Nghiên cứu phát triển công nghệ vector adenovirus để sản xuất vắc xin cho động vật trên mô hình gen kháng VP2 (virus protein 2) phòng bệnh gumboro

Đề tài KC04.24/06-10: “Nghiên cứu phát triển công nghệ vector adenovirus để sản xuất vắc-xin cho động vật trên mô hình gen kháng nguyên VP2 virus protein 2 phòng bệnh Gumboro”, đã được

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ VECTOR ADENOVIRUS ĐỂ SẢN XUẤT VẮC-XIN CHO ĐỘNG VẬT

TRÊN MÔ HÌNH GEN KHÁNG NGUYÊN VP2 (VIRUS PROTEIN 2) PHÒNG BỆNH GUMBORO

MÃ SỐ: KC04.24/06-10

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học

Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS Lê Thanh Hòa

8571

Hà Nội - 2010

MỤC LỤC

Tr

Phần thứ nhất

Phần thứ hai TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI

2.1 Đánh giá về công nghệ adenovirus tái tổ hợp 7

2.1.1 Adenovirus và nghiên cứu phát triển làm vector tái tổ hợp hiện

2.1.2 Tình hình nghiên cứu công nghệ adenovirus tái tổ hợp hiện nay 13

2.1.3 Đánh giá công nghệ thiết kế adenovirus làm khung vector cho

2.2 Nguyên liệu cơ bản cho công nghệ thiết kế để tạo adenovirus tái tổ hợp làm vacxin 17

2.2.1 Plasmid chứa DNA hệ gen của adenovirus vector 17

2.2.2 Plasmid con thoi (shuttle plasmid) hay plasmid trung gian 18

2.2.3 Hệ thống tế bào vi khuẩn E coli để đồng nhiễm 19

2.2.4 Hệ thống tế bào động vật trợ giúp kiến tạo adenovirus tái tổ hợp 20

2.3 Mô tả công nghệ adenovirus tái tổ hợp mà đề tài nghiên cứu 21

2.4 Tình hình nghiên cứu vacxin phòng bệnh Gumboro và ý nghĩa

của phát triển vacxin thế hệ mới trên nền adenovirus làm vector 25

2.4.1 Giới thiệu virus gây bệnh Gumboro 25

2.4.2 Vacxin truyền thống phòng bệnh Gumboro 28

2.4.3 Vacxin thế hệ mới phòng bệnh Gumboro 30

2.4.4 Gen kháng nguyên VP2 ứng dụng trong chiến lược tạo vacxin

2.4.5 Ý nghĩa của phát triển vacxin Gumboro thế hệ mới trên nền

Phần thứ ba NGUYÊN LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ỨNG DỤNG

3.1 NGUYÊN LIỆU 34

3.1.2 Hệ thống plasmid adenovirus FAd9 và plasmid trung gian 34

3.1.3 Hệ thống plasmid adenovirus HAd5 và plasmid con thoi 36

3.1.5 Hệ thống tế bào vi khuẩn E coli thông dụng khác để tách dòng 40

3.1.6 Các loại hóa chất, sinh phẩm, trang thiết bị và phụ trợ khác 40

3.1.7 Giống virus tái tổ hợp nguyên gốc L và

3.1.8 Virus vacxin sản xuất trên môi trường tế bào gan phôi gà 42

3.1.9 Các loại hóa chất, sinh phẩm, dụng cụ nuôi cấy tế bào thông

3.2.7 Phương pháp thiết kế và gài “hộp gen kháng nguyên VP2” vào

3.2.8 Phương pháp lưu giữ DNA plasmid của hệ thống HAd5 trong

3.2.9 Phương pháp gây đồng nhiễm tái tổ hợp trong vi khuẩn BJ5183 48

3.2.10 Phương pháp chuẩn bị DNA của plasmid adenovirus tái tổ hợp

3.2.13 Phương pháp nuôi cấy tế bào gan phôi gà một lớp 54

3.2.14 Phương pháp kiểm tra sinh học phân tử với giống và vacxin

3.2.15 Phương pháp kiểm tra an toàn, vô trùng, với giống và vacxin

FAd9-VP2 (L/R) và phân bố virus ở các cơ quan 57

3.2.16 Phương pháp kiểm nghiệm miễn dịch với kháng thể Gumboro

bằng phản ứng trung hòa trên tế bào gan phôi gà 58

3.2.17 Phương pháp kiểm tra miễn dịch của vacxin bằng ELISA 60

Phần thứ tư KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI

TỔ HỢP ĐỐI VỚI HỆ THỐNG FAD9 GIA CÂM

63

4.1 TÓM LƯỢC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ

4.2 KẾT QUẢ THU NHẬN VÀ CHUẨN BỊ NGUỒN GEN VP2 65

4.2.1 Kết quả tiếp truyền giống virus Gumboro để cung cấp nguồn 65

4.3 THIẾT KẾ VÀ GÀI “HỘP GEN KHÁNG NGUYÊN VP2”

(CMV-KOZAK-VP2-PolyA) VÀO PLASMID TRUNG GIAN p∆L2.4 68

4.3.1 Thiết kế và thu nhận “hộp gen kháng nguyên VP2“

4.3.2 Gài “hộp gen kháng nguyên VP2“

(CMV-KOZAK-VP2-PolyA) vào plasmid trung gian p∆L2.4 70

4.3.3 Chuyển nạp và chọn lọc plasmid trung gian p∆L2.4-VP2 73

4.4 KẾT QUẢ TẠO PLASMID ADENOVIRUS TÁI TỔ HỢP MANG GEN VP2 (pPacFAdV9-VP2) 74

4.4.1 Thiết kế plasmid vector FAd9 làm khung 74

4.4.2 Thu nhận lưu giữ DNA của plasmid FAd9 (pF∆TR2-EGFP) và

4.4.3 Gây đồng nhiễm tạo adenovirus FAd9 tái tổ hợp mang gen VP2 77

4.5 KIỂM TRA KIỂM NGHIỆM GIỐNG VIRUS FAD9-VP2-L/R 78

4.5.2 Đánh giá hoạt lực của virus thông qua hủy hoại tế bào 79

4.5.3 Kết quả xác định PFU của giống FAd9-VP2 (FAd9-VP2-L và

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TẾ BÀO GAN PHÔI GÀ SẢN

XUẤT VÀ KIỂM TRA GIỐNG VÀ VACXIN FAd9-VP2-L VÀ

FAd9-VP2-R

88

4.6.1 Kết quả thực hiện công nghệ tế bào để sản xuất virus làm

4.6.2 Kết quả kiểm tra khả năng nuôi cấy virus giống FAd9-VP2 trên

4.6.3 Kết quả sản xuất ~5.000 liều adenovirus tái tổ hợp trên tế bào

4.6.4 Kết quả kiểm tra an toàn vô trùng, hiệu lực và phân bố virus

trong các cơ quan ở gà được đưa vacxin 98

4.7 KIỂM TRA MIỄN DỊCH CỦA VACXIN VP2-L VÀ

4.7.2 Kết quả thử nghiệm adenovirus vacxin vào cơ thể gà bằng

đường tiêu hóa (uống), hô hấp (nhỏ mũi) và tiêm (dưới da) 104

4.7.3 Tổng hợp đánh giá kết quả kiểm tra ELISA của hai loại vacxin

FAd9-VP2-R (vacxin R) và FAd9-VP2-L (vacxin L) thử nghiệm 109

Phần thứ năm KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI

5.1 BỐ TRÍ CÁC NỘI DUNG THỰC HIỆN NGHIÊN CỨU VỚI HỆ 111

GEN ADENOVIRUS (HAD5) VÀ PLASMID CON THOI

5.3 THIẾT KẾ VÀ GÀI “HỘP GEN KHÁNG NGUYÊN VP2” (KOZAK-VP2) VÀO PLASMID CON THOI PSHUTTLE-CMV 115

5.3.1 Thiêt kế và thu nhận “hộp gen VP2“ (KOZAK-VP2) 115

5.3.2 Gài „hộp gen kháng nguyên VP2“ vào plasmid pShuttle-CMV 119

5.3.3 Kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp pShuttle-CMV-VP2 121

5.4 KẾT QUẢ TẠO PLASMID ADENOVIRUS TÁI TỔ HỢP MANG GEN VP2 (pAd-Shuttle-VP2) 124

5.4.2 Kết quả thực hiện “đồng nhiễm trực tiếp“ trong E coli BJ5183 127

5.4.3 Kết quả xây dựng phương pháp “đồng nhiễm kế tiếp” vào tế

5.4.4 Kết quả thực hiện “đồng nhiễm kế tiếp“ DNA

pShuttle-CMV-VP2 vào tế bào khả biến BJ5183 mang sẵn vector pAdEasy1 133

5.4.5 Kiểm tra plasmid đồng nhiễm tái tổ hợp pAd-Shuttle-VP2 bằng

các phương pháp cắt enzyme giới hạn (EcoRI; PmeI và EcoRI; PacI) 138

5.4.6 Kết quả kiểm tra pAd-Shuttle-VP2 bằng phương pháp sinh học

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA

Ký hiệu Tiếng Anh

Thuật từ/Cách dùng hoặc nghĩa

tiếng Việt

AGP Agar Gel Precipitation Phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch ATCC American Type Culture Collection Tổ chức tế bào quốc tế (tạm dịch sử

dụng)

CAR coxsackie/adenovirus receptor Thụ thể của adenovirus cùng với

coxsackie virus CED Chicken embryo dermal cells Tế bào biểu bì phôi gà

CEF Chicken Embryo Fibroblast Cells Tế bào xơ phôi gà

CEK Chicken Embryo Kidney Cells Tế bào thận phôi gà

CEL Chicken Embryo Liver Cells Tế bào gan phôi gà

cDNA complementary DNA DNA bổ sung

CPE Cytopathic Effect Bệnh tích tế bào

Da/kDa Dalton /Kilodalton Đơn vị tính trọng lượng phân tử protein DMEM Dulbecco's Modified Eagle's

Medium

Môi trường nuôi cấy tế bào

DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic

EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein Protein phát huỳnh quang xanh lá cây ELISA Enzym Linked Immunosorbent

Assay

Phản ứng hấp phụ miễn dịch liên kết với enzyme

FAd9 Fowl adenovirus type 9 Adenovirus type 9 loài chim

FBS fetal bovine serum Huyết thanh bê

HAd5 Human adenovirus type 5 Adenovirus type 5 người

HEK293 Human embryonic kidney cell Tế bào thận bào thai người

IBD Infectious Bursal Disease Bệnh viêm túi Fabricius truyền nhiễm IBDV Infectious Bursal Disease Virus Virus gây viêm túi Fabricius truyền

nhiễm

LB Luria-Bertani medium Môi trường LB

L-ITR Light inverted tandem repeat Cấu trúc lặp ngắn phía bên trái

LMH Leghorn male hepatoma

(avian hepatocellular carcinoma cell

line)

Dòng tế bào u gan gà phát triển từ gan gà

trống Lơgo (Kawaguchi et al., 1987)

MTA Material Transfer Agreement Thỏa thuận chuyển giao vật tư sinh học

OIE Office International des

Epizooties (since 25 Jan, 1924);

World Organisation for Animal

Health (from May, 2003)

Tổ chức Thú y quốc tế (hình thành 25/01/1924) ; từ ngày nay vẫn giữ tên lịch sử đó

ORF Open Reading Frame Khung đọc mở

phương pháp ‘úp mặt thạch”

R-ITR Right inverted tandem repeat Cấu trúc lặp ngắn phía bên phải

RT-PCR Reverse transcription-PCR Phản ứng PCR ngược

SPF Special Pathogen Free Siêu sạch mầm bệnh

TCID50 tissue culture infectious dose Liều gây nhiễm 50% tế bào

TR2 Tandem repeats Cấu trúc lặp số 2 (ở hệ gen FAd9)

VN Virus Neutralization Phản ứng trung hòa virus

vvIBDV Very virulent Infectious Bursal

DANH MỤC CÁC HÌNH CÓ TRONG BÁO CÁO

Hình 1.1 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn chính thực hiện đề tài nghiên cứu công

nghệ adenovirus vector tái tổ hợp mô hình gen kháng nguyên VP2

trên hệ thống adenovirus FAd9 gia cầm và trên hệ thống adenovirus

HAd5 người

4

Hình 2.1 Hình thái và cấu tạo của adenovirus A Ảnh kính hiển vi điện tử mô

tả các hạt adenovirus có dạng hình khối sắp xếp với nhau tạo thành

tập hợp B Mô hình cấu trúc không gian của hạt virion adenovirus 10

Hình 2.2 Mô hình cấu tạo hạt virion adenovirus (cắt phẳng) với DNA hệ gen và

Hình 2.3 Xâm nhiễm của adenovirus vào tế bào thông qua thụ thể CAR và

α-integrin (mũi tên chỉ dẫn), dẫn vào endosome và chuyển vận đến nhân

Hình 2.4 Công nghệ tạo vector adenovirus tái tổ hợp chứa gen kháng nguyên

VP2, sử dụng hệ thống AdEasy™ Adenoviral Vector System

(Stratagene Inc.)

