Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm men sinh bào tử bắn (ballistosporous yeasts) phân loại từ lá cây ở vườn quốc gia cúc phương

3 Sắp xếp các chủng nấm men sinh bào tử bắn vào các chi dựa trên các 59đặc điểm hoá phân loại và hình thái 4 Số lượng nucleotit sai khác của các chủng nhóm A với các loài có quan 65 hệ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

VIỆN VI SINH VẬT VÀ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Đ Ể T À I Đ Ặ C B IỆ T C Ấ P Đ H Q G H N

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐlỂM s i n h h ọ c v à p h â n LOẠI CỦA NẤM MEN SINH BÀO TỬ BẮN (BALLISTOSPOROUS YEASTS) PHÂN LẬP TỪ LÁ

ÙA HOC QUOC GIA HÀ NÔI

' r?ỊJNG TÃK/ rHÒNG TIN THƯ VIỆN

J ự ỉ S S L

-H à N ội - 2 0 0 8

1.1.3.4 N ghiên cứu nấm m en sinh bào tử bắn ở Trung Quốc 81.1.3.5 N ghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở N hật Bản 91.1.3.6 N ghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở một số nước khác 9

1.3.2 Các nấm m en là các nhà sản xuất protein đơn bào 131.3.3 Các nấm m en như nguồn sản xuất các sản phẩm công nghiệp 14

khác1.3.4 N ấm m en dùng làm tác nhân probiotic và các liệu pháp sinh 16

học trị liệu1.3.5 N ấm m en dùng trong chuyển hoá Sinh học (bioconversion) 161.3.6 Sử đụng nấm m en để hạn ch ế bệnh sau thu hoạch ở trái cây 17

i

và ngũ cốc

1.3.8 Cải biến nấm m en bằng đột biến, lai thể nguyên sinh và kĩ 17

thuật A DN tái tổ hợp

1.3.9 D ùng nấm m en làm sinh vật biểu hiện ADN tái tổ hợp 18

1.4.4.2 Phương pháp sử dụng sô' liệu về trình tự A D N r 21

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 36

2.1.4.1 M ôi trường phân lập và nuôi nấm m en sinh bào tử bắn 37

2.2.1 P hư ơng p h á p ph á n lập 39

2.2.2.2 Phương pháp xác định đặc tính sinh lý, sinh hoá 40

2.2.2.4 Phân loại nấm men bằng phương pháp sinh học phân tử 46

2.2.3 X ác định h oạt tính enzym bằng phư ơng p h á p khuyếch tán trên 52 thạch

3.2.2 VỊ tr í p h â n lo ạ i của các chủng nấm men sinh bào tử bấn thuộc 60

3.3 H oạt tính sinh học của các chủng nấm m en sinh bào tử bắn thuộc

chi B u llera

3.3.3 C ác điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sinh tổ n g hợp enzytn ngoại 87

bào

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIÊT TẮT

HPLC H igh Perform ance Liquid Chrom atography (Sắc ký lỏng cao áp)

chép)JCM Japan Collection of M icroorganism s (Bảo tàng giống vi sinh vật

Nhật Bản)

PABA p - A m inobenzoic Acid (a xit p - am inobenzoic)

TAE Tris- axit axetic- axit etylenediam inetetra axetic

VTCC V ietnam Type Culture Collection (Bảo tàng giống chuẩn Vi sinh

vật Việt Nam)

YM Y east-m alt extract agar (thạch cao nấm m en - cao m alt)

DANH MỤC CÁC BẢNG

2 N ấm m en sinh bào tử bắn được phân lập từ bể mật lá cây ở rừng Q uốc 56gia Cúc Phương

3 Sắp xếp các chủng nấm men sinh bào tử bắn vào các chi dựa trên các 59đặc điểm hoá phân loại và hình thái

4 Số lượng nucleotit sai khác của các chủng nhóm A với các loài có quan 65

hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADNr vùng ITS (bao gồm 5,8S)

5 Số lượng nucleotit sai khác của các chủng nhóm A với các loài có quan 70

hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADN r 26S đoạn D1/D2

6 Kết quả lai ADN genom của các chủng nấm men nghi ngờ là loài mới 74

thuộc nhóm A chi Bullera

7 Phân loại đến loài các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc nhóm A 75

DANH MỤC CÁC HÌNH

7 Cây phả hệ của nấm m en sinh bào tử bắn dựa vào phân tích trình 33

tự A D N r 18S

8 Phân tích hệ thống ubiquinon chủ yếu của các chủng nấm men 57

10 Vị trí phân loại của các chủng nấm m en sinh bào tử bắn thuộc chi 61

Bullera với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự A D N r

18S

11 Vị trí phân loại của các chủng nấm men sinh bào tử bắn thuộc nhóm A 64

chi Buỉỉera với các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự ADNr

ITS

12 Vị trí phân loại của các chủng nấm men thuộc nhóm A chi Buỉlera với 68

các loài có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự A D N r doạn D1/D2

26S

13 T ế bào sinh dưỡng và bào tử bắn của Bullera cuulongensis V Y-50T 77

14 T ế bào sinh dưỡng và bào tử bắn của Buỉlera nhoquanica V Y -55T 81

15 T ế bào sinh dưỡng và bào tử bắn của Bulỉera haininhensis V Y -86T 84

16 K hả năng sinh enzym ngoại bào của 39 chủng nấm men sinh bào tử 86

bắn thuộc chi Bullera

VII

19 Màu sắc V Y -5, V Y -21, V Y-23, V Y -69 và VY-103 106

21 Màu sắc khuẩn lạc VY-42, V Y -51, VY-75, V Y -1 16 và VY-143 106

BÁO CÁO TÓM TẮT

a, T ên đ ề tài: “N ghiên cứu đạc điểm sinh học và phân loại của nấm men sinh bào tử

bắn (ballistosporous) phân lập từ lá cây ờ Vườn Quốc gia Cúc Phương”.

b, Chủ trì đề tài: ThS Đ ào Thị Lương

c, Các cán bộ tham gia: GS TS Phạm Van Ty, ThS Lê Thị H oàng Yến, ThS Hoàng Văn Vinh

d, M ục tiêu và nội dung nghiên cứu của để tài

- Mục tiêu của đề tải:

+ Tìm hiểu nấm m en sinh bào từ bắn- m ột nhóm vi sinh vật phong phú cư trú trên nhiều loại lá cây m à từ trước đến nay chưa hề biết đến ờ Việt Nam- Khời nguổn cho một nhánh nghiên cứu mới về đa dạng sinh học

+ Tìm kiếm và phát hiện các loài mới cho khoa học, bổ sung vào danh mục loài củathế giới

+ Tìm kiếm khả nãng sinh các chất hoat đ ộ n s sinh học (các loại enzim)

- Nội dung nehiên cứu:

+ Phân lập các chủng nấm men sinh bào tử bấn từ lá cây ờ Vườn Q uốc gia Cúc Phương

+ Phân loại các chùnạ nấm men phân lặp được đến loài

+Tìm hiểu khả năng sinh các chất hoạt độna sinh học từ nhóm nấm men này và tìm kiếm khả năng ứna dụng

e, Kết quả chính của đề tài

- Phân lập được 121 chùno nấm men sinh bào từ bắn từ 20 mẫu lá câv thu thập ờ Vườn

Q uốc gia Cúc Phươns

- Trong số 85 chủng nấm men sinh bào từ bắn được lựa chọn nghiên cứu thuộc về 5 chi dựa vào các đặc điểm hoá phân loại (ubiquinone chủ yếu, sự tồn tại của xyloza tronơ tế

bào) và các kiểu sinh sản Có 44 chùns thuôc lớp H ym enom ycetes eổm 2 chi Bullera

(39 chủng) và K ockovaella (5 chủng) Có 39 chủng thuộc lớp Urediniomyces gồm 2 chi Bannoa (5 chủng), Sporobolomyces (34 chùng) Hai chủng còn lại thuộc chi Tilletiopsis, lớp Ustilaginomyces.

