Nghiên cứu quy trình công nghệ sản xuất vắc xin rota sống, uống giảm độc lực phòng bệnh tiêu chảy ở việt nam

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC 10/06-10 BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI/DỰ ÁN Đề tài: NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮC

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC 10/06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI/DỰ ÁN

Đề tài: NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮC XIN ROTA SỐNG, UỐNG GIẢM ĐỘC LỰC PHÒNG BỆNH TIÊU

CHẢY Ở VIỆT NAM

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ

CHƯƠNG TRÌNH KHCN CẤP NHÀ NƯỚC KC 10/06-10

BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI/DỰ ÁN

Đề tài: NGHIÊN CỨU QUI TRÌNH CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT VẮC XIN ROTA SỐNG, UỐNG GIẢM ĐỘC LỰC PHÒNG BỆNH TIÊU

CHẢY Ở VIỆT NAM

Mã số: KC.10.03/06 – 10

Chủ nhiệm đề tài/dự án: Cơ quan chủ trì đề tài/dự án:

(ký tên) (ký tên và đóng dấu)

PGS.TS Lê Thị Luân Nguyễn Đăng Hiên

Ban chủ nhiệm chương trình Bộ Khoa học và Công nghệ

(ký tên) (ký tên và đóng dấu khi gửi lưu trữ)

Hà Nội – 2010

TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT

VẮC XIN VÀ SINH PHẨM Y TẾ

_

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà Nội, ngày tháng năm 2010.

BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI/DỰ ÁN SXTN

I THÔNG TIN CHUNG

1 Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu Qui trình công nghệ sản xuất vắc xin Rota

sống, uống giảm độc lực phòng bệnh tiêu chảy ở Việt Nam

Mã số đề tài, dự án: KC.10/06-10

Thuộc:

- Chương trình (tên, mã số chương trình): Nghiên cứu ứng dụng và

phát triển công nghệ phục vụ bảo vệ và chăm sóc sức khỏe cộng đồng

2 Chủ nhiệm đề tài/dự án:

Họ và tên: Lê Thị Luân

Ngày, tháng, năm sinh: 17/5/1962 Nam/ Nữ: Nữ

Học hàm, học vị: Phó giáo sư, tiến sĩ

Chức danh khoa học: Phó Giáo sư Chức vụ Phó Giám đốc

Điện thoại: Tổ chức: 3 9710581 Nhà riêng: 3 628528 Mobile: 0904001727

Fax: 3 8213203 E-mail: luanpolyvac@gmail.com hoặc poliovac@fpt.vn

Tên tổ chức đang công tác:Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và

Sinh phẩm Y tế

Địa chỉ tổ chức: 135 Lò Đúc, Hai Bà Trưng, Hà Nội

Địa chỉ nhà riêng: Phòng 303 Khu tập thể Viện kiểm sát 622/11 Minh

Khai, Hai Bà Trưng, Hà Nội

Địa chỉ: 135 Lò Đúc, Hai Bà Trưng, Hà Nội

Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Nguyễn Đăng Hiền

Số tài khoản: 93101186

Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Hai Bà Trưng, Hà Nội

Tên cơ quan chủ quản đề tài: Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế

II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN

1 Thời gian thực hiện đề tài/dự án:

- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 04/ năm 2007 đến tháng 12/ năm 2008

- Thực tế thực hiện: từ tháng 01/năm 2007 đến tháng 12/năm 2008

Thời gian (Tháng, năm)

Kinh phí (Tr.đ)

Ghi chú

(Số đề nghị quyết toán)

c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

2 Ngày 7/3/2006 Biên bản họp Hội đồng KH&CN đánh giá hồ sơ đăng ký tuyển

chọn, xét chọn tổ chức và cá nhân chủ trì đề tài, dự án SXTN cấp nhà nước

3 Số

775/QĐ-BKHCN ngày

19/4/2006

Quyết định phê duyệt tổ chức cá nhân trúng tuyển chủ trì thực hiện

đề tài, dự án SXTN năm 2006 thuộc lĩnh vực Y dược và sức khỏe cộng đồng

4 Số

2096/QĐ-BKHCN ngày

22/9/2006

Quyết định phê duyệt Chủ nhiệm, Cơ quan chủ trì và kinh phí các

đề tài, dự án bắt đầu thực hiện năm 2006 thuộc Chương trình KHCN trọng điểm cấp nhà nước 2006-2010 “Nghiên cứu ứng dụng

và phát triển công nghệ phục vụ bảo vệ, chăm sóc và nâng cao sức khỏe cộng đồng, mã số KC.10/06-10

4 Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án:

Nội dung tham gia chủ yếu Sản phẩm chủ yếu đạt được chú* Ghi

1 Viện Công

nghệ sinh học

Viện Công nghệ sinh học

5 Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:

(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10 người

Nội dung tham gia chính

Tham gia tạo chủng giống gốc, chủng sản xuất, văcxin;

Viết báo cáo tổng kết, bài báo khoa học, đào tạo cán

bộ

2 Đinh Duy Kháng Đinh Duy

Kháng

Xác định trình tự gen 4,

Sản xuất tế bào, xây dựng qui trình, xây dựng tiêu chuẩn cho chủng giống

Hoàn thiện hồ

sơ chủng, hồ

sơ sản xuất văcxin

Hồ sơ chủng, hồ sơ sản xuất văcxin

5 Ngô Thu Hường Ngô Thu

Hường

Kiểm định tác nhân ngoại lai, kiểm định vắc xin bán thành phẩm

Kết quả kiểm định tác nhân ngoại lai và văc xin bán thành phẩm

6 Nguyễn Thị Mai Nguyễn Thị Kiểm định tác Kết quả kiểm định tác

Hương Mai Hương nhân ngoại

lai, kiểm định vắc xin bán thành phẩm;

Xác định trình tự gen

nhân ngoại lai, vắc xin bán thành phẩm, trình tự gen

7 Trần Bích Hạnh Trần Bích

Hạnh Kiểm vắc xin bán định

thành phẩm, thành phẩm

Kết quả kiểm định vắc xin bán thành phẩm, thành phẩm

8 Trần Hồng Thủy Trần Hồng

Thủy

Sản xuất môi trường cho sản xuất và kiểm định hệ thống chủng

và vắc xin

Các loại môi trường cho sản xuất và kiểm định hệ thống chủng và vắc xin

9 Nguyễn Nữ Anh

Thu

Nguyễn Nữ Anh Thu

Lưu giữ và bảo quản hệ thống chủng

(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên

tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người

1 Cử 02 cán bộ sang Trung tâm Kiểm soát và

Phòng ngừa bệnh tật (CDC), Atlanta, Mỹ

đào tạo về kiểm tra chất lượng hệ thống

chủng giống sản xuất vắc xin và vắc xin

trong thời gian 60 ngày với kinh phí 256

triệu đồng

02 cán bộ đã sang Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa bệnh tật (CDC), Atlanta, Mỹ đào tạo về kiểm tra chất lượng hệ thống chủng giống sản xuất vắc xin và vắc xin trong thời gian 60 ngày với kinh phí 256 triệu đồng

7 Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:

8 Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:

(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát trong nước và nước ngoài)

3 Sản xuất và kiểm định

vawcxin rota đơn týp

(5 loạt liên tiếp)

