kháng sinh Từ đó các nghiên cứu về chế phẩm probiotic về gà ngày càng được quan tâm và đẩy mạnh nghiên cứu

14 bài báo về probiotic ở gà được công bố quốc tế

Đặc biệt vào năm 2003, 2004, 2015, có 3 bài báo của Việt Nam công bố về nghiên

cứu probiotic ở gà, Các nghiên cứu về các chủng Lactobacillus và Bacillus subtilis

đều đạt được những kết quả khả quan trong việc tăng cân nặng của gà [13]–[15]

Có 28 giống vi khuẩn được chọn làm đối tượng nghiên cứu probiotic và đã được công

bố quốc tế từ những nghiên cứu trên Mỗi loại giống vi khuẩn đã nghiên cứu có thể

cạnh tranh và tiêu diệt các vi khuẩn cạnh tranh đặc thù, như B subtilis ức chế cạnh tranh với các đối tượng gây bệnh như Lactobacillus curvatus, Campylobacter

jejuni, ; Lactobacillus casei cạnh tranh mạnh mẽ với C jejuni, S enterica,

1 Search query: (probiotic[Title/Abstract]) AND (chicken[Title])

7

Hình 7 Số lượng nghiên cứu các giống vi khuẩn làm chế phẩm probiotic ở gà

Trong đó đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất là Bacilus Subtilis, giống Bacilus được phân lập từ ruột gà Các nghiên cứu cho thấy Bacilus Subtilis đã cải thiện cân

nặng cũng như nâng cao quá trình trao đổi chất ở ruột gà [13], [16]–[18] Ngoài ra

các giống vi khuẩn Lactobacillus cũng được nghiên cứu nhiều (63% các nghiên cứu)

để làm chế phẩm probiotic do đặc tính an toàn, không gây độc của chủng vi khuẩn

8

Chương 2 TÁC NHÂN VI SINH VẬT

2.1 Khái quát về chủng Bacillus Amyloliquefaciens

Giữa những ứng cử viên probiotic khác, họ Bacillus được quan tâm và nghiên cứu

hơn hết nhờ khả năng tạo bào tử, sống sót ở những điều kiện môi trường khắc nghiệt Nhờ đó đó quá trình thu sinh khối sau lên men tương đối dễ dàng hơn., các chủng Bacillus cũng dễ dàng tìm thấy ở đất và nước ao hồ Bên cạnh đó quá trình sinh trường thường không sản sinh chất gây độc cho động vật [19] Nhiều loài Bacillus có khả năng sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn đối kháng với các vi khuẩn gây hại [20], [21]

Các loài Bacillus là vi khuẩn hình que hóa, hóa dị dưỡng, di chuyển bằng lông roi và

không có nang bao bọc Là vi khuẩn kỵ khí và dương tính khi kiểm tra catalase [22]

Mỗi tê bào Bacillus sinh ra một bào tử có thể có hình trụ, hình bầu dục hoặc hình tròn

hoặc hình thận và có khả năng kháng chất khử trùng, chịu nhiệt trong thời gian dài [19]

Chủng Bacillus amyloliquefaciens công bố bởi Priest và Goodfellow vào năm 1987

[23], có khoảng 325 chủng được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau, đa số được phân lập từ mẫu đất (chiếm ~29% tổng mẫu) trên khắp thể giới [24], [25], được công bố nhiều nhất ở châu Á cụ thể là Hàn Quốc, Trung Quốc và Thái Lan là những quốc gia xuất khẩu thịt gà lớn trên thế giới [26]

9

Hình 8 Bản đồ các quốc gia công bố phân lập các chủng B

amyloliquefaciens theo số lượng công bố

B amyloliquefaciens là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc, kích thước 0.7–0.9 x 1.8–3.0 μm

Bào tử hình khối elip kích thước 0.6–0.8 x 1.0–1.4 μm Mức nhiệt độ sống sót từ 15 – 50 oC, phát triển tối ưu ở 30 – 40 oC Có thể phân hủy đường từ casein, elastin, esculin, gelatin, tinh bột và Tween 20, 40, 60 Tuy nhiên không thể phân hủy cellulose

và một số hợp chất chứa nitơ như adenine, guanine, hypoxanthine, pectin, testosterone, tyrosine, urea and xanthine Có thể phân hủy nitrate thành nitrite Citrate được coi là nguồn cacbon chính, sinh trưởng trong nồng độ NaCl từ 5 – 10% Phân giải đường glucose và các carbohydrate tạo thành acid mà không có khí sinh ra [27]