- Trong số 27 chủng thuộc nhóm A của chi Bullera, dựa vào phương pháp phân loại

sinh học phân tử (trật tự A D N r 18S, các vùng ITS, 26S đoạn D1/D2, tỷ lệ G+C, và lai ADN genom ) đã phân loại được 8 loài, 2 loài thuộc các loài đã biết, còn 6 loài thuộc

các loài mới Có 3 loài B cuulongensis, B nhoquanica, B haininhensis, đã và đang

được công bố chính thức, số còn lại sẽ công bố tiếp trong thời gian tới

- Tất cả 39 chủng nấm m en sinh bào tử bắn thuộc chi B uỉỉera đều có khả năng phân

giải ít nhất 3 cơ chất trong số các cơ chất là: tinh bột, cazein, CMC, kitin và lipit Chúng đều không có sinh chất kháng sinh đối với các vi sinh vật kiểm định

- Bốn chủng V Y -69, VY-75, VY-116, VY-142 có phức hệ enzym khá phong phú Chúng có khả năng phân giải tốt đồng thời cả năm loại cơ chất trên Điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của 3 chủng trên môi trường YM, pH6-7, nhiệt độ 20-25"C, thời gian 6 ngày

No IS, pp 38-46

2 Đào Thị Lương, Phạm Văn Ty (2007), “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả

năng sinh enzym ngoại bào của hai chủng nấm m en sinh bào tử bắn thuộc chi

Bullera", Tạp chí Công nghệ Sinh học, 5 (1), tr 1-10.

3 Luong D.T., T akasim a M., Ty P.V., Dung N.L., N akase T (2007), “Buỉlera cuulongensis sp nov., and Bullera nhoquanica., two new ballistoconidium -

form ing yeast species from Cue Phuong N ational Park o f N inh Binh Province,

V ietnam ” , Int J Syst Evol M icrobiol, (in press).

n Đào tạo: 1 luận án tiến sĩ

Đ ào Thị Lương (2007) với đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại của nấm m en sinh bào tử bắn phân lập từ lá cây ở Vườn Q uốc gia Cúc Phương”

f Tình hình sử dụng kinh phí của để tài

- Kinh phí được cấp :60.000.000 đồng

- K inh phí thực hiện: 60.000.000 đồng

ĐẠI HỌC Q UỐC GIA HÀ NỘI

xi

V iệt N am nằm trong khu vực có khí hậu nóng ẩm tạo điều kiện thuận lợi cho các vi sinh vật phát triển Việt Nam được đánh giá là một trong các quốc gia có đa dạng sinh học phong phú Đ a dạng sinh học ở cả ba góc độ đa dạng di truyền, đa dạng loài và đa dạng hệ sinh thái là những nguồn tài nguyên quan trọng, đã đang và

sẽ đóng góp m ột phần không nhỏ cho quá trinh xây dựng đất nước Bảo tồn đa dạng sinh học là m ột việc khẩn cấp và mang tính chiến lược lâu dài Nếu không bảo tồn ngay những giá trị hiện còn thì với tốc độ suy thoái đa dạng sinh học như hiện nay

sẽ có nhiều loài sinh vật quý, nhiều nguồn gen và tính trạng tốt sẽ không còn, nhiều

hệ sinh thái quan trọng đối với môi trường sống sẽ bị phá huỷ, gây nên hậu quả nghiêm trọng cho nền kinh tế và môi trường N hững tổn thất này không dễ khôi phục lại hoặc nếu có khôi phục cũng đòi hỏi chi phí lớn và thời gian dài

Ớ V iệt Nam, sự nghiên cứu đa dạng sinh học vi sinh vật mới được bắt đầu

M ục tiêu của nghiên cứu đa dạng sinh học vi sinh vật là nhằm tìm kiếm các nguồn gen m ới, tiến hành nghiên cứu, tìm cách ứng dụng và lưu giữ chúng cho các thế hệ sau Trong quá trình tìm kiếm các nguồn gen, không phải chỉ chú ý đến các nhóm vi sinh vật đã biết, m à cần phải quan tâm đến các nhóm hiếm , ít được nghiên cứu, với

hy vọng tìm ra các chất có hoạt tính sinh học mới

Vì những lẽ trên, chúng tôi thực hiện đề tài:

“N ghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại cua nấm men sinh bào tử bán (b allistosporous yeast) phân lập từ lá cây ở Vườn Q uốc gia Cúc Phương”.

Với mục tiêu:

- Tìm hiểu nấm m en sinh bào tử bắn- m ột nhóm vi sinh vật phong phú, cư trú trên nhiều loại lá cây m à từ trước đến nay chưa hể biết đến ở Việt Nam- khởi nguồn cho m ột nhánh nghiên cứu mới về đa dạng sinh học vi sinh vật

- T un kiếm và phát hiện các loài mới cho khoa học, bổ sung vào danh mục loài của thế giới

- Bước đầu tìm hiểu khả năng sinh các chất hoạt động sinh học (các loại enzym ngoại bào)

2

trời, vùng đất, vùng biển, các hệ sinh thái thuỷ vực nội địa và các phức hệ sinh thái mà

chúng ta cũng là thành viên, bao gồm sự đa dạng trong mỗi loài, giữa các loài và của

các hệ sinh thái” [5 0 ].

Đ a dạng sinh học có vai trò to lớn trong đời sống vật chất và tinh thần của con người trong việc duy trì các chu trình tự nhiên, cân bằng sinh thái trên Trái đất và là cơ

sở của sự sống còn, thịnh vượng, bền vững của xã hội loài người

Hiện nay, những hiểu biết vể đa dạng sinh học còn nhiều hạn chế Những kiến thức khoa học mới chỉ dừng lại ở việc đánh giá tính đa dạng của các dạng sống Ngay ở mức độ loài mới chỉ khoảng hơn 1,7 triệu loài được mô tả, còn sô lượng thực, đặc biệt

là số lượng loài côn trùng và vi sinh vật thì hiện nay chưa thể xác định được Sự phong phú của loài là nét đặc trưng chủ yếu của đa dạng sinh học Các nghiên cứu về đa dạng sinh học hiện nay mới chỉ biết đến một phần nhỏ (khoảng 8%) của tổng số đa dạng trong sự sống [5 0 ] Hơn nữa, hiện nay con người đang làm suy thoái, thậm chí là huỷ diệt những tài sản quý giá và không thể thay thế này Trong những thập kỷ qua, sự suy thoái đa dạng sinh học đã xảy ra với tốc độ khủng khiếp do sự mất mát về loài và suy thoái về các hệ sinh thái tự nhiên Từ năm 1990-2000, người ta ước tính có khoảng 5- 10% số loài trên thế giới đã bị tiêu diệt và 25% số loài sẽ bị tiêu diệt vào khoảng nhũng năm 2050 do mất hệ sinh thái đa dạng, nhất là rừng [3]

Do vậy, sự bảo tồn đa dạng sinh học dã trở thành vấn đề hết sức nóng bỏng và

đã nhận được sự quan tâm không những của các nhà khoa học tự nhiên, khoa học xã hội mà còn cả các cấp quản lý từ cấp quốc gia đến địa phương trên toàn T h ế giới Chính vì vậy mà Công ước quốc tế về Đ a dạng sinh học đã được 157 nước ký kết tại

R io de Janeiro tháng 6/1992 Nhiều nước đã có các chương trình và kế hoạch quốc gia

về đa dạng sinh học; đã có luật và chính sách cụ thể về bảo tổn, nghiên cứu và khai thác

đa dạng sinh học (Ấn độ, Philippin, Equado, Thái Lan ).

