Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm men sinh bào tử bắn phân lập từ lá cây ở Vườn Quốc gia Cúc Phương

68 3.2 Sắp xếp các chủng nấm men sinh bào tử bắn vào các chi dựa trên các đặc điểm hoá phân loại và hình thái 71 3.3 Số lượng nucleotit sai khác của các chủng nhóm A với các loài có quan

1.1.3 Nghiên cứu đa dạng nấm men và nấm men sinh bào tử bắn 5

1.1.3.4 Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở Trung Quốc 8 1.1.3.5 Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở Nhật Bản 8 1.1.3.6 Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở một số nước khác 9

1.3 ứng dụng của nấm men trong đời sống 24

1.3.3 Các nấm men như nguồn sản xuất các sản phẩm công nghiệp

1.3.7 Cải biến nấm men bằng đột biến, lai thể nguyên sinh và kĩ

thuật ADN tái tổ hợp

28

1.3.8 Dùng nấm men làm sinh vật biểu hiện ADN tái tổ hợp 28

1.4 Các chỉ tiêu được sử dụng trong phân loại nấm men 29

1.4.1.3 Các đặc điểm hoá phân loại và sinh học phân tử 30

1.4.2.2 Phương pháp sử dụng số liệu về trình tự ADNr 31

2.1.2.1 Các vi sinh vật kiểm định 48 2.1.2.2 Các chủng nấm men chuẩn dùng trong lai ADN genom 48

2.1.4.1 Môi trường phân lập và nuôi nấm men sinh bào tử bắn 49

2.2.2.2 Phân loại dựa vào đặc điểm sinh lý, sinh hoá 52

2.2.7 Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình

sinh tổng hợp enzym của dịch nuôi nấm men

66

3.2.1.2 Xác định xyloza trong tế bào 70

3.2.2 Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc

chi Bullera

72

3.2.2.3 Xác định và phân tích trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2 76 3.2.2.4 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng nấm men

sinh bào tử bắn thuộc chi Bullera

84

3.2.2.5 Phân loại các chủng nấm men thuộc chi Bullera đến loài 90

3.2.3 Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc

bào tử bắn thuộc chi Kockovaella

102

3.2.3.5 Phân loại các chủng nấm men thuộc chi Kockovaella đến

loài

105

3.3 Sự đa dạng của nấm men sinh bào tử bắn ở Vườn quốc gia Cúc

3.4 Hoạt tính sinh học của các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc

3.4.2 Khả năng đối kháng với các vi sinh vật khiểm định của các

3.4.3.4 Lựa chọn thời gian nuôi cấy thích hợp 119

Phô lôc 2 HÖ thèng ubiquinon cña c¸c chñng nÊm

men nghiªn cøu

148

Phô lôc 4 M« t¶ c¸c loµi míi cña chi

Kockovaella

189

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

anamorph Trạng thái bất toàn

HPLC High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng cao áp)

ITS Internal Transcribed Spacer (Khoảng giữa của hai đoạn gen sao

chép) JCM Japan Collection of Microorganisms (Bảo tàng giống vi sinh vật

Nhật Bản)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

PDA Potato-dextrose-Agar (Khoai tây - glucoza - thạch)

TAE Tris- axit axetic- axit etylenediaminetetra axetic

teleomorph Trạng thái toàn vẹn

VTCC Vietnam Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh

vật Việt Nam)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng Tên bảng Trang

3.1 Nấm men sinh bào tử bắn được phân lập từ bề mặt lá cây ở rừng

Quốc gia Cúc Phương

68

3.2 Sắp xếp các chủng nấm men sinh bào tử bắn vào các chi dựa trên các

đặc điểm hoá phân loại và hình thái

71

3.3 Số lượng nucleotit sai khác của các chủng nhóm A với các loài có quan

hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADNr vùng ITS (bao gồm 5,8S)

77

3.4 Số lượng nucleotit sai khác của các chủng nhóm C, D và E với các loài

có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADNr vùng ITS bao gồm

5,8S

79

3.5 Số lượng nucleotit sai khác của các chủng nhóm A với các loài có quan

hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2

81

3.6 Số lượng nucleotit sai khác của các chủng nhóm C, D và E với các loài

có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2

83

3.7 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng nấm men sinh bào tử bắn

thuộc chi Bullera

84

3.9 Kết quả lai ADN genom của các chủng nấm men nghi ngờ là loài mới

thuộc nhóm A chi Bullera

95

3.10 Kết quả lai ADN genom của các chủng nấm men nghi ngờ là loài mới

của các nhóm C, D và E thuộc chi Bullera

96

3.11 Số lượng vị trí nucleotit sai khác của ADNr vùng ITS ở 5 chủng nấm

men thuộc chi Kockovaella

100

chủng nấm men thuộc chi Kockovaella

3.13 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng nấm men sinh bào tử bắn

thuộc chi Kockovaella

103

3.14 Kết quả lai ADN genom giữa các chủng nghiên cứu thuộc chi

Kockovaella với các loài có quan hệ họ hàng gần

105

3.15 Sự phân bố của nấm men sinh bào tử bắn thuộc lớp Hymenomycetes

trên mẫu lá cây thu thập ở Vườn Quốc gia Cúc Phương

108

3.16 Các loài nấm men sinh bào tử bắn thuộc lớp Hymenomycetes được

phân lập ở Vườn Quốc gia Cúc Phương

110

3.17 Kết quả phân loại của 44 chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc lớp

Hymenomycetes, phân lập ở Vườn Quốc gia Cúc Phương

114

3.18 Hoạt tính enzym ngoại bào của 3 chủng nấm men VY-69, VY-116 và

VY-142

116

3.19 Môi trường nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp

enzym của ba chủng nấm men VY-69, VY-116 và VY-142

117

3.20 pH nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của ba

chủng nấm men VY-69, VY-116 và VY-142

118

3.21 Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym

của ba chủng nấm men

119

3.22 Thời gian nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym

của ba chủng nấm men VY-69, VY-116 và VY-142

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình Tên hình Trang

1.4 Sơ đồ siêu cấu trúc vách ngăn ở nấm túi (A) và nấm đảm (B) 13

1.9 Chu trình sống của nấm men sinh bào tử đảm Filobasidiella

neoformans

21

1.10 Các bước tiến hành trong phương pháp phân loại thông thường 31 1.11 Các bước trong phương pháp sử dụng số liệu trình tự ADNr 31

dựa vào trình tự ADNr 18S

3.1 Phân tích hệ thống ubiquinon chủ yếu của các chủng nấm men 69

3.3 Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi

Bullera với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADNr 18S

73

3.4 Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi

Bullera với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADNr ITS

75

3.5 Vị trí phân loại của các chủng nấm men thuộc chi Bullera với các loài

có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADNr đoạn D1/D2 26S

80

3.6 Vị trí phân loại của 5 chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc chi

Kockovaella với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự

ADNr 18S

98

3.7 Vị trí phân loại của 5 chủng nấm men thuộc chi Kockovaella với các

loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADNr vùng ITS

99

3.8 Vị trí phân loại của 5 chủng nấm men thuộc chi Kockovaella với các

loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADNr 26S đoạn D1/D2

101

3.9 Khả năng sinh enzym ngoại bào của 39 chủng nấm men sinh bào tử

bắn thuộc chi Bullera

115

PL1 Tế bào sinh dưỡng (A) và bào tử bắn (B) của Bullera sp 1- VY-75T 152

PL2 Tế bào sinh dưỡng và bào tử bắn của Bullera sp.2 - VY-5 156

PL3 Tế bào sinh dưỡng và bào tử bắn của Bullera sp 3 -VY-69 159

PL4 Tế bào sinh dưỡng và bào tử bắn của Bullera cuulongensis VY-50T 162

PL5 Tế bào sinh dưỡng và bào tử bắn của Bullera nhoquanica VY-55T 165

PL6 Tế bào sinh dưỡng và bào tử bắn của Bullera haininhensis VY-86T 168

PL7 Tế bào sinh dưỡng và bào tử bắn của Bullera ninhbinhensis VY-112T 171

PL8 Tế bào sinh dưỡng và bào tử bắn của Bullera sp 8- VY-48 174

PL9 Tế bào sinh dưỡng và bào tử bắn của Bullera sp 9- VY-2 177

PL10 Tế bào sinh dưỡng và bào tử bắn của Bullera sp.10- VY-118 181

PL12 Bào tử bắn và tế bào sinh dưỡng của B hoabinhensis VY-68 187

PL13 Bào tử bắn và tế bào sinh dưỡng của Kockovaella litseae VY-61 190

PL14 Bào tử bắn và tế bào sinh dưỡng của Kockovaella cucphuongensis

PL21 Màu sắc khuẩn lạc VY-42, VY-51, VY-75, VY-116 và VY-143 201

PL23 Phân tích thành phần G+C của các chủng nấm men bằng HPLC 202 PL24 Phân tích hệ thống ubiquinon của các chủng nấm men bằng HPLC 202

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 ĐA DẠNG SINH HỌC VÀ ĐA DẠNG VI SINH VẬT

1.1.1 Đa dạng sinh học

Đa dạng sinh học là khái niệm được Hội nghị về đa dạng sinh học (Anonymous 1992) định nghĩa: “Là sự đa dạng giữa các sinh vật từ tất cả các nguồn bao gồm vùng trời, vùng đất, vùng biển, các hệ sinh thái thuỷ vực nội địa và các phức

hệ sinh thái mà chúng ta cũng là thành viên, bao gồm sự đa dạng trong mỗi loài, giữa các loài và của các hệ sinh thái”[56] Đa dạng sinh học có vai trò to lớn trong đời sống vật chất và tinh thần của con người trong việc duy trì các chu trình tự nhiên, cân bằng sinh thái trên Trái đất và là cơ sở của sự sống còn, thịnh vượng, bền vững của xã hội loài người Hiện nay, những hiểu biết về đa dạng sinh học còn nhiều hạn chế Những kiến thức khoa học mới chỉ dừng lại ở việc đánh giá tính đa dạng của các dạng sống Ngay ở mức độ loài ước khoảng hơn 1,7 triệu loài được mô tả, còn số lượng thực tế như số lượng loài côn trùng và vi sinh vật thì hiện nay chưa thể xác định được Sự phong phú của loài là nét đặc trưng chủ yếu của đa dạng sinh học Các nghiên cứu về

