Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm men sinh bào tử bắn phân lập từ lá cây ở Vườn Quốc gia Cúc Phương tt

Ở Việt Nam, sự nghiên cứu đa dạng vi sinh vật mới thực sự bắt đầu, để góp phần vào công cuộc tìm kiếm các nguồn gen mới, tiến hành thẩm định, tìm cách ứng dụng và lưu giữ chúng cho các t

Công trình được hoàn thành tại:

- Bảo tàng giống Vi sinh vật Nhật Bản –JCM, RIKEN, Nhật Bản

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

………

Đào Thị Lương

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC

VÀ PHÂN LOẠI CỦA NẤM MEN SINH BÀO TỬ BẮN PHÂN LẬP TỪ LÁ CÂY

Ở VƯỜN QUỐC GIA CÚC PHƯƠNG

Chuyên ngành: Vi sinh vật học

Mã số: 62.42.40.01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2008

- Bộ môn Vi sinh vật, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

- Viện Vi sinh vật & Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học:

1 GS.TS Phạm Văn Ty

2 GS.TS Nguyễn Lân Dũng

Phản biện 1: GS TS Nguyễn Đình Quyến

Phản biện 2: PGS TS Lê Gia Hy

Phản biện 3: PGS TS Nguyễn Xuân Thành

Luận án được bảo vệ trước Hội đồng cấp Nhà nước chấm luận án tiến

sĩ họp tại Phòng 418, nhà T1, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Vào hồi 9 giờ 00 ngày 24 tháng 5 năm 2008

Có thể tìm hiểu luận án tại:

- Thư viện Quốc gia Việt Nam

- Trung tâm Thông tin- Thư viện, Đại học Quốc gia Hà Nội

1.1.3 Nghiên cứu đa dạng nấm men và nấm men sinh bào tử bắn 5

1.1.3.4 Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở Trung Quốc 8 1.1.3.5 Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở Nhật Bản 8 1.1.3.6 Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở một số nước khác 9

x

1.3.2 Các nấm men là các nhà sản xuất protein đơn bào 25

1.3.3 Các nấm men như nguồn sản xuất các sản phẩm công nghiệp

1.3.6 Nấm men là các tác nhân phục hồi sinh học 27

1.3.7 Cải biến nấm men bằng đột biến, lai thể nguyên sinh và kĩ

thuật ADN tái tổ hợp

28

1.3.8 Dùng nấm men làm sinh vật biểu hiện ADN tái tổ hợp 28

1.4 Các chỉ tiêu được sử dụng trong phân loại nấm men 29

1.4.1 Các nghiên cứu được dùng trong phân loại nấm men 29

1.4.1.3 Các đặc điểm hoá phân loại và sinh học phân tử 30

1.4.2.2 Phương pháp sử dụng số liệu về trình tự ADNr 31

1.4.3 Các chỉ tiêu dùng trong phân loại hiện đại 32

1.5.2 Lịch sử nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn 40

1.5.3 Vị trí nấm men sinh bào tử bắn trong cây phả hệ 42

xi

2.1.2.2 Các chủng nấm men chuẩn dùng trong lai ADN genom 48

2.1.4.1 Môi trường phân lập và nuôi nấm men sinh bào tử bắn 49

2.2.2.2 Phân loại dựa vào đặc điểm sinh lý, sinh hoá 52

2.2.7 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình

sinh tổng hợp enzym của dịch nuôi nấm men

66

xii

3.2.2 Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc

chi Bullera

72

3.2.2.1 Xác định và phân tích trình tự ADNr 18S 72 3.2.2.2 Xác định và phân tích trình tự ADNr ITS 74 3.2.2.3 Xác định và phân tích trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2 76 3.2.2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng nấm men

sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera

84

3.2.2.5 Phân loại các chủng nấm men thuộc chi Bullera đến loài 90

3.2.3 Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc

chi Kockovaella

97

3.2.3.1 Xác định và phân tích trình tự ADNr 18S 97 3.2.3.2 Xác định và phân tích trình tự ADNr các vùng ITS 98 3.2.3.3 Xác định và phân tích trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2 100 3.2.3.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng nấm men sinh