V iệt N am là nước có sự đa dạng lớn về môi trường tự nhiên và đa dạng sinh học, được xếp thứ 16 trong số các nước có đa dạng sinh học cao nhất T h ế giới Việt Nam có khu hệ động thực vật rất phong phú, có khoảng 13.000 loài thực vật, 12.000 loài động vật và khoảng 1.000 loài nấm lớn được phất hiện [3], Riêng về khu hệ vi sinh vật thì hầu như chưa có điểu tra nào đáng kể

Tương tự như ở các quốc gia khác, đa dạng sinh học của Việt Nam cũng bị suy thoái trầm trọng Chỉ trong vòng 50 năm (1941-1991), diện tích rừng che phủ đã giảm 30% , nhiều loài sinh vật quý hiếm đã bị diệt vong Trong sách đỏ V iệt Nam hiện đã ghi

365 loài động vật và 35 loài thực vật có nguy cơ tuyệt chủng Trước tình hình cấp bách hiện nay, để phát triển bền vững đa dạng sinh học phải bảo tồn, nghiên cứu và sử dụng

có hiệu quả các nguồn tài nguyên tự nhiên này M uốn vậy phải có bước quan trọng là kiểm kê đa dạng sinh học bao gồm các nghiên cứu về phân loại, di truyền và sinh thái học nhằm thống kê các loài, các quần xã và các hệ sinh thái Phân loại là khâu quan trọng đầu tiên cho bất kỳ nghiên cứu nào của đa dạng sinh học, cần phát triển các nghiên cứu thực nghiệm như hoá phân loại (chem otaxonom y), phân loại tế bào học (cytotaxonom y) và tiến tới phân loại sinh học hiện đại Phải xây dựng các trung tâm, phòng thí nghiệm hay bảo tàng có đủ điều kiện phân loại và lưu giữ các thực vật, động vật và vi sinh vật để tìm ra các loài mới chưa được phát hiện để đóng góp cho khoa

h ọ c [3 ],

1.1.2 Đa dạng vi sinh vật.

N gày nay vi sinh vật được sử dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau

từ nghiên cứu đến ứng dụng Con người ngày càng phụ thuộc nhiều vào vi sinh vật Nhiều loại sản phẩm do vi sinh vật sinh ra như thuốc kháng sinh, vitamin, axít hữu cơ axít amin, vắcxin đã gắn liền với đời sống con người Một số lượng lớn không sao đếm xuể các vi sinh vật tham gia vào vòng tuần hoàn vật chất và kiểm soát ô nhiễm môi trường trên Trái đất Các vi sinh vật với cấu tạo đơn giản, chu kỳ sống ngán đã trở thành m ỏ hình lý tưởng trong nghiên cứu các vấn để lý thuyết trong sinh học cơ bản

4

D anh sách các vi sinh vật được ứng dụng trong nghiên cứu thực tiễn ngày càng dài bởi vì ngày càng tìm ra nhiều loài vi sinh vật mới với các tính năng mới Rõ ràng, vi

sinh vật là nguồn lưu giữ kho tàng gen rất phong phú cần được sưu tầm, nghiên cứu, ứng dụng và lưu giữ lại cho các thế hệ sau Khác với sinh vật bậc cao, vi sinh vật rất dề bị đột biến do các điều kiện tự nhiên Trong tự nhiên, nhiều loại vi sinh vật nếu không được phân lập, nghiên cứu và lưu trữ thì chúng có thể sẽ bị mất đi vĩnh viễn Với quan điểm này, vi sinh vật phải được coi là nguồn tài nguyên quý giá của mỗi quốc gia và việc nghiên cứu đa dạng vi sinh vật là một công việc cần phải được quan tâm đặc biệt

Sự đa dạng của th ế giới vi sinh vật là không thể kể xiết Vi sinh vật tồn tại ở khắp mọi nơi, thậm chí ở cả nhiệt độ sôi của suối nước nóng, dưới đáy biển sâu hay nhiệt độ dưới không Vi sinh vật được ứng dụng nhiều trong các ngành cõng nghiệp chế biến (m en n ả bánh mỳ, sữa chua, rượu vang, bia, rượu, phom at, chất điều v ị ) công nghiệp sản xuất kháng sinh và rất nhiều các sản phẩm của công nghệ sinh học khác Chính vi sinh vật là nguồn tạo nên các sản phẩm m ang tính chất đột phá Ví dụ như nhờ có Tag-polym eraza do vi khuẩn sinh ra m à cuộc cách m ạng lớn trong sinh học

đã xảy ra Từ đó, người ta có thể khuếch đại các đoạn gen mong muốn Vi sinh vật đã trở thành công cụ chuyển gen lý tưởng mà giá trị của nó là cùng một công cụ nhưng có thể tạo ra các sản phẩm có chất lượng cao, giá thành hạ M ột ví dụ khác là việc tìm ra cyclosporin A từ vi nấm , có khả năng ức chế m iễn dịch, giúp các ca ghép tạng thành công, cứu sống hàng triệu người

Đ a dạng vi sinh vật phát triển mạnh mẽ trong những năm gần đây nhờ sự tiến bộ của sinh học phân tử, cho phép các nhà sinh học so sánh tất cả các cơ thể sống dựa vào các gen có tính bảo tồn cao Các nghiên cứu cho thấy riboxom chịu trách nhiệm tổng hợp protein trong tất cả các cơ thể Trinh tự cơ bản của tiểu phần (16S hoặc 18S) của

ARNr đã được sử dụng làm bản đồ biểu hiện mối liên quan của tất cả các cơ thể sống

Cây phả hệ chỉ ra sự đa dạng khác thường của vi sinh vật Bây giờ, người ta đả biết về

sự tồn tại của các dạng sinh vật trên Trái đất nhiều hơn trước kia, ước chừng 1% các

loài vi khuẩn và 5% các loài nấm đã được biết đến N hờ sự phát triển của kỹ thuật hiện

đại để phân loại các vi sinh vật và so sánh với các loài đã biết, các nhà khoa học có thể

sử dụng công cụ mới này để thãm đò, xác định các dạng sống chưa được nhận biết trước

kia [4 0 ].

1.1.3 N ghiên cứu đa dạng nấm men và nấm men sinh bào tử bán

V iệc sử dụng nấm m en trong các sản phẩm thức ãn và đồ uống có từ rất lâu đời

ở vùng nhiệt đới châu Á, đặc biệt là các nước Đ ông N am Á

Nói chung, nấm m en tìm thấy trong thực phẩm lên m en và các môi trường tương

tự không phong phú trong đa dạng Nấm túi chiếm đa số trong các môi trường này và

các loài cũng tương tự nhau tại các nước khác nhau ở Châu Á, Các nghiên cứu hiện nay

từ quan điểm da dạng sinh học đã cho thấy sự phong phú của các loài nấm men sống

trong môi trường tự nhiên [62]

1.1.3,1 N ghiên cứu nấm men ở Thái Lan

Saito và dtg (1983) đã phân lập 386 chủng nấm men từ 54 mầu thực phẩm lên

men và các môi trường tương tự, đã phân loại được 21 loài trong 11 chi s cerevisiae là

loài chiếm ưu th ế trong số chủng phân lập (30,6% ) và được tim thấy trong 39,4% sô

mẫu, tiếp theo là Ịssatchenkìa orientalis (28,2% ), H anseniaspora walbyensis (9,8% ),

c tropicalis (5,4% ), Pichia m em branifaciens (4,7% ), p ohm eri (4,4% ),

Saccharom ycopsis fibulig era (3,9%), 14 loài còn lại chiếm (1,8-0,3%) Trong nghiên

cứu này, tất cả số chủng đều thuộc các loài đã biết Suzuki và đtg (1987) nghiên cứu 80 chủng phân lập từ các sản phẩm lên men và các môi trường tương tự Họ đã phân loại

được 17 loài thuộc 9 chi ỉssatchenkia orientalis chiếm ưu thế với 42,5% , 5 cerevisìae chiếm 11,3%, / occdentalis chiếm 10% và c tropicalis chiếm 6,3% Trong nghiên cứu này chỉ có 1 chủng duy nhất được mỏ tả là loài mới c.stellim alicola.