đa dạng sinh học hiện nay mới chỉ biết đến một phần nhỏ (khoảng 8%) của tổng số đa dạng trong sự sống[59] Hơn nữa, hiện nay con người đang làm suy thoái, thậm chí là huỷ diệt những tài sản quý giá và không thể thay thế này Trong những thập kỷ qua, sự suy thoái đa dạng sinh học đã xảy ra với tốc độ khủng khiếp do sự mất mát về loài và suy thoái về các hệ sinh thái tự nhiên Từ năm 1990-2000, người ta ước tính có khoảng 5-10% số loài trên thế giới đã bị tiêu diệt và dự đoán 25% số loài sẽ bị tiêu diệt vào khoảng những năm 2050 do mất hệ sinh thái đa dạng, nhất là rừng [4]

Do vậy, sự bảo tồn đa dạng sinh học đã trở thành vấn đề hết sức nóng bỏng và

đã nhận được sự quan tâm không những của các nhà khoa học tự nhiên, khoa học xã hội mà còn cả các cấp quản lý từ cấp quốc gia đến địa phương trên toàn Thế giới Chính vì vậy mà Công ước quốc tế về Đa dạng sinh học đã được 157 nước ký kết tại Rio de Janeiro tháng 6/1992 Nhiều nước đã có các chương trình và kế hoạch quốc gia

về đa dạng sinh học; đã có luật và chính sách cụ thể về bảo tồn, nghiên cứu và khai thác

Việt Nam là nước có sự đa dạng lớn về môi trường tự nhiên và đa dạng sinh học,

được xếp thứ 16 trong số các nước có đa dạng sinh học cao nhất Thế giới Việt Nam

có khu hệ động thực vật rất phong phú, với khoảng 13.000 loài thực vật, 12.000 loài động vật và khoảng 1.000 loài nấm lớn được phát hiện [4] Riêng về khu hệ vi sinh vật thì hầu như chưa có điều tra nào

Tương tự như ở các quốc gia khác, đa dạng sinh học của Việt Nam cũng bị suy thoái trầm trọng Chỉ trong vòng 50 năm (1941-1991), diện tích rừng che phủ đã giảm 30%, nhiều loài sinh vật quý hiếm đã bị diệt vong Trong sách đỏ Việt Nam hiện đã ghi 365 loài động vật và 35 loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng Trước tình hình cấp bách hiện nay, để phát triển bền vững đa dạng sinh học phải bảo tồn, nghiên cứu và sử dụng có hiệu quả các nguồn tài nguyên tự nhiên này Muốn vậy phải có bước quan trọng là kiểm kê đa dạng sinh học bao gồm các nghiên cứu về phân loại, di truyền và sinh thái học nhằm thống kê các loài, các quần xã và các hệ sinh thái Phân loại là khâu quan trọng đầu tiên cho bất kỳ nghiên cứu nào của đa dạng sinh học, cần phát triển các nghiên cứu thực nghiệm như hoá phân loại (chemotaxonomy), phân loại tế bào học (cytotaxonomy) và tiến tới phân loại sinh học hiện đại Phải xây dựng các trung tâm, phòng thí nghiệm hay bảo tàng có đủ điều kiện phân loại và lưu giữ các thực vật, động vật và vi sinh vật để tìm ra các loài mới chưa được phát hiện để đóng góp cho khoa học [4]

1.1.2 Đa dạng vi sinh vật.

Sự đa dạng của thế giới vi sinh vật là không thể kể xiết, vi sinh vật tồn tại ở khắp mọi nơi, thậm chí ở cả nhiệt độ sôi của suối nước nóng, dưới đáy biển sâu hay nhiệt độ dưới không Ngày nay vi sinh vật được sử dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau, từ nghiên cứu đến ứng dụng và con người ngày càng phụ thuộc nhiều vào vi sinh vật Vi sinh vật được ứng dụng nhiều trong các ngành công nghiệp chế biến (men nở bánh mỳ, sữa chua, rượu vang, bia, rượu, phomat, chất điều vị…), công nghiệp sản xuất kháng sinh, vitamin, axít hữu cơ, axít amin, vắcxin và rất nhiều các sản phẩm của công nghệ sinh học khác Chính vi sinh vật là nguồn tạo nên các sản

mà cuộc cách mạng lớn trong sinh học đã xảy ra Từ đó, người ta có thể khuếch đại các đoạn gen mong muốn Vi sinh vật đã trở thành công cụ chuyển gen lý tưởng mà giá trị của nó là cùng một công cụ nhưng có thể tạo ra các sản phẩm có chất lượng cao, giá thành hạ Một ví dụ khác là việc tìm ra cyclosporin A từ vi nấm, có khả năng ức chế miễn dịch, giúp các ca ghép tạng thành công, cứu sống hàng triệu người Một số lượng lớn không sao đếm xuể các vi sinh vật tham gia vào vòng tuần hoàn vật chất và kiểm soát ô nhiễm môi trường trên Trái đất Các vi sinh vật với cấu tạo đơn giản, chu

kỳ sống ngắn đã trở thành mô hình lý tưởng trong nghiên cứu các vấn đề lý thuyết trong sinh học cơ bản

Danh sách các vi sinh vật được ứng dụng trong nghiên cứu thực tiễn ngày càng dài bởi vì ngày càng tìm ra nhiều loài vi sinh vật mới với các tính năng mới Rõ ràng, vi sinh vật là nguồn lưu giữ kho tàng gen rất phong phú cần được sưu tầm, nghiên cứu, ứng dụng và lưu giữ lại cho các thế hệ sau Khác với sinh vật bậc cao, vi sinh vật rất dễ

bị đột biến do các điều kiện tự nhiên Trong tự nhiên, nhiều loại vi sinh vật nếu không được phân lập, nghiên cứu và lưu trữ thì chúng có thể sẽ bị mất đi vĩnh viễn Với quan điểm này, vi sinh vật phải được coi là nguồn tài nguyên quý giá của mỗi quốc gia và việc nghiên cứu đa dạng vi sinh vật là một công việc cần phải được quan tâm đặc biệt

Nghiên cứu về đa dạng vi sinh vật phát triển mạnh mẽ trong những năm gần đây nhờ sự tiến bộ của sinh học phân tử, cho phép các nhà sinh học so sánh tất cả các

cơ thể sống dựa vào các gen có tính bảo thủ cao Một trong số đó là gen mã hoá riboxom chịu trách nhiệm tổng hợp protein trong tất cả các cơ thể sống Trình tự cơ bản của tiểu phần (16S hoặc 18S) của ARNr đã được sử dụng làm bản đồ biểu hiện mối liên quan của tất cả các cơ thể sống Cây phả hệ chỉ ra sự đa dạng khác thường của

vi sinh vật Bây giờ, người ta đã biết về sự tồn tại của các dạng sinh vật trên Trái đất nhiều hơn trước kia, ước chừng 1% các loài vi khuẩn và 5% các loài nấm đã được biết đến Nhờ sự phát triển của kỹ thuật hiện đại để phân loại các vi sinh vật và so sánh với các loài đã biết, các nhà khoa học có thể sử dụng công cụ mới này để thăm dò, xác định các dạng sống chưa được nhận biết trước kia [46]

1.1.3 Nghiên cứu đa dạng nấm men và nấm men sinh bào tử bắn

Việc sử dụng nấm men trong các sản phẩm thức ăn và đồ uống có từ rất lâu đời

ở vùng nhiệt đới châu Á, đặc biệt là các nước Đông Nam Á Nấm men tìm thấy trong thực phẩm lên men và các môi trường tương tự không thật sự đa dạng Trong các môi trường này nấm men thuộc Ascomycetes chiếm đa số và thành phần loài cũng tương tự nhau tại các nước khác nhau ở Châu Á Từ quan điểm đa dạng sinh học cho thấy nấm men sống trong môi trường tự nhiên phong phú hơn nhiều so với các môi trường nhân tạo [65]

1.1.3.1 Nghiên cứu nấm men ở Thái Lan

Saito và đtg (1983) đã phân lập 386 chủng nấm men từ 54 mẫu thực phẩm lên men và các môi trường tương tự, đã phân loại được 21 loài trong 11 chi

Saccharomyces cerevisiae là loài chiếm ưu thế trong số chủng phân lập (30,6%) và

được tìm thấy trong 39,4% số mẫu, tiếp theo là Issatchenkia orientalis (28,2%),

Hanseniaspora walbyensis (9,8%), Candida tropicalis (5,4%), Pichia membranifaciens (4,7%), P ohmeri (4,4%), Saccharomycopsis fibuligera (3,9%), 14

loài còn lại chiếm (1,8-0,3%) Trong nghiên cứu này, tất cả số chủng đều thuộc các loài đã biết Suzuki và đtg (1987) nghiên cứu 80 chủng phân lập từ các sản phẩm lên men và các môi trường tương tự Họ đã phân loại được 17 loài thuộc 9 chi

Issatchenkia orientalis chiếm ưu thế với 42,5%, S cerevisiae chiếm 11,3%, I occidentalis chiếm 10% và C tropicalis chiếm 6,3% Trong nghiên cứu này chỉ có 1

chủng duy nhất được mô tả là loài mới C stellimalicola

Jindamorakor (2000) phân lập 137 chủng nấm men từ các sản phẩm lên men và các môi trường tương tự có nồng độ muối cao, đã phân loại 123 chủng thuộc 33 loài đã

biết Issatchenkia orientalis chiếm đa số 27,0%, S cerevisiae chiếm 8,8%, C

parapsilosis 7,3% và C glabrata 5,8% Trong nghiên cứu này 57,6% các loài thuộc

các chi phổ biến ở các nghiên cứu của Suzuki và Saito trước đây Có 2 chủng được mô

tả cho một loài mới là Citeromyces siamensis Như vậy, các nấm men phân lập từ Thái