6/2007

1/2007-6/2007

Lê Thị Luân Trần Bích Hạnh, Nguyễn Thúy Hường

12/2007

7/2007-Lê Thị Luân Trần Bích Hạnh, Nguyễn Thúy Hường

6 Xây dựng tiêu chuẩn cho

văcxin

6/2008

1/2008-6/2008

Lê Thị Luân Nguyễn Đăng Hiền

7 Viết báo cáo và chuẩn bị

nghiệm thu

12/2008

12/2008

6/2008-Lê Thị Luân

III SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN

1 Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:

Thực tế đạt được

630

G1P8 3.510 G1P4 4.700 G4P6

7.440 -Vô trùng theo tiêu

chuẩn Việt Nam và

-An toàn đặc hiệu theo

tiêu chuẩn WHO cho

13.240 -Vô trùng : không phát

-An toàn đặc hiệu theo

tiêu chuẩn WHO cho

Vô trùng: theo tiêu

chuẩn Việt Nam và

WHO

3

Hiệu giá >10 5,4 ffu/ml

Hồ sơ với đầy

đủ thông số theo qui định

2 Qui trình sản xuất và qui

trình kiểm định chủng sản

xuất (WS)

Hồ sơ với đầy

đủ thông số theo qui định

Hồ sơ với đầy

đủ thông số theo qui định

3 Qui trình công nghệ sản xuất

và kiểm định vắc xin rota

Qui trình sản xuất và kiểm định qui mô phòng thí nghiệm

Qui trình sản xuất và kiểm định qui mô phòng thí nghiệm

Trong phòng thí nghiệm

Tiêu chuẩn Tiêu chuẩn cơ

sở qui mô phòng thí nghiệm

Tiêu chuẩn cơ

sở qui mô phòng thí nghiệm

Tế bào vero Theo hướng dẫn

của WHO Theo hướng dẫn của WHO Chủng gốc giống (MS) Theo hướng dẫn

của WHO Theo hướng dẫn của WHO Chủng sản xuất (WS) Theo hướng dẫn

của WHO

Theo hướng dẫn của WHO

của WHO

Theo hướng dẫn của WHO Môi trường nuôi cấy tế bào

của WHO

Theo hướng dẫn của WHO

Con người Theo GMP Việt

Nam Theo GMP Việt Nam

thí nghiệm c) Sản phẩm Dạng IV

Yêu cầu khoa học cần đạt

Số

kế hoạch

Thực tế đạt được

Số lượng, nơi công bố

(Tạp chí, nhà

xuất bản)

13 Tạp chí y học

dự phòng

01 Báo cáo tại Hội

nghị 8thInternational Rotavirus Symposium, Istabul- Turkey

2 Tham gia đào tạo sau đại

học

01 thạc sĩ, 01 NCS

01 thạc sĩ, 01 NCS

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

3 Đào tạo đội ngũ cán bộ tại

Trung tâm

07 cán bộ 07 cán bộ Trung tâm

Nghiên cứu Sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế

4 Sản phẩm đăng ký sở hữu

trình sản xuất và chủng giống gốc virut vắc xin Rota ”

Cục sở hữu trí tuệ

d) Kết quả đào tạo:

Số lượng

Số

TT

Cấp đào tạo, Chuyên

hoạch

Thực tế đạt được

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây trồng:

Ghi chú

(Thời gian kết thúc)

2 Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:

a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:

(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công nghệ so với khu vực và thế giới…)

Kết quả thực hiện đề tài đã tạo ra các sản phẩm khoa học sau:

+Hệ thống chủng giống cho sản xuất vắc xin phòng bệnh tiêu chảy cho trẻ

em Việt Nam, góp phần vào mục đích chăm sóc sức khỏe cộng đồng;

+ Qui trình công nghệ sản xuất vắc xin phòng bệnh tiêu chảy;

+ Vắc xin Rotavin-M1 cho thực địa lâm sàng chuẩn bị cho sản xuất đại trà thay thế vắc xin nhập ngoại với giá thành giảm 1/6

b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản phẩm cùng loại trên thị trường…)

Hiệu quả về kinh tế: theo nghiên cứu tại các nước Châu Á nếu không có chương trình văcxin phòng tiêu chảy cho trẻ em thì ước tính 171.000 trẻ em Châu

Á sẽ bị tử vong do virus rota, 1,9 triệu trẻ em phải vào viện do tiêu chảy cấp và 13,5 triệu trẻ em phải điều trị ngoại trú trong 5 năm tới Chi phí y tế liên quan đến

sự kiện này lên tới 191 triệu đô la Mỹ Tuy nhiên gánh nặng này còn tăng cao hơn

với tổng kết giá chi phí xã hội như mất sản lượng (Projected cost- effectiveness

of Rotavirus Vaccination for Children in Asia JID 2005;192 suppl 1: 133-145) Tại nước ta văcxin rota đáp ứng cho trẻ em về phòng ngừa bệnh tiêu chảy mùa Đông và tiêu chảy do virus rota, bảo đảm chăm sóc sức khỏe trẻ em Cung cấp sản phẩm với chất lượng an toàn và giá thành hạ so với phải nhập ở nước ngoài Đồng thời giải quyết được công ăn việc làm cho một lực lượng đông đảo sinh viên đã tốt nghiệp nhưng chưa có việc làm Tạo cơ sở gắn kết thường xuyên công tác nghiên cứu, đào tạo, sản xuất có sự phối hợp hỗ trợ nhau để đạt hiệu quả cao Các nhà khoa học sẽ tham gia sản xuất để nâng cao năng lực kỹ thuật chuyên môn, kết hợp tốt hơn lý thuyết với thực hành Một phần cơ sở kỹ thuật của dự án

sẽ phục vụ cho công tác nghiên cứu và đào tạo trong lĩnh vực chuyên môn qua việc khai thác chung một số trang thiết bị hiện đại Phần lợi tức được nhà nước cho phép đầu tư trở lại các bộ phận nghiên cứu sẽ góp phần tăng cường điều kiện

kỹ thuật, nâng cấp cơ sở vật chất phục vụ cho công tác nghiên cứu khoa học tiếp theo

Hiệu quả về xã hội: Đề tài này sẽ tận dụng được một số trang thiết bị sẵn

có và một đội ngũ cán bộ khoa học kỹ thuật thành thạo đã làm vắc xin Bại liệt của nước ta Ngoài ra, nó còn tạo được sản phẩm mới phục vụ phòng bệnh cho cộng đồng và có thêm nhiều chỗ làm mới, thực hiện đúng chủ trương phát huy nội lực của Đảng đề ra Đây là một đề tài khoa học nhằm phục vụ sức khỏe nhân dân, đáp ứng mục tiêu chăm sóc sức khỏe ban đầu của Đảng và Nhà nước đã đề ra, làm cho trẻ em Việt Nam có đủ điều kiện phát triển về thể chất và tinh thần Dân tộc

ta sẽ có những thế hệ công dân khỏe mạnh để xây dựng đất nước ta giàu mạnh, sánh kịp với bạn bè năm châu Các bậc cha mẹ có điều kiện lao động làm việc tạo ra nhiều của cải cho bản thân và xã hội

3 Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:

Số

Thời gian thực hiện

và cấp kinh phí cho giai đoạn II trong năm 2007;

Văc xin cần được thử nghiệm lâm sàng ngay sau khi có kết quả tiền lâm sàng (trong phòng thí nghiệm), đề nghị Chương trình KC.10/06-10 cấp kinh phí cho thực địa lâm sàng để có sản phẩm sớm cho nhà nước

2 Lần 2 15/9/2008 Đề tài đang tiến hành theo đúng tiến

độ của hợp đồng đề ra, đề nghị Chương trình nghiệm thu giai đoạn I

và cấp kinh phí cho giai đoạn II trong năm 2007;

Văc xin cần được thử nghiệm lâm sàng ngay sau khi có kết quả tiền lâm sàng (trong phòng thí nghiệm), đề nghị Chương trình KC.10/06-10 cấp kinh phí cho thực địa lâm sàng để có sản phẩm sớm cho nhà nước

II Kiểm tra định

kỳ

theo tiến độ, vì vậy cần tiếp tục đẩy nhanh tiến độ các nội dung còn lại có thể hoạn thiện sớm hơn thời gian dự kiến;

Vắc xin cần được thử nghiệm lâm sàng ngay khi có kết quả tiền lâm sàng (trong phòng thí nghiệm), đề

nghị Chương trình KC.10/06-10 cấp kinh phí cho thực địa lâm sàng, để có sản phẩm sớm cho nhà nước

kỳ;

Nếu điều kiện cho phép đề tài nên tiến hành tổng kết và nghiệm thu đề tài sớm

kỳ;

Nếu điều kiện cho phép đề tài nên tiến hành tổng kết và nghiệm thu đề tài sớm

III Nghiệm thu cơ

sở

tài để làm rõ nghĩa hơn mục tiêu cũng như thời hạn của đề tài;

Trình bày qui trình nuôi, bảo quản tế bào vero tác riêng rẽ với Hồ sơ sản xuất, kiểm định tế bào;

Chuyển phần quy trình kiểm định từ phần phụ lục thành phần nội dung chính của đề tài;

Hội đồng đánh giá xếp loại sản phẩm

“Qui trình tách và bảo quản tế bào vero” thuộc đề tài ở mức độ xuất sắc

Bổ sung nguồn gốc virut gốc (Origin virus);

Trình bày qui trình tạo chủng chung cho 3 giòng khác nhau tách riêng rẽ với Hồ sơ sản xuất, kiểm định của từng lô sản phẩm;

Chuyển phần quy trình kiểm định từ phần phụ lục thành phần nội dung chính của đề tài;

Hội đồng đánh giá xếp loại sản phẩm

“Qui trình sản xuất và kiểm định

chủng giống gốc vắc xin rota (master seed) Sản xuất chủng giống gốc vắc xin rota (Master seed)” thuộc đề tài ở mức độ xuất sắc

tiêu chuẩn cơ sở, qui trình sản xuất vắc xin rota phòng tiêu chảy tại Việt Nam, qui trình kiểm định vắc xin rota phòng bệnh tiêu chảy tại Việt Nam, vắc xin rota, bài báo khoa học, sách chuyên khảo, sở hữu trí tuệ, đào tạo thạc sĩ, tiến sĩ kết quả xếp loại xuất sắc

Chủ nhiệm đề tài

(Họ tên, chữ ký)

Thủ trưởng tổ chức chủ trì

(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)

Mục lục

Trang

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 3

1.1 Virus học 3

1.1.1 Phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm chung 3

1.1.3 Hình thái và cấu trúc 4

1.1.3.1 Hình thái 4

1.1.3.2 Cấu trúc 4

1.1.4 Các thành phần hoá học của virus Rota và chức năng 5

1.1.4.1 Axit nucleic 5

1.1.4.2 Protein 7

1.1.5 Phân nhóm và týp huyết thanh 8

1.1.5.1 Phân nhóm 8

1.1.5.2 Týp huyết thanh 8

1.1.6 Tính chất hoá lý 9

1.1.6.1 Sức đề kháng với nhiệt độ 9

1.1.6.2 Tính bền vững với pH 10

1.6.6.3 Các tính chất khác 10

1.1.7 Nuôi cấy 10

1.1.8 Sự nhân lên của virus Rota trong tế bào 11

1.1.8.1 Giai đoạn hấp phụ, xâm nhập và cởi vỏ 11

1.1.8.2 Giai đoạn tổng hợp và sao chép 12

1.1.8.3 Giai đoạn lắp ráp và giải phóng 12

1.1.9 Khả năng gây bệnh 13

1.1.9.1 Khả năng gây bệnh thực nghiệm 13

1.1.9.2 Khả năng gây bệnh cho người 13

1.1.10 Cơ chế gây bệnh 14

1.1.11 Các triệu chứng của bệnh do virus Rota 14

1.1.12 Điều trị 15

1.2 Dịch tễ học 15

1.2.1 Nguồn bệnh 15

1.2.2 Lứa tuổi mắc bệnh 15

1.2.3 Mùa bệnh 15

1.2.4 Đường lây truyền 16

1.2.5 Miễn dịch 16

1.2.6 Tình hình nhiễm virus Rota trên thế giới 17

1.3 Tình hình nhiễm virus Rota tại Việt nam 18

1.4 Vắc xin phòng bệnh 20

1.4.1 Ứng cử viên vắc xin phòng tiêu chảy do virus Rota được sản xuất từ chủng virus Rota có nguồn gốc từ động vật 20

1.4.2 Ứng cử viên vắc xin phòng tiêu chảy do virus Rota tái tổ hợp 21

1.4.3 Ứng cử viên vắc xin phòng tiêu chảy do virus Rota được sản xuất từ chủng virus Rota có nguồn gốc từ người 22

1.4.4 Vắc xin Rota đã được phê chuẩn sử dụng 24

1.5 Hướng dẫn về sản xuất của Tổ chức Y tế Thế giới về vắc xin Rota sống uống 25

1.5.1 Định nghĩa 25

1.5.1.1 Tên quốc tế và tên thích hợp 25

1.5.1.2 Mô tả định nghĩa 25

1.5.1.3 Chế phẩm chuẩn quốc tế 26

1.5.1.4 Các thuật ngữ 26

1.5.2 Khuyến cáo chung cho nhà sản xuất 28

1.5.3 Kiểm tra nguồn nguyên liệu đầu 28

1.5.3.1 Nuôi cấy tế bào cho sản xuất virus 28

1.5.3.2 Chủng virus 31

1.5.4 Kiểm định sản xuất 34

1.5.4.1 Kiểm định nuôi cấy tế bào 34

1.5.4.2 Tế bào cho sản xuất 36

1.5.4.3 Kiểm tra mẻ gặt đơn 37

1.5.4.4 Bán thành phẩm cuối cùng 41

1.5.5 Đóng lọ 42

1.5.6 Kiểm tra sản phẩm cuối cùng 42

1.5.6.1 Vắc xin 42

1.5.6.2 Dung dịch pha loãng hay nước hồi chỉnh (với vắc xin đông khô) .44

1.5.7 Hồ sơ 44

1.5.8 Lấy mẫu 44

1.5.9 Nhãn 44

1.5.10 Phân phối và vận chuyển 45

1.5.11 Bảo quản và hạn sử dụng 46

1.5.11.1 Điều kiện bảo quản 46

1.5.11.2 Hạn sử dụng 46

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 47

2.1 Nguyên vật liệu và phương pháp tạo ngân hàng tế bào sản xuất Vero đời

137 47

2.2 Nguyên vật liệu và phương pháp nuôi cấy tế bào Vero dử dụng cho sản xuất chủng giống gốc, chủng sản xuất và vắc xin Rota 47