Jindam orakor (2000) phân lập 137 chủng nấm men từ các sản phẩm lên men và các m ôi trường tương tự có nồng độ muối cao, đã phân loại 123 chủng thuộc 33 loài đã

biết Issatchenkìa orientalis chiếm đa số 27,0% , s cerevisiae chiếm 8,8% c parapsilosis 7,3% và c.g la b ra ta 5,8% Trong nghiên cứu này 57,6% các loài thuộc các

chi phổ biến ở các nghiên cứu của Suzuki và Saito trước đây Có 2 chủng được mỏ tả

cho một loài mới là C iterom yces siam ensis N hư vậy, các nấm m en phân lập từ Thái

Lan trong các sản phẩm lên men và điều kiện tương tự không đa dạng, chủ yếu chúng thuộc các loài đã biết và giống ở các nước Đông Nam Á, châu Âu và Nhật Bản

6

Trái với các sản phẩm lên m en và các điều kiện tương tự, nấm m en tìm thấy

trong môi trường tự nhiên rất đa dạng và rất nhiều loài mới được tìm thấy.

N ấm đảm , đặc biệt là nấm men sinh bào tử bắn được nghiên cứu ở phạm vi rộng

ở Thái Lan Nãm 1987, Nakase và đtg đã thu thập 20 m ẫu lá từ các vùng nội, ngoại ồ Bangkok và gần A yutthaya, phân lập được 63 chủng nấm men sinh bào tử bắn Chúng

thuộc 16 loài trong 6 chi Trong đó có m ột chi mới là K ockovaella với 2 loài mới (K

im peratae, K thailandica) và 5 loài mới thuộc các chi khác là Sporobolom yees nylandii, s verm iculatus, Tilletiopsis oryzicola và T penniseti Nãm 1990, 73 chủng

nấm men sinh bào tử bắn được phân lập từ 33 mẫu thực vật (chiếm 82% số mẫu thu

thập) Chúng thuộc 13 loài đã biết và 5 loài mới được miêu tả trong các chi Bullerơ, Kockovaella, Bensingtonia và Sporidiobổĩus/Sporobolom yces.

Năm 1996, Fungsin phân lập được 175 chủng nấm men sinh bào tử bắn ở rừng phòng hộ mưa nhiệt đới, phía bắc Thái Lan Ông đã sắp xếp 151 chủng vào các chi

Buỉlera (51 chủng), D ioszegia (2 chủng), K ockovaeỉla (4 chủng), Bensingtonia (10 chủng), Rhodotorula (6 chủng), Sporidiobolus (2 chủng), Sporobolom yces (57 chủng)

và Tilỉetiopsis (18 chủng) Trong số này, 141 chủng thuộc 47 loài, 14 loài đã biết và 33

loài mói (106 chủng, chiếm 75% số chủng nghiên cứu) Như vậy, tỷ lệ loài mới lớn gấp

3 lần số loài đã biết Kết quả này đã cho thấy rõ nấm men sinh bào tử bắn kết hợp vớt lá cây ở rùng phòng hộ Thái Lan rất phong phú trong đa dạng sinh học và nhiều loài chưa biết sống trên cơ chất này

N hững năm 2000, N akase và đtg m ở rộng phạm vi nghiên cứu đã phân lập 283 chủng nấm m en từ các nguồn trong tự nhiên của Thái Lan như: phân cỏn trùng, rêu hoa, nấm Trong số này, có 194 chủng nấm túi được định tên thuộc 134 loài, 96 chủng thuộc 41 loài đã biết 84 chủng nấm túi thuộc 79 loài mới, còn 14 chủng phải nghiên cứu tiếp Có 89 chủng (31,4% ) nấm đảm được xếp vào 53 loài, 17 loài đã biết (41 chủng), 22 loài mới (31 chủng) và 14 loài (17 chủng) chưa xác định rõ Thực tế này

đã chứng m inh rằng đa dạng loài của nấm men rất phong phú ở rùng của Thái Lan và

có một số lượng lớn các loài chưa biết sống ở đây Điều này hoàn toàn khác với các nấm túi trong thực phẩm lên men [57, 62],

1.1.3.2 N ghiên cứu nám men Indonesia

Cũng như ở các nước Đ ông Nam Á khác, nấm men được nghiên cứu rất sớm cho các sản phẩm lên men, thực phẩm, đồ uống và dạng khởi động cho lên men

N ghiên cứu về nấm m en sống trong rừng và các diều kiện tự nhiên khác từ hơn 40 năm

trưức đây D einem a(196l) phân lập nấm men tạo thành lipit, một loài mới được miêu tả

là Candida bogoriensis [57, 62].

H aryono và đtg (1996) phân lậ p từ 40 mẫu lá cây được hơn 300 chủng sử dụng

phương phấp bào tử bắn roi, 61 chủng phân lập ở các mẫu ở độ cao 900-1000 m so với mực nước biển, thuộc các chi Bullera (11 chủng), Bensingtonia (14 chủng), Sporobolom yces (36 chủng).

Oetari và đtg (1999) nghiên cứu 25 chủng nấm men phân lập từ 21 mẫu của 17

cây chuối Các chủng này thuộc các chi Pichia, Saccharom yces, H anseniaspora,

cứu trên quan điểm ứng dụng vi sinh vật [57, 62],

1.1.3.3 N ấm men tron g rừng ở Đ ài Loan

Các nghiên cứu nấm m en ở Đài Loan được thực hiện khoảng 70 năm trước đây nhưng chủ yếu liên quan đến lên m en rượu

Nakase và đtg (1997) đã phân lập 154 chủng nấm men từ thực vật ở rừng phòng

hộ mưa cận nhiệt đới Trong số này có 146 chủng sinh bào tử bấn thuộc các chi Bullera (90 chủng), D ioszegia (1 chủng), Sporobolom yces (54 chủng), K ockovaella (1 chủng)

Tám loài mới đã được m ô tả trong số các chủng phàn lập [62],

1.1.3.4 N ghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở Trung Q uốc

Năm 1982, Li đã phân lập từ lá ngô, lá lúa mì và côn trùng các chủng nấm men

thuộc chi Bullera và phát hiện 2 loài mới.

Bai và đtg (1996) đã phàn lập được 670 chủng nấm men sinh bào tử bắn từ 43mẫu ở rừng Y unnan, Trung Q uốc Họ đã chọn 109 chùng cho các nhiên cứu tiếp theo

8

Chúng thuộc các chi Bullera, Bullerom yces, D ioszegia và Sporobolom yces Có 7 loài

mới đã được mô tả trong số các chủng này [57].

