Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp Điện di mao quản Nguyễn Thị Thùy Linh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS chuyên ngành: Hóa Phân tích; Mã số: 60 44 29 Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Văn Ri Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Giới thiệu về các thuốc điều trị (virus gây suy giảm miễn dịch ở người) HIV; tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay; các phương pháp phân tích định lượng thuốc HIV; Giới thiệu chung về phương pháp điện di mao quản. Nghiên cứu các tài liệu về (điện di mao quản) CE và các đặc tính lý hóa của hoạt chất cần phân tích. Khảo sát các điều kiện điện di nhằm tìm ra điều tối ưu nhất để tách và định lượng đồng thời Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong chế phẩm viên nén. Tiến hành kiểm tra chất lượng các thuốc có cùng hoạt chất đang được sử dụng trên thị trường. Keywords: Hóa phân tích; Định lượng thuốc; Phương pháp điện di mao quản Content MỞ ĐẦU Theo phân tích của các chuyên gia, tổng số người nhiễm HIV vẫn đang tiếp tục duy trì sự sống ngày càng được tăng cao là hệ quả của hai tác động chủ yếu. Một là số người nhiễm HIV hàng năm trên toàn cầu vẫn ở mức cao. Chỉ tính riêng năm 2008, thế giới vẫn có khoảng 2,7 triệu người mới nhiễm HIV. Hai là do kết quả tích cực của liệu pháp điều trị kháng virut (ARV) làm giảm số người tử vong, kéo dài sự sống cho người bệnh. Đến tháng 12/2008 ước tính khoảng 4 triệu người nhiễm HIV ở các nước có thu nhập thấp và trung bình được điều trị bằng thuốc kháng HIV, tăng lên 10 lần trong vòng 5 năm. Trong vòng 4 năm (2004- 2008) nhờ chăm sóc điều trị tốt, số người chết do AIDS đã giảm 10% [12]. HIV/AIDS đang là vấn đề lớn hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Ở nước ta Thành Phố Hồ Chí Minh là nơi có nhiều ca nhiễm HIV/AIDS nhất (Sau đó là Hội An, An Giang, Hải Phòng, Quảng Ninh, ). Chúng ta không chỉ ngăn chặn sự lây lan của bệnh mà còn điều trị hiệu quả để giảm nguy cơ tử vong kéo dài và cải thiện chất lượng cuộc sống cho người HIV/AIDS. Trong điều trị thì kháng Retrovirut đóng vai trò rất lớn. Trước đây nước ta chưa đầy đủ các loại thuốc Retrovirut nên thường dùng đơn hóa hoặc phối hợp hai loại thuốc trong điều trị HIV/AIDS. Giờ có thể kết hợp 3 hoặc 4 loại thuốc trong những trường hợp lâm sàng nặng hơn. Hiện nay, nước ta đã sản xuất được thuốc chống HIV là Lamididrir (Lamivudine 150mg + Zidovudine 300mg). Tuy nhiên phần lớn vẫn đang sử dụng thuốc kháng HIV theo chương trình quốc gia được cấp [12] Để đảm bảo trong điều trị, an toàn trong sử dụng, việc quản lý chất lượng thuốc kháng HIV là rất cần thiết. Vì vậy cần có phương pháp phân tích có độ tin cậy cao, nhanh nhằm đáp ứng yêu cầu kiểm soát tốt chất lượng thuốc HIV. Cho tới nay sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là phương pháp phân tích hóa lý đa số được sử dụng để định lượng các loại thuốc. Ưu điểm của phương pháp này là độ lặp lại, độ chính xác và khả năng tách tốt. Đồng thời thiết bị HPLC hiện đã được tích hợp với hầu