Phương pháp tạo golden rice

Hình 1 – Cây lúa của nông dân, kết quả của các nhà khoa học Vì quỹ đất có giới hạn, các nhà khoa học đang nghiên cứu biến đổi gene của cây lúa để tạo ra giống lúa mới có năng suất cao,

MỤC LỤC

I GIỚI THIỆU CHUNG 2

1 Gạo (Rice) 2

2 Nguồn gốc 2

3 Sản xuất lúa gạo ở Việt Nam 2

4 Gạo vàng (Golden Rice) 3

5 Tình hình phát triển của gạo vàng trên thế giới 3

6 Ý nghĩa của việc tạo ra Gạo vàng (Golden Rice) 4

II PHƯƠNG PHÁP TẠO GOLDEN RICE 4

1 Đối tượng nghiên cứu: 4

2 Phương pháp nghiên cứu 5

3 Quy trình kỹ thuật chuyển gen Gạo vàng (Golden Rice) 5

3.1 Cơ chế tạo Gạo vàng (Golden Rice) 5

3.2 Quy trình kỹ thuật 6

3.3 Thuyết minh quy trình 7

4 Kiểm tra kết quả chuyển gen β-caroten 14

4.1 Kiểm tra bằng cảm quan 14

4.2 Kiểm tra bằng kỹ thuật phân tích phân tử 14

a Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện sự có mặt của các gene: psy, crt, lcy 14

b Hỗn hợp dùng trong phản ứng PCR và một sô dụng cụ cần thiết 14

c Tiến hành PCR 15

d Trích DNA và phân tích Southern 15

III KẾT LUẬN VÀ NHỮNG VẤN ĐỀ KHÁC CỦA GOLDEN RICE: 16

IV TÀI LIỆU THAM KHẢO 17

I GIỚI THIỆU CHUNG

1 Gạo (Rice)

Gạo là một sản phẩm lương thực thu từ cây lúa Hạt gạo thường có màu trắng, nâu hoặc đỏ thẫm, chứa nhiều dinh dưỡng Hạt gạo chính là nhân của thóc sau khi tách bỏ vỏ trấu và cám Gạo là lương thực phổ biển của gần một nửa dân số thế giới

2 Nguồn gốc

Cây lúa hiện nay được nông dân gieo trồng là kết quả xử lý trong phòng thí nghiệm và lai tạo tự nhiên cũng như nhân tạo của nhiều thế kỷ từ cây lúa dại

Hình 1 – Cây lúa của nông dân, kết quả của các nhà khoa học

Vì quỹ đất có giới hạn, các nhà khoa học đang nghiên cứu biến đổi gene của cây lúa để tạo ra giống lúa mới có năng suất cao, chống được bệnh tật và thời tiết khắc nghiệt, đồng thời rút ngắn thời gian chăm bón và sớm cho thu hoạch Những thành công ban đầu của lúa biến đổi gen đã được ghi nhận, song hiện các nhà khoa học vẫn chưa thống nhất được liệu loại lúa này có tác động xấu đến sức khỏe con người hay không

3 Sản xuất lúa gạo ở Việt Nam

Việt Nam có hai vùng trồng lúa chính là đồng bằng sông Hồng ở phía Bắc và đồng bằng sông Cửu Long ở miền Nam Hàng năm sản lượng của cả nước đạt 33-34 triệu tấn thóc, trong đó chỉ sử dụng khoảng 8 triệu tấn (tương đương 4 triệu tấn gạo sau khi xay xát) cho xuất khẩu, còn lại là tiêu thụ trong nước và bổ sung dự trữ quốc gia

- Ở miền Bắc một năm có hai vụ lúa chính: vụ chiêm và vụ mùa

- Ở miền Nam, nông dân trồng ba vụ một năm: vụ đông xuân (có sản lượng cao nhất

và thóc cũng đạt chất lượng tốt nhất cho xuất khẩu), vụ hè thu và vụ ba Do lũ hàng năm ở đồng bằng sông Cửu Long trong những năm gần đây ảnh hưởng đến sản xuất, một phần nữa người dân có thể kiếm lời ổn định hơn từ việc nuôi thủy sản (tôm) hay

trồng cây ăn quả, chính quyền đã khuyến cáo nông dân giảm và chuyển đổi một phần đất trồng lúa vụ ba Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn là bộ chủ quản, quản lý việc sản xuất lúa gạo của Việt Nam