Lan trong các sản phẩm lên men và điều kiện tương tự không đa dạng, chủ yếu chúng thuộc các loài đã biết và giống ở các nước Đông Nam Á, châu Âu và Nhật Bản

Trái với các sản phẩm lên men và các điều kiện tương tự, nấm men tìm thấy

Nấm đảm, đặc biệt là nấm men sinh bào tử bắn được nghiên cứu ở phạm vi rộng ở Thái Lan Năm 1987, Nakase và đtg đã thu thập 20 mẫu lá từ các vùng nội, ngoại ô Bangkok và gần Ayutthaya, phân lập được 63 chủng nấm men sinh bào tử bắn

Chúng thuộc 16 loài trong 6 chi Trong đó có một chi mới là Kockovaella với 2 loài mới (K imperatae, K thailandica) và 5 loài mới thuộc các chi khác là

Sporobolomyces nylandii, S vermiculatus, Tilletiopsis oryzicola và T penniseti Năm

1990, 73 chủng nấm men sinh bào tử bắn được phân lập từ 33 mẫu thực vật (chiếm 82% số mẫu thu thập) Chúng thuộc 13 loài đã biết và 5 loài mới được miêu tả trong

các chi Bullera, Kockovaella, Bensingtonia và Sporidiobolus/Sporobolomyces

Năm 1996, Fungsin phân lập được 175 chủng nấm men sinh bào tử bắn ở rừng phòng hộ mưa nhiệt đới, phía bắc Thái Lan Ông đã sắp xếp 151 chủng vào các chi

Bullera (51 chủng), Dioszegia (2 chủng), Kockovaella (4 chủng), Bensingtonia (10

chủng), Rhodotorula (6 chủng), Sporidiobolus (2 chủng), Sporobolomyces (57 chủng)

và Tilletiopsis (18 chủng) Trong số này, 141 chủng thuộc 47 loài, 14 loài đã biết và 33

loài mới (106 chủng, chiếm 75% số chủng nghiên cứu) Như vậy, tỷ lệ loài mới lớn gấp

3 lần số loài đã biết Kết quả này đã cho thấy rõ nấm men sinh bào tử bắn kết hợp với lá cây ở rừng phòng hộ Thái Lan rất phong phú trong đa dạng sinh học và nhiều loài chưa biết sống trên cơ chất này

Những năm 2000, Nakase và đtg mở rộng phạm vi nghiên cứu đã phân lập 283 chủng nấm men từ các nguồn trong tự nhiên của Thái Lan như phân côn trùng, rêu, hoa, nấm Trong số này, có 194 chủng nấm túi được định tên thuộc 134 loài, 96 chủng thuộc 41 loài đã biết, 84 chủng nấm túi thuộc 79 loài mới, còn 14 chủng phải nghiên cứu tiếp Có 89 chủng (31,4%) nấm đảm được xếp vào 53 loài, 17 loài đã biết (41 chủng), 22 loài mới (31 chủng) và 14 loài (17 chủng) chưa xác định rõ Thực tế này đã chứng minh rằng đa dạng loài của nấm men rất phong phú ở rừng của Thái Lan

và có một số lượng lớn các loài chưa biết sống ở đây Điều này hoàn toàn khác với các nấm túi trong thực phẩm lên men [60, 65]

1.1.3.2 Nghiên cứu nấm men Indonesia

Cũng như ở các nước Đông Nam Á khác, nấm men được nghiên cứu rất sớm

Nghiên cứu về nấm men sống trong rừng và các điều kiện tự nhiên khác từ hơn 40 năm trước đây Deinema(1961) phân lập nấm men tạo thành lipit, một loài mới được

miêu tả là Candida bogoriensis [60, 65] Haryono và đtg (1996) phân lập từ 40 mẫu lá

cây được hơn 300 chủng sử dụng phương pháp bào tử bắn rơi, 61 chủng phân lập ở các

mẫu ở độ cao 900-1000m so với mực nước biển, thuộc các chi Bullera (11 chủng),

Bensingtonia (14 chủng), Sporobolomyces (36 chủng) Oetari và đtg (1999) nghiên

cứu 25 chủng nấm men phân lập từ 21 mẫu của 17 cây chuối Các chủng này thuộc các

chi Pichia, Saccharomyces, Hanseniaspora, Zygosaccharomyces Naruki và đtg

(1999) phân lập 109 chủng nấm men chịu đường từ các mẫu thực vật trong tự nhiên,

thực phẩm, quả, sản phẩm lên men từ đường Chúng thuộc các chi Saccharomyces,

Pichia, Hanseniaspora, Candida, Kluyveromyces, Torulaspora, Schizosaccharomyces, Schwanniomyces và Zygosaccharomyces Đây chỉ là các nghiên cứu trên quan điểm

ứng dụng vi sinh vật [60, 65]

1.1.3.3 Nấm men ở Đài Loan

Các nghiên cứu nấm men ở Đài Loan được thực hiện khoảng 70 năm trước đây nhưng chủ yếu liên quan đến lên men rượu Nakase và đtg (1997) đã phân lập 154 chủng nấm men từ thực vật ở rừng phòng hộ mưa cận nhiệt đới Trong số này có 146

chủng sinh bào tử bắn thuộc các chi Bullera (90 chủng), Dioszegia (1 chủng),

Sporobolomyces (54 chủng), Kockovaella (1 chủng) Tám loài mới đã được mô tả

trong số các chủng phân lập [65]

1.1.3.4 Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở Trung Quốc

Năm 1982, Li đã phân lập từ lá ngô, lá lúa mì và côn trùng các chủng nấm men

thuộc chi Bullera và phát hiện 2 loài mới Bai và đtg (1996) đã phân lập được 670

chủng nấm men sinh bào tử bắn từ 43 mẫu ở rừng Yunnan, Trung Quốc Họ đã chọn

109 chủng cho các nghiên cứu tiếp theo Chúng thuộc các chi Bullera, Bulleromyces,

Dioszegia và Sporobolomyces Có 7 loài mới đã được mô tả trong số các chủng này [60]

1.1.3.5 Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở Nhật Bản

Nấm men sinh bào thử bắn được Saito bắt đầu nghiên cứu từ năm 1922 và Okunuki nghiên cứu vào năm 1931, nhưng các chủng của họ được chuyển cho các nhà

(1951) mới phân lập được nấm men thuộc 2 chi Bullera và Sporobolomyces Năm

1952, Tubari phát hiện ra chi mới là Tilletiopsis với 3 loài mới được đặt tên Đến năm

1985 Nakase và Suzuki đã tìm ra 8 loài mới cho khoa học Giai đoạn 1987-2000,

Nakase và các đồng nghiệp đã phát hiện ra 26 loài mới thuộc các chi Bullera,

Sporobolomyces, Bensingtonia, Tilletiopsis, Udeniomyces và 7 loài mới trong 2 chi

mới được thành lập là Kockovalella và Balistosporomyces

Saito và đtg (1994) phân lập 199 chủng nấm men từ 24 mẫu lá (66,7% trong số

36 mẫu thu thập) ở đảo Ogasawara có 197 chủng sinh bào tử bắn thuộc 7 chi Chi

Bullera gồm 46 chủng phân lập từ 10 mẫu lá (27%) thuộc 6 loài, có 3 loài mới đã được

mô tả Chi Kockovaella gồm 16 chủng từ 3 mẫu lá (8,3%), có 3 loài mới Chi

Bensingtonia có 2 chủng được phân lập trên cùng mẫu lá, có một loài mới Chi Sporobolomyces gồm 133 chủng với 103 chủng có Q10 Bannoa là chi mới gồm 30

chủng có Q10(H2) tìm thấy trong 10 mẫu lá (27,8%) Trong số các chủng không sinh bào tử bắn, có 2 chủng sinh cuống bào tử đính thuộc cho Fellomyces được mô tả là 2

loài mới [60, 65]

1.1.3.6 Nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở một số nước khác

Buhagiar và đtg (1983) đã phát hiện 2 loài mới thuộc chi Bullera có khuẩn lạc

màu cam từ rau và quả ở Anh Shiva và Rodrigue de Miranda (1983) tìm thấy

Sporobolomyces elongatus trên lá ở Australia Johri và Bandoni (1984) nghiên cứu

nấm men sinh bào tử bắn trên lá cây ở Canada và tìm ra 3 loài mới thuộc chi Bullera

và Sporobolomyces Ingold (1986) tìm thấy Bensingtonia cilliata ở Anh Van der Walt

và đtg (1986-1989) đã tìm thấy 3 loài mới thuộc chi Bensingtonia ở Nam Phi Sláviková và Grabiñska-Loniewska (1992) đã mô tả Sporobolomyces lactosus ở Ba

Lan [60]

1.1.3.7 Nghiên cứu nấm men ở Việt Nam

Cũng như ở các nước châu Á khác, việc sử dụng nấm men trong các sản phẩm lên men, thực phẩm, đồ uống và dạng khởi động cho lên men rượu đã có từ lâu đời Các nghiên cứu khoa học về nấm men chủ yếu xoay quanh các vấn đề lên men rượu, bia và một số đồ uống, sản phẩm lên men thực phẩm Sau này các nghiên cứu về nấm

ứng dụng vi sinh vật Còn các nghiên cứu về sự đa dạng loài của nấm men trong tự nhiên thì hầu như chưa được nghiên cứu đến Dưới đây là một số nghiên cứu ngoài lên

men thực phẩm và đồ uống

Tống Kim Thuần và đtg đã phân lập được 4 loài nấm men thuộc chi Lipomyces

từ nhiều loại đất ở 23 địa điểm khác nhau trên các vùng sinh thái khác nhau, trải rộng khắp Việt Nam Đã đánh giá được sự phân bố của các loài thuộc chi này trong các vùng đất khác nhau Có thể sử dụng chúng như một trong các chất chỉ thị trong phân loại, khoanh vùng đất, ứng dụng trong cải tạo đất trồng [8]