Vi khuẩn B amyloliquefaciens có tốc độ sinh trưởng nhanh, với thời gian thế hệ ~2.5h

ở 37oC Khi gặp điều kiện môi trường bất lợi như cạn kiệt nguồn dinh dưỡng, pH thay đổi mạnh có thể khiến vi khuẩn sinh bào tử, mỗi tế bào vi khuẩn sinh một bào tử để

tự bảo vệ trước điều kiện khắc nghiệt [28] Thời gian tối ưu để thu sinh khối tế bào

là sau 24h

10

Hình 9 Đường cong sinh trưởng của B amyloliquefaciens [29]

2.2 Lợi ích mang lại của Bacillus Amyloliquefaciens

Mặc dù B amyloliquefaciens có nhiều chủng với các tính chất và ứng dụng khác nhau, nhưng về tính an toàn và độc hại có thể coi chủng B amyloliquefaciens là một

chủng an toàn, có thể sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và trong dược phẩm, theo Cục quản lý thực phẩm và thuốc (FDA) Mỹ [30], [31] Bên cạch về độ an toàn, sự

tồn tại trong những điều kiện khắc nghiệt nhờ khả năng tạo bào tử giúp cho B

amyloliquefaciens đóng vai trò quan trọng trong các lĩnh khác nhau như thực phẩm

(tổng hợp enzyme, prbiotic và probiotic), dược phẩm (kháng sinh vi sinh, kháng ung thư, béo phì), nông nghiệp (ngăn ngừa bệnh cây trồng, vật nuôi), môi trường (xử lý chất thải, nhiên liệu sinh học) [32]

Chủng B amyloliquefaciens H57 được phân lập từ cây linh lăng thảo tại trường đại

học Queensland (UQ) tại Úc, đã cho thấy tiềm năng ứng dụng probiotic khi giúp tăng trọng lượng gà và hỗ trờ tiêu hóa nhờ vào các sản phẩm phụ khi hình thành bào tử như α-amylase, cellulase, proteases và metalloproteases giúp tăng hấp thu, cạnh tranh

với Clostrium perfringens, cải thiện tình trạng bệnh ruột hoại tử ở gà [33] Trong nghiên cứu này sẽ sử dụng chủng B amyloliquefaciens H57 để thiết kế quy trình lên

men thu sinh khối probiotic

11

Chương 3 CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT

3.1 Quy trình sản xuất chế phẩm

Nguồn nguyên liệu sử dụng là bắp hạt, vì trong bắp hạt chứa thành phần tinh bột cao khoảng 78% về khối lượng của hạt [34], thành phần dinh dưỡng thích hợp cho thức

ăn của gà cũng như quá trình lên men B amyloliquefaciens H57 Bên cạnh đó ngô có

nguồn cung dồi dào từ các trại bắp Tây Ninh, Kon Tum với sản lượng lớn giá cả phải chăng [35]

Hình 10 Quy trình sản xuất probiotic cho gà từ nguồn nguyên liệu bắp hạt

Nguồn nguyên liệu bắp hạt sau khi được thu mua sẽ được chọn lọc và rửa sạch Bắp

đi qua máy nghiền sẽ thu được hạt bắp và loại bỏ các nông phẩm thừa Sau đó bắp được nấu lên để thu được dịch bắp chứa những tinh chất trong hạt bắp Sau khi lọc

thô và làm mát, dịch bắp được bổ sung chủng giống B amyloliquefaciens H57 đã

được hoạt hóa cùng với phụ gia được phối trộn với dịch bắp trong bồn lên men nhằm tăng sinh sơ cấp giúp khuẩn quen với điều kiện môi trường Sau đó dịch lên men được cho vào bồn lên men thứ cấp nhằm tăng sinh khuẩn Cuối cùng bổ sung môi trường

ít dinh dưỡng để khuẩn sinh bào tử Dịch bào tử được lọc để loại bỏ dịch lên men và thu dịch bào tử, cuối cùng sấy phun để thu được sản phẩm

