Phương pháp định lượng RNA

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG RNA... NỘI DUNG BÁO CÁOII • PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ KẾ • PHƯƠNG PHÁP MEIBAUM... Là phương pháp dùng để xác định nồng độ trung bình của RNA có mặt trong 1 hỗn hợp nào

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH

LƯỢNG RNA

NỘI DUNG BÁO CÁO

II

• PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ KẾ

• PHƯƠNG PHÁP MEIBAUM

Phương

pháp định

lượng

RNA

I Giới thiệu chung

Khái niệm định lượng acid nucleic

Khái niệm định lượng RNA

I GIỚI THIỆU

Phương pháp định lượng RNA là phương pháp gì????

Là phương pháp dùng để xác định

nồng độ trung bình của RNA có

mặt trong 1 hỗn hợp nào đó!!!!

II CÁC PHƯƠNG PHÁP

PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ KẾ PHƯƠNG PHÁP MEIBAUM

Phương

pháp định

lượng

RNA

II PHƯƠNG PHÁP QUANG

PHỔ KẾ

Nguyên tắc Nguyên liệu Cách làm Các yếu tố ảnh hưởng

Ưu và nhược điểm

PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ KẾ

Nguyên Tắc:

- Do thành phần bazơ nitơ trong RNA có khả năng hấp thụ ánh sáng vùng tử

ngoại, với bước sóng cực đại là 260 nm

- Độ hấp thụ tỉ lệ với nồng độ RNA

Nguyên liệu:

- Dung dịch RNA tinh sạch ( tách chiết siêu li tâm, sắc

kí, điện li, RNA tinh sạch )

- -Cuvet thạch anh

Phương

pháp định

lượng

RNA

Cách làm

1 ml RNA thạch anh Cuvet

Đo độ hấp thụ ở  =

260nm

Độ hấp thụ ánh sáng của ống có RNA ≤ 1

- Nồng độ RNA trong mẫu được tính theo công thức:

- Trong đó:

♥ C: nồng độ của RNA ( μg/ml)

♥ A 260nm: là độ hấp thụ của dd RNA ở 260nm

♥ 40 là hệ số chuyển đổi với RNA

♥ n: là số lần pha loãng

C (μg/ml)=A260nm 40.n

ƯU ĐIỂM KHUY ẾT ĐIỂM

- Đơn giản

- Nhanh chóng

- Số đọc bị ảnh hưởng nếu mẫu

dd RNA có lẫn DNA và protein

- Độ chính xác tương đối

CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG:

 Nhiệt độ

 Nồng độ ion

 Độ pH

 Tạp chất ( DNA, Protein)

Phương

pháp định

lượng

RNA

III PHƯƠNG PHÁP MEIBAUM

Nguyên tắc Nguyên liệu Cách làm

Nguyên tắc

RNA

Phức chất có màu xanh lá cây Orcinol

Hấp thụ ánh sáng cực đại ở  = 670nm

Cường độ màu tỷ lệ với hàm lượng RNA trong dung dịch

Đun nóng

PHƯƠNG PHÁP MEIBAUM

NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT:

♥ DD RNA chuẩn 500μg/ml

♥ DD RNA cần xác định hàm lượng

♥ DD H2SO4 10%

♥ Thuốc thử orcinol

♥ FeCl3 0,1% trong HCl (đặc)

♥ Thiết bị:

♥ Nồi cách thủy (100*C)

Phương

pháp định

lượng

RNA

Cách làm

2ml dung dịch RNA

10ml H2SO4

10%

Dung dịch thủy phân

RNA

Bình nón (V = 50ml)

Có nút nhám

Đặt vào nồi cách thủy đang sôi trong 30 phút Làm nguội

2ml Dung dịch

thủy phân RNA

Ống nghiệm

Thuốc thử orcinol

Dung dịch

màu xanh lá

cây

Lắc đều Đặt vào nồi cách thủy đang sôi trong 20 phút.

Làm nguội đến nhiệt độ phòng

 Xây dựng đồ thị chuẩn RNA :

 Từ dung dịch gốc RNA tinh khiết có nồng độ xác định tiến hành pha loãng để có các nồng độ 50, 100, 200, 300, 400 và 500  m/ml.

 Lấy từ mỗi nồng độ ra 2ml

 Tiến hành thí nghiệm như với dung dịch RNA mẫu ở trên

 Dựng đồ thị tương quang giữa mật độ quang học và nồng độ RNA tương ứng

Từ số đọc về mật độ quang học thu được của dung dịch mẫu đối chiếu với đồ thị RNA => lượng RNA trong mẫu

III ỨNG DỤNG

- Phương pháp định lượng RNA dùng để xác định nồng độ RNA có

trong 1 hỗn hợp, đây là một trong những bước cơ bản của mọi nghiên cứu, thí nhiệm trong các lĩnh vực sinh học y học, di truyền,…

• TÀI LIỆU THAM KHẢO:

- Giáo trình thực tập sinh hóa – Trường Đại học Cần thơ- Biên soạn T.S Nguyễn Ming Chơn, Th.S Phan thị Bích Trâm, Th.S Nguyễn Thị Thu Thủy.

- Sinh học phân tử - Hồ Huỳnh Thùy Dương – Nhà Xuất bản giáo dục

- Internet: tailieu.tv