Vũ Nguyên Thành và đtg đã phân lập và tuyển chọn được 20 chủng nấm men có hoạt lực zymocin từ các nguồn hoa quả lên men, sản phẩm lên men truyền thống và từ thiên nhiên Có thể ứng dụng trong bảo quản đồ uống hoặc thực phẩm, sản xuất chất kháng sinh chống nấm trong y học Nhóm nghiên cứu đã phân loại 17 chủng nấm men

này dựa vào đọc trình tự ADNr đoạn D1/D2 của 26S, chúng thuộc 7 loài: Pichia

canadensis (5 chủng), Candida tenuis (5 chủng), Hanseniaspora uvarum (2 chủng), Saccharomyces cerevisiae (1 chủng), Torolaspora delbrueckii (2 chủng), Saccharomyces exiguus (1 chủng), Pichia capsulata (1 chủng) Còn 3 chủng có thể

thuộc loài chưa biết, đang được nghiên cứu tiếp [7]

Chu Thị Thanh Bình và đtg đã nghiên cứu nghiên cứu 5 chủng nấm men thuộc

loài Candida tropicalis, có khả năng phân giải xenluloza dùng trong xử lý bã dứa làm

thức ăn chăn nuôi [1]

Vũ Nguyên Thành và đtg đã phân lập từ 52 mẫu đất ở các vùng khác nhau của

Việt Nam được 73 chủng nấm men thuộc chi Lipomyces (trong 24 mẫu đất) Một loài mới (5 chủng) đã được mô tả là Lipomyces orientalis [98]

1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MEN

1.2.1 Định nghĩa nấm men

Định nghĩa chính xác về nấm men là "Nấm, nấm đảm hoặc nấm túi, giai đoạn sinh trưởng của chúng là đơn bào và sinh sản bằng nảy chồi hoặc phân cắt" [3, 43,

51, 99]

1.2.2 Hình thái và cấu trúc của tế bào nấm men

1.2.2.1 Hình thái tế bào nấm men

Các tế bào nấm men rất đa dạng về kích thước, hình dạng và màu sắc Thậm chí cùng một chủng nấm men cũng có dạng tế bào khác biệt nhau Điều này chủ yếu là do những thay đổi về điều kiện lý, hóa của môi trường nuôi cấy

Kích thước tế bào nấm men khá lớn, gấp khoảng 10 lần tế bào vi khuẩn Tuy nhiên, một số tế bào nấm men chỉ dài 2 - 3 m, một số khác lại có thể dài tới 20 - 50

m Chiều ngang của tế bào ít sai khác hơn, chỉ thay đổi từ 1 - 10 m [43]

Tế bào nấm men có thể hình cầu (globose), gần cầu (subglobose), hình elip (ellipsoidal), hình trứng (ovoidal), hình trứng ngược (obovoidal), hình trụ (cylindrical), hình dồi (botuliform), hình que (bacilliform), hình kéo dài (elongate), hình trăng khuyết (lunate), hình tam giác (triangular), hình cung nhọn (ogival), hình nhọn đầu (apiculate) Hình dạng tế bào đôi khi có thể phản ánh kiểu sinh sản và là đặc điểm của một số chi và loài đặc biệt Ví dụ: các tế bào dạng quả chanh châu Âu thường thấy

ở nấm men Hanseniaspora và Wickerhamia, tế bào dạng chai thường thấy ở

Malassezia, tế bào dạng tam giác thấy ở Trigonopsis, tế bào hình trăng khuyết bắt gặp

ở Metschnikowia lunata và Candida peltata [108]

a-Hình cầu; b- Hình elip; c- Hình quả chanh; d- Hình cung nhọn;

e- Hình chai , f- Hình kéo dài, g- Hình sợi

Hình 1.1 Hình dạng tế bào nấm men [43]

a- Nếp nhăn ở giữa; b- Nếp nhăn phóng xạ; c- Mép toàn vẹn; d- Mép lượn sóng;

e- Mép nhăn nheo; f- Mép có thuỳ, g- Mép diềm quanh

Màu sắc khuẩn lạc nấm men rất đa dạng bao gồm: màu trắng ngà (S cerevisiae,

Geotrichum spp.), đen (Aureobasidium pullulans), hồng (Phaffia rhodozyma), đỏ

(Rhodotorula spp.), da cam (Rhodosporidium spp.), vàng kem (Bullera spp.), xanh (Trichosporonoides), nâu (Metschnikowia)… Có những nấm men chứa loại sắc tố được sử dụng trong công nghiệp như astaxanthin của Phaffia rhodozyma

Bề mặt khuẩn lạc nấm men trên môi trường rắn có các dạng: nhẵn, xù xì, nhầy… Bề mặt và mép của khuẩn lạc có các dạng: nếp nhăn ở giữa, nếp nhăn hình phóng xạ, mép toàn vẹn, mép lượn sóng, mép nhăn nheo, mép có thuỳ, mép diềm quanh Các dạng khác nhau của mặt cắt ngang khuẩn lạc gồm: nhẵn, nhẵn và nổi ở giữa, nhẵn dạng núi lửa, phẳng, dạng núi lửa với nhăn ở giữa, nhăn lồi, nhăn phẳng, diềm quanh với khuẩn ty giả [43]

a-nhẵn; b- nhẵn và nổi ở giữa; c- nhẵn dạng núi lửa; d-phẳng; e- dạng núi lửa nhăn ở

giữa; f- nhăn lồi; g- nhăn phẳng; h-diềm quanh với khuẩn ty giả

Hình 1.3 Các dạng khác nhau của mặt cắt ngang khuẩn lạc [43]

1.2.2.2 Cấu trúc tế bào

Cấu tạo tế bào gồm có: thành tế bào, chất bao, màng tế bào, các rãnh lõm, chồi sẹo, tế bào chất, nhân, ty thể, hệ thống lưới nội chất (ER), bộ máy Golgi, các túi bài tiết, không bào và peroxisom Như vậy, các tế bào nấm men mang đầy đủ những đặc điểm cấu trúc và chức năng của sinh vật nhân chuẩn, được xem như là mô hình lý tưởng của sinh học tế bào nhân chuẩn Nhưng không như các tế bào động vật, nấm men có những điểm đặc biệt như: tế bào của chúng được bao bọc bởi một lớp thành tế bào dày và chắc; các sẹo sinh (birth scars) phát triển trong suốt quá trình phân chia (hình 1.5) [29, 43]

Vỏ tế bào Vỏ tế bào nấm men có chức năng bảo vệ, từ ngoài vào trong, gồm 3

Thành tế bào Thành tế bào nấm men khá dày (100 – 200 nm), chiếm 15 - 25%

trọng lượng khô tế bào Thành phần chính của thành tế bào là các polysaccharit (80 -

90%), chủ yếu là các glucan và mannan, một lượng nhỏ kitin cùng một số protein, lipit và các phosphat vô cơ Các glucan (có cả -2,6 và -1,3 liên kết glucan) làm tăng

độ vững chắc cho thành tế bào và tạo ra hệ thống vi sợi Các mannan gồm -1,6 liên

kết với lõi -1, 2 và -1, 3 chuỗi kế bên Ở S cerevisiae, thành phần này ảnh hưởng

đến khả năng lắng của nấm men

Kitin là dạng cao phân tử của N-acetylglucosamin, chỉ có khoảng 2-4% trong thành tế bào, chủ yếu có mặt trong các sẹo chồi Một số nấm men phát triển dạng sợi

như Candida albicans, lượng kitin trong thành tế bào khá cao, trong khi đa số các loài

nấm men khác lại hầu như không có kitin

Các sẹo chồi (bud scars) giàu kitin, hình tròn, là phần lồi trên bề mặt tế bào sau khi tế bào nấm men mẹ nảy chồi tạo ra các tế bào con, còn các sẹo sinh (birth scars) là phần lõm trên bề mặt tế bào nấm men con sau quá trình nảy chồi [43]

Cấu trúc thành tế bào và vách ngăn hệ sợi

Việc sử dụng kính hiển vi điện tử đã chứng minh sự khác biệt rõ ràng giữa cấu trúc thành tế bào của nấm men đảm với nấm men túi Người ta quan sát thấy thành tế bào của nấm men túi bao gồm lớp trong dày và sáng, lớp ngoài mỏng và tối Trong khi

đó, thành tế bào của nấm men đảm được dát mỏng với nhiều lớp khác nhau Mặc dù mối liên quan giữa các cấu trúc thành tế bào và phản ứng với xanh diazoni B (DBB) vẫn chưa được làm sáng tỏ, nhưng trên thực tế tất cả nấm men đảm cho phản ứng dương tính với thuốc nhuộm, còn nấm men túi thì không [99]

Các nhóm nấm men khác có sự khác biệt rõ rệt ở cấu trúc vách ngăn hệ sợi Sự khác biệt này liên quan chặt chẽ với các đặc tính khác và được chứng minh bằng phân tích cây phả hệ nhờ phân tích rADN Các loại vách ngăn dưới đây gặp ở nấm men túi Loại A1: Vách ngăn có lỗ bít lại, lỗ có bờ viền dày và mạng lưới nội chất xuyên qua lỗ

với sự giãn nở ở hai đầu tận cùng để tạo các nút Kiểu vách ngăn này gặp ở Ambrosiozyma

(nấm men duy nhất có lỗ dài được nhìn thấy dưới kính hiển vi quang học)

Loại A2: Vách ngăn với sợi hạt liên bào Vách ngăn có mối liên kết hẹp giữa các thể

nguyên sinh của các tế bào kề sát nhau, như ở nấm men Sacharomycopsis capsularis

Hình 1.4 Sơ đồ siêu cấu trúc vách ngăn ở nấm túi (A) và nấm đảm (B)[99] Loại A3: Vách ngăn nối trung tâm Được tạo thành nhờ hai màng sinh chất được

giữ lại ở giữa vách ngăn khi nó khép lại nhờ sự phát triển hướng tâm, gặp ở

Arthroascus javanensis

Các loại vách ngăn sau được biết đến ở các nấm men đảm

Loại B1 và B2: Vách ngăn với một lỗ dài (dolipore) Mạng lưới nội chất có thể

tạo ra một mũ hoặc dạng dấu ngoặc đơn ở hai đầu của lỗ Mũ có thể ở dạng nguyên thuỷ hoặc túi Các lỗ dài có hoặc không có mũ được tìm thấy ở Filobasidiaceae

