Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tinh sạch và tác dụng hàn gắn vết thương của protease từ cây thuốc xuân hoa pseuderanthemum palatiferum (ness) radlk

VIẸN ĐẠI HỌC MO HA NỌI KHOA CỐNG NGHỆ SINH HỌC —— Lđ>’ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU HOÀN THIỆN QUY TRÌNH TINH SẠCH VÀ TÁC DỤNG HÀN GẤN VÉT THUONG CỦA PROTEASE TÙ CÂY THUỐC XUÂN HOA PSEUDERAN.

Người hướng dẫn : TS VÔ HOÀI BẢC

Sinh viên thục hiện: HOÀNG THỊ TRANG

HÀ NỘI-2017

Người hướng dẫn : TS VÕ HOÀI BẮC

Sinh viên thực hiện: HOÀNG THỊ TRANG

HÀ NỘI -2017

Đổ hoànthànhluận văn này, tôi xinbày tò lời cảm ơn sâusắc tới TS.

VõHoài Bắc phòngSinh hóa Thực Vật, Viện công nghệ sinhhọc -Viện Hàn lâm Khoa học và Côngnghệ ViệtNam, đãđịnhhướngnghiên cứu, trực tiếp hướng dần, tậntinhgiúp đờ tôi trong quátrìnhhoàn thành luận văn này.Tôi xin chân thành cãmơn PGS.TS Nguyễn Mai Phương,Trưởng phòng Sinh hóa Thực vật, Viện Côngnghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học

và công nghệ Việt Nam, đã tạo điềukiện chophép tôi được thựctập tại đây Tôi xin càm ơn tập thổ cánbộ, nghiên cứu sinh, sinh viên phòng Sinh hóaThực vật, Viện Công nghệ sinhhọc -ViệnHàn lâm Khoa học và Công nghệViệt Namđãgiúp đỡ tôi tận tình trong suốt quátrình làm khóaluận, tôi xin gứilời cám ơn sâu sắc

Tôixin cảm ơn các Thầy, Cô giáo Khoa Côngnghệ sinhhọc - ViệnĐại học MớHàNội,đãluôn quan tâm,tạo điềukiện thuậnlợicho tôi trongquá trình học tập và hoàn thiện luận văntốt nghiệp

Cuối cùng, tôi xin gửi lờicảm ơn chân thành tới giađình, bạn bèđã luôn động viên giúp đỡ tôi trongsuốtthời gian học tập

Tôixin chân thànhcảmơn!

Hà nội, ngày ỉ 2 tháng 5 năm 2017

Sinh viên

Hoàng Thị Trang

Nội dung Trang

LỜI CẢM ƠN

MỤC LỤC

DANH MỤC NHỮNG TÙ VIẾT TẤT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ so ĐỒ

MỞ ĐẦU 1

PHẦN : TÓNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Mô tả thực vật cây Xuân Hoa p palatiferum 3

1.2 Những nghiên cứu về cây Xuân Hoa p palatiferutn 4

1.2.1 Kinh nghiệm dângian sứ dụnglá câyXuân Hoa 4

1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóahọccủalácây Xuân Hoa 5

1.2.3 Nghiên cứu về dượctính 6

1.3 Dịnh nghĩa và phân loại protease 9

1.3.1 Địnhnghĩa 9

1.3.2 Phân loại 9

1.4 ủ ng dụng của protease 10

1.5 Những nghiên cứu về protease từ thực vật và từ cây Xuân Hoa p palatiferum 13

PHẦN II : PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 15

2.1 Nguyên vật liệu 15

2.1.1 Mầuthí nghiệm 15

2.1.2 Hóa chất sứ dụng 15

2.1.3 Máy móc, thiết bị 15

2.2 Phuong pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Phươngpháp chiết rút protease từ lá Xuân Hoa p.palatiferum. 15 2.2.2 Xácđịnhhoạt độ proteasetheophươngpháp Ansoncãitiến.16

2.2.4 Phương pháp tinh sạchenzyme 19

2.2.5 Điện di protein 21

2.2.6 Phươngphápnghiên cứutính chất cùa protease 23

2.2.7 Đánh giá tácdụng làm lành vet thươngtrêntế bào nguyênsợi da người theo phương pháp củaLaing 25

2.2.8 Phươngphápthống kê 26

PHẦN III: KÉT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Tinh sạch protease từ lá cây Xuân Hoa p palatiferum 21

3.2 Điện di biến tính và không biến tính protein 32

3.3 Ảnh hưởng của một số chất ức chế đặc hiệu protease 34

3.3.1 Ánh hưởng của PMSF lên hoạt tính protease 34

3.3.2 Anh hưởng của PCMBlên hoạt tínhprotease 34

3.3.3 Ánh hưởng củaHgCl2lên hoạt tínhprotease 35

3.3.4 Anh hướng cúaO-phenanthrolinelên hoạttính protease 35

3.4 Khả năng thủy phân của protease trên các CO ’ chất khác nhau 36

3.5 Độ bền của protease 37

3.5.1 Độ bền với nhiệt 37

3.5.2 Độ bềnvới pH 38

3.5.3 Ănh hường của cácionkim loại lên hoạt tính protease 39

3.6 Đánh giá tác dụng làm lành vết thương trên tế bào nguyên sợi da người 39 PHÀN IV : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 42

TÀI LIỆU THAM KHẢO 43

PHỤ LỤC 49

Kí hiệu: Tênđầy đủ

BSA:Bovine Seurum Albumin

DMSO: Dimethyl Sulfoxide

EDTA: Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

HPLC: HighPerformance Liquid ChromatographyOD:OpticalDensity

SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide GelElectrophoresis

TCA:Tricloacetic Acid

UV: UltraViolet

PCMB: P-chloro-mercuribenzoicacid

PMSF: Phenylmethanesulfonylfluoride

Bảng Trang

Bảng2.1 Xác định đường cong chuẩn cúatyrosine 17

Bàng 2.2 Xác định đường cong chuấn protein 19

Bảng 2.3: Côngthức pha gel tách (12%) 22

Bàng 2.4: Công thức pha gel cô(5%) 22

Bảng 3.1: Kiêm tra hoạt tính protease cứa từngphân đoạnqua cột Sephadex G-100 29

Báng 3.2: Kiếm tra hoạt tính protease cúa từngphânđoạn qua cột DEAE- cellulose 31