23

Hình 2.5 Sơ đồ minh họa các phân đoạn A và B của hệ gen virus Gumboro 26

Hình 3.1 Hệ thống gen của FAdV-9 (FAd9) được thiết kế tạo thành plasmid

pPacFAdV-9, nhiễm tế bào Hepatoma (CH-SAH) để tạo nên virus

FAdV-9 (virus tự nhiên, hoang dã, wildtype) 35

Hình 3.2 Hệ thống gen của FAdV-9 (FAd9) được thiết kế tạo thành plasmid

pPacFAdV-9, cài “hộp gen EGFP” vào vị trí TR2 để tạo thành

plasmid pF∆TR2-EGFP làm “vector mở” (open vector) Kiểm tra

bằng cách lây nhiễm vào tế bào Hepatoma để tạo virus FAdV-9 chỉ

thị huỳnh quang, rất dễ phát hiện

36

Hình 3.3 Sơ đồ cấu trúc của plasmid khung pAdEasy-1 mua của hãng

Stratagene (Stratagene Inc.)

37

Hình 3.4 Sơ đồ cấu trúc của plasmid con thoi pShuttle-CMV và vùng đa nối

MCS tiếp nhận DNA ngoại lai (Stratagene)

38

Hình 3.5 Tế bào HEK293 (A): Nuôi cấy thành một lớp sau 72 h (đạt >90% phủ

đáy); (B): nhuộm huỳnh quang (Nguồn: http://hek293.com/); (C): Nuôi

cấy mọc thành một lớp sau 48 h, do chúng tôi (Đề tài KC04.24/06-10),

thực hiện

39

Hình 4.1 Sơ đồ minh họa 8 giai đoạn thực hiện đề tài (I - VIII), của nội dung

nghiên cứu công nghệ adenovirus FAd9 gia cầm 64

Hình 4.2 Bệnh tích điển hình của túi Fabricius (sưng to) và cơ (xuất huyết) ở gà

Hình 4.3 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR nhân gen kháng nguyên VP2 của

một chủng đại diện (A) và kiểm tra kết quả cắt DNA plasmid tái tổ

Hình 4.4 Trình bày chuỗi nucleotide và amino acid suy diễn của gen VP2 thu

Hình 4.5 Sơ đồ minh họa quá trình lắp ghép gen VP2 và các thành phần phụ trợ

khác (hộp gen CMV-Kozak-VP2-PolyA) vào plasmid trung gian

p∆L2.4 của hệ thống FAd9 adenovirus gia cầm 71

Hình 4.6 Sơ đồ bố trí vị trí cài “hộp gen kháng nguyên VP2” vào vùng cấu trúc

lặp TR2, mà trước đó TR2 đã được thiết kế thay thế bằng EGFP

tra các clone tái tổ hợp bằng phản ứng PCR với cặp mồi CMV-up

Hình 4.8 Hệ gen của FAdV-9 (FAd9) được thiết kế tạo thành plasmid

pPacFAdV-9, cài “hộp gen VP2” vào vị trí TR2 tạo thành plasmid

pF∆TR2-VP2 (quay trái) hoặc pF∆TR2-VP2inv (quay phải), lây

nhiễm tế bào Hepatoma tạo giống nguyên gốc VP2-L và

FAd9-VP2-R (thực hiện tại Canada); chuyển giao giống nguyên gốc cho Viện Công nghệ sinh học, lây nhiễm tế bào gan phôi gà (CEL) tiếp

truyền giống gốc và tạo giống cấp 1 để sản xuất vacxin FAd9-VP2-L

và FAd9-VP2-R (thực hiện tại Việt Nam)

76

Hình 4.9 Tế bào một lớp (monolayer): A Không gây nhiễm (đối chứng); B

Gây nhiễm virus FAd9-VP2 (nồng độ 10-3) có CPE sau 72 giờ 79

Hình 4.10 Tế bào Hepatoma nhiễm ở nồng độ virus gây nhiễm là 10-6 của

FAd9-VP2-L có số lượng plaque nhiều (xem tươi, không nhuộm bằng đỏ trung tính)

80

Hình 4.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm trung hòa ở các chai tế bào nuôi cấy gan phôi

Hình 4.12 Hình ảnh tế bào gan phôi gà một lớp quan sát ở thí nghiệm trung hòa

virus FAd9-VP2-L với kháng thể kháng VP2 của virus Gumboro 84

Hình 4.15 Đánh giá kết quả nuôi cấy tế bào gan phôi gà sau 24 h và 48 h; tế bào

mọc thành một lớp đều mịn trong môi trường DMEM/FBS 90

Hình 4.16 Đánh giá CPE kết quả nuôi cấy giống FAd9-VP2-L (FADVAC-L) và

FAd9-VP2-R (FADVAC-R) trên tế bào gan phôi gà sau 72 h để chọn giống

93

Hình 4.17 Đánh giá CPE để xác định thời điểm thu hoạch virus FAd9-VP2-L

(FADVAC-L) trên tế bào gan phôi gà sau 48 h, 72 h, 96 h và 144 h;

Hình 4.18 Tế bào gan phôi gà (CEL) lúc 48 h một lớp (đều, mịn, trong môi

trường DMEM/FBS) để chuẩn bị cấy giống virus vacxin

FAd9-VP2-L/R; tế bào đối chứng theo dõi lúc 72h và tế bào đối chứng lúc 144h

để so sánh với tế bào cấy giống sản xuất vacxin 94

Hình 4.19 Kiểm tra thường xuyên hàng ngày các chai tế bào gan phôi gà trước

khi cấy giống virus và các chai nuôi cấy virus và đối chứng

95

Hình 4.20 Sự hủy hoại tế bào (CPE) của 3 chai (1, 2, 3) nuôi cấy giống virus

vacxin FAd9-VP2-L trên tế bào gan phôi gà tại thời điểm 72h sau gây

Hình 4.21 Kết quả điện di kiểm tra vùng “siêu biến đổi” của gen VP2 (474 bp)

Hình 4.22 Kết quả giải trình tự kiểm tra chuỗi gen vùng “siêu biến đổi” (474 bp)

của gen VP2 thu nhận từ mẫu lách được tách dòng trong plasmid pCR2.1

101

Hình 5.1 Sơ đồ minh họa 4 giai đoạn đã thực hiện của đề tài (I - IV), thuộc các

nội dung nghiên cứu công nghệ adenovirus HAd5 người 112

Hình 5.2 Kiểm tra trên thạch agarose 1%, DNA của plasmid vector con thoi

pShuttle-CMV sau khi cắt mở vòng bằng EcoRI của các clone 1, 2, 3,

Hình 5.4 Điện di kiểm tra DNA vector tái tổ hợp pShuttle-CMV-VP2 cắt bằng

EcoRI ĐC+: DNA của pShuttle-CMV (độ dài 7,5 kb) làm đối chứng 120

Hình 5.5 Điện di kiểm tra sản phẩm vector pShuttle-CMV-VP2 của 3 chủng

Hình 5.6 Trình tự nucleotide tại đầu 5’ và 3’ của chromatogram giải trình tự

một clone đại diện của plasmid con thoi pShuttle-CMV-VP2 123

Hình 5.7 Minh họa quá trình gây đồng nhiễm trong E coli 5183 giữa DNA của

plasmid con thoi pShuttle-CMV-VP2 (cắt bằng PmeI) (1) với DNA

của plasmid adenovirus vector pAdEasy-1 (2), để tạo nên plasmid adenovirus tái tổ hợp pAd-Shuttle-VP2 (3), chứa các thành phần:

vùng mầm ori của plasmid con thoi và gen kháng kháng sinh

kanamycin (mũi tên); hộp gen kháng nguyên VP2; và khung

adenovirus HAd5 Vùng mầm ori và gen kháng kháng sinh ampicillin

của plasmid pAdEasy-1 bị loại bỏ trong quá trình đồng nhiễm 126

Hình 5.8 Kiểm tra đoạn DNA của pShuttle-CMV-VP2 sau khi cắt mở vòng

Hình 5.9 Điện di kiểm tra khả năng hiệu quả đồng nhiễm tạo vector adenovirus

Hình 5.10 Điện di kiểm tra sản phẩm DNA của các clone BJ5183 chuyển nạp

Hình 5.11 Điện di kiểm tra DNA tách từ tế bào khả biến BJ5183 mang vector

pAdEasy1 sau khi gây ”đồng nhiễm kế tiếp” với DNA

pShuttle-CMV-VP2 và xác định clone dương tính 136

Hình 5.12 Điện di kiểm tra chuyển nạp chọn lọc các khuẩn lạc chứa plasmid tái

tổ hợp pAd-Shuttle-VP2 sàng lọc phân lập với các khuẩn lạc khác 137

Hình 5.13 Kết quả điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp pAd-Shuttle-VP2 cắt

Hình 5.14 Kết quả điện di kiểm tra DNA plasmid tái tổ hợp pAd-Shuttle-VP2

(clone 1/1; 4/2 và 5/1) cắt bằng hai enzyme EcoRI và PmeI 140

Hình 5.15 Điện di kiểm tra kết quả DNA của Shuttle-VP2(1/1) và

Hình 5.16 Kết quả điện di sản phẩm PCR thực hiện để kiểm tra adenovirus tái tổ

hợp VP2(1/1); VP2(4/2) và

pAd-Shuttle-VP2(5/1), với các cặp mồi đặc hiệu SHUTF-ADER (~2,6 kb) và

Hình 5.17 Kết quả giải trình tự kiểm tra sản phẩm PCR thu nhận vùng giao nhau

giữa pShuttle-CMV và pAdEasy1 của pAd-Shuttle-VP2(1/1) chứa

hộp gen VP2

144

DANH MỤC CÁC BẢNG CÓ TRONG BÁO CÁO

Bảng 2.1 Vị trí cấu trúc và chức năng hoạt động của 13 loại protein kiến

Bảng 4.1 Theo dõi PFU hình thành sau khi gây nhiễm virus và phủ thạch 81

Bảng 4.2 Bố trí các giếng kiểm tra bằng phản ứng ngưng kết hồng cầu

Bảng 4.3 Nồng độ giống được pha và bố trí cấy giống vào tế bào gan phôi

Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra an toàn (100 liều) với 2 loại vacxin, 3 đường

Bảng 4.6 Số liệu chi tiết ELISA kết quả kiểm tra đánh giá đáp ứng miễn

dịch của gà đối với vacxin FAd9-VP2-R (gọi tắt là vacxin R) với

Bảng 4.7 Số liệu chi tiết ELISA kết quả kiểm tra đánh giá đáp ứng miễn

dịch của gà đối với vacxin FAd9-VP2-L (gọi tắt là vacxin L) với

Bảng 4.8 Kết quả ELISA kiểm tra các mẫu huyết thanh của các lô đối

Bảng 4.9 Tổng hợp kết quả kiểm tra đánh giá đáp ứng miễn dịch của gà

của các loại vacxin FAd9-VP2-R (gọi tắt là R) và FAd9-VP2-L (gọi tắt là L) với các đường dùng khác nhau bằng phản ứng huyết

Bảng 5.1 Thành phần và số lượng được cung cấp trong bộ kit AdEasy™

Phần thứ nhất

ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TÓM TẮT QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN

Những tiến bộ về công nghệ DNA tái tổ hợp, về genomics, về virus học và miễn dịch học phân tử đã mở hướng ứng dụng cho quá trình thiết kế và phát triển các loại vacxin thế hệ mới Nhu cầu vacxin và chế phẩm chẩn đoán thế hệ mới là rất lớn trong việc ứng dụng phòng chống bệnh truyền nhiễm Trong số vacxin thiết kế dựa trên hệ thống vector virus tái tổ hợp (recombinant virus-based vectoral vaccine), hệ thống adenovirus là loại hình công nghệ có hiệu quả nổi bật, đóng vai trò quan trọng trong phát triển vacxin thế hệ mới hiện nay

Đề tài KC04.24/06-10: “Nghiên cứu phát triển công nghệ vector

adenovirus để sản xuất vắc-xin cho động vật trên mô hình gen kháng nguyên VP2 (virus protein 2) phòng bệnh Gumboro”, đã được Bộ Khoa học và Công

nghệ phê duyệt, cho thực hiện trong giai đoạn 2009 - 2010, với một số chủ đích như sau:

Mục tiêu tổng thể của đề tài: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ vector

adenovirus tái tổ hợp lần đầu tiên được thực hiện tại Việt Nam, với mục đích nhằm thiết kế được hệ thống adenovirus để làm vacxin cho động vật, trước hết

là xây dựng mô hình gen kháng nguyên VP2 của virus Gumboro ở gia cầm, từ

đó, có được sự tiếp cận công nghệ mới cho nghiên cứu sản xuất vacxin thế hệ mới và các chế phẩm hoạt tính sinh học thế hệ mới sau này

Mục tiêu cụ thể của đề tài:

- Có được qui trình công nghệ và hệ thống adenovirus làm vector vacxin

- Có được giống vacxin sản xuất bằng công nghệ vector adenovirus, để có thể

sử dụng qua đường tiêu hoá (uống/ăn), hô hấp (khí dung), đường tiêm cho gia cầm và có giá trị kinh tế

- Sản xuất thử nghiệm được vacxin phòng chống bệnh Gumboro bằng công

nghệ vector adenovirus làm cơ sở (tiền đề) cho những vacxin virus khác của gia

súc, gia cầm và thuỷ sản, theo công nghệ này

Mục tiêu dài hạn sau khi thực hiện xong đề tài:

Trên cơ sở thực hiện thành công đề tài KC04.24/06-10 với mô hình gen

kháng nguyên VP2 của virus Gumboro ở gia cầm, công nghệ vector adenovirus

sẽ được triển khai và đưa ra được một loại hình công nghệ mới làm cơ sở (làm

tiền đề) cho những vacxin virus khác của gia súc, gia cầm và thuỷ sản, ứng dụng thích hợp cho mỗi loại bệnh truyền nhiễm cần phòng chống

Có nhiều loại adenovirus người và động vật đã được thiết kế làm hệ thống vector dẫn truyền gen kháng nguyên, trong đó đề tài KC04.24/06-10 đã lựa chọn và thực hiện cùng lúc trên hai hệ thống sau đây:

i) Thực hiện trên hệ thống adenovirus type 9 của gia cầm (FAdV9 hay

FAd9, Fowl adenovirus type 9), trên cơ sở hợp tác chặt chẽ với Trường Đại học Guelph, Canada, để nghiên cứu thiết kế và đã tạo ra được giống vacxin adenovirus gia cầm tái tổ hợp FAd9-VP2 mang gen VP2 (từ virus Gumboro Việt Nam) để sản xuất vacxin;

ii) Thực hiện trên hệ thống adenovirus type 5 của người (HAd5, human

adenovirus type 5), mà hệ thống này đã được thương mại hóa, do đó, chúng tôi

đã mua của hãng Stratagene resources/7-commercial products/14-stratagene.html), để thực hiện thao tác và tạo sản phẩm tái tổ hợp

Sở dĩ cùng lúc thực hiện trên cả hai hệ thống như vậy, là vì:

giống vacxin adenovirus tái tổ hợp FAd9-VP2 của gia cầm, đó là loại virus

sống nhược độc làm vacxin, có khả năng nhân lên được trong gà khi đưa vacxin

này vào, cung cấp nguồn protein VP2 kháng nguyên tổng hợp do FAd9-VP2

nhân lên được trong cơ thể gà Loại vacxin này thuộc dạng vacxin sống nhược

độc có nguồn kháng nguyên nhân lên khi sử dụng (đây là chủ định chính của

đề tài đã đăng ký, để đạt được sản phẩm cuối cùng là sản xuất và sử dụng vacxin phòng bệnh Gumboro cho gà và xây dựng qui trình công nghệ thiết kế

adenovirus vector tái tổ hợp);

ii) Thực hiện trên hệ thống HAd5, sẽ cho kết quả là tạo được giống

adenovirus tái tổ hợp HAd5-VP2 làm vacxin cho gia cầm, đó cũng là virus sống

nhược độc làm vacxin cho gà, nhưng sẽ không nhân lên được trong cơ thể gà,

mà chỉ cung cấp nguồn protein VP2 kháng nguyên cố định có sẵn tại mỗi liều

vacxin đưa vào Loại vacxin này (nếu sử dụng) thuộc dạng vacxin sống nhược

độc có nguồn kháng nguyên không nhân lên (chủ định phụ của đề tài, làm mô

hình để đề tài nghiên cứu các thao tác adenovirus vector tái tổ hợp và tạo vacxin, nếu cần)

Về nguyên liệu thiết kế, để có một hệ thống adenovirus cho sử dụng, cần

có 5 loại nguyên liệu chính: i) Plasmid vector adenovirus chứa DNA hệ gen đã được thiết kế an toàn, đúng chủ định sử dụng; ii) Plasmid vector con thoi (hay còn gọi là plasmid trung gian) để tiếp nhận “hộp gen kháng nguyên” đích, sau

đó, sử dụng để gây đồng nhiễm với DNA plasmid vector, tạo nên một loại

plasmid tái tổ hợp mang “hộp gen kháng nguyên” đích, chuẩn bị cho sự kiến tạo

adenovirus tái tổ hợp trong (các) tế bào chuyên biệt; iii) “Hộp gen kháng

nguyên” đích là đoạn DNA thu nhận có chứa toàn bộ gen kháng nguyên và các

thành phần điều hòa phụ trợ ở hai đầu của hộp gen (do chúng ta chủ động thiết

kế); iv) Hệ thống tế bào vi khuẩn để thực hiện đồng nhiễm (được sử dụng tốt

nhất hiện nay là tế bào E coli dòng BJ5183), hòa nhập DNA plasmid con thoi

tái tổ hợp (đoạn chứa chứa hộp gen kháng nguyên) với DNA plasmid adenovirus vector tạo plasmid adenovirus tái tổ hợp mang gen kháng nguyên

đích; v) Hệ thống tế bào động vật chuyên biệt, là (các) dòng tế bào động vật

đặc thù khác nhau được sử dụng để thực hiện lây nhiễm (transfection), ở trong

tế bào đó, các hạt adenovirus tái tổ hợp mang hộp gen đích sẽ được kiến tạo, để chọn lọc làm giống

Về các giai đoạn chính thực hiện việc kiến tạo adenovirus tái tổ hợp mang

gen đích kháng nguyên VP2 (của virus Gumboro) trên cả hai hệ thống là FAd9

và HAd5 để sử dụng làm vacxin, đã trải qua các giai đoạn sau (Hình 1.1):

Hình 1.1 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn chính thực hiện đề tài nghiên cứu công nghệ adenovirus vector tái tổ hợp mô hình gen kháng nguyên VP2 trên hệ thống

adenovirus FAd9 gia cầm và trên hệ thống adenovirus HAd5 người Ghi chú:

Phần đóng khung vạch đôi liền là đã thực hiện theo đăng ký của đề tài; phần khung vạch đơn rời là chưa thực hiện vì là công việc phụ chưa cần tập trung giải quyết

Phân lập và lưu giữ gen đích kháng nguyên

VP2 của Gumboro Việt Nam

Hệ thống adenovirus

FAd9 gia cầm

Hệ thống adenovirus HAd5 người

Cài “Hộp gen kháng nguyên

VP2” vào plasmid trung gian

(p∆L2.4-VP2)

Cài “Hộp gen kháng nguyên VP2” vào plasmid con thoi (pShuttle-CMV-VP2)

Tạo plasmid adenovirus

tái tổ hợp mang gen VP2

(pPacFAdV9-VP2)

Tạo plasmid adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2 (pAd-Shuttle-VP2)

Tạo adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2

(FAd9-VP2-L/R)

Tạo adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2

(HAd5-VP2)

Sản xuất adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2

(FAd9-VP2-L và R)

Sản xuất adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2

(HAd5-VP2)

Công nghệ tế bào CEL

sản xuất và kiểm tra giống và vacxin (FAd9-VP2-L và R)

Kiểm tra miễn dịch của vacxin

FAd9-VP2-L và R (Tiêu hóa; Hô hấp; Tiêm)

Phân lập và lưu giữ gen đích kháng nguyên

VP2 của Gumboro Việt Nam

Hệ thống adenovirus

FAd9 gia cầm

Hệ thống adenovirus HAd5 người

Cài “Hộp gen kháng nguyên

VP2” vào plasmid trung gian

(p∆L2.4-VP2)

Cài “Hộp gen kháng nguyên VP2” vào plasmid con thoi (pShuttle-CMV-VP2)

Tạo plasmid adenovirus

tái tổ hợp mang gen VP2

(pPacFAdV9-VP2)

Tạo plasmid adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2 (pAd-Shuttle-VP2)

Tạo adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2

(FAd9-VP2-L/R)

Tạo adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2

(HAd5-VP2)

Sản xuất adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2

(FAd9-VP2-L và R)

Sản xuất adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2

(HAd5-VP2)

Công nghệ tế bào CEL

sản xuất và kiểm tra giống và vacxin (FAd9-VP2-L và R)

Kiểm tra miễn dịch của vacxin

FAd9-VP2-L và R (Tiêu hóa; Hô hấp; Tiêm)

Phân lập và lưu giữ gen đích kháng nguyên

VP2 của Gumboro Việt Nam

Hệ thống adenovirus

FAd9 gia cầm

Hệ thống adenovirus HAd5 người

Cài “Hộp gen kháng nguyên

VP2” vào plasmid trung gian

(p∆L2.4-VP2)

Cài “Hộp gen kháng nguyên VP2” vào plasmid con thoi (pShuttle-CMV-VP2)

Tạo plasmid adenovirus

tái tổ hợp mang gen VP2

(pPacFAdV9-VP2)

Tạo plasmid adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2 (pAd-Shuttle-VP2)

Tạo adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2

(FAd9-VP2-L/R)

Tạo adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2

(HAd5-VP2)

Sản xuất adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2

(FAd9-VP2-L và R)

Sản xuất adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2

(HAd5-VP2)

Công nghệ tế bào CEL

sản xuất và kiểm tra giống và vacxin (FAd9-VP2-L và R)