Loại B3: Vách ngăn có lỗ đơn giản với một viền dạng nón, cũng được tìm thấy ở các nấm men sinh bào tử teliospore

Bao nhầy: ở tế bào nấm men mỏng (35 - 45A0), nằm giữa thành và màng tế bào, chủ yếu chứa các mannoprotein ngoại bào (invertaza chuyển hóa ngược saccaroza thành glucoza và fructoza, enzym photphataza xúc tác giải phóng photphat ra khỏi các hợp chất hữu cơ) là loại không thể thấm qua thành tế bào

Màng tế bào nấm men: Nằm ngay sát dưới thành tế bào là lớp màng nguyên

sinh chất, được cấu tạo bởi lipit và protein, gồm 3 lớp xen kẽ nhau Màng hoạt động như hàng rào trao đổi chất, chúng cho phép các chất đi qua với mức độ khác nhau

Nhân Nhân của tế bào nấm men là nhân thật, có hình tròn, bầu dục hoặc có thể

xẻ thùy Nhân nằm ở trung tâm tế bào, kích thước tương đối nhỏ 1-2µm, được bao bọc bởi hai lớp màng nhân mỏng Nhân chứa đầy đủ các yếu tố di truyền gồm ADN, ARN, enzym ADN tạo thành các nhiễm sắc thể mang thông tin di truyền Số lượng nhiễm sắc thể ở các loài khác nhau có thể khác nhau [43]

Mạng lưới nội chất là hệ thống các phiến mỏng, các ống hoặc các bể Đây là

nơi tập trung các peptit có vai trò trong tổng hợp protein và là nơi tổng hợp các oligosaccarit cho màng tế bào từ monosaccarit

Ribosom Hình cầu đường kính 20-30nm, được đặc trưng bởi hằng số lắng Tế

bào nấm men có ribosom 80S trong tế bào chất và ribosom 70S trong ty thể Ribosom

có 2 tiểu phần, tiểu phần lớn biến đổi trong suốt quá trình tiến hóa, trong khi tiểu phần nhỏ lại có tính bảo thủ cao về mặt tiến hóa Ribosom là cơ quan tổng hợp protein

Ty thể Có hình bầu dục, rộng khoảng 0,3-1µm, dài 1µm Số lượng ty thể khác

nhau ở từng loại tế bào và cách thức nuôi cấy Ty thể đóng vai trò quan trọng trong

Các hạt lipit

Ty thể

Các hạt phosphate

Sẹo chồi

Màng tế bào Thành tế bào

Không bào Tế bào nấm men khi già sẽ xuất hiện các không bào chứa đầy dịch

bào Đây là bào quan quan trọng và điển hình ở tế bào nấm men Trong không bào có chứa các enzym hydrolaza, chủ yếu là proteaza, ribonucleaza và esteraza, có tới 80-90% axit amin tự do Không bào chứa chất dự trữ cho tế bào khi điều kiện ngoại bào thay đổi

1.2.3 Phương thức sinh sản ở nấm men

Trong quá trình tồn tại và phát triển, nấm men duy trì nòi giống bằng 2 hình thức sinh sản là sinh sản vô tính và hữu tính

1.2.3.1 Sinh sản vô tính [43, 99, 108]

Hình thức nảy chồi (bud) Đây là hình thức sinh sản đặc trưng của nấm men

Chồi có thể mọc từ các tế bào nấm men hay từ các tế bào sợi Chồi thường bắt đầu từ mấu lồi ra ở một vài điểm trên bề mặt tế bào Tế bào mẹ hầu như không thay đổi kích thước trong quá trình phát triển của chồi trong khi chồi (bào tử chồi) phát triển kích thước thành tế bào mới sau đó tách ra khỏi tế bào và để lại một vết sẹo, tại vết sẹo sẽ không mọc được chồi nữa Vị trí mọc chồi cũng mang đặc điểm phân loại Chồi chỉ mọc

ra ở một cực của tế bào gọi là chồi đơn cực (monopolar), chồi mọc ra ở cả 2 cực gọi là chồi lưỡng cực (bipolar) Khi các chồi được tạo thành trên một nền khá rộng bằng cách tạo thành vách ngang thì quá trình đó được gọi là “mọc chồi trên nền rộng” (budding on

a broad base) và “mọc chồi kiểu phân cắt” (bud fision) Quá trình nảy chồi tái diễn sẽ dẫn đến sự tạo thành rất nhiều sẹo Chồi mọc ra từ nhiều vị trí khác nhau trên tế bào nấm men gọi là chồi đa cực (multipolar) Mỗi tế bào nấm men trung bình nảy được 2-32 chồi,

nhiều có thể lên đến 43

Hình thành vách phân cắt (fission) là sự nhân đôi của tế bào bằng cách tạo

thành vách ngăn chia đôi tế bào Các tế bào mới được tạo thành theo kiểu phân đôi (còn gọi là các bào tử đốt - arthroconidia) kéo dài ra và lại tiếp tục quá trình phân đôi Quá trình phân đôi tái diễn ở các tế bào có thể tạo thành rất nhiều sẹo Kiểu sinh sản

phân đôi là đặc điểm của chi Schizosaccharomyces

Hình thành bào tử trần mọc trên các cuống (conidia on stalk) Là kiểu ít gặp ở

nấm men Kiểu sinh sản này bắt đầu từ việc hình thành các mấu dạng ống trên tế bào, từ

Sterigmatomyces) hay được tạo thành ở gần chồi (ở Fellomyces, Kockovaella) Các bào

Hình 1.6 Các dạng sinh sản vô tính ở nấm men [99]

Hình thành các cấu trúc sợi bao gồm dạng khuẩn ty giả và khuẩn ty thật

Sự hình thành khuẩn ty giả (pseudomycelium): Các chồi trưởng thành có thể

tách thành các tế bào rời rạc hay vẫn bám vào tế bào mẹ tạo thành một tập hợp hay chuỗi tế bào dạng sợi lỏng lẻo gọi là khuẩn ty giả Do vậy khuẩn ty giả được định nghĩa là một sợi gồm chuỗi các tế bào được tạo thành từ sự nảy chồi

Sự hình thành khuẩn ty thật (mycelium) Một số nấm men, trong điều kiện

thích hợp, tạo ra khuẩn ty thật phân nhánh, có vách Khuẩn ty thật kéo dài do sự sinh trưởng liên tục của đỉnh sợi, sau đó tạo thành vách Cấu trúc tinh vi của vách sợi là đặc điểm cho phân loại

Hình thành các bào tử đốt (arthrospora) Trên môi trường rắn, bào tử đốt

được tạo thành theo cách này thường sắp xếp theo kiểu zigzac và mang đặc điểm phân loại

Hình thành nội bào tử vô tính (asexual endospore) Nội bào tử vô tính không

thường xuyên được tạo thành nhưng chúng đã được quan sát ở các chủng thuộc chi

Trichosporon, Candida, Cryptococcus, Oosporidium, Cystofilobasidium và Leucosporidium Nội bào tử vô tính là các tế bào sinh dưỡng được tạo thành trong các

tế bào và các sợi riêng rẽ

Hình thành bào tử màng dầy (chlamydospore) Bào tử màng dầy được định

nghĩa là bào tử vô tính có vách dầy, không rụng, được tạo thành ở các tế bào cuối hay các tế bào gian đốt, bào tử vô tính được tạo thành do sự bao tròn lại của tế bào Bản chất vô tính của bào tử màng dầy được phân biệt với teliospore của Sporidiales và Ustilaginales mà từ đó bào tử đảm được tạo thành Vì bào tử màng dầy rất giàu lipit nên chúng tồn tại được lâu qua thời kỳ nghỉ

Sự tạo thành ống mầm (germ tube) ở C.albicans Ống mầm là một mấu lồi

dạng sợi mỏng trên tế bào nhưng không gây thắt tế bào tại điểm nó mọc ra Sự tạo

thành ống mầm bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, môi trường và chủng giống

Sự hình thành bào tử bắn (ballistoconidia) Một số loài nấm men đảm có khả

năng sinh ra các bào tử bắn một cách mạnh mẽ, thường được xem như bào tử bắn vô tính hoặc một cách chính xác hơn là chúng sinh ra trên các cuống nhỏ mọc ra từ các tế bào sinh dưỡng và được phóng vào không khí bởi cơ chế giọt nhỏ, giống với các bào

tử bắn của nấm đảm Sự khác nhau đó là bào tử bắn được tạo thành bằng phân chia nguyên nhiễm, còn bảo tử đảm được tạo thành bằng giảm nhiễm Bào tử bắn có thể

không đối xứng, như ở Sporidiobolus và Sporobolomyces hoặc đối xứng ở

Kockovaella, Bullera và Bulleromyces Sự có hay vắng mặt của bào tử bắn được dùng

để phân biệt Sporobolomyces với Rhodotorula và Bullera với Cryptococcus Tuy

nhiên, các dữ liệu phân tử cho thấy các nấm men tạo bào tử bắn có mối quan hệ gần gũi với nấm men không tạo bào tử bắn Ngoài ra, sự tạo thành bào tử bắn là một đặc tính không ổn định và điều này có thể làm cho việc định loại trở nên phức tạp

1.2.3.2 Sinh sản hữu tính

Rất nhiều nấm men có hình thức sinh sản hữu tính, kết quả là tạo ra sự luân phiên các thế hệ với sự hình thành các tế bào trong đó xảy ra sự phân chia giảm nhiễm

bội của các bào tử túi được tạo thành Ở các nấm đảm, phân chia giảm nhiễm chỉ hạn chế ở teliospore hay đảm, trong đó các bào tử đảm đơn bội được tạo thành ở bên ngoài Các nấm men có khả năng tạo túi hay đảm được xem là nấm toàn vẹn hay có có trạng thái toàn vẹn Ngược lại những nấm men không tạo túi hay đảm gọi là nấm bất toàn hay có trạng thái bất toàn Theo quan điểm hiện nay, nấm ở trạng thái toàn vẹn được gọi là teleomorph còn trạng thái bất toàn được gọi là anamorph (dạng biến thái), trạng thái liên kết giữa hai trạng thái trên gọi là holomorph Dạng teleomorph và

anamorph của cùng một nấm men có tên khác nhau Ví dụ: Pichia jadinii (dạng teleomorph) và Candida utilis (dạng anamorph) là các trạng thái khác nhau của cùng một nấm men Dạng holomorph có cùng tên với dạng teleomorph nghĩa là Pichia

jadinii

a Sự hình thành bào tử túi và chu trình sống ở nấm men túi Nấm men sinh bào tử túi

có thể là đồng tản (homothallic) hay dị tản (heterothallic), pha sinh dưỡng có thể là lưỡng bội hay đơn bội hoặc lẫn lộn cả hai dạng [108]