1.1.3.5 N ghiên cứu nấm m en sinh bào tử bắn ở N h ậ t Bản

N ấm m en sinh bào thử bắn được Saito bắt đầu nghiên cứu từ năm 1922 và

O kunuki nghiên cứu vào năm 1931, nhưng các chủng của họ được chuyển cho các nhà nghiên cứu Hà Lan Đ ến các nghiên cứu của M orishita (1941), Y am azaki và Fujii

(1951) mới phân lập được nấm men thuộc 2 chi Buỉlera và Sporobolom yces Năm 1952, Tubari phát hiện ra chi mới là Tilletiopsỉs với 3 loài mới được đặt tên Đ ến nãm 1985

N akase và Suzuki đã tìm ra 8 loài mới cho khoa học Giai đoạn 1987-2000, N akase và

các đồng nghiệp đã phát hiện ra 26 loài mới thuộc các chi B u llera , Sporoboỉom yces, Bensingtonia, Tilletiopsỉs, U deniom yces và 7 loài mới trong 2 chi mới được thành lập

là: Kockovalella, B alistosporom ỵces.

Saito và đtg (1994) phân lập 199 chủng nấm men từ 24 mẫu lá (66,7% trong số

36 mẫu thu thập) ở đảo O gasaw ara có 197 chủng sinh bào tử bắn thuộc 7 chi Chi

Bulỉera gồm 46 chủng phân lập từ 10 mẫu lá (27% ) thuộc 6 loài, có 3 loài mới đã được m ổ tả Chi K ockovaella gồm 16 chùng từ 3 mẫu lá (8,3% ), có 3 loài mới Chi Bensỉngtonia có 2 chủng được phân lập trên cùng mẫu lá, có m ột loài mới Chi Sporobolom yces gồm 133 chủng với 103 chủng có Q 10 và 30 chủng có Q 10(H 2) được tìm thấy trong 10 m ẫu lá (27,8% ) được xếp vào chi mới là Bannoa Trong số các chủng không sinh bào tử bắn, có 2 chủng sinh cuống bào tử đính thuộc cho Fellom yces dược

m ô tả là 2 loài mới [57,62]

1.1.3.6 N ghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn ở m ột sô nước khác

Buhagiar và đtg (1983) đã phát hiện 2 loài mới thuộc chi Buìlera có khuẩn lạc

màu cam từ rau và quả ở Anh Shiva và Rodrigue de M iranda (1983) tìm thấy

Sporobolom yces elongatus trên lá ở A ustralia John và Bandoni (1984) nghiên cứu nấm men sinh bào tử bắn trên lá cây ở Canada và tìm ra 3 loài mới thuộc chi Bullera và Sporoboỉom yces Ingold (1986) tìm thấy Bensingtonìa cilliata ở Anh Van der W alt và đtg (1986-1989) đã tìm thấy 3 loài mới thuộc chi Bensingtonia ở Nam Phi Sláviková

và G rab iD sk a-L o n iew sk a (1992) đã mô tả Sporobolom yces lactosus ở Ba Lan [57],

Cũng như ở các nước châu Á khác, việc sử dụng nấm m en trong các sản phẩm lên men, thực phẩm , đổ uống và dạng khởi động cho lên men rượu đã có từ lâu đời.

Các nghiên cứu khoa học vể nấm men chủ yếu xoay quanh các vấn để lên men rượu,

bia và m ột số đồ uống, sản phẩm lên men thực phẩm Sau này các nghiên cứu về nấm

men cũng có dược mở rộng ra các lĩnh vực khác nhưng đều được nhìn từ quan điểm

ứng dụng vi sinh vật Còn các nghiên cứu về sự đa dạng loài của nấm men trong tự nhiên thì hầu như chưa được nghiên cứu đến Dưới đãy là m ột số nghiên cứu ngoài lên men thực phẩm và dồ uống

Tống Kim Thuần và đtg đã phân lập được 4 loài nấm men thuộc chi Lipom yces từ

nhiều loại đất ở 23 địa điểm khác nhau trên các vùng sinh thái khác nhau, trải rộng khắp Việt Nam Đã đánh giá được sự phân bố của các loài thuộc chi này trong các vùng dấí ,y/ khác nhau Có thể sử dụng chúng như một trong các chất chỉ thị trong phân loại, khoanh vùng đất, ứng dụng trong cải tạo đất trồng [10]

Vũ N guyên Thành và đtg đã phân lập và tuyển chọn được 20 chủng nấm men có hoạt ỉực zym ocin từ các nguồn hoa quả lên men, sản phẩm lên m en truyền thống và từ thiên nhiên Có thể ứng dụng trong bảo quản đồ uống hoặc thực phẩm, sản xuất chất kháng sinh chống nấm trong y h ọ c Nhóm nghiên cứu đã phân loại 17 chủng nấm men V

này dựa vào đọc trình tự ADNr đoạn D1/D2 của 26S, chúng thuộc 7 loài: Pichia canadensis (5 chủng), Candida tenuis (5 chủng), H ansenìaspora uvarum (2 chủng),

Saccharom yces exiguus (1 chủng), Pichia capsulata (1 chủng) Còn 3 chủng có thể

thuộc loài chưa biết, đang được nghiên cứu tiếp [9]

Chu Thị Thanh Bình và đtg đã nghiên cứu nghiên cứu 5 chủng nấm men thuộc

ỉoài Candida tropicalis, có khả năng phân giải xenluloza dùng trong xử lý bã dứa làm

thức ãn chãn nuôi [1]

Vũ N guyên Thành và đtg đã phân lập từ 52 mẫu đất ở các vùng khác nhau của

Việt Nam được 73 chủng nấm men thuộc chi Lipom yces (trong 24 mẫu đất) Một loài mới (5 chủng) đã được mô tả là: Lipom yces orientalis [8],

1.1.3.7 Nghiên cứu nấm men ở Việt Nam

10

H iện nay, khoảng 700 loài nấm men đã được biết D anh sách nay ngày càng được kéo dài nhanh chóng vì mỗi năm có khoảng 50 loài mới được bổ sung Trong thời gian gần đây, việc khám phá th ế giới đa dạng của nấm m en dựa vào sự kết hợp giữa

nghiên cứu hình thái - sinh lý truyền thống với hoá phân loại và các nghiên cứu phát

sinh chủng loại V iệc lập dữ liệu ADNr tham khảo cho tất cả các loài đã biết đã thúc đẩy nhanh quá trình khám phá sự đa dạng tự nhiên [89]

N ấm men không thuộc về một taxon phân loại nào nhất định, chúng có thể thuộc ngành nấm túi (Ascom ycota) hoặc ngành nấm đảm (Basidiom ycota) Hiện nay,

hệ thống học về phân loại nấm vẫn chưa được thống nhất giữa các nhà phân loại Chúng tôi sử dụng các tài liệu tham khảo theo quan điểm của các nhà phân loại nổi tiếng về nấm men như: Fell J w , Kurtzman c p., Robnett c J., Scorzetti G (Mỹ), Boekhout T., (Hà Lan) và Nakase T ( N h ậ t)

A schiascom ycetes không có sợi sinh túi (ascogenous hyphae) và túi (ascoma) Chúng rất đa dạng về hình thái Lớp A schiascom ycetes gồm 4 bộ Schizosaccharom ycetales, Taphrinales, Protom ycetales và Pneum ocystidales với 4 chi dạng toàn vẹn (telem orph)

và 2 chi dạng biến thái (anamorph)

L ớp E u asco m y cetes Bao gồm 2 chi E ndom yces và O osporidium Việc sắp xếp chi Endom yces vào lớp này vẫn còn được tranh cãi Trong cơ chất tự nhiên, chúng

sinh các khuẩn lạc dạng bông, màu trắng với khuẩn ty giả hoặc khuẩn ty thật Túi bào

tử chứa 2-12 bào tử túi dạng mũ và m ở ra nhờ nứt vỡ ở đỉnh Chi O osporidium chỉ có

m ột loài o m argaritiferum có sắc tố từ da cam đến đỏ, đây là đặc điểm phổ biến ở

nấm m en đảm

1.2 Phản loại nấm men

Lớp H em ỉascom ycetes được xem là “nấm m en thật” (true yeasts) Lớp này gồm 11 họ với 43 chi dạng toàn vẹn (teleom orph) và 12 chi dạng biến thái (anam orph),

có xấp xỉ 460 loài,

1.2.2 C ác nấm m en đảm

N ấm m en đảm ít có tác dụng lên men, trong sô hơn 200 loài của nấm men đảm

chỉ có vài loài có khả năng lên men Các nghiên cứu về nấm men đảm của Scorzetti và

