Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm men sinh bào tử bắn phân lập từ lá cây ở vườn Quốc gia Cúc Phương

Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm men sinh bào tử bắn phân lập từ lá cây ở vườn Quốc gia Cúc Phương

Hà Nội - 2007

Tóm tắt Luận án tiến sĩ sinh học

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 62.42.40.01

Nghiên cứu đặc điểm sinh học

vμ phân loại của nấm men sinh bμo tử bắn phân lập từ lá cây

ở Vườn Quốc gia Cúc Phương

Đào Thị Lương

………

đại học quốc gia hμ nội

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Phản biện 3: PGS TS Nguyễn Xuân Thành

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng cấp chấm luận án tiến

sĩ họp tại Vào hồi giờ ngày tháng năm 200

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin- Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

Mở đầu Tính cấp thiết của luận án

Nấm men sinh bào tử bắn là một nhóm nấm men lớn, tồn tại trong

tự nhiên, chiếm 14/90 chi nấm men với số lượng loài chiếm hơn 1/10 tổng số loài nấm men đã biết (khoảng 80 loài) Đây là nhóm vi sinh vật rất phong phú, hiện hữu trong thiên nhiên nhưng từ trước đến nay chưa

hề được biết đến Là nhóm nấm men có tiềm năng sinh hàng loạt enzym nên cần phải được nghiên cứu để phát hiện các enzym có tính năng mới Đây là miền đất trống, nếu nghiên cứu sẽ có khả năng phát hiện nhiều loài mới cho khoa học, góp phần bổ sung vào danh mục loài của thế giới

Việt Nam nằm trong khu vực có khí hậu nóng, ẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật phát triển Việt Nam được đánh giá là một trong các quốc gia có đa dạng sinh học phong phú ở Việt Nam, sự nghiên cứu đa dạng vi sinh vật mới thực sự bắt đầu, để góp phần vào công cuộc tìm kiếm các nguồn gen mới, tiến hành thẩm định, tìm cách ứng dụng và lưu giữ chúng cho các thế hệ sau, chúng tôi thực hiện đề

tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm men sinh

bào tử bắn phân lập từ lá cây ở Vườn Quốc gia Cúc Phương”

Mục đích của đề tài

- Tìm hiểu nấm men sinh bào tử bắn- một nhóm vi sinh vật phong phú cư trú trên nhiều loại lá cây mà từ trước đến nay chưa hề biết đến ở Việt Nam- khởi nguồn cho một nhánh nghiên cứu mới về đa dạng sinh học

- Tìm kiếm và phát hiện các loài mới cho khoa học, bổ sung vào danh mục loài của thế giới

- Bước đầu tìm hiểu khả năng sinh các chất hoạt động sinh học (các loại enzym ngoại bào) của nhóm nấm men này

Những đóng góp mới của luận án:

- Là công trình nghiên cứu đầu tiên về đa dạng sinh học của nấm men sinh bào tử bắn ở Việt Nam

- Đã phát hiện được 16 loài mới được quốc tế công nhận: 12 loài thuộc

chi Bullera và 4 loài thuộc chi Kockovaella Đưa địa danh Việt Nam

vào danh mục loài của thế giới

- Công trình đầu tiên tìm hiểu khả năng sinh các chất hoạt động sinh học của nhóm nấm men này

Bố cục luận án:

Luận án bao gồm phần mở đầu, tổng quan, đối tượng và phương pháp nghiên cứu, kết quả và thảo luận, kết luận và kiến nghị, danh mục công trình, tài liệu tham khảo, phụ lục Luận án có 22 bảng, 45 hình, 109 tài liệu tham khảo

Nội dung luận án Chương 1 Tổng quan

1.1 Đa dạng sinh học và đa dạng vi sinh vật

1.2 Đại cương về nấm men

1.3 Các chỉ tiêu được sử dụng trong phân loại nấm men

1.4 Nấm men sinh bào tử bắn

Chương 2 Đối tượng vμ phương pháp nghiên cứu

1 Chủng nấm men: Các chủng nấm men sinh bào tử bắn được phân

lập theo phương pháp của Nakase và Takashima (1993)

2 Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá: Chủ yếu theo mô tả của

Yarrow (1998) Khả năng đồng hoá nitơ được xác định theo phương pháp của Nakase và Suzuki(1986) Vitamin đòi hỏi bắt buộc được xác

định theo Komagata và Nakase (1967)