Loại hình dị tản thường thấy ở nấm men rượu S.cerevisiae Đây là loài dị tản,

sinh sản cần sự có mặt của hai dòng tế bào giới tính, kí hiệu là “a” và “” Thông thường, sự hoà trộn hai tế bào giới tính sẽ tạo ra hợp tử Nhưng không giống như các nấm khác, chu kỳ sống của loài nấm men này không theo kiểu hợp tử Các tế bào dinh dưỡng đơn bội (n) là “a” và “” sau khi tiếp hợp tạo ra tế bào dinh dưỡng lưỡng bội (2n) Tế bào lưỡng bội trong một khoảng thời gian không trải qua quá trình giảm phân

mà chỉ đồng hoá chất dinh dưỡng và sinh sản theo hình thức vô tính Hoàn thành một chu kỳ là khi tế bào lưỡng bội giảm phân sinh ra các bào tử túi Bốn nhân hình thành nên 4 bào tử túi chứa trong túi, hai dòng “a” và hai dòng “” Túi được tạo từ thành của tế bào lưỡng bội Bình thường không có sinh sản hữu tính các tế bào đơn bội vẫn liên tục sinh sôi nảy nở theo phương thức nảy chồi vô tính [78]

Loại hình đồng tản thường thấy ở loài Schizosaccharomyces octosporus Loài này khác với S.cerevisiae là chu kỳ sống theo kiểu hợp tử, giống như ở phần lớn các

loài nấm khác Do vậy, bất kỳ hai tế bào nấm men nào cũng có thể kết hợp để tạo nên hợp tử Hợp tử này sẽ tiến hành quá trình giảm phân ngay, sau đó lại nguyên phân tạo

Loại hình thứ ba quan sát thấy ở Saccharomycoides ludwigii Thể sinh dưỡngloài này chỉ có thể tồn tại dưới dạng lưỡng bội, sinh sản theo lối nảy chồi Bào tử túi đơn bội tiếp hợp từng đôi với nhau ngay cả khi còn nằm trong túi Giai đoạn đơn bội tồn tại dưới dạng bào tử túi nằm trong túi [3]

Sự hình thành túi bào tử có thể là đặc điểm phân loại của chi, ví dụ ở Lipomyces túi có cấu trúc dạng túi xách (sac-like), ở Metschnikowia túi dài và có hình chuỳ Túi

có thể bền dai, chỉ nứt ra khi bào tử nảy mầm như ở Saccharomyces và

Zygosaccharomyces hoặc cũng có thể không bền, dễ bị thuỷ phân vách để giải phóng

bào tử như ở Kluyveromyces và Clavispora Các bào tử sau khi được giải phóng có xu

hướng cụm thành đám

Các bào tử có thể khác nhau về số lượng trong túi, về hình dạng, kích thước, về cách bố trí và về màu sắc Số lượng bào tử trong túi có thể là 1 hay nhiều, thông

thường là từ 2-4 Túi có 1 hay 2 bào tử, ở Lodderomyces và một số loài thuộc chi

Debaryomyces Túi có hơn 8 bào tử là đặc điểm của chi Lipomyces và một số loài

thuộc chi Kluyveromyces Đặc điểm này đôi khi cũng quan sát thấy ở các chủng của một số loài thuộc chi Pichia và ở S cerevisiae

Hình dạng bào tử túi có thể rất khác nhau, bao gồm các hình: cầu, elip, hình trụ, hình thận, hình trăng lưỡi liềm, hình chuỳ, hình mũ, hình mũ lưỡi chai, hình sao Thổ, hình quả óc chó, hình lưỡi liềm, hình kim, hình con suốt với đuôi dạng roi Bề mặt bào

tử có thể trơn nhẵn hay thô ráp Tuy nhiên, các cấu trúc bề mặt, vành, gờ đôi khi không phát hiện được dưới kính hiển vi quang học Hình thái của bào tử túi có giá trị chẩn đoán đặc biệt trong phân loại

bào giới tính

Hình 1.7 Chu kỳ sống của nấm men sinh bào tử túi S cerevisiae

Bào tử túi có thể có màu màu hổ phách, màu nâu hay màu đỏ nâu ở các chi

Lipomyces, Nadsonia, Pichia, Saccharomycopsis và Debaryomyces

Túi 4 bào tử Túi 6 bào tử Túi 8 bào tử

Hình 1.8 Túi bào tử của nấm men

b Sự hình thành bào tử đảm và chu trình sống ở nấm men đảm

Nấm men sinh bào tử đảm có thể thấy ở cả pha đơn bội nảy chồi hay pha sợi nhân

kép (dikaryotic) hoặc ở pha lưỡng bội tự hình thành bào tử Sợi nhân kép phân vách với

các mấu nối giữa 2 đoạn sợi chính là đặc điểm của giai đoạn hữu tính ở nấm men sinh bào

tử đảm, tuy nhiên không phải lúc nào chúng cũng được tạo thành [108]

Sinh sản hữu tính của nấm đảm xảy ra ở cả nấm men đồng tản và dị tản Hệ

thống các loài dị tản có thể là lưỡng cực hay tứ cực và sợi nhân kép được tạo ra bởi sự

tiếp hợp sau khi các tế bào kết cặp với nhau Các sợi nhân kép cuối cùng tạo thành các

tế bào phồng lên, giàu lipit, có mấu liên kết, trong các tế bào này sự hợp nhân xảy ra

Các tế bào này được hiểu là tế bào tiền sinh bào tử đảm Chúng là các gian đốt, nhánh

bên hay các tế bào cuối cùng của sợi và đôi khi tạo vách dày Có 2 loại đồng tản được

tìm thấy ở các chủng đồng tản và được gọi là đồng tản sơ cấp và đồng tản thứ cấp

Cách tạo các tế bào lớn giàu lipit và sau đó phát triển thành các cấu trúc đảm rất khác

nhau ở các đơn vị phân loại

Tế bào thành dày tìm thấy ở các chi Rhodosporidium và Leucosporidium được

xem là các bào tử teliospore (bào tử thành dày khi nảy mầm sẽ mọc đảm) Các bào tử này rất khác nhau về hình dạng: hình cầu, hình trứng đến dạng có cạnh và đôi khi có

màu như ở Rhodosporidium toruloides Sau khi chín và trải qua giai đoạn nghỉ, bào tử

teliospore hình thành ống mầm gọi là metabasidium hay promycelium (tiền sợi)

Hình 1.9 Chu trình sống của nấm men sinh bào tử đảm

Filobasidiella neoformans [99]

Các chồi đơn bội mọc trực tiếp trên sợi được gọi là bào tử đảm Ở một số chủng

thuộc Mrakia frigida và Cystofilobasidium spp., tiền sợi không phân vách và bào tử

đảm sẽ mọc ở phía cuối sợi

1.2.4 Phân loại nấm men

Hiện nay, khoảng 700 loài nấm men đã được biết Danh sách nay ngày càng được kéo dài nhanh chóng vì mỗi năm có khoảng 50 loài mới được bổ sung Trong thời gian gần đây, việc khám phá thế giới đa dạng của nấm men dựa vào sự kết hợp giữa nghiên cứu hình thái - sinh lý truyền thống với hoá phân loại và các nghiên cứu

Thể đồng tản

Hình thành

đảm và bào tử

Giảm phân và hình thành bào tử

phát sinh chủng loại Việc lập dữ liệu ADNr tham khảo cho tất cả các loài đã biết đã thúc đẩy nhanh quá trình khám phá sự đa dạng tự nhiên [99]

Nấm men không phải là một nhóm phân loại độc lập, chúng có thể thuộc ngành nấm túi (Ascomycota) hoặc ngành nấm đảm (Basidiomycota) Hiện nay, hệ thống học

về phân loại nấm vẫn chưa được thống nhất giữa các nhà phân loại Chúng tôi sử dụng các tài liệu tham khảo theo quan điểm của các nhà phân loại nổi tiếng về nấm men như: Fell J W., Kurtzman C P., Robnett C J., Scorzetti G (Mỹ), Boekhout T., (Hà Lan) và Nakase T (Nhật)

1.2.4.1 Các nấm men túi

Các nấm men túi bao gồm 3 lớp Aschiascomycetes, Euascomycetes,

Hemiascomycetes [48, 99]

Lớp Aschiascomycetes do Nihida và Sugiyama đề nghị năm 1994, được coi là

nhóm cổ nhất trong 3 lớp Các chi của lớp Aschiascomycetes có một số đặc điểm giống cả nấm men túi và nấm men đảm như siêu cấu trúc của thành tế bào, các đặc điểm hoá sinh, kiểu bào tử đính và hệ thống ubiquinon chủ yếu Các loài của lớp Aschiascomycetes không có sợi sinh túi (ascogenous hyphae) và túi (ascoma) Chúng rất đa dạng về hình thái Lớp Aschiascomycetes gồm 4 bộ Schizosaccharomycetales, Taphrinales, Protomycetales và Pneumocystidales với 4 chi dạng telemorph và 2 chi dạng anamorph