hết các kỹ thuật hóa lý hiện có (phổ UV-VIS, phân tích điện hóa, MS, NMR,…) cho phép nâng cao độ nhạy và hạ thấp giới hạn phát hiện của phương pháp. Tuy vậy, phương pháp HPLC đòi hỏi sử dụng dung môi có độ tinh khiết cao, đắt tiền, có nhiều loại gây ảnh hưởng xấu, gây ô nhiễm môi trường. Đó là xuất phát điểm của việc lựa chọn và phát triển phương pháp định lượng thuốc dựa trên kỹ thuật hóa lý khác thay thế cho HPLC mà chúng tôi thực hiện trong nghiên cứu này. Kỹ thuật tách mà chúng tôi lựa chọn làm cơ sở cho nghiên cứu này là điện di mao quản (CE) [15]. CE là phương pháp mới được phát triển, tuy nhiên có nhiều ưu điểm vượt trội là hiệu lực tách rất cao, kinh tế và đặc biệt là thời gian phân tích nhanh có thể đáp ứng không những cho phân tích trong phòng thí nghiệm mà còn phục vụ cho phân tích lâm sàng và trong sản xuất. Vì thế đây là kỹ thuật rất hữu hiệu để thay thế hay hỗ trợ HPLC trong nhiều lĩnh vực phân tích, trong đó có nghiên cứu về Dược. Hơn nữa, chuyên luận chung về CE đã được quy định trong Dược điển một số nước như Hoa Kỳ, Anh, Trung Quốc…Tuy nhiên ở Việt Nam, CE chưa được ứng dụng nhiều và kinh nghiệm ứng dụng trong phân tích dược phẩm còn hạn chế. Do vậy chúng tôi nhận định hướng nghiên cứu của mình sẽ rất có ý nghĩa thực tiễn cho công tác nghiên cứu quản lý chất lượng thuốc ở nước ta. Từ những phân tích trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng của phương pháp điện di mao quản vào định lượng thuốc kháng HIV với đề tài: “Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản” CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN 1.1.Giới thiệu về các thuốc điều trị HIV Phác đồ phối hợp Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong điều trị Lamivudin và Zidovudin có cấu trúc tương tự nucleosid có tác dụng kháng retrovirus bao gồm cả HIV-1 và HIV-2 do ức chế enzym phiên mã ngược của virus. Hai thuốc này được sử dụng phối hợp trong liệu pháp kháng retrovirus để điều trị HIV. Bệnh nhân uống 3TC, AZT kết hợp Nevirapine trong 6 tháng cho kết quả khá khả quan. Các chỉ số đánh giá tình trạng bệnh nhân được cải thiện rõ rệt và có ý nghĩa thống kê. Người bệnh tăng cân, có số lượng tế bào lymphocyte tăng rõ rệt (từ 1273/mm 3 lên 1547/mm 3 ), số lượng tế bào CD4 từ 70/mm 3 lên 145/mm 3 làm cho số lượng tế bào CD4 bị phá hủy giảm đi. Như vậy, phác đồ D4T/3TC/NVP có thể khống chế sự phát triển của virus. Liệu pháp kháng retrovirus làm tăng thời gian sống sót của người bệnh có số lượng tế bào CD4 dưới 500 trong 1mm 3 . Liệu pháp này cũng có thể dùng cho những người bệnh có mật độ virus HIV trên 30000/ml huyết tương, không phụ thuộc vào số lượng tế bào CD4, vì mật độ HIV là một yếu tố tiên lượng sự tiến triển của bệnh [12]. * Lamivudin: (3TC) Công thức phân tử: C 8 H 11 N 3 O 3 S. Phân tử lượng 229,3. Tên khoa học: 4-amino-1[2-(hydroxymethyl)-1,3- oxathiolan-5- yl]-2(1H) pyrimidinon Tính chất: Là bột kết tinh màu trắng. Nhiệt độ nóng chảy: 160 0 -162 0 C. Dễ tan trong nước, ít tan trong cồn, khó tan trong các dung môi hữu cơ. Năng suất quay