4 Gạo vàng (Golden Rice)

Hình 2 – Hạt gạo vàng giàu β-caroten

"Golden rice" là loại gạo được biến đổi gene nhằm tạo ra nhiều tiền tố vitamin A (β- caroten ) cho người dùng Hạt gạo vàng còn gọi là “Hạt Hy Vọng” là một khám phá

lớn của ngành nghiên cứu lúa gạo thế giới vào đầu thế kỷ 21 Trong năm 2000, công

nghệ này đã gây ra tiếng vang lớn trong nghiên cứu về dinh dưỡng thế giới - một loại gạo biến đổi di truyền màu vàng có chứa tiền vitamin A và một số lượng lớn chất sắt được phát minh Từ năm 2000 và đến nay các viện nghiên cứu trên thế giới đã tạo được hai loại là GR1 và GR2

- GR1 được tạo ra khi chuyển gene sinh tiền tố Vitamin A từ cây hoa thủy tiên và

Erwinia uredovora vào giống lúa Indica

- GR2 được cải tiến từ GR1 bằng cách thay gene sinh tiền tố Vitamin A từ cây hoa thủy

tiên bằng gene từ cây bắp GR2 sản xuất ra lượng tiền tố vitamin A cao gấp 23 lần so với GR1

5 Tình hình phát triển của gạo vàng trên thế giới

Gạo vàng được bắt đấu tiến hành nghiên cứu từ năm 1999 Đến năm 2000 thì GR1 ra đời Vào ngày 27-3-2005, một đội ngũ khoa học gia của công ty Hạt Giống Syngenta ở Cambridge, Anh Quốc, đã tuyên bố khám phá được loại gạo vàng mới (GR 2) chứa lượng β-caroten gấp 23 lần lớn hơn gạo vàng cũ (GR 1) được khám phá vào năm 2000

Ngày 14-10-2008, Rockefeller Foundation tuyên bố sẽ tài trợ Viện Thí Nghiệm Lúa Quốc Tế (IRRI) ở Philippines để hỗ trợ dự án “Hạt gạo vàng”, nhằm tăng tốc quy trình

kiểm tra chấp thuận loại lương thực GM này tại các nước đông dân: Ấn Độ, Bangladesh,

Indonesia và Philippines Cơ quan Rockefeller hy vọng tài trợ nêu trên sẽ giúp Hạt gạo vàng đến tay nông dân sớm hơn để họ có thể sản xuất đại trà

6 Ý nghĩa của việc tạo ra Gạo vàng (Golden Rice)

- Người ta dự tính khoảng 100 đến 140

triệu trẻ em trên thế giới đang bị thiếu

vitamin A, gây ra mù mắt, bệnh sởi và tử

vong.Việc nghiên cứu tạo thành công giống lúa

cho Gạo vàng có thể cứu hàng trăm ngàn trẻ

em bị mù hàng năm vì thiếu vitamin A

- Gạo Vàng là sự kiện lớn nhất là khi mà

giá lương thực ngày một cao, trên thị trường

giống gạo này đã xuất hiện ở Iran 2005, đang

khảo nghiệm ở Trung Quốc, Philipin và nhiều

nước Châu Á khác Theo dự báo Gạo vàng sẽ

được thương mại hóa vào năm 2011 là một sản

phẩm dinh dưỡng mới có tiềm năng lớn về mặt

kinh tế Hứa hẹn mang lại một

nguồn thu nhập khổng lồ cho các

Quốc gia đang đầu tư nghiên cứu

và đang dần thành công trong đề tài

“Golden rice” này

- Gạo chuyển gen góp phần đảm

bảo an ninh lương thực và xóa bỏ

nạn đói

- Gạo vàng ra đời mang ý nghĩa to

lớn cho thấy sức mạnh và giá trị

ứng dụng của công nghệ sinh học

đối với đời sống con người

II PHƯƠNG PHÁP TẠO GOLDEN RICE

1 Đối tượng nghiên cứu:

Sử dụng Phôi non và hạt gạo các giống lúa Taipei 309, IR64 và MTL 250 (Indica) có