2.3 Nguyên liệu và phương pháp sản xuất chủng giống gốc virus Rota người .48

2.4 Nguyên vật liệu và phương pháp sản xuất chủng sản xuất virus Rota 50

2.5 Nguyên vật liệu và phương pháp sản xuất vắc xin Rota 51

2.5.1 Nguyên vật liệu và phương pháp sản xuất vắc xin đơn giá 51

2.5.2 Nguyên vật liệu cho sản xuất vắc xin thành phẩm 52

2.6 Nguyên vật liệu và phương pháp thử vô trùng chủng giống gốc, chủng sản xuất và vắc xin Rota, nước nổi nuôi tế bào, 53

2.6.1 Nguyên vật liệu 53

2.6.2 Các bước tiến hành 53

2.6.2.1 Chuẩn bị ống thử 53

2.6.2.2 Tiến hành thử 53

2.6.2.3 Đọc kết quả 54

2.6.2.4 Đánh giá kết quả 55

2.7.1 Nguyên vật liệu 55

2.7.2 Các bước tiến hành 55

2.7.2.1 Tách chiết ADN theo Kit QiaAmp DNA Mini Kit 55

2.7.2.2 Phản ứng nested PCR 56

2.7.2.3 Điện di 57

2.8 Nguyên vật liệu và phương pháp kiểm tra mycoplasma bằng phương pháp nuôi cấy 57

2.8.1 Vật liệu và dụng cụ 57

2.8.1.1.Môi trường lỏng 57

2.8.1.2 Dụng cụ 58

2.8.2 Các bước tiến hành 58

2.8.2.1 Quy trình phát hiện Mycoplasma 58

2.8.2.2 Chuẩn bị mẫu 59

2.8.2.3 Chuẩn bị chai môi trường thử 59

2.8.2.4 Lọc mẫu 60

2.8.2.5 Rửa lọc 60

2.8.2.6 Gây nhiễm – nuôi cấy 61

2.8.2.7 Cấy truyền 61

2.8.2.8 Đọc kết quả 62

2.8.2.9 Nhận định kết quả 62

2.8.2.10 Cấy truyền trên thạch 63

2.9 Nguyên vật liệu và phương pháp thử vi khuẩn lao 63

2.9.1 Vật liệu và dụng cụ 63

2.9.2 Các bước tiến hành 64

2.9.2.1 Chuẩn bị ống thử 64

2.9.2.2 Chuẩn bị mẫu 64

2.9.2.3 Gây nhiễm 65

2.9.2.4 Đọc kết quả 65

2.10 Nguyên vật liệu và phương pháp xác định virus gây hấp phụ hồng cầu 66 2.10.1 Vật liệu và dụng cụ 66

2.10.2 Các bước tiến hành 66

2.10.2.1 Yêu cầu 67

2.10.2.2 Chuẩn bị hồng cầu chuột lang 67

2.10.2.3 Chuẩn bị chai tế bào trước khi hấp phụ hồng cầu 68

2.10.2.4 Hấp phụ hồng cầu 68

2.10.2.5 Rửa chai tế bào sau khi hấp phụ hồng cầu 68

2.10.2.6 Đọc kết quả 68

2.10.2.7 Nhận định kết quả 68

2.11 Nguyên vật liệu cho thử nghiệm virus không gây hấp phụ hồng cầu trên tế bào thận thỏ tiên phát 68

2.11.1 Vật liệu và dụng cụ 68

2.11.2 Các bước tiến hành 69

2.11.2.1 Chuẩn bị tế bào 69

2.11.2.2 Gây nhiễm mẫu 69

2.11.2.3 Hấp phụ 70

2.11.2.4 Thêm môi trường duy trì MEM 2%BS 70

2.11.2.5 Đọc kết quả 7 ngày ghi biên bản 70

2.11.2.6 Đọc kết quả 70

2.11.2.7 Nhận định kết quả 70

2.12 Thử nghiệm virus không gây hấp phụ hồng cầu trên tế bào thận khỉ tiên phát 71

2.12.1.Vật liệu và dụng cụ 71

2.12.2 Các bước tiến hành 71

2.12.2.1 Chuẩn bị tế bào 71

2.12.2.2 Gây nhiễm mẫu 71

2.12.2.3 Hấp phụ 72

2.12.2.4 Thêm môi trường duy trì LHE 2%BS 72

2.12.2.5 Đọc kết quả 7 ngày ghi biên bản 72

2.12.2.6 Đọc kết quả 73 2.12.2.7 Nhận định kết quả 73 2.13 Nguyên vật liệu và phương pháp thử nghiệm virus không gây hấp phụ hồng cầu trên tế bào thận khỉ xanh phi châu (Vero) 73 2.13.1.Vật liệu và dụng cụ 73 2.13.2 Các bước tiến hành 73 2.13.2.1 Chuẩn bị tế bào 73 2.13.2.2 Gây nhiễm mẫu 74 2.13.2.3 Hấp phụ 74 2.13.2.4 Thêm môi trường duy trì MEM 2%FBS 75 2.13.2.5 Đọc kết quả 7 ngày ghi biên bản 75 2.13.2.6 Đọc kết quả 75 2.13.2.7 Nhận định kết quả 75 2.14 Nguyên vật liệu và phương pháp xác định virus không gây hấp phụ hồng cầu trên tế bào Hep2 75 2.14.1 Vật liệu và dụng cụ 75 2.14.2 Các bước tiến hành 76 2.14.2.1 Chuẩn bị tế bào 76 2.14.2.2 Gây nhiễm mẫu 76 2.14.2.3 Hấp phụ 77 2.14.2.4 Thêm môi trường duy trì MEM 2%FBS 77 2.14.2.5 Đọc kết quả 7 ngày ghi biên bản 77 2.14.2.6 Đọc kết quả 77 2.14.2.7 Nhận định kết quả 77 2.15 Xác định nhận dạng virus Rota 78 2.15.1 Nguyên vật liệu 78 2.15.2 Phương pháp sinh học phân tử xác định týp 81 2.15.2.1 Phương pháp Tách chiết ARN sợi kép của vi rút Rota từ mẫu nuôi cấy tế bào bằng Nuclisens Kit 82 2.15.2.2 Phản ứng chuỗi polimeraza khuếch đại sao chép ngược (RT - PCR) xác định gen 9 (G1, 2, 3, 4, 9) 83 2.15.2.3 Phản ứng chuỗi polimeraza khuếch đại sao chép ngược xác định gen 4 (P4, 6, 8, 9,10, 11) 84 2.15.2.4 Phương pháp điện di trên gel agarose 85 2.16 Nguyên vật liệu và phương pháp xác định hiệu giá virus Rota bằng

phương pháp miễn dịch huỳnh quang 88 2.16.1 Nguyên vật liệu nghiên cứu 88 2.16.2 Phương pháp tiến hành 88