Lớp Euascomycetes Bao gồm 2 chi Endomyces và Oosporidium Việc sắp

xếp chi Endomyces vào lớp này vẫn còn được tranh cãi Trong cơ chất tự nhiên, chúng

sinh các khuẩn lạc dạng bông, màu trắng với khuẩn ty giả hoặc khuẩn ty thật Túi bào

tử chứa 2-12 bào tử túi dạng mũ và mở ra nhờ nứt vỡ ở đỉnh Chi Oosporidium chỉ có một loài O margaritiferum có sắc tố từ da cam đến đỏ, đây là đặc điểm phổ biến ở

nấm men đảm

Lớp Hemiascomycetes được xem là “nấm men thật” (true yeasts) Lớp này

gồm 11 họ với 43 chi dạng teleomorph và 12 chi dạng anamorph, có xấp xỉ 460 loài

1.2.4.2 Các nấm men đảm

Nấm men đảm ít có tác dụng lên men, trong số hơn 200 loài của nấm men đảm chỉ có vài loài có khả năng lên men Các nghiên cứu về nấm men đảm của Scorzetti

và đtg cho rằng hiện nay mới chỉ khoảng 1% số nấm men đảm được thu thập và mô tả [84, 99] Việc phân loại nấm men đảm chủ yếu dựa vào các đặc điểm như cấu trúc lỗ vách, hình thái đảm, thành phần thành tế bào

Trong một số hệ thống phân loại, tất cả nấm men đảm được xếp vào 3 lớp: Ustilaginomycetes, Urediniomycetes và Hymenomycetes [17, 30, 84, 90, 91, 93, 99] Các loài nấm men đảm của 3 lớp được xếp vào 9 bộ, 66 chi và khoảng 220 loài [15, 99]

Trạng thái sợi của các loài thuộc lớp Urediniomycetes có vách với các lỗ đơn giản, thu nhỏ dần vào giữa lỗ Thường quan sát thấy một lỗ Mannoza và glucoza là thành phần chính trong thành tế bào, fucoza và ramnoza có thể có nhưng xyloza thì không Các loài nấm men thuộc lớp này được đặc trưng bởi không sinh các hợp chất giống tinh bột và không có khả năng đồng hoá inozitol [30, 99]

Lớp Ustilaginomycetes đặc trưng bởi cấu trúc vách ngăn lỗ nhỏ like), có thể có hoặc không có mép phồng Glucoza, galactoza và mannoza là thành phần chủ yếu trong thành tế bào, không có xyloza Có hoặc không có khả năng đồng hoá inozitol Không sinh các hợp chất giống tinh bột [30, 99]

(micropore-Nấm men của lớp Hymenomycetes khác với 2 lớp trên ở sự có mặt của vách lỗ dài (dolipore) và thành tế bào chứa glucoza, mannoza và xyloza Inozitol thường được đồng hoá và thường sinh các hợp chất giống tinh bột [30, 99] Nấm men lớp Hymenomycetes thuộc 4 bộ Tremellales, Trichosporonales, Filobasidales và Cystofilobasidiales [84]

1.3 ỨNG DỤNG CỦA NẤM MEN TRONG ĐỜI SỐNG

Các công nghệ làm bia, rượu, bánh mỳ, kêfia đã xuất hiện từ cách đây hàng nghìn năm, nhưng mãi đến giữa thế kỷ 19 Louis Pasteur mới chứng minh được vai trò thiết yếu của nấm men trong các quá trình này Nấm men thường được đại diện bởi

loài Saccharomyces cerevisiae cùng với sự sản xuất các đồ uống chứa cồn Mặc dù

tiềm năng công nghệ sinh học của nấm men Thực tế, trong các thập niên gần đây, các nghiên cứu về đa dạng trao đổi chất của những loài nấm men khác đã phát hiện ra vô

số các đặc tính đầy triển vọng cho công nghệ sinh học [23]

1.3.1 Nấm men trong lên men etylic

Việc sản xuất các đồ uống chứa cồn của S cerevisiae đã được khai thác trong

nhiều thế kỉ Hiện nay mối quan tâm chủ yếu trên toàn thế giới là việc sử dụng cồn (cồn sinh học) làm nhiên liệu thay thế cho một phần hay toàn phần xăng dầu cho các động cơ Ưu điểm của cồn sinh học là nguồn năng lượng ít gây ô nhiễm Ngoài ra, việc

sử dụng cồn sinh học được tiết kiệm khi giá thành của cơ chất lên men thấp Từ những năm 80 của thế kỷ trước, một số nước cho rằng công nghệ này là giải pháp cho sự chuyển hoá sản phẩm nông nghiệp, phụ phẩm của nền công nông nghiệp Vào thập kỷ

90, Brazin có kế hoạch sản xuất 1triệu triệu lít cồn/ năm Mỹ và Canada có dự án sản xuất cồn từ tinh bột ngô hoặc dịch thải sunphit, công suất trên 3 tỉ lít cồn/năm Sự biến đổi xyloza (sản phẩm thuỷ phân hemixenluloza thành cồn sinh học được nghiên cứu

nhiều với các loài nấm men Candida shehatae, Pichia stipitis và Pachysolen

tannophilus

Ngoài etanol, một số loại rượu khác bao gồm các rượu bậc cao có thể thu được qua lên men Các rượu bậc cao như isobutyl, isoamyl, phenyletanol và isopropyl là những thành phần hương vị quan trọng trong rượu Nhiều nấm men sản xuất ra các rượu khác như glycerol, erytritol, mannitol, xylitol và arabinitol Glycerol được sản

xuất nhờ S cerevisiae và được sử dụng rộng rãi trong việc tổng hợp các chất dẻo, dược phẩm, mỹ phẩm, kem đánh răng Mannitol được sản xuất nhờ C magnoliae và các chủng biến đổi di truyền của loài S cerevisiae Xylitol được sản xuất từ C

guilliermondii và arabinitol từ C entomaea và P guilliermondi Cả 3 loại rượu này có

thể được sử dụng như chất làm ngọt trong bánh kẹo, bánh quy, nước ngọt và màng dược phẩm [23]

1.3.2 Nấm men trong sản xuất protein đơn bào

Nhiều nấm men được sử dụng làm nguồn protein đơn bào, làm chất bổ sung

cho chăn nuôi (S cerevisiae, Yarrowia lipolytica hoặc một số loài trong chi Candida,

1.3.3 Nấm men trong sản xuất các sản phẩm công nghiệp khác

Enzym So với nấm (ví dụ Aspergillus niger) và vi khuẩn (ví dụ Bacillus spp.),

nấm men không là nguồn sản sinh mạnh mẽ các enzym dùng trong công nghiệp Tuy nhiên, vẫn có một số loài có khả năng sản xuất enzym dùng trong công nghiệp Proteaza

nấm men từ loài Saccharomycopsis fibuligera được nghiên cứu rộng rãi để ứng dụng

vào các công nghiệp thực phẩm và đồ uống

Amylaza để sản xuất kẹo và mứt (α-amylaza, glucoamylaza,

xyclodextrinaza ) được sản xuất bởi các loài thuộc chi Saccharomyces, Candida,

Filobasidium, Lipomyces và Schwanniomyces Ngoài ra, việc sử dụng các kĩ thuật

ADN tái tổ hợp cho phép nhân dòng các gen glucoamylaza từ Schwanniomyces spp và

S cerevisiae biến nạp vào các chủng nấm men sản xuất bia (Walker 1998)

Một ứng dụng có ý nghĩa kinh tế quan trọng của inulinaza một số nấm men cho

tổng hợp cồn sinh học hoặc fructoza (Kluyveromyces marxianus, C salmanticensis và

Debaryomyces)

Pectinaza từ nấm men C norvegensis, Cryptococcus albidus, K marxianus, S

cerevisiae và S pastorianus đã được nghiên cứu cho các ứng dụng công nghiệp

Lipaza từ Y lipolytica, Cr (Candida) curvata, Y lipolytica (C deformans), và

Rhodotorula glutinis được nghiên cứu để ứng dụng trong công nghiệp xử lý dầu và

chất béo, trong các chất tẩy rửa quần áo và trong công nghiệp thực phẩm

Các enzym khác đã được tìm thấy ở nấm men như xenlulaza từ Aureobasidium

pullulans; β-glucosidaza từ Dekkera intermedia và C intermedia (K cellobiovorus);

phenylalanine ammonium lyaza từ Cryptococcus và Trichosporon spp Trong những

năm gần đây, các nấm men biến đổi về di truyền có các hoạt tính enzym dùng trong

công nghiệp được phát triển nhanh chóng Người ta đã bắt đầu sản xuất lipaza từ C

rugosa và Y lipolytica, invertaza từ S cerevisiae

Lipit Một số nấm men thuộc chi Candida, Cryptococcus, Endomycopsis,

Hansenula, Lipomyces có khả năng tích lũy lipit nội bào dưới dạng các vi giọt Các

loại lipit khác cũng được sản xuất bởi nấm men như sophorolipit từ Rhodotorula (C.)

bogoriensis và C bombicola, các lipit kiểu bơ cacao từ Cr curvatus và este béo của

Carotenoit Phaffia rhodozyma là nấm men đảm sinh loại carotenoit có thể ứng

dụng trong các ngành công nghiệp dược, hóa thực phẩm và thức ăn gia súc, sản sinh astaxanthin dùng làm chất bổ sung trong thức ăn nuôi cá hồi Ngoài ra còn có một số

loài thuộc các chi Rhodotorula và Sporobolomyces sản xuất ra các carotenoit như

β-carotene, γ-β-carotene, torulene và torularhodin

Các hợp chất hương liệu Nhiều nấm men có thể sản sinh các hợp chất hữu cơ

dễ bay hơi được khai thác làm hương liệu cho các ứng dụng hóa học, dược học, mỹ

phẩm, thực phẩm, thức ăn gia súc như một số nấm men túi D hansenii, Geotrichum

candidum, K lactis, S cerevisiae và Y lipolytica Người ta đã sản xuất terpen từ Ambrosiozyma monospora và lacton từ Candida spp., K lactis, Torulaspora delbrueckii, Sporobolomyces odorus và Y lipolytica

Các vitamin Tế bào nấm men nói chung được xem là nguồn vitamin tốt,

nhưng mới chỉ có riboflavin (vitamin B2) được sản xuất ở quy mô công nghiệp từ

Eremothecium (Ashbya) gossypii và E ashbyi, axit ascobic (vitamin C) và

D-erythro-ascorbic từ Candida spp., Clavispora lusitaniae, Cr terreus, Kluyveromyces spp., P

fermentans và S cerevisiae Ngoài ra, ergosterol (tiền chất của vitamin D2) cũng đã