Báng 3.3: Tóm tắt quá trình tinh sạch protease từ lá cây Xuân Hoa p.palatiferum 32

Bảng 3.4: Hoạt tính của protease p palatiferum trên các cơ chất khác nhau 36

Bàng 3.5: Ànhhưởngcủa các ion kim loại lên hoạt tínhcủap palatiferum protease 39

Hình Trang

Hình1.1: CâyXuân Hoa p palatiferum 3

Hình 3.1:Sơđồ làm sạchprotease từ lácâyXuânHoa p palatiferum 27

Hình 3.2: Đồ thị biểu diễn protein protease từ lá cây Xuân Hoasau khi qua cộtlọc gelSephadex G-100 29

Hình 3.3: Đồ thị biếudiễn proteinprotease từ lácây XuânHoasau khi qua cột trao đối ion DEAE- cellulose 30

Hình 3.4: Điện diprotein các phân đoạnsau khi quacột sắc ký trao đổi ion DEAE- cellulose trên gcl polyacrylamid 12% 33

Hình 3.5: Phát hiện băng hoạt tính protease từ các phânđoạnsau khi quacột sắc ký trao đồi ion DEAE- cellulose trên gel polyacrylamid 12.5% 33

Hình3.6:Anh hưởng cũa PMSF lên hoạt tínhprotease 34

Hình3.7: Ảnh hưởng của PCMB lên hoạttính protease 34

Hình 3.8:Ánh hưởng của HgC12 lên hoạt tính protease 35

Hình 3.9: Ảnh hưởng cùaO-phenanthroline lên hoạt tính protease 35

Hình3.10: Độ bềnnhiệtcủa protease 37

Hình 3.11: Độ bền với pH của protease 38

Hình3.12: Hình ảnh trên kính hiển vi sựhàngắn vết rạch trên nguyên bào sợi cùaprotease 40

Hình 3.13:Mứcđộ hàngắn vếtrạch củaproteasetrênnguyên bào sợi 41

MỞ ĐẦU

❖ Đặt vấn đề

Trongnhữngnăm gần đây, việc ứng dụngprotease trong Y học đang được các nhà khoa học trên thếgiới rất quan tâm Các nghiên cứu cho thấyproteasecóhiệu quả khángviêm,tiêu cáccụcmáu đông, làm mau lành vếtthương, chống tắc nghẽn mạchmáu, chống ung thư,điềuhòa miễn dịch Các nghiên cứu trước đây của chúng tôi cho thấy cây Xuân Hoa

Pseuderanthemum palatiferum (Ness ) Radik chứahàm lượng lớn protease.Cây Xuân Hoa p palatiferum ( Ness ) Radik thuộc họ Ôrô Acanthaccacđược dùng trong dân gian đễ chừa nhiềubệnh Trongnhữngnăm gần đây, nhiềunhà khoahọcViệt Namvàthếgiớiđã xác minh đượcmột số tácdụng sinh học cùacâythuốc này như: kháng khuấn, kháng nấm, tác dụng chống oxyhóa,giảm huyết áp, hạ đườnghuyết, ức chế acetylcholinesterase Tuynhiên,việcnghiêncứu đặc tính và tác dụngdược lý chi tập trungvào nhóm chất thứ cấp vàvẫncòn nhiều côngdụng khác được lưu truyền trong dân gian của câyXuân Hoa p palatiferum chưa được chứng minh Cho đến nay chưa có nghiên cứu nào về tác dụng hàn gắn vết thương cúa protease mới từ câythuốc này

Do vậy, chúng tôi đã đi tiếnhành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tinh sạch và tác dụng hàn gắn vết thương của protease từ cây thuốc Xuân Hoa Pseuderanthemum palatiferum (Ness)

Radik ”.

Đe tài chúng tôi nghiên cứusẽ góp phần bổ sung những thông tinkhoahọc mới về câythuốc quý cúaViệtNam

❖ Mục tiêu nghiên cứu của đề tài:

- Hoàn thiện quy trình tinh sạch protease từ lá cây Xuân Hoap.

palatiferum

- Xác định được protease mới từ cây thuốc này thuộc nhóm protease nào.

- Xác định tácdụng hàn gắn vếtthương cùa protease tinh sạch từcâythuốc này

❖ Nội dung chính của đề tài:

- Tinh sạch protease từ cây thuốc Xuân Hoa p palatiferum (Ness)Radik đạt hiệu quả cao

- Xácđịnh ành hưởng của các chấtức chế đặc hiệu lên hoạt tính protease tinh sạch

- Đánh giá độbền cùaprotease với nhiệt độ, pH và các ion kimloại

- Đánh giá khánăng thúyphân cúa protease trên một số cơ chất khác nhau

- Đánh giátác dụng hàn gắn vết thươngcùaprotease trên invitro

PHẦN I - TỐNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Mô tả thực vật cây Xuân Hoa p palatiferum (Ness)Radik.

CâyXuân Hoa thuộc họ Acanthaceae, còncótên là cây Tu Linh, câyNhậtNguyệt hay cây ConKhi, cây Hoàn Ngọc, câyThần dưỡng sinh,cây Trắc Mã, cây Điền Tích, cây Lan Điều Tênkhoa học làPseuderanthemum Palatiferutn

(Nccs) Radlk

Họ 0 rô(Acanthaceae) là mộthọthực vậthailámầm trong thựcvật có hoa, chứa khoảng250 chi và khoảng 2.700 loài (Henrik, 1988) Theo Phạm Hoàng Hộ, chi Pseuderanthemiưn có khoáng 196 loài Ớ Việt Nam, chi

Pseuderanthenuimcó9 loàivà2 thứ (PhạmHoàng Hộ, 2000)