2.16.3 Đọc kết quả 89 2.17 Nguyên vật liệu Xác định hiệu giá virus Rota bằng phương pháp miễn dịch gắn enzym (EIA) 92 2.17.1 Nguyên vật liệu 92 2.17.2 Phương pháp tiến hành 92 2.17.2.1 Nguyên lý 92 2.17.2.2 Tiến hành làm phản ứng 93

2.17.2.3 Đọc kết quả 94

2.18 Phương pháp xác định hình thể virus Rota bằng kính hiển vi điện tử 95 2.18.1 Vật liệu 95 2.18.2 Phương pháp tiến hành 95 2.18.3 Kết quả 96 2.19 Nguyên vật liệu và phương pháp xác định an toàn trên động vật thí

nghiệm 99 2.19.1 Vật liệu 100 2.19.2 Phương pháp 101 2.20 Nguyên vật liệu và phương pháp thử an toàn và đáp ứng miễn dịch trên khỉ 105 2.20.1 Nguyên vật liệu và dụng cụ 105 2.20.2 Các bước tiến hành 105 2.20.2.1 Chọn lọc khỉ 105 2.20.2.2 Chuẩn bị mẫu thử nghiệm 105 2.20.3 Pha mẫu thử nghiệm 106 2.21 Xác định kháng thể trung hòa bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang 109 2.21.1 Nguyên vật liệu và dụng cụ 109 2.21.2 Các bước tiến hành 110 2.22 Phương pháp xác định trình tự gen 4(VP4), 6(VP6), 9(VP7), 10(NSP4) của virus Rota 112 2.22.1 Nguyên vật liệu 112 2.22.2 Các bước tiến hành 114 2.23 Xác định AND tồn dư của tế bào Vero trong vắc xin 121 2.23.1 Nguyên vật liệu và dụng cụ 121 2.23.2.Các bước tiến hành 121 2.23.2.1 Chuẩn bị mẫu 121 2.23.2.2 Tiến hành đo 121 2.23.3 Nhận định kết quả 122 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ 123

3.1 Chủng Rota giống gốc 123 3.1.1 Kết quả sản xuất chủng Rota giống gốc (Pl5-MS) 123 3.1.1.1 Tế bào sử dụng sản xuất chủng virus Rota giống gốc 123 3.1.1.2 Thể tích và hiệu giá chủng giống gốc 125 3.1.2 Kết quả kiểm định chủng virus Rota giống gốc 126 3.1.2.1 Kết quả hình ảnh chủng virus Rota giống gốc trên kính hiển vi điện tử 126 3.1.2.2 Kết quả nhận dạng chủng virus Rota giống gốc 127 3.1.2.3 Kết quả trình tự gen chủng virus Rota giống gốc 129 3.1.2.4 Xác định 11 đoạn ARN của chủng giống gốc bằng SDS-Page 130 3.1.2.5 Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai trong hỗn dịch chủng 130 3.1.2.6 Kết quả thủ nghiệm an toàn trên khỉ thực nghiệm 134 3.1.2.7 Kết quả đáp ứng miễn dịch trên khỉ thực nghiệm 135 3.2 Chủng sản xuất 138 3.2.1 Kết quả sản xuất chủng sản xuất 138 3.2.1.1 Tế bào Vero sử dụng cho sản xuất chủng sản xuất 138 3.2.1.2 Kết quả sản xuất chủng sản xuất G1P8 140 3.2.1.3 Kết quả sản xuất chủng sản xuất G1P4 141 3.2.1.4 Kết quả sản xuất chủng G4P6 143 3.2.2 Kết quả kiểm định chủng sản xuất virus Rota 145 3.2.2.1 Kết quả nhận dạng chủng sản xuất virus Rota 145 3.2.2.2 Kết quả trình tự gen chủng sản xuất virus Rota 148 3.2.2.3 Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai trong hỗn dịch chủng 149 3.2.2.5 Kết quả thủ nghiệm an toàn trên khỉ thực nghiệm 152 3.2.2.6 Kết quả đáp ứng miễn dịch trên khỉ thực nghiệm 153 3.3 Xác định liều gây nhiễm chủng virus Rota trên tế bào Vero 156 3.4 Sản xuất vắc xin 158 3.4.1 Sản xuất vắc xin G1P8 158 3.4.2 Sản xuất vắc xin G1P4 163 3.4.3 Sản xuất vắc xin G4P6 169 3.5 Kết quả kiểm định vắc xin hộn thô 174 3.5.1 Kết quả nhận dạng vắc xin Rota 174 3.5.3 Kết quả trình tự gen 4, 6, 9, 10 vắc xin Rota 176 3.5.4 Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai trong hỗn dịch vắc xin 176 3.6 Kết quả kiểm định vắc xin sau lọc 180 3.7 Kết quả pha vắc xin thành phẩm 184 3.7.1 Rotavin M1 184 3.7.2 Rotavin M4 185

3.7.3 Rotavin B 185 3.7.4 Rotavin T 186 3.8 Kết quả thử nghiệm vắc xin Rotavin tiền lâm sàng 187 3.8.1 Kết quả trong phòng thí nghiệm 187 3.8.2 Kết quả an toàn chung trên động vật thí nghiệm 188 3.8.3 Kết quả thử an toàn và đáp ứng miễn dịch trên khỉ 191 3.8.3.1 Kết quả an toàn 191 3.8.3.2 Kết quả đáp ứng miễn dịch 192 KẾT LUẬN 198 KIẾN NGHỊ 199 TÀI LIỆU THAM KHẢO 200

Danh mục các bảng

Bảng 1: Độ lớn các gen của virus Rota 6 Bảng 2: Đặc điểm protein của virus Rota 7 Bảng 4 Chủng virus Rota lưu hành gây bệnh tại Việt Nam từ 1998-2004 (P týp) 19 Bảng 5 Vật liệu và hoá chất dùng cho quá trình chạy PCR 78 Bảng 6 Các primer đặc hiệu cho kiểu gen G 1, 2, 3, 4, 9 (Mỹ) 79 Bảng 7 Các primer đặc hiệu cho kiểu gen P 4, 6, 8, 9, 10 (Mỹ) 79 Bảng 8 Vật liệu để xác định gen 9 của virút Rota (G genotype) 80 Bảng 9 Vật liệu để xác định gen 4 của virút Rota (P genotype) 80 Bảng 10 Tế bào Vero sản xuất chủng virus Rota giống gốc G1P8 123 Bảng 11 Tế bào Vero sản xuất chủng virus Rota giống gốc G1P4 124 Bảng 12 Tế bào Vero sản xuất chủng virus Rota giống gốc G4P6 124 Bảng 13 Thể tích và hiệu giá chủng virus Rota giống gốc 125 Bảng 14 Hiệu giá chủng virus Rota trên chai nuôi cấy tròn (RB) và phẳng