12

3.2 Chuẩn bị dịch bắp lên men

Bắp được thu mua từ các trang tại bắp ở Tây Ninh, Kon Tum Bắp được rửa sạch, nghiển để dễ dàng thu được tinh chất trong hạt bắp, trong quá trình nghiền phần vỏ dai, cứng không bị nghiền sẽ được tách riêng và loại bỏ, phần vụn bột bắp sau khi nghiền sẽ được ray và sử dụng để trợ sấy sau này

Sau đó hơi nước từ lò hơi khoảng 133oC, 3 bar sẽ được dùng để nấu bắp Nhiệt độ sử dụng 133oC, 3 bar nhằm khấu hao nhiệt thất thoát trên đường ống sao cho nhiệt đến nồi nấu tối thiểu phải 125oC để tiệt trùng và áp suất 3 bar để thỏa điều kiện hơi bão hòa 113oC Hỗn hợp bắp được nấu trong khoảng 3 giờ để thu dịch bắp

Sau khi nấu, phần dịch sẽ được lọc thô bằng lưới lọc 1 mm, phần bã lọc lắng đáy nồi sau khi nấu sẽ được loại bỏ Dịch lọc được đi qua hệ thống làm mát để nhiệt độ dịch xuống khoảng 40 – 50oC, là khoảng giới hạn nhiệt độ của B amyloliquefaciens và để

nguội, trữ trong bồn chứa ở nhiệt độ thường 37oC, sẵn sàng sử dụng

3.3 Lên men và thu bào tử

B amyloliquefaciens H57 được lên men bằng kỹ thuật lên men batch [36] B amyloliquefaciens H57 từ môi trường stock ban đầu được nhân giống ủ qua đêm trên

môi trường agar (khoảng 15 mL trên môi trường thạch nghiên) trong chai McCartney Sau đó thu dịch nổi bằng 500 μL nước cất tiệt trùng và ủ trong bình nuôi cấy tế bào CELLSTAR® với 120 mL thạch agar nghiêng qua đêm ở 30oC Sau đó tiếp tục rửa giải bằng 10 mL nước cất và thu dịch môi trường ủ trong bình Erlenmeyer 1 L chứa

500 mL dịch bắp sẵn sàng cho bước lên men sơ cấp

Cho 500 mL giống đã hoạt hóa vào bồn lên men đã bơm vào 11 L dịch bắp và 9 L nước cất, bổ sung một số chất phụ gia bào gồm 90g K2HPO4, 30g KH2PO4, 5g MgSO4.7H2O, 10g CaCO3, 1g CaCl2, 1g Na2CO3, 1g FeCl2, 1g Na2SO4, 3g MnSO4,

10 g H3BO3 [36] Quá trình lên men sơ cấp thực hiện tại 37oC, pH 7 trong 7 giờ

Bảng 2 Các chất phụ gia trong lên men sơ cấp

13

1 K2HPO4, KH2PO4 Điều chỉnh, ổn định pH ở pH 7

2 MgSO4.7H2O Cung cấp dinh dưỡng, làm săn và

điều vị, thúc đẩy lên men

3 CaCO3 Chất độn giúp tăng độ nhớt

4 CaCl2 Tăng tốc độ quá trình lên men

5 Na2CO3 Điều hòa pH, ổn định, chống đông

6 FeCl2

Bổ trợ khoáng, xử lý tạp chất trong môi trường

7 Na2SO4 Chống khô, chống oxi hóa

Sau quá trình lên men thứ cấp, điều chỉnh pH 10 bằng NaOH và ủ trong 2h nhằm sinh bào tử Sau đó tiệt trùng ở nhiệt độ 125oC trong 30 phút để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng Bào tự được thu bằng cách sử dụng máy lọc ngang dòng chảy liên tục với kích thước màng lọc 2 μm Phần dịch thu được được đem đi sấy phun để làm khô và tăng thời gian bảo quản với chất trợ sấy sử dụng vụn bột bắp ở bước nghiền Bằng cách trộn vụn bột bắp với dịch sinh khối theo tỉ lệ 3:10 sấy phun ở nhiệt độ 200oC trong vòng

8 giờ Kết quả thu được bột sinh khối đem đóng vào bao bì và bảo quản ở kho khô ráo