Cây XuânHoa Pseuderanthemum palatiferum(Nees)Radik có thế mọccao từ l-2msống lâu năm, thân cây xanh màu tím lục, khi già chuyến thànhmàunâu, phân ra nhiều nhánh,lá mọc đối diện có hình mũi mác, dài từ 12-15cm,rộng 3,5-5cm, nếp lá nguyên, cuống lá dài l-2,5cm, cụm hoa dài 10-16cm Hoamọc ở kẽlá hoặc ở đầucành Hoa lưỡngtính,không đều, màutrắng

Phân bố: Cây Xuân Hoamọchoang ớ nhiều nơi, được coilàcây thuốc quí cóuy tín trong dân gian ở các tỉnhthànhmiền Bắc, nhất làthúđô Hà Nội

Hình 1.1: Cây Xuân Hoa p palatiferum

1.2 Những nghiên cứu về cây Xuân Hoa p palatiferum

1.2.1 Kinh nghiệm dân gian sử dụng lá cây Xuân Hoa

Năm 2005, bác sĩ Xuân Lục đã đưa ra một số bài thuốc từ kinh nghiệm dângian đã sứ dụnglácây Xuân Hoa (Xuân Lục, 2005):

• Chừabệnh về đường tiêu hóa(đi lỏng,rốiloạntiêu hóa, táo bón,đau bụngkhông rõnguyênnhân):ăn từ7-9lá,khoảng 2-3 lần/ngày cho đến khi khỏi, có thể nấu canh nhạt đế ăn

• Bệnh kèm theo chảy máu (chảy máu dạ dày, đường ruột,đái ramáu, phân ramáu kểcả đái buốt,đáirắt ): ăn lá khiđói hoặc sắc nướclá đặcđể uống, có the nấu canh độ một bát nhó Ăn 1 -5 lần, máu sẽcầm, nênăn ngày 2lần

• Cácbệnhung thưthời kì phát bệnh: ăn lá xong, cơn đau giảm dần, người tinhtáo, ăn ngủ tốt, có cảm giác như khỏibệnh.Thử nghiệm qua mộtsố bệnhung thư dạ dày, gan, phối đều thấy có diễn biến tốt Lượngládùng thườngxuyên theomức độ đau, thông thường ngày 2lần, mồi lần 3-7 lá, tùy theo hiệu quá giảm đau

• Các bệnh u ở phổi,tiền liệttuyến:liều dùng như trên, sau 1 tuầncáctriệuchứng giảm hắn, bệnh nhân ăn ngútốt.Riêng u xơtiền liệt tuyến, ănvào cuốitháng, khoảng3 tháng liêntục

• Cácbệnh về gan (xơ gan cốtrướng,viêmgan ): ăn látươi như trên ngày2 lầnkhi đói Bột lá khô cùng với bột Tam thất theo ti lệ 1:1 là thuốc trị

xơgan đặchiệu

• Bệnh về thận (viêm thậncấp hoặc mãn, suy thận, các hiện tượng nước đái đục,đái ra máu):điều trị như trên sau 1 tuần Ăn 1 lần/ngày, nhưng nếu nước giải chí trong được nứa ngày thi tăng lên 2 lần/ngày Trong thời gian nứa tháng, các triệuchứngbệnh giảm rỗ rệt

• Chừa viêm loét (loét dạ dày,hànhtá tràng,đạitràng, trĩ nội ngoại,trực tràng ): ăn lá tươi khi đói (tốt nhất là vào buồi sáng) Với các vết

thương thuộc phạm vidạ dày, chicần ăntrong 1 mần, tránh uống rượumạnh.Khi chừa vết loét thuộcphần ruột, liều lượngcầnnhiềuhơntùy theo nặng,nhẹ.

• Điều chỉnh huyết áp, ổn định thần kinh: khi biến đổihuyết áp (cao hay thấp) theo liều lượng trên, ăn xong chợpmắt nghỉ trong thời gian ngắn,huyếtáp sẽ trởlại bìnhthường, khi lên cơn rối loạn thần kinh thực vật,tùy theo mức độ đế định liều lượng,có thểăn vào buối sáng giúp cơ the ồn địnhtrong ngày và đềphòngkhi thời tiết thay đồi đột ngột

• Chữa về chấnthương (cácloại chấn thương, đặc biệt là chấn thương

sọnão, va đập,gãy dập xươnghay bắpthịt): lá thuốc có tác dụng cầm máu, khôi phục các môcơbị dập,khángviêm nhiễm,lálàm cả thuốc đắp và thuốc uống Với vết thươngkín, cóthế nhai đểđắp, vết thươnghở thì nên giã đểđắp

• Chữacảmcúm: nếukéotheo rối loạn tiêu hóa, đau đầu,mệt mỏi,nhiệt độcao, nênănlá cách 2 giờ, cơn sốtnhanh chóng hạ đồng thời rối loạntiêu hóa cũngkhòi Sau cơn sốt, nên ăn cháo cólá thuốc trộn vào giúp cho ngườibệnh mau chóng trớ lạibình thường

• Khôi phục sức khỏe: khi mệt mòi toàn thânhoặc cầnnângcao sứcchịuđựng cườngđộ cao, nên ăn 5-7 látrước nửa giờ Trè con đi lỏng nôn lấy

từ1-2 lá giã lấynướcchouống

1.2.2 Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá cây Xuân Hoa

Nguyễn Thị Minh Thu và cộng sựđãcô lậpđược các hợp chatphytol, P-sitosterol, hồn hợp hai đồngphân stigmasterolvàporiferastcrol, P-sitosterol 3-P-ơ-D-glucopyranosidc từ lácây Xuân Hoa(NguyễnThị Minh Thu, 2000).Phan Minh Giang và cộng sự đã cô lập từ lá khô cây Xuân Hoahợp chất 1-pcntacosanol, palmitic acid, P-sitostcrol, stigmastcrol, hồn hợp p~ sitosterol 3-ơ-p-D-glucopyranosidevà stigmasterol 3-ơ-p-D-glucopyranoside

và apigenin 7-ơ-P-D-glucopyranoside (Phan MinhGiang, 2003)

NguyềnVăn Hùng và cộng sự đã cô lập từ lá cây Xuân Hoa cáchợpchất 1-triacotanol, hexadecanoate glycerol, salicylic acid và palmitic acid (Nguyễn VănHùng, 2004).