được thu nhận từ một số chủng của loài S cerevisiae

Các axít hữu cơ Nấm men được ứng dụng vào sản xuất một số axít hữu cơ

như citric, α-ketoglutaric, itaconic hay axít gluconic dùng trong công nghiệp thực

phẩm và y dược Axít xitric được tổng hợp bởi các loài như Y lipolytica, C

zeylanoides, C boidinii và C (citrica) tropicalis; axit gluconic từ Saccharomycopsis

spp và A pullulans; axit fumaric từ C (hydrocarbofumarica) blankii và axit isoxitric

từ C (brumptii) catenulata; axit lactic từ K thermotolerans; axit malic bởi C utlis,

P membranifaciens và A pullulans

Các polysaccarit ngoại bào Các polysaccarit ngoại bào nấm men bao gồm

(1→6)-glucan, mannan, galactomannan và pseudonigeran Các polysaccarit ngoại bào

khác được sản xuất bởi các nấm men, gồm các phosphomannan từ Pichia spp,

Hansenula spp và Pachysolen spp.; các glycolipit từ Y lipolytica và C bombicola

Pullulan (một α-glucan có liên kết α-(1→6) với các đơn vị maltotriozơ) tổng hợp bởi

A pullulans, được dùng làm màng thực phẩm β-glucan tách từ thành tế bào nấm men

rượu được quan tâm đặc biệt do khả năng ứng dụng trong nhiều ngành khác nhau

chống lại bệnh nhiễm trùng β-glucan cũng là chất chống oxy hoá, nên có khả năng chống u Trong nuôi trồng thuỷ sảnβ-glucan được bổ sung vào thức ăn để kích thích

hệ miễn dịch chống nhiều loại vi sinh vật gây bệnh thường gặp, kể cả virut [23]

1.3.4 Nấm men dùng làm tác nhân probiotic và các liệu pháp sinh học trị liệu

Các loài nấm men được sử dụng phổ biến nhất trong probiotic là K lactis, S

cerevisiae hoặc S boulardii Ngoài ra, nấm men không nhạy cảm với các kháng sinh

kháng vi khuẩn và được xem là “probiotic dược” hay “liệu pháp sinh học trị liệu” [23]

1.3.5 Sử dụng nấm men bảo quản trái cây và ngũ cốc

Sự thối hỏng trái cây, rau và ngũ cốc sau thu hoạch gây thiệt hại to lớn cho nông nghiệp Bảo quản bằng xử lý hóa học có thể mang lại các nguy cơ về sức khỏe và môi trường Để ngăn chặn sự hư hỏng do nấm có thể dựa vào việc xử lý bề mặt kho dự

trữ với các nấm men đối kháng Một số chủng thuộc các loài nấm men khác nhau, như

C oleophila, C laurentii, D hansenii, Metschnikowia pulcherrima, P anomala và P guilliermondii, đã được nghiên cứu như là các tác nhân đối kháng bệnh do nấm gây ra

ở trái cây và ngũ cốc [23]

1.3.6 Nấm men là các tác nhân phục hồi sinh học

Một số nấm men cũng có khả năng phân giải chất ô nhiễm tổng hợp có nguồn gốc từ hoạt động công nghiệp [23]

Nấm men giúp xử lý sự cố tràn dầu Nhiều loài nấm men thuộc các chi

Candida, Clavispora, Debaryomyces, Leucosporidium, Lodderomyces, Metschnikowia, Pichia, Rhodosporidium, Rhodotorula, Sporidiobolus, Sporobolomyces, Stephanoascus, Trichosporon và Yarrowia có thể đồng hóa được hydrocacbon

Nấm men-chất hấp thụ sinh học Nấm men cũng được nghiên cứu như các tác

nhân hấp thụ sinh học các kim loại nặng hay các chất phóng xạ S cerevisiae được sử

dụng trong màng lọc vi sinh vật để loại bỏ các ion kim loại nặng như Ni2+, Cu2+ và

Pb2+

Nấm men dùng để phân hủy các hợp chất hữu cơ nhóm chất thơm

Aureobasidium, Rhodotorula và Trichosporon có khả năng sinh trưởng khi có mặt

phenol vì có khả năng đồng hoá chất này

Nấm men dùng cho tẩy màu thuốc nhuộm Việc thải các thuốc nhuộm tổng

hợp vào môi trường đang gây ra những vấn đề nghiêm trọng về an toàn sinh thái Đa

số các thuốc nhuộm tổng hợp khi xử lý theo hướng vật lý hoặc hóa học thường tạo ra

các chất độc Geotrichum candidum có khả năng tẩy màu 21 loại thuốc nhuộm thuộc

nhóm azo và anthraquinon

1.3.7 Cải biến nấm men bằng đột biến, lai tế bào trần và kĩ thuật ADN tái tổ hợp

Nấm men biến đổi di truyền có các đặc tính công nghệ quan trọng: (1) việc đưa

gen STA2 glucoamylaza từ S (diastaticus) cerevisiae đã tăng cường khả năng của S

cerevisiae khi lên men polysaccarit; (2) việc bổ sung gen α-acetolactat decarboxylaza từ Enterobacter aerogenes cho phép sản xuất các bia màu với hiệu suất cao nhờ các nấm

men tích lũy diacetyl; (3) bao gồm gen mã hóa ngược malolactic từ Lactobacillus

delbrueckii làm cho các chủng S cerevisiae sản xuất ra rượu ít chua hơn và có mùi thơm

hơn Chủng S cerevisiae được chuyển gen α-glucosidaza từ thực vật sang đã mang lại

nhiều đặc tính mong muốn Việc sử dụng các kĩ thuật ADN tái tổ hợp để chuyển dạng

các nấm men không thuộc chi Saccharomyces như Candida spp., Hansenula spp.,

Kluyveromyces spp., Pichia spp và Yarrowia spp đang được triển khai [23]

1.3.8 Dùng nấm men làm sinh vật biểu hiện ADN tái tổ hợp

Khả năng biểu hiện các gen ngoại lai trong nấm men để sản xuất các phân tử có

giá trị chữa bệnh mang lại tiềm năng quý giá cho công nghiệp dược phẩm Nấm men S

cerevisiae được nghiên cứu phổ biến nhất cho việc biểu hiện gen ngoại lai trong các

dược phẩm mới và các sản phẩm thực phẩm mới Các loài khác ngoài S cerevisiae như

P pastoris và P angusta (H polymorpha) cũng đã được chấp nhận cho biểu hiện gen

ngoại lai Khả năng sản xuất hormon, kháng nguyên và enzym nhờ nấm men ở quy mô phòng thí nghiệm hoặc công nghiệp đang được nghiên cứu [23]

1.4 CÁC CHỈ TIÊU ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG PHÂN LOẠI NẤM MEN

Các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa, hóa phân loại được coi là chỉ tiêu phân loại thông thường cho nấm men, còn các chỉ tiêu dùng cho phân loại cấp độ sâu như xác định loài và loài mới thì cần dựa vào khả năng lai và tính tương đồng của phân tử ADN [52, 108]

1.4.1 Các nghiên cứu được dùng trong phân loại nấm men

1.4.1.1 Các đặc điểm hình thái và nuôi cấy

 Sự tạo thành các bào tử túi

 Sự tạo thành bào tử đảm / bào tử teliospore

 Sự tạo thành bào tử bắn

 Sự tạo thành bào tử đốt

 Sự tạo thành khuẩn ty (khuẩn ty giả / khuẩn ty thật)

 Sự tạo thành các nội bào tử vô tính

 Sự tạo thành bào tử màng dầy (chlamydospore)

 Sự tạo thành các ống mầm

 Nhân nhuộm

 Sinh trưởng trên môi trường dịch thể

 Sinh trưởng trên môi trường đặc Đặc điểm về hình thái là một trong những tiêu chí quan trọng trong phân loại vi sinh vật Hình thái của tế bào sinh dưỡng thường được sử dụng trong đơn vị phân loại đến họ Hình thái của các túi bào tử (asci) và hình thái của các bào tử túi (ascospores) được sử dụng trong phân loại đến chi và loài Hình thái của khuẩn ty giả và bào tử áo cũng là những chỉ tiêu phân loại có giá trị khi phân loại

1.4.1.2 Các đặc điểm sinh lý sinh hoá

 Khả năng kháng axit acetic (1%)

 Sự sinh axit từ glucoza

 Khả năng đồng hóa các hợp chất nitơ

 Khả năng đồng hóa các hợp chất cacbon

 Thử nghiệm Canavalin-glyxin-Xanh bromotymol

 Khả năng kháng cycloheximit

 Phản ứng màu với xanh diazon B (DBB)

 Phân giải lipit

 Khả năng lên men đường

 Khả năng hoá lỏng gelatin

 Khả năng sinh trưởng trong môi trường glucoza nồng độ 50%, 60%

 Khả năng sinh trưởng trong môi trường không có vitamin, trong môi trường có vitamin cần cho sinh trưởng

 Khả năng sinh trưởng ở 370C; ở nhiệt độ giới hạn cao nhất cho sinh trưởng

 Khả năng tổng hợp melanin trong môi trường DOPA

 Khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa 10% NaCl và 5% glucoza

 Khả năng phân giải arbutin

 Khả năng tạo thành tinh bột

 Khả năng sinh trưởng trong môi trường có chất chỉ thị tetrazoli

 Khả năng thuỷ phân urê

1.4.1.3 Các đặc điểm hoá phân loại và sinh học phân tử

 Sự tương đồng ADN-ADN

 Thành phần monosaccarit của tế bào và dịch thuỷ phân thành tế bào

 Thành phần ubiquinon chính

 Tỷ lệ G+C trong ADN nhân (C+G % mol)

 Thành phần axit béo của tế bào

 Các phương pháp huyết thanh học

 Khối phổ hồng ngoại của mannan thành tế bào

 Phân tích trình tự ARN riboxom / ADN riboxom:

Vùng ADNr 18S, ADNr 25/26S, vùng ITS, vùng ETS

 Xác định trình tự của các gen khác

1.4.2 Các bước định danh

Định danh loài dựa trên hai phương pháp: Phân loại thông thường và sử dụng