Nghiên cứu phương pháp định lượng một số phtalat trong thực phẩm

Xây dựng được phương pháp phân tích định lượng đồng thời các phtalat trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột tách pha ngược RP-HPLC, detector PD

Nghiên cứu phương pháp định lượng một số

Abstract Nghiên cứu phtalat, các phương pháp xác định phtalat Nghiên cứu

phương pháp định lượng một số Phtalat trong thực phẩm Xây dựng được phương pháp phân tích định lượng đồng thời các phtalat trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột tách pha ngược (RP-HPLC),

detector PDA và ứng dụng phân tích một số mẫu đại diện

Keywords Hóa học; Hóa phân tích; Phương pháp định lượng; Thực phẩm

Content

MỞ ĐẦU

Cuộc sống ngày càng trở nên hiện đại hơn, mọi thứ đều được thiết kế sao cho tiện dụng hơn, dễ sử dụng hơn, hiệu quả hơn và giá thành rẻ Thực phẩm hầu hết được đóng hộp, bảo quản trong những chất liệu như nhựa PVC hoặc hộp inox Những loại bao bì đó lại chưa được quản lý chất lượng một cách chặt chẽ nên rất dễ dẫn đến việc nhiễm một số chất ảnh hưởng tới sức khỏe con người Hơn nữa, tình trạng sản xuất thực phẩm theo phương thức công nghiệp công với việc các nhà sản xuất không tuân thủ các tiêu chuẩn chất lượng đã có, nên nhiều chất phụ gia được thêm vào Chúng được thêm vào để tạo sự hấp dẫn hơn của thực phẩm đó hoặc để thay thế một số chất trong tự nhiên vì hóa chất công nghiệp rẻ tiền và sẵn có hơn Vì vậy nếu không được quản lý một cách chặt chẽ, những thực phẩm mà chúng ta sử dụng rất dễ nhiễm các chất độc hại vào thực phẩm và đi vào cơ thể con người… Các chất đó không những ảnh hưởng tới sức khỏe mà còn ảnh hưởng lâu dài tới cuộc sống

Các phtalat hiện nay được sử dụng rất phổ biến trên hầu hết các lĩnh vực của cuộc sống Từ trong những sản phẩm hàng ngày làm bằng nhựa PVC như thau, chậu, hộp đựng thức ăn, bàn ghế, chai lọ Hầu hết các sản phẩm từ nhựa PVC đều có các phtalat vì nhóm các chất này được thêm vào nhựa để làm tăng độ dẻo, đàn hồi của nhựa, thậm chí nhóm này còn được gọi là “plasticizers” nghĩa là các chất dẻo giống nhựa Thành phần nhựa có thể chiếm từ 0,1-40% những chất này, thậm chí có thể lên tới 60% hay 80%[25] Hơn nữa, những chất này không tạo liên kết trong mạng lưới của nhựa mà chỉ được thêm vào nhựa như một chất phụ gia vì vậy rất dễ thôi nhiễm ra ngoài môi trường (nhất là môi trường nhiều chất béo như dầu, mỡ ) Chúng còn được sử dụng trong ngành công nghiệp xây dựng như trong một

số mặt hàng sơn tưởng, sơn gỗ lát nền nhà và thậm chí trong cả đồ chơi trẻ em và sản phẩm chăm sóc cho trẻ[21] Các phtalat còn được sử dụng trong mỹ phẩm như các loại sơn móng tay, gel vuốt tóc, kem dưỡng da, nước hoa Thêm chúng vào mỹ phẩm sẽ làm cho sơn móng

tay có độ bóng và bám bề mặt tốt hơn, trong gel vuốt tóc và kem dưỡng da làm cho bề mặt kem trông tươi mịn và hấp dẫn hơn, trong nước hoa chúng được dùng như chất định hương