Kiểm tra miễn dịch của vacxin

FAd9-VP2-L và R (Tiêu hóa; Hô hấp; Tiêm)

i) Phân lập và lưu giữ gen đích kháng nguyên VP2: Cung cấp nguồn nguyên

liệu gen VP2 để thiết kế “hộp gen kháng nguyên VP2” từ virus Gumboro của

Việt Nam

ii) Thiết kế “hộp gen kháng nguyên VP2” (VP2 antigenic expression

cassette): “Hộp gen kháng nguyên VP2” được hiểu là đoạn DNA được thiết kế

từ nguyên liệu gen kháng nguyên VP2 đã lưu giữ, có bổ sung thêm các thành phần điều hòa gen (chuỗi Kozak) [43], giúp gen kháng nguyên này biểu hiện protein, ứng với mỗi hệ thống FAd9 hay HAd5

iii) Gài “hộp gen kháng nguyên VP2” vào plasmid con thoi: Đưa toàn bộ

“hộp gen kháng nguyên VP2” vào plasmid con thoi đã được tái thiết kế, để tạo

được plasmid con thoi tái tổ hợp mang gen VP2, ứng với mỗi hệ thống FAd9 hay HAd5

iv) Tạo plasmid adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2: Đó là việc chuyển

nạp toàn bộ “hộp gen kháng nguyên VP2” từ plasmid con thoi tái tổ hợp mang

gen VP2 vào plasmid adenovirus tương ứng (ứng với mỗi hệ thống FAd9 hay

HAd5), thông qua thao tác đồng nhiễm trong E coli (homologous recombination in E coli), để tạo nên plasmid adenovirus tái tổ hợp chứa hộp

gen VP2 Sau đó, chuẩn bị lây nhiễm vào tế bào động vật đặc thù (đối với hệ

thống FAd9 gia cầm là tế bào gan dòng thuần Hepatoma của gà, ví dụ dòng

CH-SAH hay LMH; và đối với hệ thống HAd5 người là tế bào thận bào thai

người dòng HEK293)

adenovirus tái tổ hợp chứa hộp gen VP2 nhất thiết phải được cắt bằng enzyme

PacI, rồi tiếp tục thực hiện lây nhiễm (transfection) vào tế bào đặc thù cho mỗi

hệ thống (Hepatoma cho hệ thống FAd9 để tạo adenovirus FAd9-VP2; HEK293

cho hệ thống HAd5 để tạo adenovirus HAd5-VP2)

vi) Sản xuất adenovirus tái tổ hợp mang hộp gen VP2: Giống virus

FAd9-VP2 gia cầm được thực hiện trên tế bào Hepatoma để giữ giống nguyên

gốc, sau đó, có thể chuyển sang tế bào gan phôi gà sơ cấp CEL (chicken embryo

liver cell) để tiếp truyền tạo giống gốc/giống cấp 1 và sản xuất vacxin; Giống virus HAd5-VP2 được thực hiện trên tế bào HEK293 để tạo và giữ giống

nguyên gốc, nhưng cũng sử dụng dòng tế bào này để sản xuất virus làm vacxin

vii) Các công nghệ tế bào sản xuất và kiểm tra giống và vacxin: Đề tài

KC04.24/06-10 đã thực hiện công nghệ chế tạo tế bào gan phôi gà sơ cấp (CEL) để sản xuất và bước đầu kiểm tra kiểm nghiệm vacxin FAd9-VP2 (tên

gọi: FADVAC) của gia cầm

viii) Kiểm tra kiểm nghiệm vacxin thử nghiệm: Thực hiện thử nghiệm

miễn dịch với với vacxin FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R đưa vào gà bằng

đường tiêu hóa (uống), hô hấp (nhỏ mũi) và tiêm (dưới da)

Đến khi kết thúc (tháng 12/2010), đề tài KC04.24/06-10 đã hoàn thành một khối lượng công việc (liệt kê ở Hình 1.1), như sau:

đoạn (bao gồm i - viii), đã tạo được giống virus FAd9-VP2, đã xây dựng được

các qui trình gồm: a) Qui trình công nghệ thiết kế và lắp ghép gen kháng

nguyên đặc trưng của virus gây bệnh Gumboro vào hệ thống vector adenovirus

nhược độc (Qui trình thiết kế); b) Qui trình công nghệ thu nhận adenovirus

nhược độc tái tổ hợp chứa kháng nguyên làm công cụ dẫn gen gây miễn dịch

cho gia cầm (Qui trình sản xuất); c) Qui trình đưa adenovirus chứa gen kháng

nguyên VP2 vào động vật thông qua đường tiêu hoá (uống/ăn), hô hấp (khí

dung) và tiêm (Qui trình sử dụng); d) Đồng thời đề tài đã sản xuất được trên

5000 liều vacxin, đã kiểm tra kiểm nghiệm miễn dịch; và các sản phẩm hoạt

động khác của đề tài và các chỉ tiêu liên quan khác (Hình 1.1)

ii) Đối với hệ thống HAd5 người: Đã hoàn thành đến giai đoạn (iv) tức là

đã tạo được plasmid adenovirus tái tổ hợp HAd5-VP2 (i - iv), đã nuôi cấy thành

công tế bào HEK293 chuẩn bị lây nhiễm; nhưng đến giai đoạn này thì tạm dừng lại, chưa thực hiện tiếp các giai đoạn (v - viii), vì để dồn thời gian tập trung giải

quyết các giai đoạn (i - viii) của hệ thống FAd9-VP2 hoàn chỉnh làm vacxin gia

cầm, hơn nữa, đối với HAd5, đây là công việc phụ không đăng ký trong đề tài

Phần thứ hai

TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI TỔ HỢP

VÀ SỰ CẦN THIẾT NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI KC04.24/06-10

2.1 Đánh giá về công nghệ adenovirus tái tổ hợp

2.1.1 Adenovirus và nghiên cứu phát triển làm vector tái tổ hợp hiện nay

Rất nhiều loại vector virus đã được nghiên cứu thiết kế làm vector vacxin

và khám phá khả năng biểu hiện protein kháng nguyên từ nguồn gen của vi sinh vật độc hại ngoại lai, vacxin do virus làm vector chỉ có chứa duy nhất gen kháng nguyên của chúng, loại trừ được khả năng có mặt của toàn bộ đối tượng vi sinh

vật gây bệnh Trong cơ thể (in vivo), vacxin trên nền virus tái tổ hợp đã kích

thích tốt đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với các loại kháng nguyên ngoại lai, có

khả năng tận dụng được cả 3 loại hình đáp ứng miễn dịch: miễn dịch dịch thể (humoral immune response), miễn dịch trung gian tế bào (cell-mediated immune response) và miễn dịch niêm mạc (mucosal immune response) Phương

thức đưa vacxin là tiện lợi, bằng tất cả mọi đường, trong đó lợi thế lớn nhất là tính đơn giản và hiệu quả của việc đưa vacxin vào quần thể qua đường tiêu hoá (ăn/uống) và đường hô hấp (nhỏ mũi, khí dung), hạn chế đường tiêm vì tốn công sức Vacxin trên nền virus vector là loại virus sống nhược độc, dễ sản xuất, khả năng sản sinh và giới thiệu kháng nguyên trong cơ thể đối tượng thích ứng được coi là hoàn thiện Hệ thống vector để làm vacxin đảm bảo tiêu chí qui định là có khả năng cho phép sản xuất được một khối lượng lớn sử dụng công nghệ tế bào, có hiệu giá cao, do vậy giá thành vacxin thấp, có hiệu quả kinh tế (Bangari, Mittal, 2006)[15]

Adenovirus trong tự nhiên (loại hoang dã, wild type) là loại virus có kích thước bé, hình thái đơn giản, có cấu trúc hình khối đối xứng, đường kính 80 -

110 nm, không có lớp vỏ ngoài cùng (envelop), capsid bao gồm 252 capsomer phân chia thành 12 penton, 240 hexon và có 6 sợi protein (fiber) còn gọi là

angten (một số adenovirus loài chim có 12 angten) Capsid có cấu trúc 1 lớp, trọng lượng phân tử khoảng 150 - 180 triệu Dalton (Da); cả hexon, penton và angten đều là kháng nguyên bề mặt nổi, trong đó angten (fiber) mọc ra từ penton có điểm mút (knob) làm vị trí tiếp xúc với thụ thể tế bào trong quá trình

gây nhiễm (Bunchen-Osmond, 2003; Benko et al., 2005) [17; 19] (Hình 2.1)

Adenovirus động vật bậc cao có hệ gen không phân đoạn, chứa một phân

tử DNA 2 sợi, kích thước 35.800 - 36.200 nucleotide (hệ gen adenovirus của loài chim khoảng 42.000 - 43.000 nucleotide), mà tại hai đầu cuối của hệ gen

có bố trí hai chuỗi lặp ngược ITR (inverted terminal repetitions), mỗi chuỗi có

độ dài 103 bp đối với adenovirus của người, 50 - 200 bp đối với adenovirus động vật khác, có vai trò quan trọng trong quá trình khép vòng hệ gen DNA của virus Hệ gen bao gồm 2 sợi: 1 sợi DNA hướng trái L (left), 1 sợi DNA hướng phải R (right), chứa các tổ hợp gen sớm (E, early region) đó là các gen E1A, E1B, E2A-B, E4; và một khung gen chung cho sao chép muộn (L, late region), mã hoá cho 5 protein hợp nhất (L1 - 5) [3,4,36]

Tổng số, adenovirus có tất cả 13 loại protein, được chia làm 3 nhóm chính: i) Nhóm protein vỏ capsid (Capsid protein); ii) Nhóm protein nhỏ (Minor protein); iii) Nhóm protein lõi (Core protein) (Hình 2.2) Trong số 13 protein của adenovirus, ngoài các protein cấu trúc còn có các protein không cấu trúc mang hoạt tính enzyme là DNA - polymerase, replicase và protease (Bảng 2.1) Protein cấu trúc chính của adenovirus bao gồm: II (hexon); III (penton nền); IIIa; IV (fiber); V (protein lõi); VI; VII (protein lõi); VIII và IX Polypeptide Hexon (II) là thành phần vỏ virus; Penton nền (III) là protein capsid gốc, với trợ giúp của protein IIIa làm trụ cho protein fiber (IV) là cần angten cắm vào; đi sâu vào bên trong virus là các protein đệm bao bọc DNA của hệ gen, gồm protein V (đệm nhỏ) và protein VII (đệm lớn) Ngoài ra, còn có 3 loại protein chèn màng được liên kết chặt chẽ với hexon là protein VI, VIII và IX; cũng như một số loại protein phụ trợ khác, đó là TP (protein kết thúc hệ gen, terminal protein), protein Mu và protein X protease [25] (Hình 2.2; Bảng 2.1)

Bảng 2.1 Vị trí cấu trúc và chức năng hoạt động của 13 loại protein kiến tạo

adenovirus người

TT protein Tên Vị trí cấu trúc trong virus Chức năng hoạt động

1 II Hexon đơn nguyên (monomer) Protein cấu trúc bề mặt (Surface structural protein)

2 III Penton nền (base) Protein giúp virus xuyên màng (Penetration)

3 IIIa Liên kết với Penton nền (Associated with penton base) Protein giúp virus xuyên màng (Penetration) và Lắp ráp

(Assembly)

4 IV Sợi angten (Fibre) và nút bám (knob)

Tiếp xúc thụ thể tế bào (Receptor binding); Có khả năng liên kết hồng cầu thực hiện ngưng kết hồng cầu (Hemagglutination)

6 VI Tiểu protein chèn màng liên kết Hexon (Hexon minor polypeptide) Ổn định cấu trúc/ Lắp ráp virus (Stabilization/assembly of particle)

7 VII Protein đệm lớn liên kết với DNA và Penton nền (Core: associated with DNA &

penton base)

Giống histon, bao gói DNA hệ gen (Histone-like; packaging)

8 VIII Tiểu protein chèn màng liên kết Hexon (Hexon minor polypeptide) Ổn định cấu trúc/ Lắp ráp virus (Stabilization/assembly of particle)

9 IX Tiểu protein chèn màng liên kết Hexon (Hexon minor polypeptide) Ổn định cấu trúc/ Lắp ráp virus (Stabilization/assembly of particle)

10 X Protein protease liên kết với Penton (Associated with pentons?) Hoàn thiện giải phóng virus (Maturation)

11 TP Protein kết thúc hệ gen (Genome - Terminal Protein)

Tham gia và trợ giúp quá trình nhân lên hệ gen của virus (Genome replication)

12 Mu Nucleoprotein Trợ giúp sự nhân lên hệ gen của virus (Genome replication)

13 IV2a Nucleoprotein Trợ giúp lắp ráp và bao gói của virus (Genome packaging)

Hình 2.1 Hình thái và cấu tạo của adenovirus A Ảnh kính hiển vi điện tử mô

tả các hạt adenovirus có dạng hình khối sắp xếp với nhau tạo thành tập hợp B

Mô hình cấu trúc không gian của hạt virion adenovirus Nguồn: Fields et al.,

Fundamental Virology (1996)