3 Các đặc điểm hoá phân loại (chemotaxonomy): Tách chiết, tinh

sạch và xác định ubiquinon theo phương pháp của Nakase và Suzuki (1986) Xyloza trong tế bào được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng hoặc sắc ký lỏng cao áp theo Nakase và cộng sự (1976)

4 Phân tích trật tự và xây dựng cây phát sinh: Trình tự của ADNr 18S,

ITS bao gồm 5,8S và D1/D2 của 26S được xác định theo Takashima và Nakase (1999), Kurtzman và Robnnet (1997) Sử dụng chương trình computer CLUSTAL X ver 1.83 của Thompson và cộng sự (1994) Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL và Gen Bank Cây phát sinh

được xây dựng theo Kimura (1980) sử dụng phương pháp của Saitou

và Nei (1987)

5 Thí nghiệm lai ADN-ADN: Phân lập và tinh sạch ADN thực hiện theo

phương pháp của Takashima và Nakase (2000) Các thí nghiệm lai ADN-ADN genom được thực hiện theo phương pháp huỳnh quang của Ezaki và cộng sự (1989)

6 Xác định hoạt tính enzym ngoại bào và khả năng sinh chất kháng

sinh bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch Xác định sinh khối

bằng phương pháp cân trọng lượng khô (Nguyễn Lân Dũng và đtg, 1972)

Chương 3 Kết quả vμ thảo luận

3.1 Phân lập nấm men

Từ 20 mẫu lá cây thu thập ở Vườn Quốc gia Cúc Phương, sử dụng phương pháp phân lập nấm men sinh bào tử bắn của Nakase và Takashima, đã phân lập được 151 chủng nấm men trong đó có 121 chủng nấm men sinh bào tử bắn Dựa vào đặc điểm hình thái bào tử, hình thái màu sắc khuẩn lạc, các chủng này được ghép thành 85 nhóm, trong

đó mỗi nhóm chọn một chủng làm đại diện cho các nghiên cứu tiếp theo 3.2 Phân loại nấm men sinh bào tử bắn

3.2.1 Phân loại đến chi

Dựa trên các tiêu chí phân loại nấm men sinh bào tử bắn bao gồm: hình thái bào tử bắn, sự tạo thành bào tử đính có cuống, sự tồn tại của xyloza và ubiquinon chủ yếu, 85 chủng nghiên cứu đã được xếp vào 3 lớp: Hymenomycetes, Urediniomycetes và Ustilaginomycetes

Lớp Hymenomycetes bao gồm 2 chi là Bullera và Kockovaella Lớp Urediniomycetes gồm 2 chi là Bannoa và Sprobolomyces Lớp Ustilaginomycetes gồm một chi Tilletiopsis (Bảng 3.2)

Bảng 3.2 Sắp xếp các chủng nấm men sinh bào tử bắn vào các chi

dựa trên các đặc điểm hoá phân loại và hình thái

Hình dạng bào tử bắn

Bào

tử

đính

có cuống

- Sprobolomyces

5 - Q-10 (H2)

Không

đối xứng

Urediniomycetes

dài, cong lưỡi liềm

- Tilletiopsis Ustilaginomycetes

Có 39 chủng nấm men thuộc chi Bullera đ−ợc đặc trưng bởi

khuẩn lạc màu trắng đến hơi vàng, sinh sản bằng bào tử bắn dạng đối xứng và bằng bào tử nảy chồi, chứa xyloza trong tế bào và ubiquinon chủ yếu là Q-10 Có 5 chủng có các đặc điểm: chứa xyloza trong tế bào, Q-10 là ubiquinon chủ yếu, sinh sản bằng bào tử bắn dạng đối xứng, bào tử đính có cuống và tế bào nảy chồi Đây là các đặc điểm đặc

tr−ng cho chi Kockovaella Có 34 chủng nấm men đ−ợc đặc tr−ng bởi

khuẩn lạc có màu hồng, cam đến đỏ, sinh sản bằng bào tử bắn dạng không đối xứng, không chứa xyloza trong tế bào và có ubiquinon chủ

yếu là Q-10 những chủng này thuộc chi Sporobolomyces. Có 5 chủng nấm men đ−ợc đặc tr−ng bởi khuẩn lạc có màu hồng, cam, sinh sản bằng bào tử bắn dạng không đối xứng, không chứa xyloza trong tế bào và có ubiquinon chủ yếu là Q-10(H2) Những chủng này thuộc chi Bannoa Có

2 chủng nấm men đ−ợc đặc tr−ng bởi sinh sản bằng bào tử bắn dạng dài và cong l−ỡi liềm, không đối xứng, không chứa xyloza trong tế bào

và có ubiquinon chủ yếu là Q-10 Những chủng này thuộc chi

Tilletiopsis.