để giữ cho mùi thơm nước hoa lâu phai hơn [13] Tất cả các phtalat ở trong các sản phẩm kể trên đều có khả năng thôi nhiễm ra ngoài môi trường không khí hay thức ăn một cách dễ dàng Chúng có thể hấp thụ qua da do tiếp xúc, qua đường hô hấp do hít phải và qua đường tiêu hóa như ăn uống Về lâu về dài chúng gây ra những tác hại to lớn đối với cơ thể con người và môi trường Chúng gây ung thư ở chuột (chưa có thử nghiệm nào trên cơ thể người)[24], các phtalat này có thể làm xáo trộn nội tiết trong cơ thể con người, ở bé gái có thể gây dậy thì sớm, ở bé trai thì làm teo tinh hoàn Nếu bị tích lũy lâu trong cơ thể, chúng sẽ lắng đọng lại ở phổi, gan và lá lách và dần dần sẽ làm suy giảm chức năng của các bộ phận đó[26]

Trong thực phẩm, nguyên nhân sự xuất hiện các phtalat có thể là do bị thôi nhiễm từ bao bì sản phẩm bằng nhựa dẻo hoặc túi nilon nếu thực phẩm chứa trong đó là các loại thực phẩm giàu chất béo Hoặc một số loại đồ uống có cồn cũng có thể nhiễm các phtalat do nguyên nhân này Còn một nguyên nhân khác đáng chú ý hơn vì mức nồng độ các phtalat này cao hơn hẳn mức nồng độ do bị thôi nhiễm Đó là do các nhà sản xuất sử dụng trực tiếp các phtalat, chủ yếu là DEHP, DINP để làm chất tạo đục trong các sản phẩm chứa nước, bởi vì phtalat rất kém tan trong môi trường này[7] hoặc trong các sản phẩm bơ, dầu ăn làm cho thực phẩm nhìn có vẻ tự nhiên hơn[20] Vì vây, để giúp người tiêu dùng có những lựa chọn đúng

đắn về các loại thực phẩm, chúng tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu phương pháp định lượng một số phtalat trong thực phẩm” để biết được những thực phẩm có hại và có biện

pháp tránh sự nhiễm các phtalat vào cơ thể qua đường ăn uống

Chương I:

TỔNG QUAN 1.1Tên gọi, cấu trúc của một số phtalat

1.1.1 Công thức và tên gọi các phtalat

Công thức cấu tạo của các phtalat như sau:

Đây là công thức cấu tạo chung của các este o-phtalats hay còn được gọi là đi-este của

axit benzenedicarboxylic R và R' là 2 gốc của 2 rượu đã tác dụng với axit phtalic để thu được este phtalat Hai nhóm này có thể giống nhau hoặc khác nhau tùy thuộc rượu tham gia phản ứng Cấu trúc khác nhau của 2 nhánh này sẽ tạo ra những tính chất hóa học và vật lý rất riêng của phân tử và làm thay đổi hoạt tính sinh học của chúng[22,25] Bảng 1.1 chỉ ra một số phalat thông dụng, tên gọi vả cấu tạo của một số phtalat thông dụng

Bảng 1.1: Tên gọi, cấu tạo, KLPT của một số phtalat điển hình [6]

(g/mol )

6 Diisobutyl phtalat DIBP C6H4[COOCH2CH(CH3)2]2 278

10

5

312

6H4[COO(CH2)5CH(CH3)2]2 390

18

1.1.2 Tính chất lý hóa của các este phtalat

- Nhóm các este phtalat là những chất lỏng dạng dầu, dễ bay hơi, có mùi nhẹ, không tan trong nước và cacbon tetraclorua, nhưng lại tan tốt trong các dung môi hữu cơ như metanol, acetonitril, hexan, các dung dịch dầu ăn, chất béo Chúng có thể tan được trong máu

và những chất dịch cơ thể có chứa lipoprotein

- Khi bị phân hủy bởi nhiệt các phtalat này cho khí mùi hơi chát

- Phtalat không có tương tác với những muối nitrat, kiềm, axit hay những chất oxy hóa mạnh

1.1.3 Ứng dụng của các este phtalat và nguồn gốc phát tán vào thực phẩm

1.1.3.1.Ứng dụng của các este phtalat

- Hơn 87% được sử dụng trong nhựa, làm cho nhựa dẻo, linh hoạt hơn, đàn hồi tốt hơn

- Trong mỹ phẩm các phtalat cũng được thêm vào để làm tăng độ mịn, hấp dẫn cho các loại kem dưỡng da, làm chất định hương cho nước hoa, dầu gội, sữa tắm, sử dụng trong sơn móng tay để làm cho sơn bền màu và bám móng hơn