Hình 2.2 Mô hình cấu tạo hạt virion adenovirus (cắt phẳng) với DNA hệ gen

và 13 loại protein được biết hiện nay Tất cả các protein của adenovirus được ký hiệu đánh số, trừ protein TP (protein kết thúc hệ gen) và Mu (nucleoprotein) Nguồn: http://www.microbiologybytes.com/virology/Adenoviruses.html

II III

IV

X TP

III

II

V VI

VII VIII IIIa

X

Mu

II III

IV

X TP

III

II

V VI

VII VIII IIIa

Hình 2.3 Xâm nhiễm của adenovirus vào tế bào thông qua thụ thể CAR và integrin (mũi tên chỉ dẫn), dẫn vào endosome và chuyển vận đến nhân để thực hiện chu trình tái tạo virus Mô hình cấu tạo hạt virion adenovirus (cắt phẳng) với DNA hệ gen và 13 loại protein được biết hiện nay Tất cả các protein của adenovirus được ký hiệu đánh số, trừ protein TP (protein kết thúc hệ gen) và

α-Mu (nucleoprotein)

Nguồn: http://www.microbiologybytes.com/virology/Adenoviruses.html

Adenovirus hấp phụ lên tế bào thích ứng bằng cách dùng nút angten (fiber knob) bám dính vào thụ thể tế bào đích (Hình 2.3) Thụ thể tế bào đích có tên

gọi là CAR (coxsackie/adenovirus receptor), xuất phát từ bản chất của thụ thể

adenovirus giống hoàn toàn thụ thể của virus Coxsackie B, do vậy, thụ thể này được sử dụng chung cho cả hai loại virus [48,59,69] Sau khi bám dính, penton

của adenovirus cần có sự tương tác với α-integrin của bề mặt tế bào để kết dính

và xuyên màng thông qua quá trình ẩm bào (endocytosis) [49] Bên trong nhân

tế bào, adenovirus thực hiện quá trình sao chép sớm (early transcription) để có vật liệu hệ gen và tiếp tục thực hiện quá trình sao chép muộn (late transcription)

để có protein cấu trúc, tạo nên capsid của các hạt virion mới [28] Sao chép,

tổng hợp protein, tổng hợp DNA và bao gói virus đều xảy ra trong nhân tế bào nhiễm

Tất cả adenovirus đều có hệ gen là DNA hai sợi (double-stranded DNA), đều thuộc họ Adenoviridae, hầu hết adenovirus đều vô hại, một số chỉ gây nhiễm nhẹ trên các loài thích ứng mà không gây chết Adenovirus được phân làm 4 nhóm chính nằm trong họ Adenoviridae [19], đó là

Mastadenovirus, Aviadenovirus, Atadenovirus và Siadenovirus [17] Phần lớn

adenovirus của động vật có vú đều thuộc về nhóm Mastadenovirus, kể cả các

serotype của adenovirus của người (human adenovirus, HAd) Tất cả mọi loại

adenovirus phân lập từ chim được phân loại thuộc về nhóm Aviadenovirus Nhóm Atadenovirus bao gồm những virus đơn nhất, phân lập từ cừu, bò, hươu,

thú có túi và một vài loài chim Nhóm thứ tư mới được phân loại gần đây là

Siadenovirus được tạm quy định bao gồm tất cả các adenovirus phân lập từ

ếch, cá, một số loài không xương sống và loại virus gây bệnh viêm ruột xuất huyết ở gà tây [17,25]

Adenovirus tái tổ hợp làm vacxin có khả năng sản sinh đáp ứng miễn dịch dịch thể, miễn dịch trung gian tế bào và thích ứng hấp phụ lên tế bào niêm mạc hệ hô hấp và hệ tiêu hóa để sản sinh miễn dịch niêm mạc [14] Adenovirus

đã được làm vector vacxin đối với nhiều bệnh ở người và gia súc, gia cầm,

trước hết phải kể đến dịch hạch Yersinia pestis, nhiệt thán Bacillus anthracis, vi

khuẩn lao, sốt xuất huyết Dengue, sốt xuất huyết Ebola, sốt xuất huyết Dengue

đa type, hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải HIV/AIDS ở người và khỉ, hội chứng hô hấp virus cấp ở người SARS, cũng như nhiều tác nhân gây bệnh khác

ở người Đối với động vật, nhiều loại vacxin trên nền adenovirus đã được nghiên cứu và đưa vào sử dụng như viêm não tuỷ truyền nhiễm ngựa, cúm A/H5N1 [33,64], viêm phế quản truyền nhiễm IBV, Gumboro virus [31,62], hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (tai xanh) ở lợn và nhiều ứng dụng vacxin khác cho gia súc, gia cầm [30] Hệ thống dẫn truyền adenovirus cũng được định hướng sử dụng liệu pháp gen phòng chống ung thư, điều trị ung thư từ tế bào

gốc, điều trị bệnh ty thể, định hướng kích ứng miễn dịch, sản xuất kháng thể đơn chuỗi scFv (single chain fragment variable) và biểu hiện kháng thể đơn chuỗi trong tế bào cơ thể, cũng như định hướng phá bỏ gen thông qua cơ chế can thiệp của RNAi (Xem bài tổng hợp tại [4])

2.1.2 Tình hình nghiên cứu công nghệ adenovirus tái tổ hợp hiện nay

Công nghệ vector tái tổ hợp adenovirus là công nghệ mới, linh hoạt, thuận lợi và dễ ứng dụng Tổng toàn bộ thời gian thao tác để có được adenovirus tái tổ hợp chứa gen kháng nguyên làm vacxin là rất ngắn, chỉ vài tháng khi đã thiết lập xong công nghệ cơ sở, đáp ứng nhu cầu cần có vacxin trong điều kiện cấp bách (dịch bệnh cấp, bệnh mới phát sinh/phát hiện, khủng bố sinh học ) Vacxin trên nền adenovirus tái tổ hợp có tính bền nhiệt, liều lượng sử dụng ít, miễn dịch lâu, hiệu lực đảm bảo Việc sản xuất cũng hết sức thuận lợi đó là sử dụng công nghệ tế bào nền với hàm lượng virus tạo ra rất cao

Cho đến khi đề tài KC04.24/06-10 bắt đầu, công nghệ vector tái tổ hợp adenovirus làm vacxin, hoàn toàn chưa được nghiên cứu tại Việt Nam, do vậy,

đề tài thực hiện với mục đích khám phá loại hình công nghệ mới, cho ra sản phẩm mới, sản phẩm mang tính kỹ thuật cao và thực dụng (Xem Thuyết minh

đề tài KC04.24/06-10; và [4])

Có thể kể đến một số ứng dụng adenovirus làm vector cho vacxin như sau:

Đối với hệ thống HAd5 (Human adenovirus type 5):

- Vacxin HAd5 vector đối với virus Ebola kích thích sinh miễn dịch bảo hộ tốt khi công cường độc bằng virus Ebola và loài động vật thí nghiệm gần người (primates)

- Vacxin HAd5 vector đối với virus HIV-1 chứa gen kháng nguyên env có

khả năng kích thích miễn dịch bảo hộ chống lại virus HIV khi thử nghiệm trên

khỉ rhesus và khỉ baboon

- Vacxin HAd5 vector mang gen kháng nguyên của vi khuẩn nhiệt thán

(Bacillus anthracis) cho khả năng bảo hộ hiệu quả đối với vi khuẩn nhiệt thán

cường độc phòng bệnh tahn ở người và động vật

- Vacxin HAd5 vector mang gen virus hội chứng hô hấp cấp tính (SARS) thuộc loại Coronavirus cho đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tốt khi thử nghiệm trên

chuột BALB/c và khỉ Rhesus macaque (Macaca mulatta)

- Vacxin HAd5 vector đối với virus cúm A/H5N1 mang gen H5 đã cho miễn dịch và bảo hộ tốt trên gà và chuột/chồn Ferret khi công cường độc bằng chủng A/Vietnam/1203(04)(H5N1)

- Hệ thống HAd5 vector cũng có thể còn được sử dụng như là một công cụ liệu pháp miễn dịch, chống ung thư, điều trị bệnh ty thể, sản xuất kháng thể đơn chuỗi scFv (single chain fragment variable) và biểu hiện kháng thể đơn chuỗi trong tế bào cơ thể, định hướng phá bỏ gen thông qua cơ chế can thiệp của RNAi

Đối với adenovirus loài chim (FAd, Fowl adenovirus):

- Nuôi ở mật độ đông, gia cầm cần có nhiều loại vacxin sử dụng thuận lợi qua đường tiếu hóa, hô hấp, nên một loạt các type adenovirus loài chim, FAd1, FAd8, FAd9 và FAd10 là các hệ thống được nghiên cứu nhiều nhất làm vacxin

ở gia cầm

- Vector tái tổ hợp FAd1 (CELO virus) mang gen VP2 của virus Gumboro đã cung cấp được miễn dịch bảo hộ hoàn toàn khi công cường độc với chủng Gumboro cường độc [31] Vector FAd1 cũng được kiểm nghiệm đối với liệu pháp gen chống ung thư trên mô hình chuột chống lại khối u melanoma dưới da chuột

- Vector FAd8 tái tổ hợp có hiệu quả nhất hiện nay là vacxin vector chứa gen

S1 của virus viêm phế quản truyền nhiễm (IBV) [39] FAd8 vector chứa gen

kích ứng miễn dịch (cytokine), mang gen interferon γ (IFN- γ) của gà đã được

sử dụng để dẫn truyền cytokine có khả năng tăng cường miễn dịch rất cao chống lại cầu trùng [40]

- Vector FAd9 (đối tượng nghiên cứu chính của Đề tài KC04.24/06-10), là

loại đã được nghiên cứu thiết kế thành công tạo thành khung plasmid vector pPacFAdV9 để tiến hành lắp ráp các gen kháng nguyên có chủ định [20; 21; 22;

23; 56] Nhóm nghiên cứu tại Trường Đại học Guelph (Ontario, Canada) do GS.TSKH Eva Nagy chủ trì, đã hoàn thiện hệ thống plasmid vector và plasmid con thoi (trung gian) trong nghiên cứu phát triển hệ thống adenovirus làm vector vacxin cho gia cầm Chúng tôi (PGS.TS Lê Thanh Hòa và nhóm nghiên cứu thuộc đề tài KC04.24/06-10, Viện Công nghệ sinh học) đã thiết lập mối quan hệ hợp tác với Trường Đại học Guelph (Ontario, Canada) trong định hướng sử dụng hệ thống FAd9 làm khung cho tái tổ hợp vector làm vacxin với gen kháng nguyên VP2 của virus Gumboro gây suy giảm miễn dịch ở gia cầm phân lập tại Việt Nam (Kết quả trình bày trong Báo cáo tổng hợp kết quả đề tài KC04.24/06-10)

- Vector FAd10 tái tổ hợp cũng đã được thiết kế mang gen VP2 của virus Gumboro, bằng cách gài vào hệ gen ở vị trí số 90,8 đến 100 một bộ phận gen biểu hiện VP2 ngay phía trước của cấu trúc lặp, cũng có hiệu lực tốt khi dùng qua đường niêm mạc [62]

2.1.3 Đánh giá công nghệ thiết kế adenovirus làm khung vector cho phát triển vacxin tái tổ hợp

Adenovirus được chia làm 4 nhóm chính nằm trong họ Adenoviridae đó

là Mastadenovirus, Aviadenovirus, Atadenovirus và Siadenovirus [19]

Hệ gen adenovirus của người có kích thước 35.800 - 36.200 nucleotide, cấu trúc bao gồm các gen sớm (E, early region) là E1A, E1B, E2A-B, E3, E4 và một gen chung gồm 5 đoạn gen hợp nhất (L1-5) Theo nguyên tắc thiết kế, nếu

thiết kế làm vector nền, vùng gen E1 hoặc E3 phải được cắt bỏ để đảm bảo an

toàn sinh học, như vậy, độ dài hệ gen của adenovirus người (human adenovirus) làm vector giảm mất 5.000 - 6.000 nucleotide, chỉ còn khoảng 30.000 bp Đối với mục đích thiết kế vector, tuỳ đối tượng cần được sử dụng mà chọn loại adenovirus thích hợp đã cắt bỏ vùng gen thích hợp, để đưa gen kháng nguyên vào vị trí thích hợp [25; 36]