3.2.2 Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn

thuộc chi Bullera

Để xác định vị trí phân loại của các chủng nấm men phân lập,

thuộc chi Bullera, chúng tôi tiến hành đọc trình tự ADNr của 18S, các

vùng ITS, đoạn D1/D2 của 26S và nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chúng Một số nhóm ch−a xác định rõ vị trí phân loại sẽ

đ−ợc tiến hành lai ADN genom

Trình tự của các đoạn ADNr 18S , ITS và 26S (đoạn D1/D2) của các chủng nấm men đ−ợc đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự động

ABI 3100 Avant của hãng Applied Biosystems (Mỹ) Trình tự nucleotit

của các chủng nấm men đ−ợc so sánh với các trình tự đã có trong

GenBank sử dụng giao diện tìm kiếm “nucleotide-nucleotide BLAST” của Trung tâm Tin- Công nghệ sinh học Quốc gia (National Center for Biotechnology Information), Bethesda (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 18S (450 bp) của

các chủng nghiên cứu so sánh với 38 loài thuộc các chi Bullera,

Cryptococcus, Dioszegia, Kockovaella, Trimorphomyces và Udeniomyces

Kết quả hình 3.3 cho thấy: 39 chủng nấm men mới phân lập thuộc chi

Bullera gộp thành 5 nhóm nằm rải rác trong các dòng Bulleromyces và Cryptococcus luteolus (hay Luteolus) của lớp Hymenomycetes Nhóm

A có số lượng lớn nhất gồm 27 chủng có quan hệ họ hàng gần với các

loài thuộc nhánh Bullera huiaensis và B mrakii của dòng (lineage)

Cryptococcus luteolus Nhóm này phân lập được ở 15/20 mẫu lá, chứng

tỏ chúng rất phổ biến ở Vườn quốc gia Cúc Phương Nhóm B gồm 1

chủng cùng nhánh với Cryptococcus podzolicus (không sinh bào tử bắn) Nhóm C gồm 4 chủng nằm ở vị trí gần với B coprosmaensis, B sinensis

và C luteolus Nhóm D gồm 4 chủng có quan hệ họ hàng gần với nhóm

B variabilis Nhóm E gồm 2 chủng hợp thành nhóm với các loài B pseudoalba, B unica, C cellulolyticus và C laurentii của dòng Bulleromyces

Để xác định chính xác vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh

bào tử bắn đến loài chúng tôi tiến hành nghiên cứu kết hợp giữa các

đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và so sánh các trình tự ADNr ITS

và 26S (D1/D2)

Berbee và đtg (1995); Fell và đtg (2000); James và đtg (1996) đã sử dụng trình tự vùng ITS như một thước đo phân loại hữu ích nhờ vùng này có tỷ lệ sai khác cao hơn hẳn so với các vùng ADNr 18S và 26S

Fell và đtg (2000); Sugita và đtg (1999) cũng đã chứng minh rằng tỷ lệ nucleotit trong vùng ITS ở cùng một loài thường khác nhau nhỏ hơn 1%

Hình 3.3 Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn

thuộc chi Bullera với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào

56

100

78

VY-63 VY-118

Bullera siamensis (AY188389)

99

VY 2 Bullera setariae (AB118875)

89 100

51

100 Bullera oryzae (D31652) Cryptococcus luteolus (AB032641)

Bullera kunmingensis (AF325169)

a anomala (AF453291)

54

Bullera huiaensis (D78331) Bullera boninensis (AB022928) Bullera w

VY-102 VY-91 VY-75 VY-21 VY-42 VY-144 VY-20 VY-51 VY-116 VY-3

altii (AB022929)

Bullera mrakii (AF314993) Bullera p

VY-50 VY-69 VY-5 VY-23 VY-85 VY-143

52

93

68

86 61

Cả 39 chủng nấm men thuộc chi Bullera được xác định trình tự

ADNr các vùng ITS (480- 580 bp) Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự ADNr các vùng ITS của các chủng nghiên cứu so sánh với