bào tử bắn thuộc chi Kockovaella

102

3.2.3.5 Phân loại các chủng nấm men thuộc chi Kockovaella đến

loài

105

3.3 Sự đa dạng của nấm men sinh bào tử bắn ở Vườn quốc gia Cúc

3.4 Hoạt tính sinh học của các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc

3.4.2 Khả năng đối kháng với các vi sinh vật khiểm định của các

3.4.3.1 Lựa chọn môi trường nuôi cấy thích hợp 117

Phô lôc 2 HÖ thèng ubiquinon cña c¸c chñng nÊm

men nghiªn cøu

148

Phô lôc 4 M« t¶ c¸c loµi míi cña chi

Kockovaella

189

MỞ ĐẦU Tính cấp thiết của luận án

Nấm men sinh bào tử bắn là một nhóm nấm men lớn, tồn tại trong tự nhiên, chiếm 14/90 chi nấm men với số lượng loài chiếm hơn 1/10 tổng số loài nấm men đã biết (khoảng 80 loài) Đây là nhóm vi sinh vật rất phong phú, hiện hữu trong thiên nhiên nhưng từ trước đến nay ít được biết đến Là nhóm nấm men có tiềm năng sinh hàng loạt enzym nên cần phải được nghiên cứu để phát hiện các enzym có tính năng mới Đây là miền đất trống, nếu nghiên cứu sẽ có khả năng phát hiện nhiều loài mới cho khoa học, góp phần bổ sung vào danh mục loài của thế giới

Việt Nam nằm trong khu vực có khí hậu nóng, ẩm, tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật phát triển Việt Nam được đánh giá là một trong các quốc gia có đa dạng sinh học phong phú Ở Việt Nam,

sự nghiên cứu đa dạng vi sinh vật mới thực sự bắt đầu, để góp phần vào công cuộc tìm kiếm các nguồn gen mới, tiến hành thẩm định, tìm cách ứng dụng và lưu giữ chúng cho các thế hệ sau, chúng tôi thực

hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm

men sinh bào tử bắn phân lập từ lá cây ở Vườn Quốc gia Cúc Phương”

Mục đích của đề tài

- Tìm hiểu nấm men sinh bào tử bắn- một nhóm vi sinh vật phong phú cư trú trên nhiều loại lá cây mà từ trước đến nay chưa hề biết đến ở Việt Nam- khởi nguồn cho một nhánh nghiên cứu mới về

đa dạng sinh học

- Tìm kiếm và phát hiện các loài mới cho khoa học, bổ sung vào danh mục loài của thế giới

- Bước đầu tìm hiểu khả năng sinh các chất hoạt động sinh học (các loại enzym ngoại bào) của nhóm nấm men này

Những đóng góp mới của luận án:

- Là công trình nghiên cứu đầu tiên về đa dạng sinh học của nấm men sinh bào tử bắn ở Việt Nam

- Đã phát hiện được 16 loài mới được quốc tế công nhận: 12 loài

thuộc chi Bullera và 4 loài thuộc chi Kockovaella Đưa địa danh Việt

Nam vào danh mục loài của thế giới

- Công trình đầu tiên tìm hiểu khả năng sinh các chất hoạt động sinh học của nhóm nấm men này

Bố cục luận án:

Luận án bao gồm phần mở đầu, tổng quan, đối tượng và phương pháp nghiên cứu, kết quả và thảo luận, kết luận và kiến nghị, danh mục công trình, tài liệu tham khảo, phụ lục Luận án có 25 bảng, 46 hình, 108 tài liệu tham khảo

NỘI DUNG LUẬN ÁN Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Đa dạng sinh học và đa dạng vi sinh vật

1.2 Đại cương về nấm men

1.3 Ứng dụng của nấm men trong đời sống

1.4 Các chỉ tiêu được sử dụng trong phân loại nấm men

1.5 Nấm men sinh bào tử bắn

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 Chủng nấm men: Các chủng nấm men sinh bào tử bắn được phân

lập theo phương pháp của Nakase và Takashima (1993)

2 Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá: Chủ yếu theo mô tả của

Yarrow (1998) Khả năng đồng hoá nitơ được xác định theo phương pháp của Nakase và Suzuki(1986) Vitamin đòi hỏi bắt buộc được xác định theo Komagata và Nakase (1967)

3 Các đặc điểm hoá phân loại (chemotaxonomy): Tách chiết, tinh

sạch và xác định ubiquinon theo phương pháp của Nakase và Suzuki (1986) Xyloza trong tế bào được phân tích bằng sắc ký lớp mỏng hoặc sắc ký lỏng cao áp theo Nakase và cộng sự (1976)