đtg cho rằng hiện nay mới chỉ khoảng 1% số nấm men đảm được thu thập và mô tả [77, 89] V iệc phân loại nấm m en đảm chủ yếu dựa vào các đặc điểm như cấu trúc lỗ vách, hình thái đảm , thành phần thành tế bào

Trong m ột số hệ thống phân loại, tất cả nấm men đảm được xếp vào ngành Basidiomycota, gồm 3 lớp: U stilaginom ycetes, U rediniom ycetes và H ym enom ycetes

và các dạng bất toàn của chúng [16, 27, 77, 83, 84, 85, 89] Kirk và đtg (2001) cũng chia ngành B asidiom ycota thành 3 lớp, nhưng đổi tên lóp H ym enom ycetes thành Basidiom ycetes [37]

Trạng thái sợi của các loài thuộc lớp U rediniom ycetes có vách với các lỗ đơn giản, thu nhỏ dần vào giữa lỗ Thường quan sát thấy một lỗ M annoza và glucoza là thành phần chính trong thành tế bào, fucoza và ram noza có thể có nhưng xyloza thì không Các loài nấm m en thuộc lớp này được đặc trưng bởi không sinh các hợp chất giống tinh bột và không có khả năng đồng hoá inozitol [27, 89]

Lớp U stilaginom ycetes đặc trưng bởi cấu trúc vách ngăn lỗ nhỏ (m icropore- Iike), có thể có hoặc không có mép phổng G lucoza, galactoza và m annoza là thành phần chủ yếu trong thành tế bào, không có xyloza Có hoặc không có khả năng đồng hoá inozitol K hông sinh các hợp chất giống tinh bột [27, 89]

Nấm m en của lớp H ym enom ycetes khác với 2 lớp trên ở sự có mặt của vách lỗ dài (dolipore) và thành tế bào chứa glucoza, m annoza và xyloza Inozito! thường đượcđồng hoá và thường sinh các hợp chất giống tinh bột [27, 89], Lớp

H ym enom ycetes bao gồm 4 bộ Trem ellales, T richosporonales, Filobasidales và

Cystofilobasidiales [11].

Các loài nấm men đảm của 3 lớp được xếp vào 9 bộ, 66 chi và khoảng 220 loài [14

12

Các công nghệ làm bia, rượu, bánh mỳ, kêfia và rượu sữa cừu đã xuất hiện từ cách đây hàng nghìn năm, nhưng mãi đến giữa thế kỷ 19 Louis Pasteur mới chứng minh được vai trò thiết yếu của nấm m en trong các quá trình này Nấm men thường

được đại diện bởi loài Saccharom yces cerevisiae cùng với sự sản xuất các đồ uống

chứa cồn M ặc dù vậy, vi sinh vật được thuần hóa chỉ đại diện cho một phần nhỏ tính

đa dạng sinh học rộng lớn và tiềm năng công nghệ sinh học phong phú của nấm men Thực tế, trong các thập niên gần đây, các nghiên cứu về đa dạng trao đổi chất của các nấm men phi truyền thống (NCYs) đã phát hiện ra vô số các đặc tính đầy triển vọng cho công nghệ sinh học (W olf và đtg, 2003) Công nghệ sinh học nấm men bao gồm nhiều quá trình khác nhau liên quan đến hoạt động của tế bào nấm men và các chất trao đổi có trong đổ uống và thực phẩm lên men, các chất hóa học và dược học [22]

1.3.1 N ám men tron g lên men etylic

Khả năng sản xuất các dồ uống chứa cồn của s cerevisiae đã được khai thác

trong nhiều th ế kíí M ối quan tâm phổ biến trên toàn thế giới hiện nay là việc sử dụng cồn (cồn sinh học) làm nhiên liệu thay thế cho một phần hay toàn phần xăng dầu cho các động cơ, Ư u điểm của cồn sinh học là nguồn năng lượng không gây ô nhiễm Ngoài ra, việc sử dụng cồn sinh học được tiết kiệm khi giá thành của cơ chất lên men thấp Vào thập kỷ 90, Brazin có k ế hoạch sản xuất 1.000 triệu lít cồn/ năm Mỹ và Canada có dự án sản xuất cồn từ tinh bột ngô hoặc dịch thải sunphit, công suất trên 3 tỉ lít cồn/nãm Sự biến đổi xenluloza và hem ixenluloza thành cồn sinh học được nghiên

cứu với các loài nấm m en C andida shehatae, Pichia stipitis và Pachysolen tannophilus.

Nhiều nấm m en sản xuất ra các rưẹru có chỉ sô' hydro khác nhau như glycerol,

erytritol, m annitoỉ, xylitol và arabinitol G lycerol hiện nay được sản xuất nhờ s cerevisiae được sử dụng rộng rãi trong việc tổng hợp các chất dẻo, dược phẩm, mỹ phẩm và kem đánh răng Sản xuất m annitol nhờ c m agnoliae và các chủng biến đổi di truyền cua loài s cerevỉsiae sản xuất xylitol từ c guillierm ondii và sản xuất arabinitol nhờ c entom aea và p guiỉlierm ondi Cả 3 loai rượu này có thể được sử

dụng như chất làm ngọt trong bánh kẹo, bánh quy, nước ngọt và m àng dược phẩm [22]

1,3.2 C ác nấm m en là các nhà sản xu ất protein đơn bào

1.3 ứng dụng của nấm men trong đời sống

Nhiều nấm men được sử dụng làm nguồn protein đcm bào, làm chất bổ sung cho

chăn nuôi (5 cerevisiae, Yarrowia lipolytica hoặc m ột số loài trong chi C andida, chi Hansenula và Saccharom ycopsis) Nhiều chất thải công nông nghiệp được dùng làm

các cơ chất cho quá trình sản xuất protein đơn bào (tinh bột từ khoai tây, nhũ thanh-

lactoserum .) [22].

1.3.3 Các nấm men n h ư nguồn sản xu ất các sản ph ẩm công nghiệp khác

C ác enzym So với nấm (ví dụ Aspergillus niger) và vi khuẩn (ví dụ Bacillus spp.),

nấm men không là nguồn sản sinh mạnh mẽ các enzym dùng trong công nghiệp Tuy nhiên, vẫn có một số loài có khả năng sản xuất enzym dùng trong công nghiệp

Proteaza nấm m en từ loài s fibu lig era được nghiên cứu rộng rãi để ứng dụng

vào các công nghiệp thực phẩm và đồ uống

A m ylaza để sản xuất kẹo và mứt (a-am ylaza, glucoam ylaza và cyclodextrinaza)

được sản xuất bởi các loài thuộc chi Sơccharom yces, C a ndida, Fiiobasidium , Lipom yces và Schxvanniom yces Ngoài ra, việc sử dụng các kĩ thuật ADN tái tổ hợp cho phép nhân dòng các gen glucoam ylaza từ Schw anniom yces spp và s (dìastaticus) cerevisiae 5 biến nạp vào các chủng nấm men sản xuất bia (W alker 1998).

M ột ứng dụng có ý nghĩa kinh tế quan trọng của inulinaza của một số nấm men

cho tổng hợp cồn sinh học hoặc fructoza (K iuyverom yces m arxiam is, c salm anticensis

và D ebaryom yces).