(Flash) 126 Bảng 15 Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai trong hỗn dịch virus chủng giống gốc bằng phương pháp PCR 130 Bảng 16 Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai trên nuôi cấy tế bào 131 Bảng 17 Kết quả an toàn trên thỏ thí nghiệm 131 Bảng 18 Kết quả an toàn trên chuột lang thí nghiệm 132 Bảng 19 Kết quả an toàn trên chuột nhắt thí nghiệm 133 Bảng 20 Kết quả an toàn trên chuột ổ thí nghiệm 133 Bảng 21 Kết quả an toàn trên khỉ thí nghiệm 134 Bảng 22 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm chủng G1P8MS 135 Bảng 23 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm chủng G1P4MS 136 Bảng 24 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm chủng G4P6MS 137 Bảng 25 Thông tin về tế bào Vero sử dụng cho sản xuất chủng sản xuất 139 Bảng 26.Tế bào Vero sử dụng cho sản xuất chủng sản xuất 140 Bảng 27 Thể tích chủng sản xuất G1P8 140 Bảng 28 Hiệu giá chủng sản xuất G1P8 141 Bảng 29 Tế bào Vero sử dụng cho sản xuất chủng sản xuất 141 Bảng 30 Thể tích chủng sản xuất G1P4 142 Bảng 31 Hiệu giá chủng sản xuất G1P4 142 Bảng 32 Tế bào Vero sử dụng cho sản xuất chủng sản xuất 143 Bảng 33 Thể tích chủng sản xuất G4P6 144 Bảng 34 Hiệu giá chủng sản xuất G4P6 144

Bảng 35 Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai trong hỗn dịch virus chủng sản xuất bằng phương pháp PCR 149 Bảng 36 Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai trên nuôi cấy tế bào 149 Bảng 37 Kết quả an toàn trên thỏ thí nghiệm 150 Bảng 38 Kết quả an toàn trên chuột lang thí nghiệm 150 Bảng 39 Kết quả an toàn trên chuột nhắt thí nghiệm 151 Bảng 40 Kết quả an toàn trên chuột ổ thí nghiệm 151 Bảng 41 Kết quả an toàn trên khỉ thí nghiệm 152 Bảng 42 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm chủng G1P8WS 153 Bảng 43 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm chủng G1P4WS 154 Bảng 44 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm chủng G4P6WS 154 Bảng 45 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm hỗn hợp 3 chủng: G1P8WS; G1P4WS; G4P6WS 155 Bảng 46 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ đối chứng 156 Bảng 47 Liều gây nhiễm chủng G1P8 156 Bảng 48 Liều gây nhiễm chủng G1P4 157 Bảng 49 Liều gây nhiễm chủng G4P6 157 Bảng 50 Thông tin về tế bào Vero sử dụng cho sản xuất vắc xin G1P8 159 Bảng 51.Tế bào Vero sử dụng cho sản xuất vắc xin G1P8 159 Bảng 52 Thể tích Vắc xin G1P8 160 Bảng 53 Hiệu giá vắc xin G1P8 162 Bảng 54 Thông tin về tế bào Vero sử dụng cho sản xuất vắc xin G1P4 163 Bảng 55 Tế bào Vero sử dụng cho sản xuất vắc xin G1P4 164 Bảng 56 Thể tích Vắc xin G1P4 165 Bảng 57 Hiệu giá vắc xin G1P4 bán thành phẩm(M2B) 167 Bảng 58 Thông tin về tế bào Vero sử dụng cho sản xuất vắc xin G4P6 169 Bảng 59.Tế bào Vero sử dụng cho sản xuất vắc xin G4P6 170 Bảng 60 Thể tích Vắc xin G4P6 bán thành phẩm M4B 171 Bảng 61 Hiệu giá vắc xin G4P6 bán thành phẩm 173 Bảng 62 Kết quả kiểm tra vi khuẩn, nấm, mycoplasma, lao trong hỗn dịch vắc xin bằng phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy 177 Bảng 63 Kết quả kiểm tra tác nhân ngoại lai trên nuôi cấy tế bào 177 Bảng 64 Kết quả an toàn trên thỏ thí nghiệm 177 Bảng 65 Kết quả an toàn trên chuột lang thí nghiệm 178 Bảng 66 Kết quả an toàn trên chuột nhắt thí nghiệm 179 Bảng 67 Kết quả an toàn trên chuột ổ thí nghiệm 179 Bảng 68 Chất lượng vắc xin G1P8 sau lọc 180 Bảng 69 Chất lượng vắc xin G1P4 sau lọc 181

Bảng 70 Chất lượng vắc xin G4P6 sau lọc 183 Bảng 71 Số lượng vắc xin thành phẩm 184 Bảng 72 Số lượng vắc xin thành phẩm 185 Bảng 73 Số lượng vắc xin thành phẩm 186 Bảng 74 Số lượng vắc xin thành phẩm 186 Bảng 75 Kết quả thử nghiệm vắc xin thành phẩm 187 Bảng 76a Trọng lượng chuột trong quá trình thử nghiệm 188 Bảng 76b Tính an toàn vắc xin thành phẩm trên chuột nhắt trắng 189 Bảng 76c Tính an toàn vắc xin thành phẩm trên chuột lang 190 Bảng 77a Trọng lượng và nhiệt độ của khỉ trong quá trình thử nghiệm 191 Bảng 77b An toàn vắc xin thành phẩm trên khỉ Macaca mulatta 192 Bảng 78 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm Rotarix (GSK) 192 Bảng 79 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm Rotavin M1 193 Bảng 80 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm Rotavin M4 194 Bảng 81 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm Rotavin Bi 195 Bảng 82 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm Rotavin T 197

Danh mục các sơ đồ

Sơ đồ 1: Quy trình phát hiện Mycoplasma 59

Sơ đồ 2 Sơ đồ tóm tắt tế bào Vero sử dụng cho sản xuất chủng virus Rota giống gốc 123

Sơ đồ 3: Tóm tắt qui trình sản xuất chủng sản xuất 138

Sơ đồ 4: Tóm tắt qui trình bảo quản tế bào Vero từ đời 134 -137 tại POLYVAC 138

Sơ đồ 5: Tóm tắt qui trình bảo quản tế bào Vero từ đời 134 -137 tại

VABIOTECH 139

Danh mục các biểu đồ

Biểu đồ 1 Sự phân bố của các chủng virus Rota trên toàn cầu 9 Biểu đồ 2 Sự phân bố chủng virus Rota (G týp) lưu hành tại Việt nam từ 1998 - 2004 19 Biểu đồ 3 Sự phân bố chủng virus Rota lưu hành tại Việt nam (P týp) từ 1998 - 2004 20 Biểu đồ 4 Hiệu giá chủng virus Rota trên chai nuôi cấy tròn (RB) và phẳng (Flash) 126 Biểu đồ 5 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm chủng G1P8MS 135 Biểu đồ 6 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm chủng G1P4MS 136

Biểu đồ 7 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm chủng G4P6MS 137 Biểu đồ 8 Hiệu giá chủng sản xuất G1P4 143 Biểu đồ 9 Hiệu giá chủng sản xuất G4P6 145 Biểu đồ 10 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm chủng G1P8WS 153 Biểu đồ 11 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm chủng G1P4WS 154 Biểu đồ 12 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm chủng G4P6WS 155 Biểu đồ 13 Hiệu giá vắc xin G1P8 163 Biểu đồ 14 Hiệu giá vắc xin G1P4 bán thành phẩm (M2B) 169 Biểu đồ 15 Hiệu giá vắc xin G4P6 bán thành phẩm 174 Biểu đồ 16 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm Rotarix (GSK) 193 Biểu đồ 17 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm Rotavin M1 194 Biểu đồ 18 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm Rotavin M4 195 Biểu đồ 19 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm Rotavin B 196 Biểu đồ 20 Hiệu giá kháng thể trung hoà trên khỉ thử nghiệm Rotavin T 197