4 Phân tích trật tự và xây dựng cây phát sinh: Trình tự của ADNr

18S, ITS bao gồm 5,8S và D1/D2 của 26S được xác định theo Takashima và Nakase (1999), Kurtzman và Robnnet (1997) Sử dụng chương trình computer CLUSTAL X ver 1.83 của Thompson và cộng

sự (1994) Các trình tự tham khảo dùng trong nghiên cứu cây phát sinh chủng loại được lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL và Gen Bank Cây phát sinh được xây dựng theo Kimura (1980) sử dụng phương pháp của Saitou và Nei (1987)

5 Thí nghiệm lai ADN-ADN: Phân lập và tinh sạch ADN thực hiện theo

phương pháp của Takashima và Nakase (2000) Các thí nghiệm lai ADN-ADN genom được thực hiện theo phương pháp huỳnh quang của Ezaki và cộng sự (1989)

6 Xác định hoạt tính enzym ngoại bào và khả năng sinh chất kháng sinh

bằng phương pháp khuyếch tán trên thạch Xác định sinh khối bằng

phương pháp cân trọng lượng khô (Nguyễn Lân Dũng và đtg, 1972)

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 PHÂN LẬP NẤM MEN

Từ 20 mẫu lá cây thu thập ở Vườn Quốc gia Cúc Phương, sử dụng phương pháp phân lập nấm men sinh bào tử bắn của Nakase và Takashima, đã phân lập được 151 chủng nấm men trong đó có 121 chủng nấm men sinh bào tử bắn Dựa vào đặc điểm hình thái bào tử, hình thái màu sắc khuẩn lạc, các chủng này được ghép thành 85 nhóm, trong đó mỗi nhóm chọn một chủng làm đại diện cho các nghiên cứu tiếp theo

3.2 PHÂN LOẠI NẤM MEN SINH BÀO TỬ BẮN

3.2.1 Phân loại đến chi

Dựa trên các tiêu chí phân loại nấm men sinh bào tử bắn bao gồm: hình thái bào tử bắn, sự tạo thành bào tử đính có cuống, sự tồn tại của xyloza và ubiquinon chủ yếu, 85 chủng nghiên cứu đã được xếp vào 3 lớp: Hymenomycetes, Urediniomycetes và

Ustilaginomycetes Lớp Hymenomycetes bao gồm 2 chi là Bullera và

Kockovaella Lớp Urediniomycetes gồm 2 chi là Bannoa và Sprobolomyces Lớp Ustilaginomycetes gồm một chi Tilletiopsis

(Bảng 3.2)

Có 39 chủng nấm men thuộc chi Bullera được đặc trưng bởi

khuẩn lạc màu trắng đến hơi vàng, sinh sản bằng bào tử bắn dạng đối xứng và bằng bào tử nảy chồi, chứa xyloza trong tế bào và ubiquinon chủ yếu là Q-10 Có 5 chủng có các đặc điểm: chứa xyloza trong tế bào, Q-10 là ubiquinon chủ yếu, sinh sản bằng bào tử bắn dạng đối

xứng, bào tử đính có cuống và tế bào nảy chồi Đây là các đặc điểm đặc

trưng cho chi Kockovaella Có 34 chủng nấm men được đặc trưng bởi

khuẩn lạc có màu hồng, cam đến đỏ, sinh sản bằng bào tử bắn dạng không đối xứng, không chứa xyloza trong tế bào và có ubiquinon chủ

yếu là Q-10 những chủng này thuộc chi Sporobolomyces. Có 5 chủng nấm men được đặc trưng bởi khuẩn lạc có màu hồng, cam, sinh sản bằng bào tử bắn dạng không đối xứng, không chứa xyloza trong tế bào và có ubiquinon chủ yếu là Q-10(H2) Những chủng này thuộc chi Bannoa

Có 2 chủng nấm men được đặc trưng bởi sinh sản bằng bào tử bắn dạng dài và cong lưỡi liềm, không đối xứng, không chứa xyloza trong

tế bào và có ubiquinon chủ yếu là Q-10 Những chủng này thuộc chi

Tilletiopsis.

