Chương 2: Vật liệu và phương pháp
2.2. Hóa chất, thiết bị và dụng cụ
a) Hóa chất và môi trường
Môi trường thạch đĩa LB (Luria-Bertani) agar: dùng để đổ đĩa vi khuẩn và thực khuẩn thể dùng trong Plaque Assay và Drop Assay. Công thức để pha 200 ml môi trường LB agar như sau:
Bảng 2.1 Công thức pha 200 ml LB agar Hóa chất Lượng thêm vào
Polypepton 2 g
Cao nấm men 1 g
Agar 3 g
Môi trường sau khi pha xong sẽ chỉnh pH 7 và hấp tiệt trùng 120oC, 120 phút. Sau khi sấy khô 70 độ C khoảng 30 phút đặt trong túi nhựa, môi trường nhanh chóng được đổ vào đĩa agar đặt trong tủ cấy tránh để agar bị đông khi đổ môi trường ra đĩa. Sau khi đổ môi trường xong chờ agar khô rồi bảo quản trong túi nhựa ở nhiệt độ phòng sẵn sàng sử dụng.
SM buffer để lưu trữ ngắn hạn và giúp ổn định phage. Công thức pha đệm SM:
Bảng 2.2 Công thức pha đệm SM
Hóa chất Nồng độ
NaCl 5.8 g/L
MgSO4.7H2O 2 g/L
1M Tris-Cl (pH 7.5) 5%
2% (w/v) gelatin solution 0.5%
Phage sau khi pha xong sẽ được chiết ra lọ và hấp tiệt trùng. Sau khi để nguội, bảo quản trong tủ lạnh -4oC. Lọ SM này sẵn sàng để dùng để thu stock phage. Ngoài ra chiết từ lọ SM ra mỗi ống eppendoff 900 mL trong tủ cấy, những ống eppendoff này sau đó được trữ lạnh và dùng để pha loãng phage sử dụng trong Plaque Assay và tạo Stock phage.
Môi trường TSB (Tryptic Soy Broth) để nuôi giống vi khuẩn làm vật chủ E.
ictaluri E1 cho phage xâm nhiễm. Môi trường TSB sử dụng có thành phần như sau:
17
Bảng 2.3 Thành phần môi trường TSB
Thành phần Nồng độ
Tryton 17 g/L
Soya pepton 3 g/L
NaCl 5 g/L
K2HPO4 2.5 g/L
Dextrose 2.5 g/L
Cân 21 g môi trường TSB và định mức 700 mL bằng nước cất để thu đươc 700 mL môi trường TSB lỏng. Sau đó chiết TSB vào các ống falcon nhỏ 50 mL rồi đem đi hấp tiệt trùng. Sau khi khi để nguội bảo quản các ống môi trường TSB trong tủ kín ở nhiệt độ phòng sẵn sàng sử dụng để tạo stock vi khuẩn.
Môi trường TSA (Tryptic Soy Agar) dùng để tạo lớp thạch trên trong Plaque Assay và Tạo Stock Phage, giúp cố định và ổn định phage khi để chúng tương tác với vật chủ, hình thành các plaque rõ ràng. Để chuẩn bị TSA, cân 3% (w/v) môi trường TSB và 0.4% (w/v) agar. Hòa tan agar trong lò vi sóng khoảng 18 phút, sau đó hấp tiệt trùng 120oC, 20 phút. Sau khi sấy khô 70oC khoảng 30 phút, môi trường TSA nhanh chóng được rót vào các ống nghiệm nhỏ (100 x 13mm). Sau đó các ống nghiệm nhỏ chứa TSA được đem đi hấp tiệt trùng một lần nữa. Sau khi nguội ta có TSA 0.4% được bảo trong tủ mát ở nhiệt độ phòng sẵn sàng sử dụng trong Plaque Assay và Tạo Stock Phage.
PCI (Phenol – Cloroform - Isoamyl Acohol) là hỗn hỗn dung dịch được dùng trong tách chiết DNA nhằm biến tính protein, tinh sạch DNA và phân tách 2 pha: pha dung môi (phenol) đáy và pha lỏng (cloroform) trên36. DNA được giữ trong pha lỏng trong khi protein biến tính bị giữ lại trong pha dung môi, vai trò của isoamyl acohol là phá hệ nhũ tương (bọt) khi ly tâm tách lớp. PCI được pha theo tỉ lệ các thành phần tương ứng 25:24:1 theo thể tích, việc pha PCI được thực hiện trong tủ hút và trang bị đầy đủ đồ bảo hộ vì cả ba chất thành phần đều rất độc37–39.
Đệm TAE 1X dùng trong quá trình điện di giúp trung hòa điện tích DNA khiến DNA di chuyển thuần nhờ kích thước phân tử ngoài ra tránh hiện tượng điện phân nước ảnh hưởng đến sự di chuyển của DNA. Thành phần của đệm TAE 1X bao gồm 40 mM Tris-acetate và 1 mM EDTA40.
18 Các hóa chất sử dụng khác
Bảng 2.4 Các hóa chất sử dụng
STT Tên hóa chất Nguồn gốc Công dụng
1 DNase I Thermo
Fisher Phân cắt DNA của vật chủ khi tinh sạch
2 RNase NT1 Thermo
Fisher Phân cắt RNA của vật chủ khi tinh sạch 3 DNase I buffer Thermo
Fisher
Tạo môi trường cho DNase I và RNase NT1 hoạt động
4 Sodium acetate 3M Tự pha Hỗ trợ tủa DNA
5 Ethanol lạnh 100% Tự pha Tủa DNA khỏi Cloroform 6 Ethanol lạnh 70o Tự pha Tủa DNA
7 Elute buffer Thermo
Fisher Thu huyền phù DNA sau khi làm khô
8 Agarose Chuẩn bị gel điện di
9 Loading Buffer Nhuộm màu DNA khi chạy điện di
10 Ladder Dùng để đánh giá hiệu suất của quá trình điện di và xác định kích thước genome điện di
b) Dụng cụ và thiết bị
Bảng 2.5 Danh sách thiết bị sử dụng STT Tên thiết bị Thương hiệu Công dụng
1 Tủ mát Sanyo
Bảo quản stock phage, đệm, hóa chất điện di, hóa chất tinh sạch DNA.
2 Tủ lạnh ngang 4oC Alaska Bảo quản giống vi khuẩn, hóa chất tinh sạch DNA
3 Tủ cấy vô trùng Cấy chuyền vi khuẩn, pha loãng stock phage
4 Máy vortex VELP Scientifica Vortex đều mẫu khi pha loãng 5 Máy lắc ổn nhiệt JISICO Nuôi vi khuẩn cấy chuyền
6 Bể ủ khô Việt Á Ủ nhiệt bất hoạt/hoạt hóa enzyme
7 Máy ly tâm NUVE Ly tâm cô đặc khuẩn
8 Tủ hút ChemGARD Pha hóa chất
19
9 Tủ -70oC Bảo quản DNA
10 Máy ly tâm lạnh Sigma Ly tâm, tủa DNA
11 Nanodrop BioSpectrometer Đo mật độ DNA 12 Cân điện tử Sartorius Cân hóa chất 13 Bộ thiết bị điện di Bio-Rad Kiểm tra DNA
Bảng 2.6 Các dụng cụ sử dụng
STT Dụng cụ STT Dụng cụ
1 Giá ống nghiệm falcon 6 Màng lọc 0.22
2 Becher 50 mL 7 Xi lanh 5 mL
3 Đèn cồn 8 Eppendoff 1.5 và 2 mL