- Trong ngành công nghiệp xây dựng, các phtalat được sử dụng trong sơn tường, sơn sàn gỗ

- Trong ngành công nghiệp thực phẩm các phtalat có thể bị thôi nhiễm từ vỏ hộp vào thực phẩm hoặc được thêm trực tiếp vào thực phẩm làm tăng vẻ tự nhiên hấp dẫn của loại thực phẩm đó

1.1.3.2 Nguồn gốc phát tán các phtalat vào thực phẩm

Phtalat trong thực phẩm chủ yếu là do bị nhiễm trong quá trình sản xuất và do thôi nhiễm[14]

Trên thực tế các phtalat này có trong thực phẩm không chỉ do nguyên nhân thôi nhiễm

từ các vật chứa hoặc tiếp xúc mà đôi lúc còn có mặt trong thực phẩm do được cố tình thêm vào Những sản phẩm giàu chất béo như bơ, phomai, mayonaise đều được thêm một lượng nhỏ các phtalat vào để làm chúng trông tươi ngon và mịn hơn Các phtalat thường được thêm vào nước hoa quả hoặc đồ uống có cồn để làm tăng độ đục và tạo cảm giác tự nhiên hơn cho các loại thực phẩm đó

1.1.4 Độc tính của các phtalat

1.1.4.1 Con đường lây nhiễm phtalat

- Nhựa PVC chứa rất nhiều phtalat, khi nhựa cũ, bị vỡ, các phtalat sẽ bị thôi ra ngoài môi trường không khí, nước uống, và thực phẩm chứa trong đồ nhựa

- Đối với nhựa chứa đồ ăn, nhất là đồ nhiều dầu mỡ, các phtalat sẽ thôi nhiễm và tan vào môi trường thực phẩm

- Phtalat trong mỹ phẩm cũng sẽ thôi nhiễm vào con người khi bôi kem dưỡng da, gel xịt tóc, nước hoa, sơn móng

- Các đồ xây dựng chứa phtalat cũng dễ gây nhiễm phtalat trong không khí

1.1.4.2 Độc tính

- Gây ung thư

- Xáo trộn nội tiết, có tác dụng như hormon nữ hóa

- Tác động chủ yếu đến hệ sinh sản chưa phát triển hoàn toàn của cả nam và nữ

1.2 Các phương pháp xác định phtalat trong mẫu thực phẩm

1.2.1 Các phương pháp HPLC xác định phtalat

Các phtalat là những este của axit phtalic với hai hoặc một rượu nào đó, do đó tính chất cũng như cấu tạo của chúng có tính tương đồng cao Phương pháp phân tích các hợp chất này phải đủ mạnh để không bị ảnh hưởng lẫn nhau của các phtalat khi xác định đồng thời Và sắc ký đáp ứng tốt được điều đó Vì là các este nên có thể sử dụng cả sắc ký khí và sắc ký lỏng để phân tích Tuy nhiên khi dùng sắc ký khí phải được ghép nối với detector khối phổ mới cho hiệu quả cao, còn các detector khác đều kém nhậy (như FID, ECD) Sắc ký lỏng thì có thuận lợi hơn là có thể sử dụng detector UV cũng có thể định lượng cũng như định tính được các phtalat Tuy cũng có nhiều ưu nhược điểm khác nhau, khi dùng HPLC-UV thì khi phân tích mẫu thực, kết quả phải được kiểm chứng lại bằng một phương pháp mạnh hơn như ghép nối với MS Bởi vì dạng phổ hấp thụ của các phtalat rất giống với nhiều chất khác có một vòng benzen, bước sóng hấp thụ cũng không đặc trưng nên khả năng định tính thấp Tuy nhiên trên một số đối tượng nhất định, nền mẫu kém phức tạp hơn thì HPLC-UV lại ưu việt hơn nhờ giá thành rẻ hơn và khá chính xác, phương pháp xử lý mẫu đơn giản

Thêm một nghiên cứu nữa về phương pháp tách và định lượng các phtalat, theo tài liệu [13], tác giả Hyun Jung Koo và cộng sự đã nghiên cứu và ứng dụng phương pháp HPLC-