38 loài thuộc các chi Auriculibuller, Bullera, Bulleromyces, Calathella,

Cryptococcus, Dioszegia Trên cây phả hệ, 39 chủng nấm men nghiên

cứu cũng nằm rải rác trong 5 nhóm như ở cây phả hệ của ADNr 18S ở

các dòng Bulleromyces và C luteolus của lớp Hymenomycetes

Hiện nay, ngày càng có nhiều dữ liệu về đoạn D1/D2 của ADNr 26S của nấm men đã được gửi vào GenBank và càng có nhiều người

sử dụng các số liệu này trong phân loại nấm men Fell và đtg (2000); Kurtzman và Robnett (1997, 1998); Sugita và Nishikawa (2003) chứng minh rằng các chủng nấm men có tỷ lệ nucleotit khác nhau lớn hơn 1% sẽ thuộc các loài khác nhau

Tất cả 39 chủng nấm men thuộc chi Bullera được xác định trình tự

ADNr 26S đoạn D1/D2 (600 bp) Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự của 39 chủng nghiên cứu so sánh với 36 loài thuộc các chi

Auriculibuller, Bullera, Bulleribasidium, Cryptococcus, Dioszegia, Kockovaella, Tremella, Trichosporon Trên cây phả hệ dựa vào ADNr

26S đoạn D1/D2, 39 chủng nấm men nghiên cứu thuộc chi Bullera cũng nằm xen kẽ trong 5 nhóm ở các dòng Bulleromyces và

Cryptococcus luteolus của lớp Hymenomycetes tương tự như ở cây

phả hệ của 18S và ITS

Sự sai khác về trình tự ADNr vùng ITS và D1/D2 của các chủng nấm men nghiên cứu với các loài có quan hệ họ hàng gần được so sánh

Nhóm A: gồm 27 chủng được chia thành 7 nhóm nhỏ

Nhóm nhỏ 1: có 5 chủng VY-3, VT-20, VY-85, VY-91 và VY-102

được xếp vào cùng một loài vì sự sai khác giữa chúng ở mức độ ADNr

rất nhỏ 0-1,1 % ở vùng ITS và 0-0,3% ở 26S (D1/D2), ngoài ra các đặc

điểm sinh lý sinh hoá giữa chúng cũng tương tự nhau Năm chủng này

sai khác với B mrakii 0,3-1% trong vùng ITS và 0,5-0,8% ở 26S (D1/D2), các đặc điểm sinh lý sinh hoá cũng giống nhiều nhất với B

mrakii Các chủng VY-3, VT-20, VY-85, VY-91 và VY-102 thuộc loài Bullera mrakii

Nhóm nhỏ A2: gồm 5 chủng 42, 51, 75, 116 và

VY-143 Sự sai khác giữa các chủng này ở ADNr ở vùng ITS là 0,2-1,3 % và

ở 26S (D1/D2 ) là 0,2-0,3%, các đặc điểm sinh lý sinh hoá giữa chúng không có khác biệt nhiều, nên cần phải thực hiện lai ADN genom để xác

định xem chúng có cùng loài hay không Năm chủng này là loài mới do khác biệt lớn về trình tự ADNr với các loài đã biết: 9,4-23,6% ở vùng ITS

và 1,5-4,0 % ở 26S (D1/D2)

Nhóm nhỏ A3: gồm VY-5, VY-21, VY-23, VY-69 và VY-103 Sự

sắp xếp vị trí phân loại của các chủng này với B nakasei chưa rõ ràng vì sai khác ở mức độ ADNr giữa các chủng này với B nakasei là 3,5-

4,1 % ở vùng ITS và 0,8-1,5 % ở 26S (D1/D2) Để khẳng định rõ vị trí phân loại của nhóm này cần thực hiện lai ADN genom

Nhóm nhỏ A4: chủng VY-50 sai khác ADNr với các loài đã biết 10,1 – 27,4% ở vùng ITS và 1,4-3.8 % ở 26S (D1/D2) Các đặc điểm sinh lý sinh hoá giữa VY-50 và các loài đã biết sai khác nhiều VY-50 thuộc loài mới