đặc điểm tốt về nông học, chất lượng để thực hiện biến đổi gene

Các Viện nghiên cứu đã sử dụng công nghệ biến đổi gen đưa một gen của cây thủy tiên

hoa vàng hoặc từ cây ngô và vi khuẩn Erwinia uredovora vào bộ gen của lúa, tạo ra

giống lúa mới có hàm lượng beta-caroten

Sử dụng hai loại vector chuyển gen gồm hai plasmid là pCaCar và pFun3 để

chuyển gen vào vi khuẩn Agrobacterium tumefactien

Dùng vi khuẩn A tumefactien đã được gắn plasmid nói trên để chuyển đoạn DNA

mong muốn vào trong phôi của các giống lúa được chọn lọc

2 Phương pháp nghiên cứu

Hạt gạo vàng là một thành quả lớn trong chương trình nghiên cứu của đội ngũ khoa học

gia Thụy Sĩ và Đức, được cơ quan Rockerfeller Foundation của Mỹ tài trợ 100 triệu USD trong 10 năm Đội ngũ này được hướng dẫn bởi Giáo sư Ingo Potrykus, Viện Kỹ Thuật Liên Bang ở Thụy Sĩ, và Tiến Sĩ Peter Beyer, Đại học Freiburg ở Đức Các

nhà khoa học đã sử dụng phôi của hạt lúa nuôi cấy mô tái sinh cây lúa phòng thí nghiệm

rồi chuyển gene bằng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để đưa tất cả các gene lạ vào

phôi hạt lúa sau đó Kiểm tra biểu hiện của gene qua kiểm tra kiểu hình (hạt gạo có màu vàng), kiểm tra theo phương pháp đánh giá cảm quan bằng mắt thường Kiểm tra sự xuất hiện của các gen chuyển trong cây lúa chuyển gen bằng phương pháp điện di và PCR

3 Quy trình kỹ thuật chuyển gen Gạo vàng (Golden Rice)

3.1 Cơ chế tạo Gạo vàng (Golden Rice)

Hình 3 – cơ chế tạo gạo vàng

Chuyển gene vào

Plasmid pFun3

Bản thân hạt gạo có chứa Geranyl geranyl diphosphate (GGPP) một tiền chất quan trọng trong tiến trình sinh tổng hợp β-caroten Nhưng cây lúa thường thì lại không hề

chứa β-caroten, bằng chứng là hạt gạo thường có màu trong suốt mà không hề có màu

vàng đặc trưng của β-caroten Để GGPP chuyển hóa thành các chất trung gian rồi

chuyển thành β-caroten thì cần có các Enzyme xúc tác tương ứng, nhưng bản thân cây lúa lại không có chứa các gene có nhiệm vụ sinh tổng hợp ra các enzyme cần thiết để xúc tác

cho các phản ứng chuyển hóa GGPP thành β-caroten Khi chuyển các đoạn gene psy, crtI, lcy vào trong cây lúa thì sẽ tạo ra một sự thay đổi rất lớn Khi đó, gen psy là gene

mã hóa để sinh tổng hợp ra enzyme phytoen synthase có nhiệm vụ xúc tác để chuyển

hóa GGPP (20C) thành phytoen (40C) Tiếp theo đoạn gen crtI mã hóa để sinh tổng hợp

enzyme phytoene desaturase có nhiệm vụ chuyển hóa phytoen thành ζ-Caroten (

zeta-Caroten) rồi chuyển hóa tiếp thành Lycopen Cuối cùng gen lcy mã hóa để sinh tổng hợp

enzyme Lycopen β-Cyclase có nhiệm vụ xúc tác chuyển hóa Lycopen thành β-caroten Và

kết quả là hạt gạo chuyển gen thể hiện kiểu hình có màu vàng đặc trưng của β-caroten và chứa một lượng tiền vitamin A rất lớn so với hạt gạo bình thường

3.2 Quy trình kỹ thuật

Hình 4 – Sơ đồ quy trình chuyển gene gạo vàng

Chuẩn bị hạt giống Taipei

309, IR64 và MTL 250

(Indica)

