Sau khi tạo Stock Drop (từ Drop Asssay) và Stock Phage (từ Tạo stock phage bằng Plaque), tiến hành Plaque Asssay để khảo sát mật độ phage ở 2 mẫu stock của 2 phage M18N và M26N, cùng với đó nồng độ DNA sau khi tách chiết được đo bằng NanoDrop.
Kết quả thu được như bảng dưới.
Bảng 3.1 Mật độ phage ở các mẫu stock và nồng độ DNA thu được M18N M26N
Stock Drop
(pfu/mL) 4,8.109 1,870.107 Stock Phage
(pfu/mL) 5,6.109 8,7.109
Kết quả trên cho thấy khi hoạt hóa phage, phage M18N dễ dàng hoạt hóa hơn phage M26N. Tuy nhiên sau khi được hoạt hóa Stock phage thu được từ M26N cao hơn nhiều M18N, cho thấy phage M26N ly giải vật chủ tương đối nhanh hơn M18N. Điều đó dẫn đến nồng độ DNA của M26N cao hơn hẳn so với M18N.
3.1.1. Kết quả hoạt hóa thực khuẩn thể
Thực hiện Plaque Assay với 100 μL phage/200 μL khuẩn (trừ nồng độ ở các nồng độ 10-6 của M18N).
Hình 3.1 Kết quả Plaque Assay của Stock Drop M26N (trái) và M18N (phải)
31
Đối với M18N thực hiện khảo sát ở nồng độ pha loãng 10-6, 10-7, và nồng độ 10-6 với tỉ lệ phage và khuẩn giảm đi một nữa (50 μL phage/200 μL khuẩn). Hình thái plaque đều, rõ, mật độ thưa ở nồng độ 10-6, dễ dàng đếm bằng mắt thường. Kết quả số lượng plaque đếm được ở nồng độ 10-6 và 10-7 lần lượt là 212 và 48, từ đó theo công thức tính mật độ phage có thể suy ra mật độ phage tương ứng là 4,24.109 và 4,80.109 pfu/mL. Kết quả 4,8.109 pfu/mL đáng tin cậy hơn, vì ở nồng độ 10-6 mật độ plaque vẫn còn khá cao (~212) có thể một vài plaque trùng lên nhau gây nên sai số. Để thu Stock Plaque, ta cần đĩa có mật độ phage 3000 - 4000 plaque. Vậy nên chọn nồng độ 10-5 cho Webbed plate M18N để số plaque trên đĩa ~4800 plaque nhằm chuẩn bị cho bước tạo Stock Plaque.
Bảng 3.2 Kết quả Plaque Assay Stock Drop M18N và M26N
Cũng tương tự với M26N, thực hiện Plaque Assay ở 4 nồng độ từ 10-1 đến 10-4. Ở hai nồng độ đầu, phage hoàn toàn ly giải hết vật chủ, đĩa trong. Nồng độ 10-3 có thấy dấu vết vòng sinh tan, mật độ plaque cũng rất nhiều nên không thể đếm được. Ở nồng độ 10-4 số lượng plaque đã rõ ràng hơn và đếm được có 187 plaque tương ứng với mật độ phage của Stock Drop M26N là 0,00187.109 pfu/mL. Vì vậy chọn nồng độ pha loãng 10-3 cho Webbed plate M26N để thu được ~1870 plaque.
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
M18N x x x x x 212* 48
M26N - - - 187 x x x
(*): 50 μL phage/200 μL μL khuẩn (x) Nồng độ không khảo sát
(-) Số lượng plaque nhiều không đếm được
32 3.1.2. Kết quả thu stock thực khuẩn thể
Sau khi đã tính toán được Webbed plate của hai phage, tiến hành chuẩn bị 4 đĩa nồng độ pha loãng 10-3 đối với phage M26N và 4 đĩa nồng độ pha loãng 10-5 đối với phage M18N nhằm chuẩn bị cho bước thu Stock Plaque. Thực hiện theo quy trình Tạo stock phage bằng Plaque như đã đề cập trước.