cực: [α] 21 D = - 135 0 ( C = 0,38 % trong methanol ) Hằng số pK a = 3,31. Lamivudin hấp thụ UV ở bước sóng hấp thụ cực đại là 278nm; A 1% 1cm trong H + 1M ~ 600 *Zidovudin: (AZT) Công thức phân tử C 10 H 13 N 5 O 4 . Phân tử lượng 267.242 g/mol. Tên khoa học: 1-[(2R,4S,5S)-4-azido-5-(hydroxymethyl) oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Tính chất : Tinh thể trắng hoặc hơi nâu. Nhiệt độ nóng chảy: ~ 124 0 C. Khó tan trong nước, ít tan trong cồn . Năng suất quay cực + 60,5 0 → + 63,0 0 ( C = 1% trong EtOH) ; + 99 0 (C = 0,5% trong nước) Hằng số pK a = 9,36 *Nevirapin (NVP) Công thức phân tử C 15 H 14 N 4 O. Phân tử lượng 266.888 g/mol. Tên khoa học: 11-cyclopropyl-4-methyl-5,11-dihydro-6H- dipyrido[3,2-b:2′,3′-e][1,4]diazepin-6-one Tính chất : Bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng. Thực tế không tan trong nước, ít tan trong CH 3 Cl. Năng suất quay cực + 60,5 0 → + 63,0 0 ( C = 1% trong EtOH) ; + 99 0 (C = 0,5% trong nước) Hằng số pK a = 2,42. 1.2. Tình hình sử dụng thuốc HIV ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay Tính đến 31/5/2012, trên toàn quốc có 66.191 người nhiễm HIV trong đó có 62.654 người lớn và 3.537 trẻ em, đạt 94,6% kế hoạch năm 2012. Kết quả báo cáo tại 10 tỉnh có số người được điều trị cao nhất là 46.332 bệnh nhân, chiếm 70% số người nhiễm HIV đang được điều trị trên toàn quốc. Thành phố Hồ Chí Minh tiếp tục là thành phố dẫn đầu cả nước về số lượng người nhiễm HIV đang điều trị. Tính đến 31/5/2012, thành phố Hồ Chí Minh có 20.435 người nhiễm HIV đang điều trị, chiếm 30,9% số lượng bệnh nhân đang điều trị trên toàn quốc [10]. Kể từ ca nhiễm HIV được phát hiện đầu tiên tại Mỹ từ năm 1981, cho đến nay loài người đã trải qua 30 năm đối phó với một đại dịch quy mô lớn, phức tạp, tính đến cuối năm 2009, có 33,3 triệu người đang bị nhiễm HIV, tỷ lệ người nhiễm HIV trong nhóm tuổi 15-49 là 0,8%. Riêng năm 2009 ước tính có 2,6 triệu người nhiễm mới HIV và 1,8 triệu người tử vong do AIDS. So sánh với năm 1999, số người nhiễm mới HIV đã giảm 21%. Báo cáo UNAIDS cũng ghi nhận tính cuối năm 2009 đã có 33 nước có số ca nhiễm mới giảm, trong đó 22 nước khu vực cận Saharan, Châu Phi. Tuy nhiên hiện vẫn còn 7 nước tỷ lệ nhiễm mới tăng trên 25% khi so sánh giữa năm 1999 và 2009[11]. 1.3. Các phƣơng pháp phân tích định lƣợng thuốc HIV 1.3.1. Các phƣơng pháp sắc ký (HPLC & HPTLC) Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là trong việc tách và phân tích lượng vết các chất. Phương pháp HPLC với cột tách pha đảo được sử dụng rất rộng rãi để xác định thuốc HIV trong các loại mẫu khác nhau do có nhiều ưu thế so với các phương pháp khác vì có độ chính xác, độ nhạy, độ lặp lại cao, khoảng tuyến tính rộng… Detector ghép nối trong máy HPLC cho phép phát hiện sự xuất hiện chất sau khi rửa giải. Hiện nay có rất nhiều loại detector được sử dụng cho mục đích này đã mở rộng khả năng phân tích được rất nhiều loại chất bằng phương pháp HPLC. Đối với phân tích dư lượng, detector khối phổ (MS) là một sự lựa chọn ưu tiên do có thể phát hiện và phân tích chất trong các đối tượng phức tạp. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo (RP-HPLC) với pha động là 20mM đệm Natri photphats (8mM muối Natrioctanesulphonic acid) : axetolnitril (04:01,v/v), pH= 3,5 điều chỉnh bằng acid photphoric. Pha tĩnh là Cột C18-ODS Hypersil (5µm x 250mm x 4,6mm). Thời gian lưu của mỗi chất là Stavudine là 2,85 phút, Lamivudine là 4,33 phút và Nevirapine là 8,39 phút.[26] Xác định bằng Phương pháp sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao với dung môi pha động là chloroform: methanol(9:1,v/v), pha tĩnh là bản mỏng Silicagen 60F 254 và định lượng các chất ở bước song hấp thụ 265nm. Hệ số lưu giữ của Stavudine, Lamivudine và Nevirapine lần lượt là 0.21-0.27, 0.62-0.72 và 0.82-0.93.[26] Xác định thuốc HIV trong huyết tương bằng phương pháp LC-MS/MS với metaxalone là chất chuẩn nội với giai đoạn đầu tiên là Chiết pha rắn, sau đó sử dụng cột C18 (5µm x 150mm x 3.9mm) pha động là 0.5% acetic băng trong nước : axetolnitril (20:80,v/v). Các ion được tách ra và theo dõi trên máy phổ khối tứ cực.[21] 1.3.2. Phƣơng pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis - CE) Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng dụng để tách và xác định thuốc HIV trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau. Xác định Lamivudin (3TC), Stavudine( d4T) và Nevirapin (NVP) bằng phương pháp MEKC. Tác giả đã sử dụng Cột mao quản silica trần dài 73,5 cm (chiều dài hiệu dụng 62cm), đường kính trong là 75µm. Dung dịch điện li nền bao gồm 10mM sodium tetraborat (pH= 9,8), 100mM sodiumdodecylsunphat (SDS) và 15%(v/v) 2-propanol. Áp thế 20kV.Bơm mẫu bằng áp suất 50mbar trong 9s. Tất cả các chất được tách ra trong vòng 14 phút. Khoảng tuyến tính 20-200 µg/ml (r 2 = 0,9996) cho 3TC; 5-50 µg/ml (r 2 = 0,9985) cho d4T và 25-250 µg/ml (r 2 = 0,9987) cho NVP[24] Nhóm nghiên cứu đã tách được lamivudin và tạp đồng phân hoàn toàn (độ phân giải 1,95) với điều kiện điện di thích hợp là: cột mao quản silaca nung chảy, đường kính trong 50 µm, chiều dài 48 cm, chiều dài hiệu quả 39,5 cm, nhiệt độ cột 25 0 C, điện thế 15 kV, bước sóng phát hiện 270 nm… Về định lượng lamivudin trong chế phẩm, với dung dịch đệm natri tetraborat (pH khoảng 9,2) và sự hiện diện của chất hoạt động bề mặt là SDS (sodium dodecyl sulfat) có thể phân tích đồng thời lamivudin và chất phối hợp zidovudin…; điều kiện điện di thích hợp là: cột mao quản silaca nung chảy, đường kính trong 50 µm, chiều dài 48 cm, chiều dài hiệu quả 39,5 cm, nhiệt độ cột 25 0 C, điện thế 15 kV, bước sóng phát hiện 270 nm, dung dịch đệm natri tetraborat 50 Mm chứa 50 mM SDS [9] Micellar điện động sắc ký (MEKC) phương pháp để tách và định lượng đồng thời lamivudine và zidovudine trong dược phẩm đã được phát triển. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tách, chẳng hạn như pH, nồng độ chất hoạt động bề mặt (sodium dodecyl sulfate, SDS), dung môi hữu cơ và điện áp áp dụng đã được tối ưu hóa. Dung dịch điện ly nền bao gồm 12,5 decahydrate tetraborat mM sodium và 15 mM axit boric điều chỉnh pH 10,8, có chứa 90 mM SDS 5% (v / v) acetonitrile (ACN) đã được khảo sát là phù hợp cho việc tách các loại thuốc. p-aminobenzoic acid (PABA) đã được sử dụng như là chất chuẩn nội (IS). Phát hiện chất phân tích và IS được thực hiện ở bước sóng 210 nm. Điện di đồ đã được quan sát thấy rằng cả hai loại thuốc và IS đã được di chuyển trong vòng 20 phút ở điện áp 10 kV. Đánh giá của phương pháp này đã được thực hiện về tính chính xác, độ tuyến tính, độ đúng, giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ). Khoảng tuyến tính từ 10-80 mg / ml cho Lamivudine và 10-100 mg / ml cho Zidovudine. Các giới hạn phát hiện cho Lamivudine và Zidovudine được tìm thấy là 2,5 và 2,0 mg / ml, tương ứng. Phương pháp đã được áp dụng để xác định đồng thời Lamivudine và Zidovudine trong huyết tương. Độ thu hồi của cả hai thuốc ở dạng bào chế viên thuốc và trong huyết tương ≥ 99,72% (độ lệch chuẩn tương đối (RSD) ≤ 1,84%) và ≥80,4% (RSD ≤ 5,4%), tương ứng.[25] CHƢƠNG 2 - ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.1. ĐIỀU KIỆN NGHIÊN CỨU 2.1.1.1. Các chất chuẩn đối chiếu - Chuẩn quốc gia Lamivudine (200mg/ lọ) hàm lượng 99,45 % C 8 H 11 N 3 O 3 S tính theo nguyên trạng, SKS 031214603, bảo quản nhiệt độ 5 0 C, tránh ánh sáng - Viện kiểm nghiệm – Bộ Y Tế. - Chuẩn quốc gia Zidovudin (200 mg/ lọ) hàm lượng 99,64 % C 10 H 13 N 5 O 4 (HPLC) tính theo nguyên trạng, SKS 0105143, bảo quản nhiệt độ 5 0 C, tránh ánh sáng – Viện kiểm nghiệm - Bộ Y Tế. - Chuẩn quốc gia Nevirapin (200 mg/ lọ) hàm lượng 99,49 % C 15 H 14 N 4 O tính theo nguyên trạng, SKS WS 0109263, bảo quản nhiệt độ 2 0 C – 8 0 C, tránh ánh sáng – Viện kiểm nghiệm - Bộ Y Tế. 2.1.1.2. Hóa chất: - Nước cất deion: là nước cất hai lần mới, được lọc qua bộ lọc tinh khiết có cột trao đổi anion và cation, sau đó lọc qua màng lọc 0,2µm. - Axít Boric H 3 BO 3 , muối natri tetraborat Na 2 B 4 O 7 .10H 2 O, chất hoạt động bề mặt Natri dodecyl sunfat SDS, NaOH, NaH 2 PO 4 .2H 2 O, Na 2 HPO 4 … của hãng MERCK KGaA Germany 2.1.1.3. Thiết bị và dụng cụ - Máy điện di mao quản Aligent CE system 9001 được điều khiển bằng phần mềm Chemstation 100001 (sản xuất tại hãng Hewlett Packard, Đức) của bộ môn Hóa phân tích- Độc chất, Trường đại học Dược Hà Nội. - Máy lọc nước tinh khiết Sartorius arium 611: model SARTORIUS AG GOTYINGEN, áp suất tối đa 100psi/ 6,9bar. - Máy siêu âm Ultrasonic LC 60H ( sản xuất tại hãng Elma, Đức). - Máy đo pH EUTECH Instrument. - Cân phân tích Sartorius TE214S. - Giấy lọc đường kính lỗ lọc 11cm- Trung Quốc. - Màng lọc PTFE với kích thước lỗ lọc 0,2 µm. - Bộ lọc hút chân không màng lọc cenlulose với kích thước lỗ lọc 0,45 µm. - Các dụng cụ chính xác: bình định mức, pipet chính xác với các thể tích khác nhau. - Các dụng cụ khác: cốc có mỏ, ống nghiệm, đũa thủy tinh, chày và cối. 2.1.2. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 2.1.2.1. Chế phẩm làm việc - Chế phẩm làm việc Lamivudine 150mg, Nevirapine 200mg & Zidovudine 300mg do công ty Ranbaxy laboratories Limited Ấn Độ sản xuất . Ngày sản xuất 9/2011. Hạn sử dụng 9/ 2013. - Chế phẩm làm việc Lamivudine 150mg & Zidovudine 300mg do công ty Matrix Laboratories Limited Ấn Độ sản xuất. Ngày sản xuất 9/2011. Hạn sử dụng 10/2013 2.1.2.2. Chuẩn bị mẫu * Pha dung dịch chuẩn và dung dịch thử: - Dung dịch gốc chuẩn: cân chính xác khoảng 30,9 mg Lamivudin, 39,7 mg Nevirapin và 59,6 mg Zidovudin vào cốc có mỏ. Thêm vào 10,0 ml MeOH hòa tan, sau đó thêm nước cất deion hòa tan. Chuyển hết vào bình định mức 100 ml, siêu âm cho tan hoàn toàn, thêm nước deion đến thể tích vừa đủ và lắc đều. - Dung dịch chuẩn: hút chính xác 5,0ml dung dịch gốc chuẩn pha vào bình định mức 10ml, thêm nước deion vừa đủ thể tích và lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,2µm. - Dung dịch mẫu thử: Cân 20 viên thuốc viên, xác định khối lượng trung bình một viên và nghiền thành bột mịn. Cân một lượng bột viên tương ứng với 15,00 mg Lamivudin, 20,00 mg Nevirapin và 30,00 mg Zidovudin cho vào bình định mức 100,0 ml, thêm 70 ml nước deion siêu âm cho tan hết, thêm nước deion đến vừa đủ thể tích, lắc đều. Lọc qua giấy lọc đường kính lỗ lọc 11cm. Bỏ 20 ml dịch lọc đầu. Dịch lọc được tiếp tục lọc qua bộ lọc hút chân không màng lọc 0,45µm. Tiếp tục bỏ 20ml dịch lọc đầu. Dịch lọc được lọc qua màng lọc 0,2µm trước khi tiêm vào lọ đựng mẫu. -Dung dịch mẫu trắng: Chuẩn bị như mẫu chuẩn nhưng không có chất phân tích. *Chuẩn bị dung dịch điện ly nền: - Dung dịch điện ly nền Na 2 B 4 O 7 10mM: Cân chính xác khoảng 0,1906 g Na 2 B 4 O 7 vào bình định mức 50,0 ml thêm nước để siêu âm và hòa tan hoàn toàn. Điều chỉnh nước tới vạch và lắc đều. - Dung dịch điện ly nền Na 2 B 4 O 7 10mM + SDS 50mM : Cân chính xác khoảng 0,1906 g Na 2 B 4 O 7 và 0,7210 g SDS vào bình định mức 50,0 ml thêm nước để siêu âm đuổi khí và hòa tan hoàn toàn. Điều chỉnh nước tới vạch và lắc đều. Dung dịch điện ly nền này điều chỉnh pH đến pH 8,5 ; pH 9,2 và pH 10. - Dung dịch điện ly nền Na 2 B 4 O 7 10mM + β-cyclodextrin 10mM: Cân chính xác khoảng 0,1906 g Na 2 B 4 O 7 và 0,4820g β-cyclodextrin vào bình định mức 50,0 ml thêm nước để siêu âm đuổi khí và hòa tan hoàn toàn. Điều chỉnh nước tới vạch và lắc đều. 2.2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nội dung nghiên cứu Tham khảo và nghiên cứu các tài liệu về CE và các đặc tính lý hóa của hoạt chất cần phân tích. Trên cơ sở đó khảo sát các điều kiện điện di nhằm tìm ra điều tối ưu nhất để tách và định lượng đồng thời Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin trong chế phẩm viên nén. Từ phương pháp đã xây dựng được, tiến hành kiểm tra chất lượng các thuốc có cùng hoạt chất đang được sử dụng trên thị trường. 