Hệ gen adenovirus của loài chim khoảng 42.000 - 43.000 nucleotide (có

loại đến 48.000 nucleotide), không chứa “gen độc” như E1-E3 ở adenovirus

động vật, nhưng chứa nhiều cấu trúc lặp TR (TR, tandem repeats) hoặc vùng không nghĩa (non-sense region), được thiết kế cắt bỏ để có vị trí cài gen kháng nguyên ngoại lai vào, mà không ảnh hưởng đến sự nhân lên của adenovirus [20; 22; 23; 54]

Hai hệ thống adenovirus mà đề tài KC04.24/06-10 chọn làm đối tượng

nghiên cứu làm vector là hệ thống adenovirus người (HAd5) và hệ thống

adenovirus loài chim type 9 (FAd9) Ngoài ra một số hệ thống adenovirus loài

chim khác (FAd1, 8, 10) cũng đang được sử dụng cho nghiên cứu ứng dụng làm

vector vacxin tái tổ hợp hiện nay [44]

Phần lớn những nghiên cứu về vacxin sử dụng adenovirus làm vector chủ yếu tập trung vào loại hình HAd type 5 (HAd5) như một hệ thống biểu hiện và dẫn truyền gen kháng nguyên hữu hiệu trong rất nhiều thực nghiệm về gây miễn dịch, về liệu pháp gen chống ung thư và nhiều ứng dụng khác HAd5 vector là một loại vector làm vacxin thế hệ mới với khả năng ứng dụng của chúng rất rộng [16] và linh hoạt thiết kế trong công cuộc phòng chống khủng bố sinh học [18]

Adenovirus phân lập từ chim (FAd, Fowl adenovirus) nằm trong nhóm

Aviadenovirus [46] Phân nhóm 1 của Aviadenovirus bao gồm các adenovirus

gia cầm (FAd) từ serotype 1 đến serotype 12 (FAd1 - 12) và thông thường không gây bệnh hoặc gây nên những triệu chứng bệnh rất nhẹ, một số FAd hoàn

toàn vô độc [30] FAd1 (còn gọi là virus mồ côi gây chết phôi gà, CELO

(chicken embryo lethal orphan)) được phân lập từ gia cầm nhưng lại không liên quan đến bất kỳ một loại bệnh cụ thể nào ở gà sau nở Toàn bộ chuỗi gen của hệ gen FAd1, cũng như FAd9, đã được giải mã và phân tích cho thấy không có những vùng gen có cấu trúc và thành phần tương ứng với những vùng gen E1a, E1b, E3 hoặc E4 của HAd5 ở người

Vector FAd1 được thiết kế bằng cách sử dụng các phương pháp cổ truyền tái

tổ hợp trao đổi chéo (đồng nhiễm) trong vi khuẩn để DNA plasmid hệ gen FAd1

hợp nhất với plasmid con thoi mang gen kháng nguyên đích, kiến tạo nên hệ

gen FAd1 vector tái tổ hợp Sau đó, cắt bằng enzyme PacI, lây nhiễm hệ thống

tế bào u gan gà Hepatoma dòng thuần (dòng LMH hoặc dòng CH-SAH) của gà

Leghorn, để kiến tạo FAd1 adenovirus có khả năng nhân lên toàn năng [47] Việc xóa bỏ đến 1,3 kb của hệ gen FAd1 ở vùng bản đồ số 91 đến 99, cho phép

có thể cài vào đó gen ngoại lai có độ dài đến 4 kb Do vậy, FAd1 vector có thể được sử dụng như một vector vacxin tiềm năng đối với miễn dịch của các loài gia cầm và không phải gia cầm [15,31]

Cùng với vector FAd1, các loại vector FAd8, FAd9 và FAd10 cũng được khám phá và nghiên cứu phát triển để làm vacxin cho gà vài ngày tuổi bằng phương pháp cho uống hoặc nhỏ mắt

Đối với virus FAd9, đối tượng của đề tài, việc xoá đi cấu trúc lặp số 2 (TR2) không gây nên ảnh hưởng xấu đối với hệ gen của virus; và do vậy, khi đưa vào đó gen ngoại lai (ví dụ, gen kháng nguyên; gen cytokine) thì virus vẫn thu nhận và nhân lên bình thường FAd9 là loại adenovirus không độc, hiện nay,

đã được nhóm nghiên cứu tại Trường Đại học Guelph (Ontario, Canada) thực hiện chiến lược thiết kế FAd9 tạo thành một loại vector tối ưu Hệ thống FAd9 tái tổ hợp (còn gọi là FAd9vec), sau các thao tác biến đổi hệ gen như thế này, hệ gen đã không bị ảnh hưởng, về các phương diện phân bố trong tế bào, nhân lên trong tế bào, biểu hiện gen ngoại lai và đáp ứng miễn dịch khi so sánh với virus

bố mẹ tự nhiên [20,21,22,23]

2.2 Nguyên liệu cơ bản cho công nghệ thiết kế để tạo adenovirus tái tổ hợp làm vacxin

2.2.1 Plasmid chứa DNA hệ gen của adenovirus vector

được cắt bỏ vùng “gen độc” (ở hệ thống HAd5 là gen E1 hay/và E3) để tạo nên

plasmid mang hệ gen adenovirus nhược độc làm khung vector (vectoral DNA) Đối với hệ thống HAd5, plasmid chứa DNA của HAd5 làm khung vector đã được thiết kế có sẵn do các hãng sinh phầm sản xuất Chúng tôi đã sử dụng hệ thống pAdEasy-1 và plasmid con thoi pShuttle-CMV của hãng Stratagene, để

thực hiện đề tài (http://www.qcbio.com/stratagene/pAdEasy-1%20Vector.htm) Thiết kế plasmid chứa hệ gen HAd5 làm khung vector phải an toàn dựa trên

nguyên tắc: i) Xóa bỏ có chủ định vùng gen E1, việc này sẽ dẫn đến tạo ra các

hạt virion nhân lên thiểu năng, tạo lợi thế an toàn khi dùng trên động vật và

người (in vivo) [68]; ii) Vùng gen thứ hai là E3, không cho sản phẩm cần thiết

cho sự nhân lên của virus, cũng có thể xóa bỏ được để có khoảng trống tiếp nhận chuyển giao gen ngoại lai, do vậy, khi thay thế vùng gen này, virus vector

được tạo ra vẫn là virus nhân lên toàn năng; iii) Vùng gen E4 là một vùng gen

khác cũng thích hợp cho gài lắp các gen ngoại lai, nằm ở vị trí phía phải của hệ

gen virus; iv) Khi xóa hết tất cả các vùng gen E1, E2, E3 và E4, có thể tạo ra

được 3 vị trí tiếp nhận gen ngoại lai, để một lúc cài vào đó nhiều gen kháng

nguyên khác nhau, hoặc hỗn hợp gen kháng nguyên và cytokine

Đối với hệ thống FAd9: FAdV-9 hay FAd9 chủng A-2A (kích thước

45.063 bp, số đăng ký Ngân hàng gen: AF083975) là loại adenovirus có gây

nhiễm ở gia cầm trong tự nhiên, thuộc nhóm D trong chi Aviadenovirus gia cầm, bao gồm 2 thành viên: FAdV-D (FAdV-2 và FAdV-9), hệ gen của chúng không có các vùng “gen độc” như E1, E3 ở HAd5 của người [22,23] Nhóm

nghiên cứu tại Trường Đại học Guelph (Ontario, Canada) đã thực hiện chiến lược thiết kế thành công một loại vector FAdV-9 tối ưu, gọi là plasmid pPacFAdV9 (kích thước: 49.141 bp), trong đó vùng lặp TR2 (độ dài: 1755 bp) loại bỏ là những vị trí thích hợp để thay thế và cài vào đó gen ngoại lai cần tái tổ

hợp [21,22,23,55] Chúng tôi đã hợp tác cùng thực hiện tái tổ hợp “hộp gen

kháng nguyên VP2” (từ virus Gumboro của Việt Nam) vào plasmid pPacFAdV9

thông qua plasmid trung gian p∆L2.4, để có được plasmid tái tổ hợp

pPacFAdV9-VP2, từ đó, sau khi cắt bằng enzyme PacI, đã tiến hành lây nhiễm

tế bào Hepatoma (dòng CH-SAH) để kiến tạo adenovirus gia cầm tái tổ hợp

FAd9-VP2, làm giống và sản xuất vacxin thử nghiệm tại Việt Nam (Xem Báo cáo Tổng kết kết quả đề tài)

2.2.2 Plasmid con thoi (shuttle plasmid) hay plasmid trung gian

Plasmid con thoi là loại plasmid nhỏ, thiết kế dựa trên hệ thống plasmid

pBR322 chứa vùng mầm (ori), chuỗi gen kháng kháng sinh và vùng đa nối MCS (multi-cloning site) để tiếp nhận “hộp gen kháng nguyên” Loại plasmid này phải có khả năng đồng nhiễm trong tế bào vi khuẩn E coli gọi là tái tổ hợp

đồng nhiễm (homologous recombination in E coli) với DNA của plasmid

adenovirus làm vector, để tạo ra plasmid adenovirus tái tổ hợp chứa hệ gen vector mang hộp gen ngoại lai

thông dụng, có một điểm cắt của enzyme PmeI và hai điểm cắt của PacI, được chúng tôi mua của hãng Stratagene, sử dụng để gài “hộp gen kháng nguyên

VP2” (gồm chuỗi Kozak-VP2) vào sau chuỗi promoter CMV và loại plasmid

này có khả năng đồng nhiễm trong tế bào E coli dòng BJ5183 (Stratagene Inc)

do Trường Đại học Guelph, Canada (GS.TSKH Eva Nagy) thiết kế, sau khi tái

tổ hợp “hộp gen kháng nguyên VP2” (gồm chuỗi CMV-Kozak-VP2-polyA) vào,

plasmid tái tổ hợp mới có độ dài 11,4 kb, có khả năng đồng nhiễm trong tế bào

E coli dòng BJ5183 với DNA của FAd9, để tạo plasmid tái tổ hợp

pPacFAdV9-VP2 (Xem Báo cáo kết quả đề tài)

2.2.3 Hệ thống tế bào vi khuẩn E coli để gây đồng nhiễm

Hệ thống tế bào vi khuẩn E coli dòng BJ5183 là loại được sử dụng nhiều nhất BJ5183 (genotype: endA, sbcB−, recBC−, strR) không phải là chủng đột biến recA, recBCD, recJ, hoặc recF, mặc dù vậy, tuy không phải recA mutant,

nhưng BJ5183 có đầy đủ các enzyme cung cấp cho đồng nhiễm hiệu suất cao

Đồng nhiễm trong E coli BJ5183 là sự hòa nhập DNA xảy ra giữa một loại

DNA mạch thẳng (plasmid con thoi chứa hộp gen kháng nguyên, đã cắt hai đầu

bằng PmeI) và DNA mạch vòng nguyên vẹn của plasmid adenovirus làm khung

vector (HAd5) Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp theo phương pháp kháng kháng sinh và tầm soát kích thước plasmid adenovirus tái tổ hợp phù hợp, cũng như xác định sự có mặt của gen kháng nguyên gài vào trong đó