Bảng 3.2 Sắp xếp các chủng nấm men sinh bào tử bắn vào các chi

dựa trên các đặc điểm hoá phân loại và hình thái

Hình dạng bào tử bắn

Bào

tử đính

có cuống

- Sporobolomyces

Urediniomycetes

Không đối xứng

dài, cong lưỡi liềm

- Tilletiopsis Ustilaginomycetes

3.2.2 Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn

thuộc chi Bullera

Để xác định vị trí phân loại của các chủng nấm men phân lập,

thuộc chi Bullera, chúng tôi tiến hành đọc trình tự ADNr của 18S, các

vùng ITS, đoạn D1/D2 của 26S và nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hoá của chúng Một số nhóm chưa xác định rõ vị trí phân loại sẽ được tiến hành lai ADN genom

Trình tự của các đoạn ADNr 18S , ITS và 26S (đoạn D1/D2) của các chủng nấm men được đọc trực tiếp trên máy đọc trình tự tự

động ABI 3100 Avant của hãng Applied Biosystems (Mỹ) Trình tự

nucleotit của các chủng nấm men được so sánh với các trình tự đã có trong GenBank sử dụng giao diện tìm kiếm “nucleotide-nucleotide BLAST” của Trung tâm Tin- Công nghệ sinh học Quốc gia (National Center for Biotechnology Information), Bethesda

Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự ADNr 18S (450 bp) của

các chủng nghiên cứu so sánh với 38 loài thuộc các chi Bullera,

Cryptococcus, Dioszegia, Kockovaella, Trimorphomyces và

Udeniomyces

Kết quả hình 3.3 cho thấy: 39 chủng nấm men mới phân lập thuộc chi

Bullera gộp thành 5 nhóm nằm rải rác trong các dòng Bulleromyces và Cryptococcus luteolus (hay Luteolus) của lớp Hymenomycetes Nhóm

A có số lượng lớn nhất gồm 27 chủng có quan hệ họ hàng gần với các

loài thuộc nhánh Bullera huiaensis và B mrakii của dòng (lineage)

Cryptococcus luteolus Nhóm này phân lập được ở 15/20 mẫu lá, chứng

tỏ chúng rất phổ biến ở Vườn quốc gia Cúc Phương Nhóm B gồm 1

chủng cùng nhánh với Cryptococcus podzolicus (không sinh bào tử bắn) Nhóm C gồm 4 chủng nằm ở vị trí gần với B coprosmaensis, B sinensis

và C luteolus Nhóm D gồm 4 chủng có quan hệ họ hàng gần với nhóm

B variabilis Nhóm E gồm 2 chủng hợp thành nhóm với các loài B

pseudoalba, B unica, C cellulolyticus và C laurentii của dòng Bulleromyces

Để xác định chính xác vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh

bào tử bắn đến loài, chúng tôi tiến hành nghiên cứu kết hợp giữa các đặc

điểm hình thái, sinh lý, sinh hoá và so sánh các trình tự ADNr ITS và 26S (D1/D2)

Berbee và đtg (1995); Fell và đtg (2000); James và đtg (1996) đã sử dụng trình tự vùng ITS như một thước đo phân loại hữu ích nhờ vùng này có tỷ lệ sai khác cao hơn hẳn so với các vùng ADNr 18S và 26S Fell và đtg (2000); Sugita và đtg (1999) cũng đã chứng minh rằng tỷ lệ nucleotit trong vùng ITS ở cùng một loài thường khác nhau nhỏ hơn 1%

Hình 3.3 Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn

thuộc chi Bullera với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào

trình tự ADNr 18S

Cả 39 chủng nấm men thuộc chi Bullera được xác định trình tự

ADNr các vùng ITS (480- 580 bp) Cây phả hệ được xây dựng dựa

Udeniomyces puniceus (D31658) Trimorphomyces_papilionaceus (AB085808)

56

100

78

VY-63 VY-118

Bullera siamensis (AY188389)

100 Bullera oryzae (D31652) Cryptococcus luteolus (AB032641)

Bullera kunmingensis (AF325169)

83

52

Bullera anomala (AF453291)

VY-55 VY-142

VY-65

54

VY-103

Bullera huiaensis (D78331) Bullera boninensis (AB022928) Bullera waltii (AB022929)

VY-102 VY-91 VY-75 VY-21 VY-42 VY-144 VY-20 VY-51 VY-116 VY-3 Bullera mrakii (AF314993)

Bullera pseudohuiaensis (AF314994)