UV để xác định 04 phtalat (DEP, DBP, BBP, DEHP) trong các mẫu mỹ phẩm Sử dụng hệ máy HPLC của Hitachi (model L-700, Tokyo), bộ phận bơm mẫu tự động, cột Supecol LC-

18 5µm (250mm×4,6mm), nhiệt độ cột 200C±20C Pha động tỷ lệ 88:12 (88% ACN và 12% dung dịch đệm trietylamine 0,08% pH 2,8 được điều chỉnh pH bằng axit photphoric 1mol/L) Tốc độ dòng 0,7 mL/phút, tổng thời gian chạy là 50 phút Đường chuẩn dựng từ 10-400ppm,

sử dụng chất nội chuẩn DnHP Kết quả thu được, phát hiện 19/21 mẫu sơn móng tay và 11/42 mẫu nước hoa chứa DBP, 24/42 mẫu nước hoa chứa DEP với hàm lượng khá cao Trong nghiên cứu này còn chỉ ra mức con người nhiễm phải các phtalat khi sử dụng mỹ phẩm hàng ngày Ước tính dựa trên lượng các phtalat phát hiện được trên các đối tượng mẫu

Ngoài sắc ký lỏng hiệu năng cao, detector UV còn có một số phương pháp khác để định lượng cũng như định tính các phtalat Các phương pháp này được trình bày ở phần 1.2.2

1.2.2 Các phương pháp khác xác định các phtalat

Ngoài phương pháp HPLC, một phương pháp phổ biến để xác định các phtalat là

GC-MS Có thể sử dụng sắc kí khí ghép nối với các detector khác để xác định các phtalat như detector bắt điện tử (ECD), hay ion hóa ngọn lửa (FID)

Theo tiêu chuẩn CPSC-CH-C1001-09.3[21] của tổ chức CPSC Mỹ (United States Consumer Product Safety Commissions), các phtalat được xác định trên đối tượng là đồ chơi trẻ em, sử dụng hệ thiết bị GC-MS Các phtalat được chiết ra khỏi đối tượng bằng dung môi THF và n-hexan Khoảng 50 mg mẫu được cân chính xác, sau đó thêm 5ml THF, tiếp đó thêm 10ml n-hexan (tổng thể tích dung môi là 15 ml) Phần dung dịch lọc, lấy 0,1 ml sau đó thêm vào 80µl dung dịch chất nội chuẩn benzyl benzoat 250µg/ml, sau đó cho đến thể tích 20ml bằng n-hexan Đường chuẩn 06 phtalat (DBP, BBP, DEHP, DNOP, DIDP, DINP) được dựng từ 0,5 – 10 µg/ml với mẫu trắng là cyclohexan Với điều kiện chạy GC-MS trên cột DB-5MS 30m×0,25mm ID×0,25µm, tốc độ dòng ban đầu 1ml/phút, dòng chảy liên tục, khí mang He, van tiêm mẫu 1µl ở nhiệt độ 2900C, áp suất 35 psi, từ 2-5 phút giữ ở 500C, sau đó tăng 300C/phút tới 2800C, sau đó tăng 150C/phút tới 3100

C, giữ trong 4 phút Thu được thời gian lưu của các chất BB (m/z=105), DBP (m/z=223) từ 5-9,5 phút, BBP (m/z=206) và DEHP (m/z=279) từ 9,5-10,8 phút và của DNOP (m/z=279), DINP (m/z=293) và DIDP (m/z=307) ra sau phút 10,8 Có phân tích mẫu chuẩn CRM để xác nhận giá trị của phương pháp

Ngoài GC ghép nối với detector MS ra thì người ta còn sử dụng các loại detector khác nhau để phân tích các phtalat như FID, ECD Tiến sĩ Sapna Johnson và các cộng sự [20]

đã nghiên cứu xác định 08 phtalat (DMP, DEP, DBP, BBP, DEHP, DINP, DNOP, DiDP) trong đối tượng đồ chơi trẻ em sử dụng detector ECD Mẫu được cân với khối lượng 5g được chiết Soxhlet trong 100ml dung dịch diclometan 16 giờ và ở 600C 90ml dịch chiết được làm giàu ở 300C, và 1µl được bơm vào cột tách Tất cả các mẫu phân tích đều được làm lặp lại 3 lần Cột được sử dụng là DB-5MS 30 m x 25 mm ID x 0.25 µm, tốc độ ban đầu 1ml/phút, khí mang He, van bơm 1µl ở nhiệt độ 2900C, áp suất 35 psi, 0,5 phút, 2-5 phút giữ ở 500

