Đề tài Các phương pháp định lượng protein docx

Ngoài các nguyên tố trên một số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca.... Tran Thi Bich Lam Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, O, N, H,

Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam

Mục lục

00807005 3

So 5 4

1 CẤU TẠO PHÂN TỬ PROTEIN: 2-©2+©++2+++E++£E++E+E+EEtErxerrverkrrrkrrrerrvee 4

1.1 Cấu trúc bậc Ï: cc+ecskS SE rrecrereree 4 1.2 — Cấu trúc bậc 2: - + St SE2EEEEE 1E 51111 E1 EEcrkrrree 5 1.3 Cấu trúc bậc 3: -ceckSeSk SE re, 6 DLA, COU tric DAC Ar ceececcecccscsesssssscsssessvsesessesescsesscscsesscssscsescsesssscsesscssscesescseeees 6

I CAC PHUONG PHAP DINH LUGNG PROTEIN csscssscssscssscssscsssccsssenssessees 7 1 ĐỊNH LƯỢNG NITƠ TỔNG SỐ BẰNG PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL . 7 1.1 Định lượng Nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl - 7 1.2 — Định lượng nitƠ phủ PrOf€ÏH: -c- 55+ sseseeseeeeeessere 12 1.3 Định lượng Protein trong nguyên liỆU: - -« «+

2 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHAP SO MẦU -5++s+c++>++ 13

2.1 Định lượng Protein theo phương pháp Biure - -«-«=-«+ 13 2.2 Định lượng Protein bằng phương pháp Lowry (Biure cải tiến): 16 2.3 Định lượng Protein theo phương pháp Bradford (Coomassie Brilliant

776050 8006EẺẺSS 19 3 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP DÙNG BICINCHONINIC ACID

$.I Nguyên tắc:

3.3 Tính kết qHả: -ccScccSScSSterererrterererrrereree 22 3.4 Độ nhạy và khả năng ứng đụg: - «55s £sx£evesexseeseeee 22

4 ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP QUANG PHỔ

4.1 Nguyên tỐC: SĂcS+ St StSrrSStetrrrrrrrerrrrrrerrrrrrree 23

Các phương pháp định lượng protein GVED: TS Tran Thi Bich Lam

4.2 Cách tiến hành:

4.3 Tính kết quả: -c5Ă5cSScScccrererrrererrreree 24 4.4 Độ nhạy và khả năng ứng dPg: - 5 5+ sssveeeeeeeserse 24

5 PHƯƠNG PHÁP HUỲNH QUANG O-PHTHALALDEHYDE (OPA): . 25

5.2 Độ nhạy và khả năng ứng dụng: «s55 sseeeeeeesersee 25 6 PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG AMONIAC - +5+5++++rxzevrterertererrrrrrrrrrrree 25 STANN/ 1 naa 25

6.2 Cách tiến hành:

6.3 Tính kết quẢ: ecScScScSScretererrrtrrerrrrrerrere 27 6.4 Khả năng ứng dụng: -cccS«cSseeseeserseeeerres 27

7.1 Nguyên tẮC: SẶS+SC St St SrEEeettrrErrerrrrrrrterrrrrrereree 28 7.2 Thiết bị: ccSc ST Street 28 7.3 Cách tiến hành: 5-5+5+ScctcctEtEteterererrtererrrerreree 29 8 PHƯƠNG PHÁP PRM (PYROGALLOL RED MOLYBDATE): 5s +5s+ 31 8.1 Nguyên IỐC: e-ScS+StSrESStetertrieterrrrrrrrerrrrrrrrsee 31

8.3 _ Tiến hành -.-.c-ccScSecrsrtretererrrrrrerrrrrrrrsee 32

II SO SÁNH MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN 33

1 SO SÁNH MẪU BIA CÓ VÀ KHÔNG QUA THẤM TÍCH . . - +2 ©5+5++++ 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO © «eettt+++++eEEEttEttirAerrttrttrrrrrrtree 34

Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam

$: 0 — 0.24% Ngoài các nguyên tố trên một số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như P, Fe, Zn, Cu, Mn, Ca (Sách Hóa sinh công nghiệp- Lê Ngọc Tú- NXB khoa học và kĩ thuật HN, trang 94)

Protein có đặc tính đặc thù cao cho từng loài, từng cơ quan mô của cùng một

cá thể Protein rất đa dạng về cấu trúc và chức năng của cơ thể sống

Trong mô và tế bào của các sinh vật cũng như trong thành phần Protein (chất đạm) tổn tại ở nhiều dạng khác nhau như: đạm hữu cơ, đạm vô cơ, đạm Protein (comoniac hoặc muối amonium) Để xác định được chúng hiện nay có nhiều phương pháp tùy theo đối tượng khảo xác và tùy theo chiều hướng muốn khảo xác, người ta áp dụng từng phương pháp thích hợp có thể trục tiếp hoặc gián tiếp

Seminar này sẽ trình bày một số phương pháp dùng để định lượng Protein, cùng với một số lưu ý khi sử dụng từng phương pháp cụ thể.

Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Tran Thi Bich Lam

Tất cả các protein đều chứa các nguyên tố C, O, N, H, một số còn chứa một

lượng nhỏ S Tỉ lệ phần trăm khối lương các nguyên tố này trong phân tử protein như sau: C: 50-55%; O: 21-24%; N: 15-18%; H: 6,5 - 7,3%; S: 0 — 0.24% Ngoai các nguyên tố trên một số protein còn chứa một lượng rất ít các nguyên tố khác như P,

Fe, Zn, Cu, Mn, Ca

Protein có thành phần phức tạp và có nhiều bật cấu trúc khác nhau, nổi bật cấu trúc có cấu trúc và chức năng khác nhau và giữ vai trò rất quan trọng đối với tất cả các cơ thể sinh vật

Cấu trúc protein được chia thành 4 bậc: 1, 2, 3, 4

Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam

1.2 Cấu (rúc bậc 2:

Là tương tác không gian giữa các gốc acid amin ở gần nhau trong mạch polypeptide Nói cách khác nó là không gian cục bộ của từng phần trong mạch polypeptide Cấu trúc được làm bển chủ yếu nhờ liên kết Hidro được tạo thành giữa các liên kết peptide ở gần nhau cách nhau khoảng xác định

Amino acid -^

monomer

l Polypeptide strand

Only the N—C,-—C backbone The N—C,—C backbone as well

is represented ‘The vertical as the Cg of R groups are represented

line is the helix axis here Note that the amide planes are

perpendicular to the image

Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Tran Thi Bich Lam

Tương tác không gian giữa các gốc

acid amin 6 xa nhau trong mach

polypeptide, 14 dạng cuộn lại trong không

gian của mạch polypeptide (hình dạng

chung của chuỗi polypeptide) Trong nhiều

protein hình cầu có chứa các gốc Cys, sự à ⁄a liên Lết đã ye

tạo thành các liên kết disunfua giữa các qusinchary sinipline

(aggregation of two or more peptides)

gốc Cys 6 xa nhau trong mach polypeptide,

làm cho mạch bị cuộn lại đáng kể Các liên kết khác như liên kết Vandecvan,liên kết tĩnh điện, liên kết hidro giữa các mạch bên của các gốc acid amin đều tham gia làm bền cấu trúc bậc 3 Kết quả nguyên cứu nhiều protein cho thấy chính trình

tự sắp xếp các gốc acid amin trong chuỗi polypeptide chứa những thông tin cần thiết để hình thành cấu trúc bậc 3

1.4 Cấu (rúc bậc 4:

Đối với các phân tử protein bao gồm 2 hay nhiễu chuỗi polypeptide hình cầu, tương tác không gian giữa các chuỗi trong phân tử gọi là cấu trúc bậc 4 Mỗi chuỗi

Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Tran Thi Bich Lam

polypeptide gọi là ”phần dưới đơn vị ” chúng gắn với nhau nhờ liên kết hidro, lực 'Vandecvan giữa các nhóm phân bố trên bể mặt của các “phần dưới đơn vị”

TI.Các phương pháp định lượng protein

1 Định lượng nitơ tổng số băng nhương pháp Kjeldahl

Theo nguyên tắc Protein được định lượng bằng cách xác định lượng nitơ tổng

số và kết quả nhân với 6.25, như thế nghĩa là coi Protein luôn chứa 16% là nitơ (vì

trong phân ti Protein thì hàm lượng nitơ tương đối cao và khá ổn định khoảng 15 —

17%)

Trong thực tế bên cạnh Protein thật còn có các chất hữu cơ khác có chứa nitơ như: alcaloic, amin, amoniac, acid nitric Các chất này gọi là nitơ phi Protein Vì vậy trong trường hợp này cần phải xác định nitơ tổng số và nitơ phi Protein sau đó xác định nitơ Protein

Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein

=> Nitơ protein = Nitơ tổng số — Nitơ phi protein

ef

LJ Định lượng Nitd tổng số theo phương pháp Kjeldahl

Nguyên (ắc:

Quá trình gồm 2 giai đoạn:

e Giai đoạn vô cơ hóa: (quá trình tiến hành trong tử hotte)

Ở nhiệt độ cao và dưới tác dụng của H;SO¿ thì các hợp chất có chứa nitơ sẽ bị phân hủy và bị oxi hóa đến CO; và H;O, còn nitơ chuyển thành amoniac (NH;) rồi kết hợp với H;SO¿ tạo thành muối amoni sulphate

e_ Giai đoạn cất đạm: (quá trình xẩy ra trong máy cất dam)

Sau khi vô cơ hóa ta đuổi NH; ra khỏi dunh dịch bằng NaOH

(NH4)2SO4 + NaOH > Na2SO, + NH3 + H20

Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Trần Thị Bích Lam Lượng NH; sinh ra được lôi cuốn bằng máy Parmas và được dẫn đến một erlen có chứa một lượng thừa H;SO¿ đã biết chính xác nồng độ Lúc này NH; sẽ tác dụng với H;SO¿ chuyển thành (NH,);SO¿

NH; + H;SO¿ > (NH¿);SO¿ + H;SO¿ dư Sau đó đi chuẩn độ lượng H;SO¿ còn lại bằng dung dịch NaOH qua đó tính được lượng nitơ có trong mẫu

NaOH + H;SO¿ > Na;SO¿ + H;O

Cách tiến hành: » »“

Nguyên liệu, hóa chất, thiết bị:

s* Nguyên liệu: các mẫu cần xác định hàm lượng Protein, nếu nguyên liệu khô cần được sấy khô tuyệt đối (105°C, trong 30 phút)

s% Hóa chất: hỗn hợp xúc tác KaSOu/CuSO¿ (9:1), H;SO¿ đặc, H;SO¿ 0,01N,

H;PO; 2%, NaOH 0,01N, nước cất vô đạm , cồn 96°, acid tricloacetic (TCA),

thuốc thử đỏ metyl

$% Thiết bị: bếp đun, máy cất đạm Parmas Warger

(chen hình vào)

Quá trình được thực hiện qua các bước

s* Bước 1: vô cơ hóa mẫu (được tiến hành trong tử hotte để tránh khí độc SOs,

CO,)

Nếu mẫu khô thì cân 0,1 -0,3g mẫu rồi dùng một ống giấy (không tro) cuộn tròn cho mẫu cẩn thận vào tận đáy bình Kjeldahl, thêm vào đó vài giọt nước cất vô đạm để thấm ước bột Nếu mẫu là chất lỏng thì dùng pipet lấy 2 — 5 ml,nếu nước quả hộp thì nên lấy 10 — 20ml tiếp tục cho 0,5g hỗn hợp xúc tácK;SO,/CuSO¿ (hoặc selen, hay HO; 30%, hay HCLO¿ 70%) và 10ml H;SO¿ đặc

Để binh Kjeldahl trên bếp điện đặt trong tủ hotte và đun cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt và có màu xanh da trời nhạt là được Lấy ra để nguội

Các phương pháp định lượng protein GVED: TS Tran Thị Bích Lam

Chuyển sang bình định mức 100m], tráng bình Kjeldahl nhiều lần bằng nước cất vô đạm và định mức đến vạch định mức

s* Bước 2: Cất đạm

Sơ đồ máy cất đạm

Rửa máy: cho vào bình A khoảng 3/2 thể tích bình, đun sôi bình và mở nước

vào ống làm lạnh D, cả 3 khóa điều đóng, sau đó cho lên phiểu C một ít nước cất (khoảng 10 m]) và cho chảy xuống bình B rồi khóa van 2 lại Hơi nước của bình A

sẽ từ từ qua erlen E, cứ để như vậy cho đến khi ở E có khoảng 5ml nước Ngắt điện

ở bình A, hơi nước trong máy sẽ nguội lại,làm giảm áp xuất ở A và B do đó nước

trong bình B sẽ rút qua G khi nước rút hết, thêm nước vào phiễu C và mở van 2 cho nước chảy vào B, kế đó nước sẽ rút qua G ta có thể làm như vậy vài lần Nếu