2.2.4 Hệ thống tế bào động vật trợ giúp kiến tạo adenovirus tái tổ hợp

Đối với hệ thống HAd5, do khiếm khuyết một số gen cần cho tổng hợp protein E1/E3 để virus tạo capsid và bao gói thành hạt virion, nên trong tế bào bình thường, virus không thực hiện đầy đủ chu kỳ tái tạo của mình, vì không có các loại protein này để bao gói Do vậy, sau khi có plasmid adenovirus tái tổ hợp mang toàn bộ hộp gen kháng nguyên (pHAd5-VP2, hay trong nghiên cứu

của đề tài này là pAdEasy1-VP2); và sau khi cắt bằng PacI để lộ đoạn DNA

chứa toàn bộ khung vector và gen kháng nguyên VP2, cần có một loại tế bào có protein E1/E3 bảo đảm cho kiến tạo, để virus thực hiện chu kỳ tái tạo hoàn

chỉnh Dòng tế bào bao gói được dùng thông dụng nhất là dòng tế bào thận bào

thai người HEK293 (human embryonic kidney cell) [65] và dòng tế bào giác mạc trẻ sơ sinh PER.C6 [45] Ngoài ra còn rất nhiều dòng tế bào khác, ví dụ

dòng Hepatoma, dòng Caco-2, tuỳ thuộc đặc tính của virus vector và gen kháng

nguyên tái tổ hợp Các dòng tế bào này đều có ở Tổ chức tế bào quốc tế ATCC (American Type Culture Collection, http://www.atcc.org/) hoặc các hãng sinh

phẫm và dễ dàng đặt mua để sử dụng Chúng tôi đã mua HEK293 từ hãng

Stratagene

HEK293 là loại tế bào xơ thận bào thai người được phát triển thành dòng

tế bào thuần cách đây vài chục năm và chính thức được dùng để sản xuất vector tái tổ hợp HAd5 trong 20 năm gần đây, hiện nay được thương mại hóa, thông qua Tổ chức tế bào quốc tế (ATCC) với mã số thương mại [Cat No CRC-1573]) [65] Dòng tế bào này có thể tiếp truyền đến 20 đời trong môi trường thích ứng để thực hiện nghiên cứu và sản xuất vaccine (http://www.mbi.ufl.edu/~shaw/293.html)

PER.C6 là dòng tế bào giác mạc trẻ sơ sinh người, đã được tạo ra trong

những năm gần đây nhằm giải quyết nguồn tế bào dòng thuần an toàn để sản xuất các chế phẩm tái tổ hợp dùng cho người, trong đó có vacxin vector adenovirus Đây là tế bào dòng thuần đáp ứng sản xuất vacxin, kháng thể đơn dòng, cytokine, protein tái tổ hợp và protein hoạt chất sử dụng trong điều trị liệu

pháp gen (gene therapy) [50] Đối với vector adenovirus, do dòng tế bào này thiếu nguồn bổ sung gen và sản phẩm gen E1, nên vector nhân lên trong dòng tế

bào này thuộc loại thiểu năng, hay nói cách khác rất an toàn cho người và động

vật khi sử dụng làm vacxin [45]

911 hay còn gọi là HER ký hiệu 911, đó là dòng tế bào có nguồn gốc từ

nguyên bào giác mạc bào thai người (HER, Human Embryonic Retinoblast) và

là dòng tế bào có nhiều đặc tính tương đồng với HEK293, dễ gây nhiễm, tiếp nhận nhanh chóng plasmid adenovirus tái tổ hợp để hình thành virus HER (911) có đặc điểm nổi trội hơn HEK293 đó là sự hình thành plaque nhanh và rõ (sau 3 - 4 ngày) để phát hiện, do đó, tiết kiệm thời gian định lượng virus sau khi tạo ra Số lượng adenovirus thiểu năng (nhược độc) được tạo ra gấp 3 lần so với dòng HEK293 [29]

GH329 là dòng tế bào người xuất phát từ dòng thuần HeLa, biểu hiện sản

phẩm protein E1 trên cơ sở hoạt động của promoter lấy từ nguồn gen phosphoglycerate kinase Khả năng tiếp nhận và xúc tiến việc tạo nên adenovirus tái tổ hợp của dòng GH329 tương đương với HEK293 [32]

Đối với hệ thống adenovirus gia cầm FAd9, dòng tế bào u gan gà

Hepatoma của gà hay còn gọi là chicken hepatocellular carcinoma cell line, là

thích hợp nhất cho giai đoạn kiến tạo virus FAd9 mang gen kháng nguyên [41] Hepatoma dòng LMH (hoặc tương tự, dòng CH-SAH) là dòng tế bào thuần, có nguồn gốc tế bào khối u carcinoma tiên phát của gan gà (primary hepatocellular carcinoma) do Tomoyuki Kitagawa (Nhật bản) phát triển đầu tiên vào năm

1981, từ tế bào gan gà trống Leghorn, sau xử lý bằng hóa chất diethylnitrosamine một thời gian dài Tế bào có dạng hình thái dài, giống như tế bào tua (dendritic cell) Đây là dòng tế bào thuần, thích hợp cho lây nhiễm (transfection) để tạo giống virus FAd gia cầm mới

2.3 Mô tả công nghệ adenovirus tái tổ hợp mà đề tài nghiên cứu ứng dụng

2.3.1 Đặt vấn đề

Công nghệ vector adenovirus tái tổ hợp được hiểu là lĩnh vực ứng dụng một loạt các kỹ thuật sinh học phân tử và phương pháp tế bào học, để tạo nên một loại adenovirus tái tổ hợp nhược độc, có hệ gen vector làm nền đã được mang gen kháng nguyên có chủ định, để làm vacxin Sau khi tạo ra, adenovirus tái tổ hợp là loại virus sống, nhược độc, có khả năng nhân lên, nhưng chỉ ở trong tế bào đặc thù thích ứng, nơi có đầy đủ điều kiện để chúng thực hiện các quá trình nhân lên và bao gói thành hạt virus của mình

Khi nuôi cấy tế bào, có cung cấp điều kiện thuận lợi cho virus nhân lên, adenovirus nhược độc vacxin có khả năng cho thu hoạch hiệu giá virus đạt đến

109-10PFU/ml (plaque forming unit), thông thường khoảng 108PFU/ml, mà mỗi liều vacxin chỉ cần 105PFU, như vậy, 1 ml nuôi cấy tế bào nhiễm có thể cung cấp khoảng 1.000 - 10.000 liều vacxin, rất có ý nghĩa kinh tế [14,26]

2.3.2 Đối với hệ thống HAd5

HAd5 là hệ thống adenovirus có nguồn gốc từ người (human adenovirus type 5), vùng tiếp nhận gen kháng nguyên là nơi có thể gài vào đó đoạn DNA

ngoại lai dài đến 7,5 kb Hệ gen adenovirus đã được cắt bỏ các vùng gen “độc”

không phù hợp (gen E1 và E3) để làm nhược độc, sử dụng làm vector vacxin

Các vị trí cắt bỏ các gen này chính là nơi nhường chỗ cho vị trí cài “hộp gen

kháng nguyên” ngoại lai vào

Để hoàn thiện công nghệ vector HAd5 adenovirus tái tổ hợp, cần có các nguồn nguyên liệu sau: i) DNA plasmid chứa hệ gen adenovirus nhược độc

HAd5 (plasmid pAdEasy-1); ii) DNA plasmid con thoi (plasmid pShuttle-CMV)

và tái tổ hợp chứa hộp gen kháng nguyên; iii) Các dòng tế bào E coli đơn thuần

để chuyển nạp lưu giữ các plasmid này (dòng tế bào E coli DH5α, chẳng hạn);

iv) Dòng tế bào E coli đặc thù, chủng BJ5183, để gây đồng nhiễm tạo plasmid adenovirus tái tổ hợp (dòng tế bào E coli BJ5183); v) Các enzyme giới hạn đặc chủng PmeI và PacI để thao tác (enzyme giới hạn); vi) Dòng tế bào động vật chuyên biệt HEK293 để kiến tạo hạt adenovirus tái tổ hợp đầy đủ (dòng tế bào

động vật); vii) Các nguyên vật liệu dung môi phụ trợ (vật liệu môi trường) [26]

Hình 2.4 Công nghệ tạo vector adenovirus tái tổ hợp chứa gen kháng nguyên

VP2, sử dụng hệ thống AdEasy™ Adenoviral Vector System (Stratagene Inc.)

Mô tả chi tiết các bước 1-5 được trình bày trong bài

1

2

3 Đồng nhiễmtrong E coli

Plasmid vector adenovirus

Plasmid con thoi

SẢN XUẤT VACCINE 5

Plasmid con thoi

SẢN XUẤT VACCINE 5

1

2

3 Đồng nhiễmtrong E coli

Plasmid vector adenovirus

Plasmid con thoi

SẢN XUẤT VACCINE 5

VP2

Có thể mô tả vắn tắt lược trình thực hiện đối với gen VP2 của virus

Gumboro, sử dụng hệ thống HAd5, như sau:

Bước 1 Gen kháng nguyên VP2 (1356 bp) của virus Gumboro thu nhận

bằng cặp mồi đặc hiệu được lưu giữ trong plasmid tách dòng Sử dụng các mồi chuyên biệt (có chuỗi Kozak và enzyme giới hạn thích hợp) thu nhận DNA

“hộp gen kháng nguyên VP2”, sau khi cắt bằng enzyme giới hạn, được gài vào ngay sau chuỗi promoter CMV của plasmid pShuttle-CMV; để tạo nên pShuttle-

CMV-Kozak-VP2 Gen VP2 được định vị tại vùng DNA thuộc “tay trái” (left

arm) của hệ gen adenovirus HAd5 Plasmid pShuttle-CMV-Kozak-VP2 được

chuyển nạp vào dòng E coli đơn thuần (DH5α) và tách chiết DNA vector con thoi tái tổ hợp, chuẩn bị cho thao tác tiếp theo

Bước 2 Plasmid vector adenovirus (HAd5) là pAdEasy-1 vector (kích thước

33,5 kb) do hãng Stratagene thiết kế và cung cấp Sau khi mua về, DNA của

vector pAdEasy-1 được chuyển nạp vào dòng E coli đơn thuần (DH5α) và tách

chiết DNA vector pAdEasy-1, chuẩn bị cho các thao tác tiếp theo

Bước 3 DNA plasmid con thoi pShuttle-CMV-Kozak-VP2 được cắt bằng

enzyme PmeI, loại bỏ phần DNA của vector, chỉ lấy đoạn DNA giới hạn trong

điểm cắt của PmeI có chứa hộp gen VP2 (gọi là DNA-VP2(PmeI)) Chuẩn bị tế

bào E coli dòng BJ5183 Lấy DNA plasmid pAdEasy-1 và đoạn

DNA-VP2(PmeI) cho vào ống tế bào E coli dòng BJ5183 rồi thực hiện gây đồng

nhiễm (homologous recombination) bằng phương pháp xung điện

(electroporation), để tạo ra plasmid adenovirus tái tổ hợp pAdEasy-VP2 Tách

chiết DNA của pAdEasy-VP2 chuẩn bị cho thao tác tiếp theo

Bước 4 DNA của plasmid pAdEasy-VP2 được cắt bằng enzyme PacI, loại

bỏ phần vector, chỉ lấy đoạn DNA giới hạn trong điểm cắt của PacI có chứa hộp gen VP2 và DNA của adenovirus, gọi là DNA-VP2-LITR/RITR(PacI) mạch thẳng Chuẩn bị tế bào động vật dòng HEK293 Lấy DNA-VP2- LITR/RITR(PacI)) hỗn hợp với tế bào HEK293 trong dung môi thích hợp, có

Lipofectin, sau đó cho môi trường nuôi cấy tế bào Chọn lọc adenovirus tái tổ

hợp bằng phương pháp úp mặt thạch (plaque forming method), sau khi phủ thạch, nuôi trong 7 - 10 ngày để phát hiện plaque Sau khi chuẩn độ, adenovirus

tái tổ hợp chứa hộp gen VP2, gọi là giống adenovirus-VP2, hoàn toàn là một

loại virus sống nhân lên tốt trên môi trường tế bào HEK293 hoặc tương đương

Bước 5 Giống adenovirus-VP2 được bảo quản, nuôi cấy để sản xuất virus

làm vacxin theo qui trình công nghệ tế bào thường qui

2.3.3 Đối với hệ thống FAd9 gia cầm

Các bước thực hiện cũng tương tự như đối với hệ thống HAd5, nhưng

“hộp gen kháng nguyên VP2” được thiết kế khác hơn, đó là đoạn DNA bao gồm

đầy đủ chuỗi promoter CMV (606 bp); chuỗi Kozak; gen VP2 (1356 bp) và chuỗi tín hiệu polyA (hộp gen VP2 là: CMV-Kozak-VP2-PolyA), có cấu trúc hoàn thiện, dù quay trái (left) hay quay phải (right) vẫn bảo đảm là một hộp gen biểu hiện được, vì đã có đủ promoter CMV khởi động, gen VP2 biểu hiện và tín hiệu kết thúc polyA Hộp gen CMV-Kozak-VP2-PolyA) được gài nạp vào

plasmid trung gian p∆L2.4, rồi gây đồng nhiễm trong E coli BJ5183 để tạo

plasmid tái tổ hợp pPacFAdV9-VP2 DNA của plasmid pPacFAdV9-VP2 sau

đó được cắt bằng PacI, lây nhiễm vào tế bào Hepatoma dòng CH-SAH (giống

như dòng tế bào LMH) [41] Sàng lọc bằng phương pháp úp mặt thạch (plaque forming method); và sau khi phủ thạch, nuôi tế bào nhiễm virus trong 7 - 10 ngày để phát hiện plaque Sau khi chuẩn độ, adenovirus gia cầm FAd9 tái tổ

hợp chứa gen VP2, lúc này gọi là giống adenovirus nguyên gốc FAd9-VP2, hoàn toàn là một loại virus sống nhân lên tốt trên môi trường tế bào Hepatoma