Mai ĐìnhTrịvàcác cộngsự đã cô lập các hợp chất từ lá cây Xuân Hoa baogồm: p-amyrin,olcanolic, p-sitostcrol, stigmastcrol, hồnhọp họpP-sitosterol 3-ơ-p-D-glucopyranoside vàstigmasterol 3-O-p-D-glucopyranoside(Mai ĐìnhTrị, 2005)

TrầnKim Thu Liễu đã cô lập từ lácây Xuân Hoacác hợp chất squalene, dotriacontane, phytol,palmiticacid,P-sitosterol, stigmasterol, hỗnhợp P-sitostcrol3-ơ-P-D-glucopyranosidc,24-mcthylcnccycỉoartanolvà loliolide(Trần Kim Thu Liễu,2007)

Các nghiên cứutrước đây của chúng tôichỉra rằng lá Xuân Hoachứađầyđùcác acidamin thiết yếuvới hàm lượng tống số khá cao, đặc biệthàmlượng isoleucin, leucin và valinratcao, không phát hiệncácnguyên tố kim loại nặng như Cd, Pd, As,Cr (Võ Hoài Bắc, 2003).Chúng tôi cũng đãpháthiện hàm lượng caoprotease, polysaccharide từ lácây này(Lê Lan Oanh và

Võ Hoài Bắc, 1998, 1999)

ỉ.2.3 Nghiên cứu về dược tính

1.2.3.1 Nghiên cứu in vitro

a) Hoạt tính kháng khuấn và kháng nấm

Trần Công Khánh và cộng sự đã thử tác dụng khángvi sinh vật kiếm định (trongổng nghiệm)cúa caođặcchiết từlá cây XuânHoa, kết quảcho thấy cao đặc có tác dụng kháng vi khuẩn Gram âm (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa), kháng vi khuân Gram dương (Bacillus subtilis,

Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes), nấm moc (Aspergillus

niger, Fusarium oxysporum, Pyricuỉaria oryzae, Rhezoctonia solanii), nấmmen(Saccharomyces cerevisiae, Candidaalbicans)(TrầnCôngKhánh,1998)Năm2005, Phan Minh Giang vàcộng sự đãkháosátsơbộ hoạt tính khángkhuẩn và khángnấmcùa cao ethyl acetatevà/7-butanol(ở nồng độ 10

mg/ml) từ lá câyXuân Hoa,cáckết quả cho thấy cả hailoại cao trích đều thểhiện khả năng kháng các chùng vi khuẩn Gram dương (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus), Gram âm (Escherichia coli) và vi nấm (Candida

albicans, Candida stellatoides), trong đó caotrích ethyl acetate có hoạt tínhtốt hơn cao trích M-butanol Kết quảcũng cho thấy cao trích ethyl acetate kháng tốt các chúngSalmonella typhi 158, Shigella flexneri vàEscherichia coll, đâylà những vi khuẩn gây bệnhvề đườngruột, tiêu cháy, viêm ruột, lị(Phan Minh Giang, 2005)

b) Hoạt tínhkháng oxy hóa

Phan Minh Giang vàcộng sự đãnghiên cứu hoạttính kháng oxy hóacùa các loạicao ethyl acetatevà tt-butanol từ lá cây Xuân Hoa bằngphương pháp nghiên cứu ảnh hướng của các loại cao này lên độ hoạt động của enzyme peroxydase trongmáu.Ket quá cho thấy cá hai loại cao ethyl acetate

và /7-butanol từ lá câyđều có tác dụng kháng oxy hóa (Phan Minh Giang, 2005)

1.2.3.2 Nghiên cứu in vivo về dược tỉnh

Peerawit vàcộngsự đã thử nghiệm độc tính cùacao trích ethanol 80%

từ lá cây XuânHoa cả in vitro lẫnin vivo.Ket quả thử nghiệm in vitro trên tế bào thận khi xanh châu Phi bằng phưong pháp GFP (green fluorescent protein) cho thấy mẫuthứkhông độc ở nồngđộ 50 pg/ml, liềucao nhất có thểpha được Với thừ nghiệm in vivo, thử nghiệm với cao trích ethanol 80%được thực hiện trên chuột trường thành qua đường uống, với một liều duynhấtở các nồngđộkhác nhau, 500,1000, 1500 và 2000 mg mầu cao trích/kgtrọng lượng chuột Ket quá cho thấy chuộtkhông có dấu hiệungộ độc trong

24 giờ đầu và không chếtqua 14 ngày thứ nghiệm,không có sựkhác biệtvề thế trọng giữa nhóm chuột thử nghiệm và nhóm chuột đối chứng Với thử nghiệm in vivotrên chuột qua đườnguống, mỗi ngày, trong 14 ngày, ớ các nồng độ khác nhau, 250, 500, 1000 mg mẫu cao trích/kg trọng lượng chuột,không có liều nào gây độc cho chuột Các trị số hóa lý như creatinine,triglyceride,cholesterol tong,protein tong vàalbumin không có sựkhác biệt giữa nhóm chuột thừ nghiệm và nhóm chuột đối chứng (Peerawit Padee,2009)

b) Tác dụngbảo vềtế bào gan

NguyễnThị MinhThu đã thứ tác dụngbáo vệ tếbào gan của cao đặctoàn phần lá câyXuân Hoatrên chuột nhắt trắng Môhìnhgây ngộ độc gan bằngtetrachloromethane Kết quá như sau: liềugâyđộc gan 1 ml CCl4/kgthể trọng, hàm lượng men gan có giảmnhưng chưa đáng kể,có dấu hiệu binh phụctếbàogan Ớliều gâyđộc 0,5 ml cciykg the trọng,hàm lượng men gan

có giảm nhưngkhôngđáng kể, códấu hiệu bìnhphục tế bàogan (Nguyễn Thị Minh Thu, 1999)

c) Tác dụng trị tiêu chây

Huỳnh Kim Diệuvà cộng sự đãxácđịnhhiệu quả cúa bột láXuân Hoa trong trị bệnh tiêu cháy heo con theo mẹ,so sánh với hai chế phẩm Coli- norgent và Cotrimxazol.Kết quá 3 ngày điều trịcho thấy bột lá khôcó tí lệ

khỏi bệnh cao hơn và ti lệtái phát thấp hơnso với kháng sinh Coli-norgent(90,48%/9,52%) vàCotrimxazol (83,33%/14,29% (Huỳnh Kim Diệu,2006) d) Hiệu quá ức chế enzyme acetylcholinesterase