Các kí hiệu và chữ viết tắt

ATCC American Type Correction Centre

CCID50 Cell culture infective dose 50(liều gây hủy hoại 50 % tế bào) CDC Center for Disease Control(Trung tâm Phòng chống và Kiểm

soát bệnh tật) DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium

ECACC Euopean Collection of Cell Cultures

EIA Enzyme Immuno Assay(phương pháp miễn dịch enzym)

ELIZA Enzyme Linked Immunosorbent Assay(phương pháp miễn dịch

gắn enzym) FBS Fetal Bovin serum(huyết thanh bê bào thai)

FFU Fluorescence Forcus Unit(đơn vị huỳnh quang)

G Glycoprotein

GMP Good Manufacture Practice(Thực hành sản xuất tốt)

HIV Human immunodeficiency virus(virus gây suy giảm miễn dịch ở

người)

IgM Imuno globulin M

MA104 Tế bào thận bào thai khỉ Rhesus

MCB Master Cell Bank(ngân hàng tế bào gốc)

MOI Multiplicities of infection(liều gây nhiễm)

NSP Non-structure protein(protein không cấu trúc)

P Proteaza

PAGE Polyarylamide gel electrophoresis(điện di trên gel

polyacrylamide) PBS Phospate Buffer Solution

PBS-T Phospate Buffer Solution-Tween

PFU Plaque forming unit(đơn vị tạo đám hoại tử)

POLYVAC Center for Research and Production ò Vaccine and Biologicals

(Trung tâm Nghiên cứu, sản xuất Vắc xin và Sinh phẩm Y tế)

QPCR Quantitative reverse transcription polymerase chain reaction

RB Roller bottle(chai tròn)

RRV-TV Rhesus Rotavirus-tetravalent vaccine

RT-PCR Reverse Transcription polymerase chain reaction (phản ứng

chuỗi polymeraza sao chép ngược)

TKTP Tế bào thận khỉ tiên phát

UV Ultraviolet

Vero Tế bào thận khỉ xanh Châu Phi

VLP Virus like particle

WCB Working Cell Bank(ngân hàng tế bào sản xuất)

WHO World Health Organization(Tổ chức Y tế Thế giới)

ĐẶT VẤN ĐỀ

Virus Rota là nguyên nhân hàng đầu gây bệnh tiêu chảy thể nặng ở trẻ sơ sinh

và trẻ nhỏ, chiếm tới 45% trong tổng số các trường hợp tiêu chảy thể nặng tại các nước phát triển và đang phát triển Hầu như toàn bộ trẻ em trên toàn thế giới bị nhiễm virus Rota ở độ tuổi 3-5 tuổi, bất kể các điều kiện kinh tế xã hội và điều kiện môi trường Hàng năm, virus Rota gây ra khoảng 111 triệu đợt bệnh viêm dạ dày ruột chỉ cần chăm sóc tại nhà và 25 triệu ca phải đến thăm khám tại các cơ sở Y tế, 2 triệu ca phải nhập viện và có từ 352.000 đến 592.000 ca tử vong (trung bình 440.000) ở trẻ em dưới 5 tuổi Trong số đó, khoảng 90% các ca nhập viện và 99% các ca tử vong xảy ra tại các nước đang phát triển, ước tính có khoảng 145.000 ca tử vong xảy ra do virus Rota xảy ra tại khu vực cận Sahan-châu Phi và xấp xỉ 200.000 ca tử vong xảy ra tại châu Á Tại châu Mỹ La tinh, hàng năm, có khoảng 75.000 ca vào nằm viện, trong đó,

có 15.000 ca chết Bệnh này không ảnh hưởng bởi cải thiện điều kiện vệ sinh và sức khoẻ Bệnh phòng được bằng vắc xin

Từ năm 1999, tại Châu Á, hệ thống giám sát bệnh tiêu chảy do virus Rota đã được thiết lập, trong đó, Việt Nam là một thành viên Theo thống kê trong 2 năm đầu tiên thực hiện ở 36 bệnh viện đã xác định được bệnh tiêu chảy do virus Rota chiếm 45% trong tổng số các ca tiêu chảy vì mọi nguyên nhân lớn gần gấp 2 lần con số thông báo trước đây (25%) Thông báo này dựa trên kết quả báo cáo của Trung Quốc, Thái Lan, Indonesia, Hồng Kông, Đài Loan, Hàn Quốc, Malaysia và Việt Nam

Tại nước ta, bệnh tiêu chảy do virus Rota được giám sát từ năm 1998, đề tài hợp tác và tài trợ với Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa bệnh tật CDC-Atlantta- Mỹ

và Tổ chức Y tế Thế giới WHO Đề tài này thực hiện giám sát tiêu chảy ở 6 bệnh viện

đó là: Bệnh Viện Nhi Đồng 1, 2 thành phố Hồ Chí Minh; Bệnh viện Nhi Hải Phòng; bệnh viện Nhi Khánh Hoà, bệnh viện Xanh Pôn Hà Nội và bệnh viện Nhi Thụy Điển Kết quả cho thấy, trong 11 ngàn bệnh phẩm thu được trong 5 năm giám sát, tiêu chảy

do virus Rota chiếm 55%-60% trường hợp Mặc dù chưa có số liệu thống kê về tỷ lệ

chết nhưng theo ước tính của Tổ chức Y tế Thế giới 20% trẻ em dưới 5 tuổi tử vong là

do virus Rota

Mục tiêu của đề tài:

1 Xây dựng qui trình công nghệ sản xuất vắc xin Rota sống uống giảm độc lực bảo đảm an toàn và hiệu lực;

2 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho vắc xin;

3 Gắn được với cơ sở sản xuất vắc xin

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Virus học

Năm 1973, Bishop và cộng sự quan sát dưới kính hiển vi điện tử mảnh sinh thiết niêm mạc ruột của một em bé chết vì tiêu chảy cấp đã phát hiện ra một loại virus

giống Reovirus, có đường kính 70nm Sau đó, virus này đã được đặt tên là virus Rota

vì hình thể của nó rất giống cái bánh xe với các nan hoa (hình1) Trước khám phá này thì căn nguyên gây tiêu chảy ở trẻ em chỉ được phát hiện từ 10% đến 30%

Trong vòng 5 năm (1973 - 1978), virus Rota đã được công nhận là nguyên nhân phổ biến nhất thường gây tiêu chảy ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ trên khắp thế giới, nhất là trẻ em dưới 5 tuổi Có khoảng 1/3 trường hợp tiêu chảy nặng do virus Rota ở trẻ em phải nằm viện

Ở Việt Nam, mãi đến năm 1980, mới nghiên cứu và xác định virus này là nguyên nhân chính gây nên bệnh tiêu chảy ở trẻ em [9, 10, 11] Tỷ lệ trung bình số trẻ mắc bệnh tiêu chảy cấp do virus Rota trong năm 1998 và 1999 ở Việt Nam là 56% và hàng năm số trẻ chết do virus Rota chiếm từ 4% - 8% trong tổng số trẻ dưới 5 tuổi bị chết vì mọi nguyên nhân