Sau khi thu được Stock Plaque, kiểm tra mật độ phage trong mẫu stock bằng Plaque Assay. Khảo sát ở độ pha loãng từ 10-4 đến 10-7 đối với cả hai phage, 100 μL phage/200 μL khuẩn. Đối với M18N vòng sinh tan quan sát được hơi mờ, ở nồng độ 10-7 đếm được 56 plaque, dựa vào công thức tính mật độ phage có thể ước tính mật độ phage trong Stock Plaque M18N là 5,6.109 pfu/mL, thích hợp để giải trình tự. Plaque của M26N đều, rõ, ở nồng độ pha loãng 10-7 của M26N đếm được 87 plaque tương ứng với mật độ phage của Stock Plaque M26N là 8,7.109 pfu/mL.
Bảng 3.3 Kết quả Plaque Assay Stock Plaque M18N và M26N
10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
M18N x x x - - 313 56
M26N x x x - - - 87
(x) Nồng độ không khảo sát
(-) Số lượng plaque nhiều không đếm được
Hình 3.2 Kết quả Plaque Assay Stock Plaque M26N (trái) và M18N (phải)
33 3.1.3. Kết quả đo mật độ DNA bằng NanoDrop
Từ đồ thị NanoDrop cho thấy có một peak ở bước sóng 260 nm, chứng tỏ đã thu được DNA (nhưng vẫn có thể còn lẫn RNA). Chỉ số A260/A280 cho thấy độ tinh sạch của DNA đối với protein, A260/A280 càng bé cho thấy DNA càng chưa tính sạch với protein. Với DNA được tinh sạch với protein chỉ số A260/A280 thường bằng 2,0 (1,8 - 2,0). Ở đây chỉ số A260/A280 của M18N và M26N lần lượt là 1,89 và 1,96 chứng tỏ mẫu đã được tính sạch với protein.
Còn chỉ số A260/A230 cho thấy độ tinh sạch của DNA đối với muối và các tạp chất khác hấp thụ mạnh ở bước sóng 230 nm như phenol, Guanidinium chloride, EDTA68.
DNA được tinh sạch thường có chỉ số A260/A230 bằng 2,0 (1,8 – 2,0). Nếu chỉ số này thấp chứng tỏ vẫn còn tạp chất gây ô nhiễm trong mẫu. Ở đây chỉ số A260/A230 của M18N và M26N lần lượt là 0,45 và 0,63 chứng tỏ trong mẫu vẫn còn có muối hoặc phenol.
Bảng 3.4 Kết quả kiểm tra hàm lượng DNA bằng NanoDrop A260/A280 A260/A230 Nồng độ DNA (ug/mL)
M18N 1.89 0.45 22.7
M26N 1.96 0.63 131.9
Hình 3.3 Kết quả đo nồng độ DNA M18N (trái) và M26N (phải)
34 3.1.4. Kết quả điện di
Kết quả điện di cho thấy cả hai mẫu M18N và M26N đều có dấu vết của DNA và chỉ có một vạch. Cho thấy DNA không bị nhiễm hay bị đứt gãy trong quá trình tinh sạch.
Kích thước DNA của M18N và M26N tương đối bằng nhau, điều này có thể là do chúng cùng loài, có quan hệ gần nên genome có độ dài không mấy khác biệt. Tuy nhiên vệt của M18N lại sáng rõ hơn vạch của M26N mặc dù nồng độ DNA của M18N thấp hơn M26N, có thể do trong hỗn hợp có tạp chất như phenol hấp thụ bước sóng của DNA gây sai lệch kết quả đo NanoDrop hoặc điều kiện bảo quản mẫu trước điện di không tốt, làm phân hủy DNA hoặc có thể do hiệu suất tinh sạch.