Wararut Buncharoen và cộng sự đã xác định hiệu quả ức chếenzyme acetylcholinesterasecủa dịch tríchnước lá cây ờcác liều 0,3;0,7và Ig/kg thểtrọng trong 30 ngày Hiệu quảức chế đượcđánh giádựatrên te bàomáu đõ,huyếtthanh vànão chuột Kếtquảcho thấy dịch trích có thể làm giảm sự tốnghợp enzyme acetylcholinesterase trong não chuột Hiệu quả ứcchế enzyme acetylcholinesterasecúa dịch trích nước lá cây Xuân Hoađãcho thấy tiềmnăng chữa bệnh Alzheimer củacâythuốcnày Waran.it Buncharocn, 2010)

1.3 Định nghĩa và phân loại protease

1.3 ỉ Định nghĩa

Protease là enzymethuộc nhómhydrolase,xúc tác cho quá trinh thúyphân liên kết peptid (-CO - NH-) của phântử proteinvàpeptidthành các acid amin tự do, một ítprotein ngắn,pepton

1.3.2 Phân loại

Protease được chia thành 2loại: endopeptidase và exopeptidase

• Dựa vàovị trí tácđộng trên mạchpolypeptide, exopeptidase được phânchia thành 2 loại:

- Aminopeptidase: xúc tác thúy phân liên kết peptid ở đầu Ntự do cúa chuỗi polypeptideđe giải phóng ramột amino acid, một dipcptidchoặcmộttripeptide

- Carboxypcptidase: xúc tác thủyphân liên kết peptide ở đầuc cùa chuỗi polypeptide và giàiphóngra một aminoacid hoặcmột dipcptide

• Dựa vào động học cùa cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành 4 nhóm sau(LêNgọcTú, 2010):

- Serin protease: là những protease chưa nhóm -OH của gốc serine trong trung tâm hoạt độngvà có vai trò đặc biệt quan trọng đốivới hoạt động xúc tác của enzyme Nhỏm này bao gồm 2 nhóm nhỏ: chymotrypsin và

subtilisin Nhóm chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật nhưchymotrypsin, trypsin, elastase Nhóm subtilisinbao gồm hailoại enzymevikhuấn như subtilisin Carlsberg Các serine thường hoạt động mạnh ớ vùng kiềm tính và thể hiện tínhđặc hiệu cơ chất tương đối rộng.

- Cysteine protease:Các proteinchứanhóm -SH trong trungtâmhoạtđộng Cystein protease bao gồm cácprotease thực vật như: papain,bromelin,một vài protein động vật và protease ký sinh trùng Các cystcin protease thường hoạt động ớ vùngpH trungtính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng

- Aspartic protease: Hầu hết các asparticprotease thuộc nhóm pepsin.Nhómpepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, rennin Aspartic protease cóchứanhómcacboxyl trongtrung tâm hoạtđộngvà thường hoạtđộng mạnhởpHtrungtính

- Metallo protease:Là nhóm protease được tìm thấy ớ vi khuấn, nấmmốc cũng nhưcác vi sinhvật bậccaohơn Cácprotease thường hoạt động ở

pH trungtính và hoạt độ giám mạnh dưới tác dụngcúa EDTA

Ngoài ra, protease còn đượcphân loại theo cách đơn giản dựa vào tính chất xúc tác phản ứng ở pH: chia thành3 nhóm:

- Protease acid: pH 2-4có nhiều ở tếbào động vật, nấm men,nhưng ítthấy ở vikhuần

- Protease tiling tính: có pH 7-8 như papain, bromelin, ficin Nhữngproteasenàylàenzyme ổn định với nhiệt độ nhất

- Protease kiềm có pH 9-11

1.4 ủng dụng cua protease (ĐặngThị Thu, 2012)

• Trong công nghiệp chế biến thịt' Protease được díing làm mềm thịtnhờ sự thủy phân 1 phần proteintrong thịt,làm cho thịt cóđộ mềm thíchhợp

và cóvị tốthơn.Protease được sử dụng đếlàmmềm thịt vàtăng hương vị thịt, (ngâm thịtvào dinh dưỡng protease ởpH vànhiệt độxácđịnh, phương pháp này phổ biến và thuận lợi nhất; Tẩm hồn hợp làm mềm thịt (enzyme, muối, bộtngọt) Tiêm dung dịchenzyme vào thịt; tiêm dung dịchenzyme vào

con vật trước khi giết mo) Sử dụng protease đe sán xuất dịch đạm: từ

Streptomyces fradiaetáchđượcchế phẩmkeratineza thuỷphânđượckeratin rất

có giá trịđếsán xuất dịch đạm từ da, lông vũ Nếu dùngaxit để thuýphânsẽmất

đi hoàn toàn các axit amin chứa lưu huỳnh, nếu dùngkiềmđểthuý phân sẽ bị raxcmic hoá(chuyểndạngL sang D làm giâm giá trị sinh họccủa axit amin).Đổthuýphânsâusắc và triệt de protein(trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm

y tế) cần dùng cácprotease có tính đặc hiệu cao và tác dụngrộng, muốnvậy người ta thườngdùng phối họp cã 3 loạiprotease của 3 loài: vi khuấn, nấmmốc, thực vật với tý lệ tổng cộng 1- 2% khối lượngprotein cần thuý phân Ưu điếm cúa việcthuỷ phân protease bởi enzyme làbáotoàn được vitamin cúa nguyên liệu, không tạora các sán phẩm phụ, không làm sẫm màu dịchthuỷ phân