Pectinaza từ các nấm m en c norvegensis, Cryprococcus aìbidus, K m arxianus,

s cerevisiae và s pastorianus đã được nghiên cứu cho các ứng dụng công nghiệp Lipaza từ Y lipolytica, Cr curvata, c deform ans, và Rhodotorulơ gluíinis

được nghiên cứu để ứng dụng trong công nghiệp xử lý dầu và chất béo, trong các châ't tẩy rửa quần áo và trong công nghiệp thực phẩm

Các enzym khác đã được tìm thấy ở nấm m en như xenlulaza từ Aureobasidiitm pullulans', |3-glucosidaza từ D ekkera interm edia và c interm edia {K ceììobiovorus)- phenylalanine am m onium lyaza từ C ryptococcus và Trichosporon spp Trong những

năm gần đày, các nấm m en biến đổi về di truyển có các hoạt tính enzym dùng trong

14

công nghiệp được phát triển nhanh chóng Đã bắt đầu sản xuất lipaza từ c rugosa và ỵ

lipolytica, invertaza từ s cerevisiae.

L ip it M ột số nấm m en thuộc chi Candida, C ryptococcus, Endom ycopsis,

Hansenula, Lipom yces được tìm thấy có tích lũy lipit nội bào dưới dạng các vi giọt

Các loại lipit khác cũng được sản xuất bởi nấm men như sophorolipit từ R (C.) bogoriensis và c bom bicoìa, các lipit kiểu bơ cacao từ Cr curvơrus và este béo của rượu đa chức từ R gram inis và A pullulans.

C a ro te n o it Phaffia rhodozym a là nấm men đảm sinh loại carotenoit có thể ứng

dụng trong các ngành công nghiệp dược, hóa thực phẩm và thức ăn gia súc, sản sinh astaxanthin dùng làm chất bổ sung trong thức ãn nuôi cá hồi Ngoài ra còn có một số

loài thuộc các chi Rhodotoruỉa, Sporobolom yces, Rhodoloriila và Sporobolom yces sản

xuất ra các carotenoit như (3-carotene, Y-carotene, torulene và torularhodin

Các hợp chất tạo m ùi Nhiểu nấm men có thể sản sinh các hợp chất hữu cơ dễ

bay hơi được khai thác làm chất mùi cho các ứng dụng hóa học, dược học, mỹ phẩm,

thực phẩm, thức ăn gia súc như m ột số nấm men túi D hanseniì, G eotrichum candidum,

K lactis, s cerevisiae và Y lipolytica sản xuất terpen từ Am brosiozym a m onospora và lacton từ Candida spp., K lactis, T orulaspora delbrueckii, Sporoboỉom yces odorits và

C ác a x ít h ữ u cơ N ấm m en được ứng dụng vào sản xuất một số axít hữu cơ như citric, a-ketoglutaric, itaconic hay axít gluconic dùng trong cổng nghiệp thực phẩm và

y dược Axít xitric được tổng hợp từ các loài như Y ìipoỉyttca, c zeylanoides, c boidinii và c (citrica) tropical is; axit gluconic từ Saccharom ycopsis spp và A

p u ỉlu la n s; axit fum aric từ c (hydrocarbofum arica) bỉankii và axit isoxitric từ c

(brum ptii) catenulata', axit lactic từ K therm otolerans; axit m alic bởi c lit I is, p

membranifaciens và A pullulans.

C ác p o ly s a c c a rit ngoại bào Các polysaccarit ngoại bào nấm men bao gồm (1—>6)-glucan, m annan, galactom annan và pseudonigeran Các polysaccarit ngoại bào khác được sản xuất bởi các nấm men, gồm các phosphom annan từ Pichia spp,

H ansenula spp và Pachysolen spp.; các glycolipit từ Y lipoỉytica và c bom bicola Sự tổng hợp pullulan, 1 a-glucan có liên kết a - ( l —>6) với các đơn vị maltotriozơ, bởi A pullulans, được dùng làm màng thực phẩm Trong nhũng nãm gần đây 3 -glucan tách

từ thành tế bào nấm m en rượu được quan tâm đặc biệt do khả nàng ứng dụng trong nhiều ngành khác nhau Trong y học, p -glucan là m ột chất tãng cường đáp ứng miễn

dịch, do đó giúp cơ thể chống lại bệnh nhiễm trùng £ -glucan cũng là chất chống oxy

hoá, nên có khả năng chống u Trong nuôi trổng thuỷ sản 3 -glucan được bổ sung vào thức ăn để kích thích hệ m iễn dịch chống nhiều loại vi sinh vật gây bệnh thường gặp,

kháng vi khuẩn và được xem là “probiotic dược” hay “liệu pháp sinh học trị liệu” [22],

1.3.5 N ám men dù n g tron g chuyển hoá sinh học (bioconversion).

N ấm m en có thể thưc hiện các phản ứng hoá học rất tinh vi, vượt ra ngoài khả năng của hoá học hữu cơ mang lại hiệu quả kinh tế cao vì rút ngấn được các bước tổng hợp hoá học V í dụ, để chuyển hóa steroid có thể từ sterol (tách từ bã đậu tương, bã giấy hay bã m ía^ n h ờ nấm m en có thể chuyển hoá thành các chất trung gian như AD và 9- ° -hydroxyA D Phản ứng xảy ra ở nhiệt độ và áp suất bình thường VỚI dung môi là nước Từ AD, bằng m ột vài bước phản ứng hoá học có thể tạo ra các cortisteroit như hydrocortizon, predtisolon dùng làm thuốc chống viêm và thuốc ức ch ế miễm dịch, testosteron điều trị thiểu năng sinh dục, progestagen là thuốc tránh thai Từ 9- ° - hydroxyA D tổng hợp nhiều chất chống viêm như dexam ethason, triam cinolon [22],

16

1.3.6 S ử dụ n g nấm m en đ ể hạn c h ế bệnh sau thu hoạch ở trá i cáy và ngũ cốc

Sự thối hỏng trái cây, rau và ngũ cốc sau thu hoạch đã gây ra thiệt hại to lớn cho

nông nghiệp Bảo quản bằng xử lý hóa học có thể m ang lại các nguy cơ về sức khỏe và

m ôi trường Để ngãn chặn sự hư hỏng do nấm có thể dựa vào việc xử lý bề mặt kho dự

trữ với các nấm m en đối kháng Một số chủng của các loài nấm men khác nhau, như C oleophila, c laurentii, D hansenii, M etschnikow ia pulcherrim a, p anom aia và p guiltierm ondii, đã được nghiên cứu như là các tác nhân điều khiển sinh học của bệnh

postharvest do nấm gây ra ở trái cây và ngũ cốc [22]

1.3.7 N ấm men là các tác nhân phục hồi sinh học

M ột số nấm m en cũng có khả nãng phân giải các chất ô nhiễm tổng hợp có nguồn gốc từ các hoạt động công nghiệp [22],

N ấm m en g iú p x ử lý sự cố tr à n d ầu Nhiều loài nấm men dồng hóa được

hydrocacbon thuộc về các chi Candida, C lavispora, D ebaryom vces, Leucosporidium, Lodderom yces, M etschnikow ia, Pichia, Rhodosporidium , Rhodoĩorula, Sporidioboỉus, Sporobolom yces, Stephanoascus, Trỉchosporon và Yarrowia.

N ấm m e n -c h ấ t h ấ p th ụ sinh học Nấm men cũng được nghiên cứu như các tác

nhân hấp thụ sinh học các kim loại nặng hay các chất phóng xạ s cerevisiae được sử

dụng trong màng lọc vi sinh vật để loại bỏ các ion kim loại nặng, N i2+, Cu2+ và Pb2+

Nấm m en dùng đé phân hủy các họp chất hữu cơ nhóm chất thơm.