nước ở bình G đầy thì mở van 3 cho nước rút đi Khóa van 3 và 2 lại

Cất đạm: lấy vào erlen E (erlen 250m]) 10 - 20ml dung dịch HạSO¿ 0,01N

và 3 giọt thuốc thử mêtyl đỏ, dung dịch có màu tím đỏ Đặt bình hứng sao cho đầu

mút của ốngsinh hàn D ngập trong dung dịch H;SO„0,01N của erlen E

Hút 10ml dung dịch đã vô cơ hóa và đã pha loãng cho lên phiếu C đun sôi bình A, mở van 2 để dung dịch này chảy từ từ xuống B, đóng van 2 lại Đổ nước cất

vào và tráng C, cũng mở van 2 thật nhẹ nhàng để nước chảy từ từ xuống B từng

Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Tran Thi Bich Lam giọt cho đến khi mực nước trong C xuống gần sát tới van 2 thì khóa van 2 lại Rửa

C một lần nữa với thao tác tương tự như trên

Thêm vào phiếu C 10ml NaOH đậm đặc Mở van 2 từ từ để cho NaOH chảy

xuống C từng giọt một Nếu nước trong B trào mạnh quá thì khóa van 2 lại, rồi tiếp tục cho chảy từ từ đến khi NaOH chảy gần hết xuống B

Tráng phiếu C hai lần với một ít nước cất, chỉ cho nước chảy xuống gần sát tới kẹp

2 mà thôi

Quá trình kết thúc sau khoảng 25 phút sau đó hạ erlen E xuống sao cho đầu mút của ống sinh hàn nằm rong không khí, đun tiếp 3 phút nữa Rửa đầu nhọn của ống làm lạnh D bằng một tia nước của bình xịt Lấy erlen E ra rồi rửa lại máy vài lần như trên rồi chuẩn độ lượng H;SO¿ thừa bằng dung dịch chuẩn NaOH 0,01N + Bước 3: chuẩn độ

Lượng H;SO¿ còn dư trong bình E được chuẩn độ bằng NaOH 0,01N quá trình chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ đỏ sang màu nhạt

Xác định hệ số hiệu chỉnh x: lấy 3 erlen cho vào mỗi erlen 20ml H;SO¿ 0,01N và

vài giọt đỏ metyl Sau đó chuẩn độ bởi NaOH 0,01N lấy giá trị trung bình của 3 lần chuẩn độ

Tính kết quả:

Hệ số hiện chỉnh x sẽ được tính theo công thức sau:

x là tỉ số giữa thể tích H;SO, 0,01N và thể tích NaOH tiêu tốn khi chuẩn độ Hay là tỉ số giữa nồng độ thực tế và nông độ tỉnh toán cuả NaOH

Hàm lượng nitơ trong mẫu đượctinh1 theo công thức:

Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Tran Thi Bich Lam

m: khối lượng mẫu đem vô cơ hóa

0,0014: lượng gam nitơ ứng với 1ml H;SO¿0,1NÑ

Nếu là mẫu lỏng:

1000 N/=14*(v, —w, *x)*10°#———

V,

Trong đó: V„ là thể tích mẫu

*Ghi chú: Nếu chuẩn độ trực tiếp với hệ chuẩn HạSO¿ - HạBO;

Sử dụng hệ chuẩn H;SO„— H;BO; để xác định hàm lượng nitơ tiện lợi và

tránh được những sai số về sự thay đổi nông độ đương lượng của kiểm hoặc không khí

Cách tiến hành:

> Nguyên liệu và hóa chất:

H;BO; 2%, thuốc thử Tarshiro, H;SO¿ 0,01N, các hóa chất dùng cho việc vô

cơ hóa mẫu và cất đạm

Cho vào bình hứng 2ml H;BO; 2%, thêm một ít nước cất sao cho dd H;ạBO; ngập đầu mút của ống sinh hàn Trong bình hứng, dd H;BO; tự phân li:

H3BO; > HBO, + H,0 Khi cất đạm NH; bị kiểm đẩy khỏi (NH4);SO¿ theo hệ thống sinh hàn vào

bình hứng, phản ứng với HBO; :

NH,OH + HBO, > NH,‘ + BO; + H;O

BO; là một bazơ mạnh làm dd của bình hứng chuyển từ màu tím đỏ sang

màu xanh lá mạ Lượng BO; được tạo thành tương đương lượng NH; bị đẩy ra trong quá trình cất đạm Xác định lượng BO; bằng cách độ ngược với H;SO, 0,01N Giai đoạn chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ mầu xanh lá mạ sang

mau tim dé

BO, + H* > HBO, Tinh két qua:

Hàm lượng N%(mg N trong 100g mẫu) sẽ được tính theo công thức sau:

11

Các phương pháp định lượng protein GVED: TS Tran Thi Bich Lam

V, *0,14V *100

V„*m

N(%) =

Trong đó: V.— lượng H;SOx 0,01N để chuẩn độ BO, (ml)

V ~ số mol dd mẫu pha loãng (100m])

Vm — 86 ml dd mau cat dam

m — trong ludng mẫu đem vô cơ hóa (mg)

0,14— số mg N tương đương 1ml HạSO¿ 0,01N

1.2 Định lượng nítơ phí Proteïm:

Nguyên tắc:

Dùng các dung môi thích hợp để chiết rút tất cả các dạng nitơ phi Protein Tuy nhiên trong dịch chiết vẫn còn lẫn một vài loại Protein Vì vậy cần dùng các chất kết tủa để tách riêng phần Protein hòa tan trong quá trình chiết rút

Kết tủa Protein có thể tiến hành theo nhiễu cách như: Aceton, muối kim loại nặng,

acid, thẩm tích đối nước Nhưng thông dụng nhất là dùng các chất kết tủa sau: TCA 10 — 20% (acidtricloacetic), Pb(CHạCOO); 10 — 15%, CuSO¿ 10% trong hổn hộp với NaOH 10% với tỉ lệ 1:1

Lọc kết tủa Protein, rửa kết tủa nhiều lần ta được dung dịch phi Protein Vô

cơ hóa dung dịch, cất đạm tương tự định lượng nitơ tổng số

Cách tiến hành:

Nguyên liệu: các mẫu cần được xác định hàm lượng phi Protein

Hóa chất: cồn 70 và các chất cần cho việc định lượng Protein theo phương phap Kjeldahl

Cân chính xác 5 — 10g mẫu nguyên liệu đã nghiền nhuyễn, cho vào cối sứ hay thủy tỉnh, nghiển lẫn với etanol 70° (đ lệ thể tích : nguyên liệu là 1:4 nếu mẫu tươi và 1:§ nếu mẫu khô) Nghiễển trong 20 phút, sau đó để ngâm khoảng 40 — 80

12

Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Tran Thi Bich Lam phút và khuấy liên tục Lọc tách bã hay ly tâm 5000 vòng/phút, sau đó đổ phần bã vào một becher 250ml còn phần bã lấy ra cối chiết lại bằng cồn 70” một lần nữa theo tỉ lệ 1:4 và nhiều lần bằng nước cất vô đạm cho đến khi nước chiết không còn phản ứng với thuốc thử ninhydrin Dồn tất cả các dịch chiết lại và đem kết tủa Protein, sau đó đem lọc trong đó cặn chứa nitơ Protein, còn dịch lọc chứa nitơ phi Protein Đem vô cơ hóa dịch lọc và tiến hành xác định hàm lượng nỉ tơ theo phương phap Kjeldahl

1.2 Định lượng Prot¿eïn trong nguyên liệu:

Có thể tiến hành theo 2 cách sau:

Nit tổng số = NỞ proeein + NitO phi protein

Ta xác định nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl và nitơ phi Protein sau

đó tính nitơ Protein

Nitd protein = Nitd téng sé - Nitd phi Protein

> Protein = Nit6 protein * 6,25

2.1 Định lượng Proteïm theo pliương pháp Biure

Nguyên (ắc:

Dựa vao phan ting tao mau giữa Protein và Cu” trong môi trường kiểm tạo

phản ứng màu xanh tím có độ hấp thu cực đại ở bước sóng 540nm

13

Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Tran Thi Bich Lam

Cách tiến hành:

Chuẩn bị nguyên liệu và hóa chất: dung dịch Albumin tiêu chuẩn 1%

Chuẩn bị thuốc thử Biure:

Các phương pháp định lượng protein GVED: TS Tran Thi Bich Lam

Bảng 3: lập đồ thị chuẩn nông độ Protein

Lắc đều các ống nghiệm và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Đem đo

độ hấp thu của các ống ở bước sóng 540nm và ghi nhận mật độ quang

Chuẩn bị dung dịch nghiên cứu

Cho vào ống nghiệm 1ml dung dịch nghiên cứu và 4ml thuốc thử Biure lắc

đều và để yên trong 30 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó đem đo mật độ quang ở bước

sóng 540nm Ghi nhận mật độ quang

T ính toán:

Lập đồ thị chuẩn của các ống nghiệm từ 26 Trị số mật độ quang của các ống nghiệm từ 26 bằng mật độ mật độ quang của các ống nghiệm từ 26 đã được đo ở trên trừ cho mật độ quang của ống 1 Sau đó lập đô thị biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang theo nồng độ Protein chuẩn

Tương tự độ hấp thu thật sự của Protein có trong ống thí nghiệm là trị số mật

độ quang của ống thí nghiệm trừ ống đối chứng Sau đó đối chiếu vào đường cong mẫu suy ra lường Protein có trong mẫu thí nghiệm

15

Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Tran Thi Bich Lam

Độ nhạy và kha nang ứng dụng:

Phương pháp này nhạy hơn phương pháp Lowry nhưng không bằng phương

pháp Bradford vì nó được sử dụng đối với mẫu nghiên cứu có khối lượng Protein tương đối lớn 20 — 2,000ug/mI

22 Định lượng Protein băng phương pháp Lowry (Biure cải tiến):

Nguyên (ắc:

Dựa vào phan ứng màu của Protein và thuốc thử Folin Phương pháp này sử

dụng phối hợp phản ứng Biure và phản ứng với thuốc thử Folin tác dụng lên gốc tyrosin, tryptophan, hystidin, để tạo phức màu xanh đặc trưng có độ hấp thu cực đại

ở bước sóng 750nm và dựa vào đường chuẩn Protein để từ đó dịnh lượng hàm

lượng Protein Cường độ màu tỉ lệ với nồng độ Protein

(phosphomolybdic/phosphotungstic acid} Amax = 750 nm

Hinh : Phan ting Lowry

Tién hanh

Chuẩn bị nguyên liệu, hóa chất, thiết bị

e Dung dich Protein chudn c6 10 - 100 pg Protein/1ml

e Dung dich nghién ctfu cé 50 - 300 wg Protein/1ml

16

Các phương pháp định lượng protein GVHD: TS Tran Thi Bich Lam

e Dung dịch chuẩn: Albumin 0,1%, thường là huyết thanh bò (BSA - bovine serum albumin)

Hóa chất : pha

e Dung dich A : Na,CO; 2% hoa trong NaOH 0,1N

e Dung dich B : CuSO4.5H20 0,5% pha trong dung dich natri citrat 1%

e Dung dich C : hén hgp dung dich A va dung dich B véi ti 1é 49:1

e Dung dich Folin

Cách pha dung dịch Folin: Pha trong bình cầu có V= 21

Cân 100g natri tungstat (natri wonframat (Na;WOx.2H;O) và 25g natri

molypdate ( Na;MoO¿.2H;O) Thêm vào đó 700ml nước cất và 50ml acid orto

phosphoric 85% ( H;PO¿) Khuấy cho tan và thêm vào đó 100ml HCI đậm đặc và tỉnh khiết rồi tiếp tục khuấy Đun sôi hỗn hợp có ống sinh hàn làm lạnh hồi lưu trong 10h Sau khi đun hồi lưu thêm vào d6 150g lithium sulfat ( LiySO4.H,O) tinh khiết Khuấy cho đến khi tan hoàn toàn rồi cho vào đó 5 — 10 ml nuéc Brom khuấy đều và đun sôi ở tủ hotte 15 phút để đuổi lượng Brom thừa Dung dịch phải có màu vàng, nếu dung dịch có màu xanh thì phải xử lý với Brom lần thứ 2 sau khi làm nguội dung dịch ở nhiệt độ thường Để vào bình định mức 11 và định mức đến vạch

Có thể lọc nếu dung dịch không trong Đựng trong chai thủy tỉnh nút nhám có màu nâu, cất giữ ở nơi lạnh, sau 2 — 3 tháng, dung dịch chuyển sang màu xanh thì thêm vài giọt Brom và đun sôi 15 phút dung dịch lại có màu vàng trở lại Trước khi dùng phải pha loãng thuốc thử bằng nước cất đến nồng độ 0,5N

Thiết bị : máy so màu quang điện

Tiến hành:

Chuẩn bị mẫu thí nghiệm nghiên cứu:

Cho vào ống nghiệm Iml dung dich mau ,thém vào ống nghiệm 4ml dung dịch C, lắc đều, để yên trong 10 phút ở nhiệt độ phòng Sau đó thêm 0,5ml thuốc thử Folin, lắc đều và để yên trong 30 — 90 phút, lúc này dung dịch sẽ chuyển từ

17