• Trong chế biến thuỳ sản' Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thường thờigian chế biến thường làdài nhất, hiệu suấtthuỷ phân(độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén,nguyênliệucá Nênhiệnnay quytrinh sàn xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện trongđó

sửdụngchế phẩmenzyme thực vật (bromelain và papain) và vi sinh vật đếrút ngắn thờigian làmvà cảithiệnhương vị củanước mắm Tuy nhiên vần còn một số tồn tại cần phải hoàn thiện thêmvề côngnghệ

• Trong sán xuất bia: Chế phẩm proteasecóý nghĩa quan trọng trongviệc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc ProteasecủaA oryzae

đượcdùng đê thúyphânprotein trong hạtngũcốc, tạo điều kiện xứ lý bia tốt hơn

• Trong công nghiệp sữa: Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuấtphomatnhờhoạt tính làm đông tụ sữa của chúng Protease từmột số vi sinh vật như/í Candidas , p roquerti, B mesentericus được dùng trong sản xuất pho mát Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy protease làm giâmthờigiantrộn,tăng độ deo và làm nhuyễn bột, tạođộ xốp

và nở tốt hơn

• Trong công nghệ thuộc da:Quá trình chế biến da bao gồm 1 số côngđoạn như: ngâm ướt, tấy lông, làm mềm da hoặc thuộc da.Thông thường, các phươngphápthuộc dathường dùng các hóachấtđộchại như natri sulfide,làm ảnh hưởng đến môi trường khi nước thải nhà máy thảira sông Việcsứdụng enzyme đế thay thế các hóa chất đã rất thành côngtrongviệc nângcaochất lượng da và làm giảm ô nhiễm môi trường Protein là một thành phần cơbán cùa davà lông nônprotease đã được sửdụng đế thúy phân 1 số thànhphần phi collagen cũa da và loại bỏ các protein phi fibrin như albumin, globulin trong quá trìnhthuộc da rất có hiệu quá.

• Trong công nghệ tơ tằm: Làmbóngvàtáchrời các sợi tơ

• Trong hương mỹ phấrn: Người ta trộn mộtlượng nhở proteasevào kemxoa,kem cạorâu, dầugội, dầu bôi tóc,kemmặt để làm mềm da,tẩy tebào chết

• Trong sán xuất chất tẩy rứa: Protease là một trongnhững thành phần không thethiếu trong tất cá cácloại chất tay rửa(chấttay rứa dùng tronggiađình,chất làm sạch kính, kem đánh răng ).Việcứng dụng enzyme vào các chấttấyrứa nhiều nhất là trong bộtgiặt Cácprotease thích hợp đếbố sungvàochất tẩy rửa thườngcó tínhđặc hiệu cơ chất rộngđể dễdàng loại bỏ các vết bấn do thức ăn,vết máu, sữa và các chất docơ the ngườitiếtra Proteasedùngtrong chất tẩy rứa phái hoạt động tốt trong điều kiện nhiệt độvàpHcaocũng như phải thích hợp vớicác tác nhân oxy hóa vàcác chất kìm hãm cótrong thànhphầncủa chấttayrửa Subtilisin đáp ứngđược đầyđú những yêu cầu khắt khetrên Hiện nay, tất cá các proteasebổ sung vào chất tẩy dùng trênthịtrường đều là serineprotease được sán xuất từcácchủngBacillus và chủ

yếu là R.subtilis Trên thế giới, mồi năm người ta đã sứ dụng 89% enzyme này cho ngành công nghiệp tấy rửa

• Trong Y học:

- Protease được dùngđe sản xuất môi trườngdinhdưỡng nuôivi sinhvật,sản xuất huyết thanhmiễn dịch

- Dùngđê phân húycác cụcmáu đông trong cơ thê, chữa bệnh nghẽntĩnhmạch

- Sứ dụng các chấthoạt hóa và kìm hãmproteaseđế điều trị các bệnhđặctrưng

- Sàn xuấtthuốclàm tăng khả năng tiêu hóa protein cho những người

bị tiêu hóa kém

- Sừdụnglàmthuốc kháng viêm, chừa lành vết thương

• Trong nông nghiệp'. Protease được dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu đạm bổsungvàothức ăn củalợn và gia cầm

• Trong kỹ nghệ phim ánh' Protease từ vi khuẩn được dùng đếtái sinh các nguyên liệu như phimđiện ảnh,phim Rơnghen Protease phân giải và hòa tanlớp nhũ tương gelatintrênphimvà giấy ánh, dođó cóthể làm sạchvà

sứdụngtrớlạicác loạiphim và giấy ánh quý

1.5 Nghiên cứu về protease từ thực vật và từ cây Xuân Hoa

p palatiferum.

Thực vật rất giàu protease Năm 1900, Loew và cộng sự đã tách protease từ cây thuốc lá (Loew, 1900) Greenberg và Winnick đã xácđịnhđược một sốthực vật chứa protease như: bromelain thuđược từ quá, chồi dứa,

vỏ dứa Ficin thu được từ nhựa cây cọ (Ficus carica) (Greenberg, 1945).Nhiều protease được tìm thấy trong vách tếbào thực vật (Lamport, 1982).Cho đến nay,cácnhàkhoahọc trênthế giới vần tiếp tục nghiên cứu vàphát hiện được các protease mớitừ thực vật nhưprotease táchtừ cây Jatropha curcas (Indranil, 2011)

Gần đây, các protease từ thực vật cũng được nghiên cứu ứng dụng trongY học đố điều trị viêm, làm tancác cục máuđông, giảm đau,chống oxyhóa,ức chế sự phát triến của các tế bào ung thư Protease có the giámviêmbởi giảm tiết các cytokine tiền viêm, quétcác gốc oxy hóa tự do,điều hòa cácphân tứ bámdính (Veremeenko,2000; Huang, 2008) Bromelain có khá năng kháng viêmgiámcác edema trong tônthương (Netti, 1972)và kháng các tế

bào ung thư (Garbin, 1994;Grabowska, 1997; Rabelo, 2004) Protease tách từcây Jatropha curcas và câyPlumeria rubra Liuncó hiệuquả khángviêm và làmlành vết thương (Indranilc,201 ỉ; Nath, 1992).