C, tăng 300C/phút tới 2800C, sau tăng 150C/phút tới 3100

C giữ trong 4 phút Tổng thời gian 50 phút Detector ECD, nhiệt độ bổ trợ 3000C, khí Nitơ 20ml/phút Kết quả thu được cho thấy 4 loại phtalat phổ biến là DEHP, BBP, DBP và DINP có mặt trong tất cả 24 mẫu thí nghiệm với hàm lượng từ <0,1%-16,22% Sau khi mẫu được xác định bằng GC-ECD thì được kiểm tra để khẳng định lại bằng GC-MS

1.2.3 Phương pháp chiết tách các phtalat ra khỏi nền mẫu thực phẩm

Trước khi mẫu được đưa vào hệ HPLC để phân tích cho ra hàm lượng phtalat có trong mẫu thì nó phải được đồng nhất, chuyển từ các trạng thái khác nhau về dạng lỏng, các phtalat được tan trong dung môi acetonitril hoặc metanol Khi đưa vào đầu cột tách có khả năng hấp thu và rửa giải qua cột

Theo tài liệu [22], mẫu phải được đồng nhất trước khi đem xử lý hoặc chiết Với mẫu lỏng có thể dùng biện pháp lắc, trộn lẫn, hay khuấy Đối với mẫu rắn thường sử dụng máy trộn để làm đều hoặc có thể cho thêm dung môi hữu cơ phân cực hoặc nước cất để làm đều Các phtalat được chiết ra từ mẫu không chất béo dạng lỏng với dung môi hữu cơ không phân cực và có thể đo mà không cần bất kỳ sự làm sạch nào Áp dụng với trường hợp đối với nước, các loại nước giải khát và đồ uống có cồn Hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử dụng chiết Lỏng-Lỏng để phân tách các phtalat ra khỏi nền mẫu Dung môi có thể dùng clorofom, n-hexan, n-heptan, hoặc isooctan Cũng có thể sử dụng chiết pha rắn để tách lấy các phtalat phân tích Đối với các loại thực phẩm không béo dạng rắn thường được chiết với ACN hoặc hỗn hợp ACN-Nước Trường hợp thực phẩm giàu chất béo dạng rắn thì các phtalat được chiết

ra khỏi nền cùng với chất béo có thể sử dụng diclometan, hỗn hợp diclometan với cyclohexan, n-hexan, và hỗn hợp n-hexan với aceton, hoặc có thể dùng ACN để tăng độ chọn

lọc của các phtalat từ thực phẩm, dựa trên khả năng tan kém của các chất béo vào trong ACN

Kỹ thuật chiết phổ biến nhất chỉ bằng cách lắc mẫu với hỗn hợp chiết Tuy nhiên dùng biện pháp rung siêu âm và lò vi sóng là 2 biện pháp đã cho hiệu quả tốt nhất

Dựa trên điều kiện phòng thí nghiệm và các tài liệu tham khảo đã có, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp sắc kỷ lỏng hiệu năng cao pha đảo của Shimadzu, ghép nối với detector PDA, cột Cadenza CD-C18 250mm × 4,6mm × 3µm, hệ điều khiển SCL 10A, lò cột CTO-10AS, bộ trộn dung môi, bơm cao áp LC-10Advp, đèn SPD-M10A (đèn D2 và W) Vòng nạp mẫu 50µl Các điều kiện chạy máy và xử lý mẫu đều được khảo sát và tối ưu hóa trước khi phân tích mẫu

CHƯƠNG II:

THỰC NGHIỆM

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.2 Các loại phtalat thường có trong thực phẩm

Bảng 2.1: Thông tin về mẫu phân tích được chọn

1 Mẫu bơ thực vật (hộp

80g)