VY-50 VY-69 VY-5 VY-23

54

VY-85 VY-143

trên trình tự ADNr các vùng ITS của các chủng nghiên cứu so sánh

với 38 loài thuộc các chi Auriculibuller, Bullera, Bulleromyces,

Calathella, Cryptococcus, Dioszegia Trên cây phả hệ, 39 chủng nấm

men nghiên cứu cũng nằm rải rác trong 5 nhóm như ở cây phả hệ của

ADNr 18S ở các dòng Bulleromyces và C luteolus của lớp

Tất cả 39 chủng nấm men thuộc chi Bullera được xác định trình tự

ADNr 26S đoạn D1/D2 (600 bp) Cây phả hệ được xây dựng dựa trên trình tự của 39 chủng nghiên cứu so sánh với 36 loài thuộc các chi

Auriculibuller, Bullera, Bulleribasidium, Cryptococcus, Dioszegia, Kockovaella, Tremella, Trichosporon Trên cây phả hệ dựa vào ADNr

26S đoạn D1/D2, 39 chủng nấm men nghiên cứu thuộc chi Bullera cũng nằm xen kẽ trong 5 nhóm ở các dòng Bulleromyces và

Cryptococcus luteolus của lớp Hymenomycetes tương tự như ở cây

phả hệ của 18S và ITS

Sự sai khác về trình tự ADNr vùng ITS và D1/D2 của các chủng nấm men nghiên cứu với các loài có quan hệ họ hàng gần được so sánh

Nhóm A: gồm 27 chủng được chia thành 7 nhóm nhỏ

Nhóm nhỏ A1: có 5 chủng 3, VT-20, 85, 91 và

VY-102 được xếp vào cùng một loài vì sự sai khác giữa chúng ở mức độ

ADNr rất nhỏ 0-1,1 % ở vùng ITS và 0-0,3% ở 26S (D1/D2), ngoài ra các đặc điểm sinh lý sinh hoá giữa chúng cũng tương tự nhau Năm

chủng này sai khác với B mrakii 0,3-1% trong vùng ITS và 0,5-0,8% ở

26S (D1/D2), các đặc điểm sinh lý sinh hoá cũng giống nhiều nhất với

B mrakii Các chủng VY-3, VT-20, VY-85, VY-91 và VY-102 thuộc

loài Bullera mrakii

Nhóm nhỏ A2: gồm 5 chủng 42, 51, 75, 116 và

VY-143 Sự sai khác giữa các chủng này ở ADNr ở vùng ITS là 0,2-1,3 %

và ở 26S (D1/D2 ) là 0,2-0,3%, các đặc điểm sinh lý sinh hoá giữa chúng không có khác biệt nhiều, nên cần phải thực hiện lai ADN genom để xác định xem chúng có cùng loài hay không Năm chủng này là loài mới do khác biệt lớn về trình tự ADNr với các loài đã biết: 9,4-23,6% ở vùng ITS

và 1,5-4,0 % ở 26S (D1/D2)

Nhóm nhỏ A3: gồm VY-5, VY-21, VY-23, VY-69 và VY-103 Sự

sắp xếp vị trí phân loại của các chủng này với B nakasei chưa rõ ràng

vì sai khác ở mức độ ADNr giữa các chủng này với B nakasei là

3,5-4,1 % ở vùng ITS và 0,8-1,5 % ở 26S (D1/D2) Để khẳng định rõ vị trí phân loại của nhóm này cần thực hiện lai ADN genom

Nhóm nhỏ A4: chủng VY-50 sai khác ADNr với các loài đã biết 10,1 – 27,4% ở vùng ITS và 1,4-3.8 % ở 26S (D1/D2) Các đặc điểm sinh lý sinh hoá giữa VY-50 và các loài đã biết sai khác nhiều VY-50 thuộc loài mới

Nhóm nhỏ A5: gồm các chủng VY-45, VY-57, VY-105, VY-139 và VY-145 được xếp vào cùng một loài vì sự sai khác giữa chúng ở mức độ ADNr rất nhỏ 0-0,2% ở vùng ITS và 26S (D1/D2), ngoài ra các đặc điểm sinh lý sinh hoá giữa chúng cũng tương tự nhau Năm chủng này

sai khác với B pseudoschimicola 0,5-0,7 % trong vùng ITS và 0- 0,5 %