Tách chiết gene ctrI từ

vi khuẩn đất Erwinia - uredovora

Tách chiết gene psy và gene lyc từ cây Daffodil

hoặc từ cây ngô

Chọn hạt giống có phôi tốt Chuyển gene vào

Plasmid pCaCar

Nuôi cấy mô tái sinh từ phôi

A.tumefactien và nuôi tăng

sinh vi khuẩn

Nuôi cấy

A.tumefactien trên

đĩa có chứa mầm tái

sinh từ phôi

Nuôi tăng sinh và tái tạo cây con từ mầm tái sinh đã chuyển gene

Trồng lúa chuyển gene và cho lai với giống lúa địa phương

Trồng đại trà

và cho sản phẩm gạo vàng

3.3 Thuyết minh quy trình

Trong cây lúa biến đổi gen người ta đưa vào để biểu hiện hai gene mã hóa,

phytoene synthase (psy) và lycopene cyclase (lcy) từ cây hoa thủy tiên vàng và gen mã hóa carotoene synthetase 1 (crtI) từ vi khuẩn đất Erwinia uredovora

Nhưng người ta thấy rằng loại lúa này không cho nhiều tiền tố vitamin A như

mong đợi vì psy làm giảm hiệu quả tích tụ β-caroten trong nội nhũ của hạt gạo

Vì thế gen psy từ cây hoa thủy tiên vàng được thay thế bằng gen psy từ ngô

Bước 1: Giống lúa Taipei 309, IR64 và MTL 250 (Indica) được trồng trong

nhà kính với các điều kiện môi trường tối ưu, được sinh trưởng phát triển tốt, đảm bảo sạch bệnh Người ta chọn những cây lúa có đặc điểm tốt, chọn hạt chắc mẩy, bóc vỏ để chọn phôi tốt rồi tiến hành bảo quản trong môi trường vô trùng

Hình 5 – Cây lúa được trồng trong các điều kiện nhân tạo tối ưu

để lấy nguyên liệu chuyển gene

Bước 2: Tiến hành nuôi cấy mô từ phôi đã chọn lọc ở Bước 1 để chuẩn bị nguyên

liệu cho giai đoạn chuyển gen Quá trình nuôi cấy sử dụng môi trường MS có thành

phần như sau:

A.Đa lượng (g/l)

KNO3 19.0

NH4NO3 16.5

CaCl4.2H2O 4.4

MgSO4.7H2O 3.7

B.Phosphat (g/l)

KH2PO4 1.7

NaH2PO4 1.7

C.Vi lượng1 (g/l)

H3BO3 0.62

MnSO4 H2O 1.69

ZnSO4.2H2O 0.86

D.Vi lượng 2 (g/l)

KI (Kali iodua) 0.83

Na2MoO4.2H O 0.25

E.Vi lượng 3 (g/l)

CuSO4.5H2O 0.25

CoCl2.6H2O 0.25

F.Sắt/EDTA (g/100ml)

Na2EDTA 0.372

FeSO4.7H2O 0.278

G.Vitamin (mg/100ml)

Glycin 200

Nicotinic acid 50

Pyridoxin-HCl 50

Thiamin-HCl 10

Myo-inositol 10.000

* Muốn có 1 lít môi trường làm việc MS:

- Chuẩn bị một bình dung tích 2 lít, chứa sẵn 400ml nước cất

-Thêm 100ml A và 100ml B

-Thêm 10ml C và 10ml F

-Thêm 1ml D và 1ml G

-Thêm 0,1ml E

-Thêm nước cất cho đủ 1 lít

Bước 3: Tách chiết DNA từ vi khuẩn đất Erwinia uredovora, sau đó tiến hành cắt

bằng enzyme EcoRI và Kpnl để thu nhận đoạn gen ctrI

Quá trình tách chiết gen ctrI được tiến hành như sau:

Lấy 1 ml nước cho và một ít giống vi sinh vật (vi khuẩn Erwinia uredovora) trên

ống thạch nghiêng cho vào ống eppendorf rồi đem cân Lấy thêm một ống eppendorf khác, thêm nước vào sao cho có khối lượng bằng với khối lượng của ống thí nghiệm

và đem hai ống đi ly tâm

Đưa hai ống vào máy ly tâm, đặt sao cho 2 ống ở vị trí đối xứng tâm với nhau qua trục quay của máy ly tâm Đóng cửa của máy và đặt chế độ ly tâm cho máy như sau:

- Tốc độ quay: 10000 vòng/phút

- Thời gian ly tâm : 1 phút

- Nhiệt độ ly tâm: 100C

Sau khi ly tâm, lấy ống thí nghiệm ra, thấy hỗn hợp phân thành 2 lớp Ta loại bỏ lớp nước nổi ở phía trên đi, chỉ giữ lại phần lắng (Phần sinh khối vi sinh vật) Tiếp tục

ta thêm vào ống thí nghiệm vừa loại bỏ phần nổi 200 microlit InstaGene (InstaGene là

hỗn hợp các chất – là bộ kid để test nhanh), rồi đem ủ ở 560C trong máy ổn nhiệt trong 30 phút để hoạt hóa enzim Bấm đồng hồ để canh thời gian

Sau 30 phút lấy ống thí nghiệm ra khỏi máy ổn nhiệt và đem ống đi lắc mạnh trong

10 giây bằng máy vortex Sau đó tiếp tục đưa ống vào đặt trong bể ổn nhiệt ở 950C hoặc nước sôi trong 8 phút Bấm đồng hồ để canh thời gian

Sau 8 phút, lại lấy ống ra đem lắc mạnh bằng vortex trong 10 giây Rồi đem ly tâm với chế độ ly tâm được cài đặt là:

- Tốc độ: 11000 vòng/phút

- Thời gian ly tâm: 2-3 phút

- Nhiệt độ ly tâm: 100C

Sau khi ly tâm, lấy ống nghiệm ra quan sát thấy hỗn hợp phân thành 3 lớp Lớp trên cùng chính là DNA có khối lượng nhỏ nhất nên nổi lên trên sau khi ly tâm

Phần DNA sau khi tách ra được tiến hành cắt đoạn gen cần (đoạn gen ctrI) bằng enzyme EcoRI Ta thu nhận được đoạn gen ctrI để sử dụng trong chuyển gen ở các

bước sau

Bước 4: Hoa thủy tiên (hoặc ngô) được trồng trong nhà kính với các điều kiện

môi trường tối ưu, đảm bảo sạch bệnh, được chọn lọc với điều kiện cây sinh trưởng phát triển tốt, cho hoa có màu vàng tươi Người ta chọn những bông hoa (quả ngô)

đang trong thời gian phát triển mạnh để chiết xuất gen Gene psy và gene lyc của các

bông hoa (quả) này được tiến hành theo các giai đoạn như sau:

- Bỏ 10 g đá khô vào xay nhuyễn, sau đó cho 8 g hoa thủy tiên (hoặc hạt ngô), xay cho đến khi thành bột mịn

- Chuyển bột này vào cốc đã được làm lạnh trên nitơ lỏng trước rồi cho vào cốc 50

ml nitơ lỏng Đặt ở -20 độ trong vòng 6 tiếng

- Cho 20 ml dung dịch đệm đã được đun sôi vào mẫu bột đã được xử lí trên rồi tiến hành lắc nhẹ

- Ngâm trong bể ổn nhiệt ở 56 độ trong vòng 20 phút

- Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ phòng Sau khi lắc chuyển dịch chiết tách trên qua ống dùng để quay li tâm và tiến hành quay

li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút)

- Chuyển lớp nước ở phía trên vào ống nghiệm mới sau đó cho 2 ml dung dịch CTAB 10 % đã được hâm nóng ở 700 Sau đó trộn đều

- Cho 20 ml Chloroform: isoamylalcohol (24:1) vào rồi lắc đều ở nhiệt độ phòng Sau đó quay li tâm ở nhiệt độ phòng (2800 rpm, 20 phút)

- Cho 30 ml đệm kết tủa CTAB sau đó trộn đều cho tới khi có một màng D N A màu trắng đục nổi lên

- Quay li tâm ở nhiệt độ phòng (3000rpm, 20 phút) Loại bỏ phần dịch lỏng thu phần kết tủa

- Hòa tan kết tủa bằng 5ml dung dịch muối ở nhiệt độ 56oC NaCl 1M và cho vào dung dịch 5µl enzyme RNase 10mg/ml để phân hủy RNA

- Cho 10ml cồn lạnh nguyên chất và lắc đều để kết tủa DNA

- Quay li tâm, lấy phần tủa

- Cho 20ml cồn 70 %, quay li tâm, lấy phần tủa