Công ty Cổ phần Dầu Thực vật Tường An

NSX:16/11/12 HSD:16/5/13

2 Mẫu phomai Con bò

Bảng 2.2: Nồng độ các dung dịch chuẩn este phtalat

STT Tên viết tắt Khối lượng cân (g) Nồng độ (ppm) Cách pha

Ph1 DMGP

0,0080

8000

Định mức đến 1ml bằng Metanol Ph2 DPP

- Hệ thống HPLC Shimadzu 10Avp với detector PDA Shimadzu SPD – M10Avp

- Cột pha đảo Cadenza CD-C18 250mm × 4,6mm × 3µm

- Cân phân tích Scientech SA 210, độ chính xác 0,0001 g

2.4 Mục tiêu nghiên cứu

Xây dựng được phương pháp phân tích định lượng đồng thời các phtalat trong một số mẫu thực phẩm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụng cột tách pha ngược (RP-HPLC), detector PDA và ứng dụng phân tích một số mẫu đại diện

2.5 Phương pháp phân tích

2.5.1 Phương pháp xử lý mẫu

Với 2 dạng mẫu rắn này chúng tôi đưa ra phương pháp xử lý mẫu:

Mẫu được cân khối lượng khoảng 0,2 g chính xác tới 0,0001g trên cân phân tích, chuyển mẫu vào ống thủy tinh 10ml Thêm 5 ml dung môi acetonitril, lắc trên máy lắc 30 phút, sau đó rung siêu âm 30 phút ở nhiệt độ 400C để giúp cho chất béo trong đó bị chảy ra, các phtalat tan dễ dàng hơn Cuối cùng quay ly tâm 30 phút để lắng cạn và thu dịch trong sang 1 ống khác Dung dịch này sau khi lọc qua màng lọc 0,45µm được bơm vào cột để định lượng các phtalat có trong mẫu Mẫu thêm chuẩn cũng được thực hiện với một quá trình trên

để xác định hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu

2.5.2 Phương pháp phân tích

Phép phân tích các phtalat được thực hiện trên hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC của Shimadzu, kết nối với hệ bơm gồm 4 kênh, bộ điều khiển, lò cột, bộ trộn dung môi và detector photo-diode-array (PDA) đặt ở bước sóng 225 nm Các điều kiện chạy máy được tóm tắt như sau:

- Nhiệt độ cột 250C

- Van bơm mẫu 50 µL

- Hệ dung môi gồm 2 kênh Kênh A: pha nước chứa 0,04% trietylamin được chỉnh pH tới 2,8 bằng dung dịch axit photphoric Kênh B là ACN

- Chế độ gradient tốc độ dòng: thời điểm ban đầu tốc độ là 0,8 ml/phút, giữ ở tốc độ này trong vòng 12,5 phút sau đó tăng dần lên 1,0 ml/phút ở phút thứ 14 Giữ 2 phút, sau đó tăng lên 1,2 ml/phút trong vòng 2,5 phút Giữ tốc độ này đến khi các chất được rửa giải hết ra khỏi cột Tổng thời gian chạy là 25 phút Tỷ lệ giữa 2 kênh A:B là 5:95 (% về thể tích) được giữ suốt quá trình chạy mẫu

2.6 Nghiên cứu điều kiện tối ưu và đánh giá phương pháp phân tích

2.6.1 Phương pháp nghiên cứu điều kiện tối ưu

Các điều kiện tối ưu trên hệ máy sử dụng cũng như quá trình xử lý mẫu đã được khảo sát

Thứ nhất là khảo sát để chọn hệ dung môi pha động Chúng tôi đã khảo sát 3 hệ dung môi MeOH-Nước, ACN-nước và ACN-pha nước chứa trietylamin 0,04%, pH 2,8 chỉnh pH bằng axit photphoric 1 mol/L

Sau khi chọn được hệ dung môi phù hợp chúng tôi đi khảo sát thành phần của pha động Tỷ lệ giữa 2 pha ACN và pha nước cũng được khảo sát ở 2 tỷ lệ 88% ACN : 12 % pha nước và 95% ACN:5% pha nước (% về thể tích)

Khảo sát thành phần % của trietylamin trong pha nước Nồng độ của trietylamin cũng được khảo sát ở 3 mức: 0,01%; 0,04%; và 0,08%