Việc phát hiện ra virus Rota là một trong những căn nguyên chính gây nên tiêu chảy ở trẻ em đã dẫn tới việc mở rộng các nghiên cứu nhằm tìm ra các biện pháp ngăn chặn, làm giảm tỉ lệ mắc và tử vong do căn bệnh này

1.1.1 Phân loại

Virus Rota thuộc họ Reoviridae Họ này gồm có các nhóm: Aqureovirus,

Coltivirus, Cypovirus, Fijivirus, Orbivirus, Phytoreovirus, Oryzavirus, Reovirus, Rotavirus,

1.1.2 Đặc điểm chung

Virus Rota thuộc họ Reoviridae nên mang những đặc điểm hình thái và hoá

sinh chung của họ này

Đặc điểm sinh học:

Hạt virus trưởng thành dạng khối cầu 20 mặt, đường kính khoảng 75nm Capsít gồm 3 lớp: Lớp ngoài, lớp trong và lớp lõi 60 cái gai kéo dài khoảng 120 dalton từ bề mặt nhẵn nhụi của lớp ngoài

Hạt virus chứa ARNpolymerase phụ thuộc ARN và các enzym khác có khả năng tổng hợp bản sao ARN

Bộ gen virus mang 11 đoạn ARN sợi kép và virus có khả năng sắp xếp lại gen

Sự sao chép xảy ra trong bào tương tế bào bị nhiễm virus

Nuôi cấy virus trong invitro thực hiện được nhờ enzym phân giải protein, enzym này tăng cường tính gây nhiễm bằng việc phân tách các gai polypeptit của capsit lớp ngoài

Virus có một cách tạo hình độc đáo: Hạt virus được hình thành bằng cách nảy chồi vào trong lưới nội sinh chất và có vỏ bao ngoài xuất hiện một cách tạm thời trong giai đoạn này Hạt virus trưởng thành không có vỏ bao ngoài, được giải phóng từ tế bào nhiễm bằng ly giải tế bào

1.1.3 Hình thái và cấu trúc

1.1.3.1 Hình thái

Những virus hoàn chỉnh có đường kính khoảng 75nm, giống hệt như một cái bánh xe có các gai ngắn và một cái vành rất nhẵn Tên virus Rota từ tiếng La tinh Rota có nghĩa là bánh xe bắt đầu bởi hình thái của nó

Hình 1 Hình ảnh virus Rota chụp dưới kính hiển vi điện tử 1.1.3.2 Cấu trúc

Dưới kính hiển vi điện tử, virus Rota có dạng khối cầu 20 mặt, đường kính khoảng 75nm, Chuỗi nucleocapsit của virus được tạo thành bởi 3 vòng xoắn đồng tâm gồm 11 đoạn ARN kép

Capsit của virus Rota có dạng đối xứng 20 mặt, 132 capsomer sắp xếp đối xứng xoắn Cấu trúc capsít của virus Rota gồm 3 lớp:

- Lớp ngoài chứa protein cấu trúc VP4 và VP7

- Lớp trong chứa protein cấu trúc VP6 là loại kháng nguyên đặc hiệu nhóm, chiếm 50% hạt virus và có thể được phát hiện trong kỹ thuật ELISA

- Lớp lõi chứa protein cấu trúc VP1, VP2 và VP3

Các nghiên cứu bằng kỹ thuật điện di miễn dịch và kính hiển vi điện tử đã khẳng định: Cápsít trong mang kháng nguyên đặc hiệu nhóm, capsít ngoài mang kháng nguyên đặc hiệu týp, nhân của virus không mang tính kháng nguyên

Hình 2 Hình minh họa cấu trúc của virus Rota [86]

Chú thích: - Neutralization antigen: Kháng nguyên trung hoà

- Subgroup antigen: Kháng nguyên phân nhóm

- Core: Lõi

1.1.4 Các thành phần hoá học của virus Rota và chức năng

1.1.4.1 Axit nucleic

Là ARN sợi kép gồm 11 gen, có độ lớn khoảng 18 nghìn cặp bazơ, trọng lượng

phân tử từ 11.106 - 14.106 dalton Mỗi gen có trọng lượng phân tử từ 2.105 - 2,2 106dalton và mã hoá cho một protein cấu trúc hoặc không cấu trúc Điện di trên gel polyacrylamit 11 gen này chia làm 4 khu vực Những gen này được đánh số theo thứ

tự phân bố của chúng trên bản gel, chẳng hạn gen nào di chuyển chậm nhất được đánh

số là gen 1

Đối với virus Rota nhóm A, có 4 gen có kích thước lớn, 2 gen trung bình, 3 gen nhỏ và 2 gen nhỏ nhất [ 49, 57] (hình 3, bảng1)

Hình 3 Sự phân bố các đoạn ARN của virus Rota nhóm A trên gel Polyacrylamit

Bảng 1: Độ lớn các gen của virus Rota

Đoạn gen Số cặp Bazơ G + C (%) Số Amino acid

Đoạn gen Số cặp Bazơ G + C (%) Số Amino acid

Ba protein mang tính đặc hiệu kháng nguyên của virus là VP4, VP6 và VP7 [9,

39, 58] VP7 là một glycoprotein (G serotype) là kháng nguyên trung hoà đặc hiệu cho týp huyết thanh VP4 là một protein nhạy cảm với proteaza (P serotype) là kháng nguyên có đặc tính ngưng kết hồng cầu Nhờ enzym phân hủy protein, VP4 được tách

ra một cách đặc hiệu giúp cho sự xâm nhập của virus vào tế bào VP6 là kháng nguyên chung cho các dưới nhóm của virus Rota Trọng lượng phân tử, vị trí, chức năng các protein của virus Rota được trình bày ở bảng 2

Bảng 2: Đặc điểm protein của virus Rota

Đoạn

gen

Sản phẩm Protein

Trọng lượng phân tử (M) a Vị trí trong hạt

Đoạn

gen

Sản phẩm Protein

Trọng lượng phân tử (M) a Vị trí trong hạt

Ghi chú: (M)a là trọng lượng phân tử của protein chủng SA11

1.1.5 Phân nhóm và týp huyết thanh

thành

1.1.5.2 Týp huyết thanh

Trong mỗi nhóm, virus Rota được phân loại theo các týp huyết thanh, VP4 là một loại protein chống phân tách proteaza - protein P và VP7 một loại glycoprotein - protein G Hai protein này là 2 protein cấu trúc lớp ngoài cùng quyết định týp huyết thanh của virus và được coi như một nhân tố hàng đầu trong nghiên cứu sản xuất vắc xin vì chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình trung hoà kháng thể Hai thành phần gen mã hoá cho những protein này theo lý thuyết có thể phân chia độc lập với nhau 14 týp VP7 đã được phát hiện bằng phản ứng trung hoà giảm đám hoại tử, 10 trong 14 týp trên xuất hiện ở người và đã được xác định bởi phản ứng trung hoà chéo với các mẫu huyết thanh động vật đa giòng Các týp huyết thanh này tương quan với