Nhóm nhỏ A5: gồm các chủng VY-45, VY-57, VY-105, VY-139 và VY-145 được xếp vào cùng một loài vì sự sai khác giữa chúng ở mức độ ADNr rất nhỏ 0-0,2% ở vùng ITS và 26S (D1/D2), ngoài ra các đặc điểm sinh lý sinh hoá giữa chúng cũng tương tự nhau Năm chủng này sai

khác với B pseudoschimicola 0,5-0,7 % trong vùng ITS và 0- 0,5 % ở

26S (D1/D2) Các đặc điểm sinh lý sinh hoá cũng tương tự khi so sánh

với B pseudoschimicola Các chủng VY-45, VY-57, VY-105, VY-139

và VY-145 thuộc loài Bullera pseudoschimicola

Nhóm nhỏ A6: gồm 3 chủng VY-60, VY-86 và VY-140 Ba chủng này tương đồng về trình tự ADNr ITS, sai khác 0,2-0,5 % ở 26S (D1/D2) nên chúng thuộc cùng loài ADNr của 3 chủng nghiên cứu sai khác 20,0-24,9 % ở vùng ITS và 3,5-5,5 % đoạn D1/D2 với các loài đã biết Vì vậy 3 chủng VY-60, VY-86 và VY-140 thuộc một loài và là loài mới

Nhóm nhỏ A7: gồm 3 chủng VY-55, VY-65 và VY-142 sai khác ADNr 0,3- 0,7 % trong vùng ITS và 26S (D1/D2), và sai khác với các loài đã biết 25,5-28% trong vùng ITS và 3,7-5,5 % đoạn D1/D2 Các chủng VY-55, VY-65 và VY-142 là các loài chưa biết Cần xác định

vị trí của 3 chủng này thông qua lai ADN genom

Nhóm B: sự sai khác về trình tự ADNr của chủng VY-112 với Cryptococcus podzolicus đủ lớn để khẳng định VY-112 là loài mới

(8,7 % ở vùng ITS và 5% ở đoạn D1/D2)

Nhóm C: gồm 3 nhóm nhỏ

Hai chủng VY-132 và VY-144, tương đồng về trình tự ADNr vùng

ITS và 26S (D1/D2) Chúng sai khác với B oryzae 0,2 % ở ADNr

vùng ITS và đoạn D1/D2 So sánh các đặc điểm sinh lý sinh hoá của 2

chủng này và B oryzae không có sự khác biệt nhiều 132 và

VY-144 là một loài và chúng thuộc Bullera oryzae

Hai chủng VY-48 và VY-104, thuộc cùng loài vì mức độ sai khác nhau về trình tự ADNr vùng ITS và D1/D2 là rất nhỏ (0,2 %)

Chúng sai khác với C luteolus 1,2-1,4 % ADNr ở vùng ITS và 1,2 %

trong đoạn D1/D2 Cần phải thực hiện lai ADN genom của 2 chủng

này với C luteolus

- Chủng VY-77 sai khác với B sinensis 0,6 % ADNr ở vùng ITS

và tương đồng ở đoạn D1/D2 Chủng này cũng không khác biệt nhiều

khi so sánh các đặc điểm sinh lý, sinh hoá với loài B sinensis VY-77 thuộc loài Bullera sinensis.

Nhóm D: gồm 4 chủng chia làm 3 nhóm nhỏ

Hai chủng VY-63 và VY-118, không có sự sai khác về trình tự

ADNr ở các vùng ITS và D1/D2, sai khác với B panici 1,9 % ở vùng

ITS và 26S (D1/D2) là 0,5 % Cần thực hiện lai ADN genom để xác

định rõ vị trí phân loại của nhóm nhỏ này

Chủng VY-2 sai khác với B setariae 4,5 % ADNr ở vùng ITS và

D1/D2 là 3 % VY-2 thuộc loài mới

Chủng VY-128 có mức độ sai khác đủ lớn để phân biệt loài khác

về ADNr ở vùng ITS với B variabilis và B pseudovariabilis 5,3 %) và đoạn D1/D2 với B pseudovariabilis, B variabilis và

(4,7-Bulleribasidium oberjochense (2,0-2,2 %) VY-128 thuộc loài mới

Nhóm E: gồm 2 chủng chia làm 2 nhóm nhỏ

Chủng VY-68 sai khác với B pseudoalba 3,6 % ở vùng ITS và

D1/D2 26S là 0,7 % Cần lai ADN genom để xác định rõ vị trí phân loại của nhóm nhỏ này

Chủng VY-120 sai khác với B japonica 0,3 % ADNr ở vùng ITS

và D1/D2 là 0,2 % VY-120 thuộc loài Bullera japonica.

Lai ADN genom

Thí nghiệm lai ADN genom được thực hiện giữa các chủng

nấm men chưa xác định rõ vị trí phân loại với các chủng nghiên cứu hoặc với chủng chuẩn có quan hệ gần nhất

Nhóm A có 3 nhóm nhỏ A2, A3 và A7