Giá trị pH pha động cũng được khảo sát, ở 3 giá trị pH: 3,31; 2,82 và 2,20

Chế độ chạy đẳng dòng và gradient đã được khảo sát Chế độ đẳng dòng khảo sát ở 2

tỷ lệ pha động 88:12 (% thể tích của ACN : pha nước) và 95:5 (% thể tích của ACN:pha nước) 6 chương trình gradient cũng được khảo sát để chọn được một chế độ chạy phù hợp nhất, hiệu quả tách tốt nhất Với tốc độ dòng thay đổi theo thời gian từ 0,6 ml/phút tới 1,2 ml/phút từ thời điểm ban đầu đến khi kết thúc quá trình chạy khoảng 60 phút

2.6.2 Đánh giá phương pháp phân tích

- Độ lặp lại: độ lặp máy và độ lặp xử lý mẫu dựa trên %RSD

- Đánh giá sai số hệ thống của đường chuẩn

- Đánh giá hiệu suất thu hồi của quá trình xử lý mẫu

- Đối chiếu kết quả phân tích với kết quả phân tích trên hệ GC-MS

- So sánh sự khác nhau giữa 2 kết quả

2.6.3 Phương pháp đối chiếu

Mẫu thực sau khi được phân tích trên hệ HPLC, detector PDA thu được các giá trị hàm lượng của các phtalat, sau đó các kết quả này được so sánh với kết quả thu được khi phân tích trên hệ GC-MS theo tiêu chuẩn CPSC-CH-C1001-09.3

Bảng 2.3: Điều kiện chạy GC – MS phân tích phtalat

Điều kiện cho GC

Tốc độ (oC/phút) Nhiệt độ

Thời gian duy trì nhiệt (phút)

10 305 1 10 305 1

Điều kiện cho MS

Trì hoãn dung môi: 6 phút

Kết quả thu được, được so sánh với kết quả thu được khi phân tích trên hệ HPLC Sử dụng chuẩn Student để đánh giá sự khác nhau có ý nghĩa giữa hai kết quả thu được

CHƯƠNG III:

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tối ưu hóa các điều kiện chạy sắc ký

3.1.1 Van bơm mẫu

Ngày nay, van bơm mẫu 6 chiều rất phổ biến, do đó, chúng tôi lựa chọn loại van này

3.1.4 Chọn bước sóng hấp thụ cực đại của các este phtalat

200.0 225.0 250.0 275.0 nm 0

250

500

mAU 3.91/ 1.00

Chúng tôi đã nghiên cứu, thử nghiệm các hệ dung môi sau:

 Hệ dung môi 1: MeOH-H2O

 Hệ dung môi 2: ACN-H2O

 Hệ dung môi 3: ACN-dung dịch đệm trietylamin 0,04% được chỉnh pH 2,8 bằng dung dịch H3PO4 1M

3.1.5.1 Dung môi pha động là MeOH-H2O

Đối với hệ dung môi này có rất nhiều chất bị trùng pic, gần như bị chập hoàn toàn và đường nền xấu Chúng tôi đã thử một số chế độ gradient thành phần pha động để thay đổi khả

năng tách, tuy nhiên sự tách vẫn chưa được cải thiện

Bảng 3.2: Thời gian lưu của các cấu tử:

Các phtalat Thời gian lưu (phút) Nhận xét

3.1.5.2 Dung môi pha động là ACN-H 2 O

Thứ tự ra khỏi cột của 08 phtalat khảo sát là:

T (phút)

% ACN

T (phút)

% ACN

40 Stop

Bảng 3.5: Độ phân giải, thời gian lưu ứng với các gradient

Độ phân giải R Gradient 1 Gradient 2 Gradient 3

Vì vậy, chúng tôi cũng thêm một lượng trietylamin vào pha động, điều chỉnh pH của pha động tới giá trị 2,8 bằng axit photphoric 1M Nồng độ của trietylamin và pH pha động cũng được khảo sát

3.1.5.3 Dung môi pha động là ACN-trietylamin

Bảng 3.6: Thời gian lưu của các cấu tử ứng với hệ dung môi 3:

Bảng 3.7: Kết quả phân tích của 2 tỷ lệ ACN: pha nước chứa trietylamin

Các phtalat %ACN:%đệm = 88/12 %ACN:%đệm = 95/5

Thời gian lưu (phút)