2.2.2. Phương pháp nghiên cứu Hai kỹ thuật được lựa chọn ở đây là CZE, MEKC xem ở kiểu điện di nào có thể tách tốt các hoạt chất. Sau đó tiến hành khảo sát các điều kiện để chọn chương trình điện di thích hợp, cụ thể là: - Lựa chọn kiểu (mode) điện di phù hợp. - Nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu tách 3 hoạt chất và định lượng đồng thời như: pH, nồng độ chất điện ly, điện thế, nhiệt độ…. - Đánh giá thống kê phương pháp phân tích - Áp dụng phân tích một số mẫu thuốc - Đánh giá ưu khuyết điểm của phương pháp CHƢƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nghiên cứu khảo sát tối ƣu điều kiện tách 3TC, AZT và NVP 3.1.1. Chọn bƣớc sóng phát hiện chất Để khảo sát phổ 3TC,AZT và NVP, detector được chọn là DAD. Do 3 hoạt chất đều là những hợp chất không có mầu, hấp thụ ánh sáng trong vùng tử ngoại nên chúng tôi sử dụng máy điện di với detector DAD để quét phổ trực tiếp với khoảng quét phổ là 190 – 400 nm để xác định các bước sóng hấp thụ tối ưu của các chất này. Các chất được pha với nồng độ 120µg/ml trong 10 mM đệm Borat, 50 mM SDS, pH=9,3. Phổ thu được thể hiện hình 3.1. Kết quả quét phổ cho ta thấy: Lamivudin có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 270,5nm, Zidovudin có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 264,5nm và Nevirapin có phổ hấp thụ quang cao nhất ở 268,5nm.Chúng tôi chọn các bước sóng hấp thụ cực đại cho từng chất trong phép định [...]... nghiệm, với mục đích ứng dụng phương pháp điện di mao quản điện động học kiểu Mixen (MEKC) để tách và định lượng một số hoạt chất kháng HIV sử dụng phối hợp điều trị trong chế phẩm thuốc, chúng tôi thu được kết quả như sau: 1 Đã chọn được phương pháp phân tích một số hoạt chất kháng HIV với yêu cầu chuẩn bị mẫu đơn giản, dung môi sử dụng là các muối vô cơ, chất hoạt động bề mặt đơn giản là SDS nên... sát có hàm lượng nằm trong khoảng giới hạn định lượng cho phép (95%- 105%) ( theo phụ lục 11.1 Dược điển Việt Nam IV) 3.3 Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp điện di mao quản (CE) Phương pháp CE là một phương pháp phân tích hiện đại cho độ tin cậy và hiệu quả tách cao Phương pháp có thể xác định được trên nhiều đối tượng khác nhau bao gồm cả chất mang điện tích và chất trung tính Phương pháp có một số đặc điểm... Lamivudin và Zidovudin và Nevirapin trong hỗn hợp chế phẩm nằm trong giới hạn cho phép (98% - 102%) Do đó phương pháp này có độ đúng cao(Theo hướng dẫn thẩm định phương pháp của ICH) 3.2.7 Kết quả định lƣợng trong chế phẩm 3.2.7.1 Kết quả định lượng trong viên nén AVOCOMB-N: Bảng 3.13.Kết quả định lượng viên nén Avocomb-N Mẫu Hàm lượng hoạt chất trong 1 viên thử (mg) Lamivudin Nevirapin Zidovudin % Hàm lượng. .. 10mM Thế điện di 20kV, bơm mẫu áp suất 50mbar, thời gian bơm mẫu 5s, nhiệt độ mao quản 250C Nhận thấy nếu chỉ dùng phương pháp điện di mao quản vùng (CZE) thì không tách được 3 chất ra khỏi nhau Vì pKa của Lamivudin (pKa= 3,31 ) và Nevirapin (pKa= 2,42) khá gần nhau Trong dung dịch điện ly nền với khoảng pH nhất định thì 2 chất này bị ion hóa giống nhau, 2 chất đi ra khỏi mao quản trong cùng một thời... độ tuyến tính của Lamivudin, Zidovudin và Nevirapin đều có RSD . định lượng thuốc kháng HIV với đề tài: Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp điện di mao quản CHƢƠNG. Xây dựng phương pháp định lượng một số hoạt chất kháng HIV trong thuốc bằng phương pháp Điện di mao quản Nguyễn Thị Thùy