(dòng CH-SAH hoặc LMH) Hoặc sau đó có thể chuyển được sang tiếp truyền

và nuôi trên môi trường tế bào gan phôi gà sơ cấp một lớp (primary chicken

embryo liver cell monolayer, CEL) để có giống gốc/giống cấp 1 và sản xuất vacxin

2.4 Tình hình nghiên cứu vacxin phòng bệnh Gumboro và ý nghĩa của phát triển vacxin thế hệ mới trên nền adenovirus làm vector

2.4.1 Giới thiệu virus gây bệnh Gumboro

Gumboro (lấy tên từ một địa danh ở Mỹ, nơi phát hiện bệnh đầu tiên vào năm 1962) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính do virus gây ra ở gia cầm, chủ yếu là ở gà 2 - 6 tuần tuổi, với tỷ lệ chết cao Tỷ lệ chết cao còn là hậu quả của suy giảm miễn dịch do virus gây ra và sự liên - tạp nhiễm các bệnh khác Cũng

do bị suy giảm miễn dịch, mọi chương trình vacxin phòng chống một số bệnh nguy hiểm khác ở gia cầm cũng bị ảnh hưởng, gây thiệt hại kinh tế lớn, đối với

gà nuôi công nghiệp [2] Tại Việt Nam, kể từ khi công bố phát hiện những năm

1980, Gumboro là một bệnh gây thiệt hại nặng nề và đã trở thành lĩnh vực nghiên cứu rất sâu rộng ở tất cả mọi góc độ về bệnh, chẩn đoán, dịch tễ, sinh học phân tử và vacxin truyền thống và thế hệ mới [1,2,5,6,7,8,9,10,11,12]

Virus Gumboro hay còn gọi là IBDV (infectious bursal disease virus) thuộc

họ BIRNAVIRIDAE, hệ gen chỉ chứa duy nhất RNA làm vật liệu di truyền Virus không có vỏ bọc ngoài cùng, rất nhỏ bé Xét về cấu trúc, virus Gumboro

có đường kính 58 - 60 nm, cấu trúc đối xứng khối bao gồm 32 capsomer tạo nên

vỏ capsid, đó là lớp vỏ đơn protein

Hình 2.5 Sơ đồ minh họa các phân đoạn A và B của hệ gen virus Gumboro

VP1 do phân đoạn B mã hóa; VP5, VP2, VP4, VP3 thuộc phân đoạn A, mã hóa

do 2 khung đọc mở (chiều mũi tên chạy); Vùng “siêu biến đổi” (hypervariable

region) nằm gần giữa gen VP2, có thể thu nhận bằng RT-PCR bằng cặp mồi GF-GR cho sản phẩm 474 bp

Hệ gen của IBDV chứa ribonucleic acid (RNA) gồm 2 phân đoạn A và B lồng vào nhau Phân đoạn B, có độ dài khoảng 2800, là một gen tổng hợp protein VP1, có hoạt tính sinh học chịu trách nhiệm là enzyme RNA polymerase

của virus Phân đoạn A, kích thước khoảng 3,2 kb, bao gồm một khung đọc mở

lớn (ORF, open reading frame) mã hóa cho một tiền protein, gọi là protein chung (polyprotein) có phân tử lượng là 108 kDa, được phân cắt thành 3 protein

cấu trúc là VP2, VP4, VP3; và một khung đọc mở nhỏ, mã hóa cho protein VP5, chạy cùng chiều và lồng vào khung đọc mở lớn [42](Hình 2.5)

VP2 và VP3 lần lượt tạo nên phần vỏ capsid bên ngoài và bên trong của virus, VP2 trình diện bề mặt, VP3 lặn sâu vào bên trong VP2 là phần gen đầu tiên trong chuỗi gen hợp nhất VP2-4-3, mã hóa cho protein chung của phân đoạn A (có độ dài 3039 bp), bao gồm bộ mã khởi đầu ATG (của VP2) và bộ mã kết thúc TGA (của VP3) Sau khi tổng hợp, polypeptide sắp xếp theo trật tự:

NH2-pVP2-VP4-VP3-COOH Từ đó, nhờ hoạt động của VP4 là enzyme

protease, polypeptide chung này được phân cắt thành VP2 nguyên thủy (pVP2, còn gọi là VPX) (48 kDa), VP3 (28 kDa) và VP4 (32 kDa); cuối cùng, polypeptide VP2 (VPX) được tém gọn lại tại đầu C (carboxyl, -COOH), để tạo nên VP2 trưởng thành có trọng lượng 37 kDa Chuỗi gen VP2 có độ dài 1356 bp, có bộ mã khởi đầu ATG, nhưng không có bộ mã kết thúc, vì tiếp nối vào đó là chuỗi nucleotide của VP4 [38] VP2 có độ bảo tồn cao về thành phần nucleotide ở hai đầu 5’ và 3’ và thành phần amino acid ở đầu tận cùng N (-NH2) và C (-COOH), nhưng lại

có một vùng khoảng gần ở chính giữa của gen rất thay đổi trong các chủng khác

nhau, nên được gọi là vùng “siêu biến đổi” (hypervariable region) Vùng này

thay đổi theo từng týp, chủng, và nhóm độc lực khác nhau, quyết định tính độc lực và tính kháng nguyên của virus, do vậy, cũng là vùng được chọn để so sánh, chẩn đoán, giám định và lập phả hệ các chủng virus cường độc Gumboro 66] Virus Gumboro có cấu trúc đơn giản và hệ gen chỉ bao gồm nucleotide mã hoá cho 5 thành phần protein Sau khi virus được thụ thể có trên bề mặt của màng tế bào tiếp nhận thì virus thực hiện quá trình xâm nhập sâu hơn Thụ thể

tế bào là một phần cấu trúc trên màng tế bào được biến đổi đặc hiệu để tiếp nhận virus Gumboro Quá trình xâm nhập xuyên qua màng tế bào được thực hiện theo cơ chế thông thường Giai đoạn tiếp theo là virus phải lột vỏ capsid để giải phóng hệ gen RNA Quá trình đầu tiên được thực hiện là virus sao chép thông tin và tổng hợp protein VP1 bởi vì VP1 có giá trị làm enzyme xúc tác RNA polymerase cho các quá trình tiếp theo

Tiếp theo là sự tổng hợp một protein chung từ phân đoạn A của RNA hệ gen virus Protein này được gọi là tiền protein có phân tử lượng là 108 kDa, tiếp tục được phân cắt thành 2 loại protein khác Một loại có tên gọi là VP2a có phân tử lượng 45 - 50 kDa Loại thứ hai là VP3 và VP4 có phân tử lượng là 35 - 60 kDa Sau đó, V2a được phân cắt tiếp thành VP2b có phân tử lượng 40 - 45 kDa và là thành phần bề mặt của vỏ capsid có trách nhiệm có tính kháng nguyên và tính độc lực của virus, hay còn được chính thức coi là VP2 kháng nguyên, thành phần tham gia phản ứng trung hoà (neutralization test) Còn VP3 và VP4 được phân cắt thành 2 loại hình protein riêng biệt Loại thứ nhất có phân tử lượng bé (28 kDa) gọi là VP4 có hoạt tính sinh học làm emzyme protease, giúp cho thao tác phân cắt protein khác nhau của virus Loại thứ hai có tên gọi là VP3 (30 -32 kDa) làm thành phần bên trong của vỏ capsid, là một protein cấu trúc, đó cũng

là thành phần tham gia phản ứng kết tủa khuếch tán trong thạch (phản ứng AGP

= agar gel precipitation) [27,63]

2.4.2 Vacxin truyền thống phòng bệnh Gumboro

Vacxin nhược độc Gumboro:

hiện nay có ba cấp độ vacxin Gumboro nhược độc đang sử dụng trên thế giới, dựa vào độc lực còn lại của loại vacxin đó trên gà mẫn cảm, tại thời điểm

sử dụng vacxin:

i) Vacxin nhược độc Gumboro có độ độc tương đối cao (relatively virulent

Gumboro vaccine) là loại có khả năng gây triệu chứng lâm sàng, bệnh tích và suy giảm miễn dịch đối với gà mẫn cảm; tuy kích thích miễn dịch tốt, nhưng

khả năng “lại độc” rất cao, do vậy, loại này hiện nay không còn được sử dụng ở

dạng vacxin nhược độc sống, chỉ để làm nguyên liệu sản xuất vacxin vô hoạt;

ii) Vacxin nhược độc Gumboro vô độc (avirulent Gumboro vaccine): Là

loại vacxin rất an toàn, không gây bất kỳ ảnh hưởng nào, nhưng kích thích miễn dịch kém;

iii) Vacxin nhược độc trung gian (intermediate Gumboro vaccine): có thể

dùng cho gà mẫn cảm, gà có kháng thể thụ động do mẹ truyền sang (dù với hàm lượng nhiều) mà không bị trung hoà hết nguồn virus kháng nguyên có trong vacxin Do vậy, vacxin loại này được sử dụng khá rộng rãi, dùng theo phương

pháp “nhắc nhở”, hai lần cách nhau 10 - 14 ngày là tốt nhất, được sử dụng nhiều

nước trên thế giới hiện nay Loại này cũng có sức truyền ngang mạnh (horizontal transmission), nếu dùng liên tục trong phạm vi hẹp về địa lý (trong

cùng trại nuôi), thì về lý thuyết, chúng cũng có khả năng “tăng độc” (“lại độc”)

Một số vacxin nhược độc Gumboro được sản xuất từ một số chủng sau: i) Chủng SAL (Bursine, Salsbury Laboratories, Charlesty, IOWA); ii) Chủng BB (Bio-Burs, Agri - BioCorp Ithaca, NEWYORK); iii) Chủng Lukert (University

of Georgia, Athens, GEORIA) (Lê Thanh Hòa, 2003)[2]

Vacxin vô hoạt Gumboro: là chế phẩm được tạo ra bằng cách vô hoạt

virus cường độc hoặc virus nhược độc có đặc tính kháng nguyên cao, chủ yếu bằng hoá học (sử dụng Bêta - propiolactone); tạo nên vacxin là không ở dạng virus sống (bị vô hoạt, bất hoạt), nhưng vẫn đảm bảo còn tính kháng nguyên, do cấu trúc protein trên bề mặt virus không bị thay đổi Có một số loại: i) Loại tốt nhất hiện nay là vacxin dùng 80% nhũ dầu với 20% nước, có cho thêm chất điều

hoà huyễn dịch, đó là vacxin vô hoạt Gumboro nhũ dầu-nước (inactivated

Gumboro vaccine in water-in-oil emulsions) Nhiều năm trước đây, ở Việt Nam

đã có loại vacxin vô hoạt Gumboro nhập từ Pháp có tên gọi là GUMBORIFFA, mỗi liều chứa 105,7 CCID50 virus Gumboro chủng VNJO đã được vô hoạt và bổ trợ bằng nhũ dầu; ii) Cũng đã xuất hiện tại Việt Nam loại vacxin nhị giá vô hoạt Gumboro - Dịch tả gà, cũng do Pháp sản xuất, mỗi liều chứa 105,7 CCID50 virus