Lê Lan Oanh và Vô Hoài Bắc (1999) đã phát hiện hàm lượng caoproteasetừlá cây Xuân Hoa và đã tiến hànhtách chiết chúng.Chođến naytrênthếgiớivà ớ Việt Namchưa có một nghiên cứu có hệ thống về đặc tính sinhhóa và tác dụng làm lànhvết thươngcủa protease từ cây Xuân Hoa p palatiferum Việc nghiên cứu tính chất sinhhoácũng như những ứng dụng cùa protease từ câythuốc này làrất cần thiết, góp phầnbổ sungnhữngthôngtinkhoa học mớivề cây thuốc quýcủa Việt Nam

PHÀN II - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu

2.1 Nguyên vật liệu

2.1.1 Mau thí nghiệm

Lá cây Xuân Hoa thu hái ở Hà Nội,được loại bỏnhững lá sâu, lá héo

úa, lá nát Sau đó được mang vềphòng thí nghiệmrửa sạch, cắt bỏcuống

và lau khô nhẹ nhàng Lá được cân vàbọctrongcác túi nilonvà bảo quản trong -20 "C cho thí nghiệm tách chiết

2.1.2 Hóa chất sử dụng

Các hóachất phân tích đều đạtđộ tinh khiết, chú yếu làcác hóa chấtnhập ngoại của các hãng Sigma, Invitrogen, Merk, Prolabo, Bio-Canada:casein, Folin, BSA (albumin huyết thanh bò), TCA (tricloacctic), tyrosine, đệm phosphate Sorensen, cồn tuyệt đối cúa Việt Nam (99,5%), gelcanxiphosphat, dung dịch gốc acrylamit 30%, đệm tris-HCl, sodium dodecylsulphat 10%, comasie Brilliant blue,temed Cột lọcgel Sephadex G-100, cột trao đổi ionDEAE-cellulose đượcmua từ hãngGE healthcare

2.1.3 Máy móc, thiết bị

Thiết bị, máymóc sử dụng trong nghiên cứu nàycó độ chính xác caocúa ViệnCông nghệSinh học, Viện Hóa học-ViệnKhoa học và CôngnghệViệt Nam như: máy quang phouv 1601 (Visible Spectrophotometer 1601),máy quang phổ uv 1601 secom, máy đo pH Corning 215 (Anh), cân điện Shimazu(Nhật Bàn), cân kỳ thuậtCaltcx (Tây Đức), box Laminar (Pháp),tủ sấy (Anh),nồi khứ trùng (Đài Loan,Nhật Bán), máyly tâm eppendorf (Đức),

bể điều nhiệt Mcmmcr(Mỹ), máy sắcký lỏng cao áp HPLC (Đức), máy điệndi

2.2 Phuong pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp chiết rút protease từ lá Xuân Hoa

LáXuân Hoa tươi báoquàn ở -20°C trong 24 giờ được nghiền mịnbằng cối có bố sung thêm cát thúy tinh, sau đó chiết bằng đệm 0,05M

phosphast Sorensen, pH = 7,6; EDTA 0,00IM; MgCl2 6H2O 0,0IM;NaCl2M theotý lệ 1:7 (trọnglượng/ thểtích),khuấy nhẹ bằngmáy khuấy từ trongvòng 30 phút, ly tâm 8000 vòng/ phút trong15phút ớ4 °C thu lấy dịch trong.

2.2.2 Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến

* Nguyên lý cơ hân của phương pháp

Cho enzym protease tác dụng với cơ chat casein, sau đó kết tủaprotein dư thừa bằng TCA, xác định sản phẩm tạo thànhbằngphản ứngmàu với thuốc thử Folin Một đơnvị hoạt độ là lượng enzyme trongđiềukiện chuẩn,sau 1 phútphân giảiprotein tạo thành các sản phầm hoà tantrong TCA tương ứng với Ipmol tyrosine (Pictrowa, 1966; PhạmThị TrânChâu,2006)

12000vòng/phúttrong 10 phút đế thu dịch trongsuốt cóchứa sản phàmhoà tan của phảnứngenzyme Hàm lượng của sảnphẩm trong dung dịchlọc được xác định bằngphản ứng màu

+ Phàn ứng màu:

Lấy0,5ml dịch sau phàn ứng enzyme chovào ống nghiệm, them 2ml Na2CO3 6%, lắcđều, thêm 0.5ml thuốc thử Folin pha loãng 5 lần, lắcđều.Sau 30phút để ở nhiệt độ phòng đem so màu trên máy quang phố ở bước sóng 750nm

+ Xây dựng đồ thịchuẩn tyrosine:

Chuẩn bị dung dịch tyrosine với nồng độ khác nhau 0,1-1 pmol/mltrong HCI 0.2N Lấy0,5ml từ mồi nồng độlàm phàn ứngmàu nhưtrên Đo mậtđộ quang học cùa các ống Dựng đồ thị chuấn biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang học và nồng độ tyrosine Tính hiệu số giá trị mật độquanghọc của mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm tra, dựa vào đồ thị chuẩn tính lượngpmol tyrosine tương ứng Một đơn vị hoạtđộng là lượng enzym ởđiềukiện tiêuchuấn30 °C, sau 1 phút phân giải protein tạo thành các sàn phâm hoà tan trong TCAtươngứng với 1 micromoltyrosine.

Bảng 2.1 Xác định đường cong chuẩn của tyrosine

4: Thểtíchcủahỗnhợp phản ứngvàTCA

a: Số pmol tyrosine tương ứng với hiệu số giá trị mật độ quanghọccủa ống thí nghiệmvà ống kiếm tra

k:Độ pha loãng dungdịch enzyme.

t:Thời gian phản ứng (10 phút)

2.2.3 Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry (Lowry, 1951)

* Nguyên lý cơ bản của phương pháp

Phương phápLowrydựa trên nguyên tắc sau:

Sự tạothànhphứchợp củađồng và protein trongdung dịch kiềm, phứchợp của đồngvà protein khừ phosphomolybdic- phosphotungstate tạo dung dịch màu xanh đậm

Phương pháp này có thế được sừ dụng để xác định từ 20-200pgprotein/ml

* Vật liệu và hóa chất:

- Dung dịch BSA(bovineseurum albumin) có nồngđộ khácnhau (0,4; 0,8; 1,2; 1,6 và 2,0mg/ml)

- Thuốc thửFolin đã phaloãng2 lần

- Thuốc thứ A: 1,56g CuSO-tSFLO/lOOml nước cất

- Thuốc thử B: 2,37g sodium tartarte/100ml nước cất

- Thuốc thử C:2g NaOH + 10g Na2C03/500ml nước cất

- Thuốc thử D: 100mlc+lml A+lml B

* Xây dựng đồ thị chuẩn Protein

Bảng 2.2 Xác định đường chuẩn protein

STT Protein (pl) H 2 O (pl) Lượng

protein (mg)

Dung dịch

D (ml)

Thuốc thử Folin (pl)

2.2.4 Phương pháp tinh sạch enzyme

2.2.4.1 Ket tủa enzyme bằng dung môi hữu cơ

Nguyên tắc:

Quátrình kếttủa enzyme dựa trên sự thay đối hangso điện môi cúa môi trường Lực đấy và lực húttỉ lệnghịch với hằng sổđiện môi của môitrường.Vì vậy, khi bố sung các dung môi cóhangsố điện môi nhó (ethanol, acetone ), chúng sẽ làm giảm hàng số điện môi của môi trường,từ đó làmgiảm khảnăng solvathóacùa các phân tứ nước đối với phân tứ enzyme trong dung dịch Do vậy, tính tan của enzyme giảm và enzyme bị kết tủa Hiện tượng kết túa xảy ra tốt hơn và cầnítdung môi hơn khi pH dung dịch gần với

pl củaenzyme

Dung môi:

Protein có the kết tủa bằng dung môi hữu cơ tan trong nước, nhưethanol,acetone, methanol, isopropanol.Trong đó,acetone và ethanol là haidung môi phố biếnnhất trong việc kết túa protein Dung môi sứdụng phái an toàn, không độc và có nhiệt độ bốc cháylớn hơn 20°C.

Phương pháp thực hiên:

Bo sung ethanol tuyệt đối vào dung dịch enzymetheotý lệ 1 thế tích dung dịch enzyme và thểtích ethanol tuyệtđối Sau đó dung dịch enzyme được đế qua đêm ớ -20 °C nhằm tạo điều kiện kếttúa thuận lợi Khi cácenzyme đã kếttủa hếtthì cần phái tách ra ngay bằng quá trình lytâm trongvòng20 phútởtốc độ quay 12.000vòng/phút, thời gian là 20 phút vànhiệt

độ là 4°c Trong kếttúa vẫn còn một phầnetanol, lượng etanol này được tách

ra bằngphươngphápbốchơi ở áp suất chân không

2.2.4.2 Phương pháp tinh sạch enzyme hằng sắc ký lọc gel Sephadex Gỉ00

Nguyên tắc

Phương pháp sắc ký lọcgel(gelfiltration) được ứng dụng để tách hồnhợp cácchất dựa vào sự khácnhauvềkíchthước, hình dạng, cấutrúc không gian, phântử lượng

Bán chất cùa quá trình loc gel

Quá trình triềnkhai sắc ký đượcthực hiện thôngquasự tương tác của2 pha:

- Pha tĩnh là cáchạtgel cócấutrúc mở, chứa liên kết ngang tạothànhmạng lướikhông gian bachiều được nhồi cố địnhtrongcột Bèn trong và bên ngoài hạt gel có các mao quán kích thước nhỏ Cộtgelđược cân bằng trongdungdịchđệm

- Pha động là hỗnhợpgồm dịch enzyme và cáctạpchất hòa tan khác

cókích thước phântử khác nhauđược pha trongdung dịch đệm

Dungdịch mầu chứa enzyme và các cấu tứ hòa tan (pha động) có kíchthước khácnhau được chạy quacột Những phân tửcó kích thước lớn hơn kích thước lồ mao quản cùa gcl thìkhông the đi vào bên trong hạt gcl,vì thế

chúngdi chuyêntrongkhoảngkhông gian giữa các hạt Những phân tửcókích thước nhỏ hơn thì có khả năngkhuếch tán vàobên trongcáchạt gel.

Cách tiến hành:

Đệm A: 10 niMphosphat Sorensen, pH 7,6

Dịch enzyme sau khi làm sạch qua cột qua gelCa3(PO4)2 được cô đặc bằng 1/10 the tích ban đầu bằng cách cho qua cột amicon ultra centrifugal filter (kích thước 30 MW) 5 ml dịch enzyme cô đặc được bơm lên cộtSephadex G-100 (60 cm X 1.6 cm)vớitốc độ dòng chảy0.5 ml/ph Mỗi phân đoạn thu 3ml, kiểm trahoạt tínhproteasetừngphân đoạn.Vùngphân đoạn có hoạt tính được dồnlại đế sứ dụngchobước tinh sạch qua cột trao đối ionDEAE-cellulose

2.2.4.3 Phương pháp tinh sạch enzyme bằng sắc ký trao đoi ion DEAE- celliiỉose.

Dung dịch đệm A: 10 mMphosphat Sorensen, pH 7,6

Cột DEAE-cellulose được cân bằng với 3 thế tích cột (CV) đệmA sau

đódịchenzyme thuđược saukhi quacột lọc gel được bơmlêncột vớitốc độ dòng chày Iml/phút Quá trìnhlàm sạchtrên cộttrao đối ion được thiết lậpnhưsau:

- Rửa proteinkhôngbám trên cột bàng đệm : 5 the tích cột

- Thôi protein bám trên cột bằng đệmA với các nồng độ muối NaCI khác nhau từ 0,1; 0,2; 0,3; 0;4 và IM.Mồi nồng độ sử dụng 6 cv Thu mỗiphân đoạn 3ml, sau đó xácđịnh hoạt tính protease ớ từngphânđoạn