Aureobasỉdium , Rhodotorula và Trichosporon có khả năng sinh trưởng khi có mặt

phenol vì có khả năng đổng hoá chất này

N ấm m en d ù n g ch o tẩ y m à u th u ố c n h u ộ m V iệc thải các thuốc nhuộm tổng hợp vào môi trường đang gây ra những vấn đề nghiêm trọng về an toàn sinh thái Đa số các thuốc nhuộm tổng hợp khi xử lý theo hướng vật lý hoặc hóa học thường tạo ra các

chất độc Nấm G eoỉrichum candidưm có khả năng tẩy màu 21 loại thuốc nhuộm thuộc

nhóm azo và anthraquinon

1.3.8 C ải biến nấm men bằng đột biến, lai thé nguỵén sình và k ĩ thuật A O N tái tổ

JRUNG TÀM TH0NGTINTH1 Ư VIEN

17

N ấm m en biến đổi di truyền có các đặc tính công nghệ quan trọng: (1) việc đưa

gen STA2 glucoam ylaza từ s (diastaticus) cerevisiae đã tăng cường khả năng của s

cerevisiae khi lên men polysaccarit; (2) việc bổ sung gen a-acetolactat decarboxylaza từ Enterobacter aerogenes cho phép sản xuất các bia màu hiệu suất cao nhờ các nấm men

tích lũy diacetyl; (3) bao gồm gen m ã hóa ngược m alolactic từ Lactobacillus deibrueckii làm cho các chủng s cerevỉsiae sản xuất ra rượu ít chua hơn và có mùi thơm hơn Chủng

s cerevisiae được chuyển gen a-glucosidaza từ thực vật sang đã mang lại nhiều đặc tính

mong muốn Việc sử dụng các kĩ thuật ADN tái tổ hợp để chuyển dạng các nấm men

không thuộc chi Saccharom yces như Candida spp., H ansenula spp., Kỉuvveromyces spp., Pichia spp, và Yarrowia spp đang được triển khai [22],

1.3.9 D ù n g n ấ m m en làm sin h vật biểu hiện A D N tái tổ hợp

K hả năng biểu hiện các gen ngoại lai trong nấm men để sản xuất các phân tử có

giá trị chữa bệnh mang lại tiềm năng quý giá cho công nghiệp dược phẩm Nấm men s

cerevisiae được nghiên cứu phổ biến nhất cho việc biểu hiện gen ngoại lai Trong thực tế,

các gen m ã hóa cho các protein ngoại lai được phổ biến trong các dược phẩm mới và các sản phẩm thực phẩm mới Một con số đáng kể các protein ngoại lai quan trọng trong y

học được biểu hiện bởi s cerevisiae Các loài khác ngoài s cerevisiae như p pastoris

và P angusta (H polym orpha) cũng đã được chấp nhận cho biểu hiện gen ngoại lai Khả

năng sản xuất hormon, kháng nguyên và enzym nhờ nấm men ở quy mô phòng thínghiệm hoặc công nghiệp đang được nghiên cứu [22]

18

1.4, CÁC CHỈ TEÊU ĐƯỢC SỬDỤNG TRONG PHÂN LOẠI NẤM MEN

Các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa, hóa phân loại được coi là chỉ tiêu phân loại thông thường cho nấm men, còn các chỉ tiêu dùng cho phân loại cấp độ sâu nhưxác định loài và loài mới thì cần dựa vào khả năng lai và tính tương đồng của phân tử

ADN [46,98],

1.4.1 Các đặc điểm hình thái và nuôi cấy

• Sự tạo thành các bào tử túi

• Sự tạo thành bào tử đảm / bào tử teliospore

• Sự tạo thành bào tử bắn

• Sự tạo thành bào tử đốt

• Sự tạo thành khuẩn ty (khuẩn ty giả / khuẩn ty thật)

• Sự tạo thành các nội bào tử vô tính

• Sự tạo thành bào tử áo

• Sự tạo thành các ống m ầm

• N hân nhuộm

• Sinh trưởng trên môi trường dịch thể

• Sinh trưởng trên môi trường đặc

Các đặc điểm về hình thái là một trong những tiêu chí quan trọng trong phân loại vi sinh vật Hình thái của tế bào sinh dưỡng thường được sử dụng trong đơn vị phân loại đến họ H ình thái của các túi bào tử (asci) và hình thái của các bào tử túi (ascus) được sử dụng trong phân loại đến chi và loài Hình thái của khuấn ty giả và bào

tử áo cũng là những chỉ tiêu phân loại có giá trị khi phân loại

1.4.2 Các đặc điểm sinh lý sinh hoá

• K hả năng kháng axit acetic (1 %)

• Sự sinh axit từ glucoza

• K hả năng đồng hóa các hợp chất mtơ

19

• K hả năng đồng hóa các hợp chất cacbon

• Thử nghiệm C anavalin-glyxin-X anh brom otym ol

• K hả năng kháng cyclohexim it

• Phản ứng màu với xanh Diazon B (DBB)

• Phân giải lipit.

• K hả nãng lên m en đường

• Khả aăng hoá lỏng gelatin

• Khả năng sinh trưởng trong môi trường glucoza nồng độ 50% , 60%

• Khả năng sinh trưởng trong mỏi trường không có vitamin, trong môi trựờng có vitamin cần cho sinh trưởng

• K hả năng sinh trưởng ở 37f,C; ở nhiệt độ giới hạn cao nhất cho sinh trưởng

• K hả năng tổng hợp m elanin trong mối trường DOPA

• K hả năng thử nghiệm sinh trưởng trên môi trường chứa 10% NaCl và 5%

glucoza

• K hả năng phân giải arbutin

• K hả năng tạo thành tinh bột

• K hả năng sinh trưởng trong môi trường có chất chỉ thị tetrazoli

• Khả năng thuỷ phân urê

1.4.3 Các đặc điểm hoá phân loại và sinh học phân tử

• Thành phần axit béo của tế bào

• Các phương pháp huyết thanh học

• Khối phổ hồng ngoại của m annan thành tế bào

• Phân tích trình tự ARN riboxom / ADN riboxom:

V ùng A D N r 18S, ADN r 25/26S, vùng ITS, vùng ETS

• X ác định trình tự của các gen khác

1.4.4 C ác bước định danh

Định danh loài dựa trên hai phương pháp: Phân loại thông thường và sử dụng số liệu về trình tự ADNr.

1.4.4.1 Phư ơng p h á p ph â n loại thông thường

Các thí nghiệm thông thường(các đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa) .

Lựa chọn các thí nghiệm cho phân loại ( chuyên khảo / chương trình máy tính)

ị

Nghiên cứu hoá phãn loại

ị

Lai A DN-ADN

Hình 1 Các bước tiến hành trong phương pháp phản loại th ô n g thường

1.4.4.2 Phương p h á p sử dụng s ố liệu về trinh tự A D N r

Lai A D N -A D N các loài trong nhóm

Hình 2 Các bước trong phương pháp sử dụng sò liệu trình tự ADNr

1.4.5 Các chỉ tiêu dùng trong phân loại hiện đại

1.4.5.1 H oá p h â n loại

a- Phân tích hệ thống ubiquinon

Crane và đtg đã m ô tả và đặt tên cho các ubiquinon (coenzym Q) là các chất

m ang quan trọng trong chuỗi vận chuyển điện tử của các hệ thống hô hấp ở ty thể Cấu trúc của các ubiquinon bao gồm một nhóm 5, 6-dim ethoxytoluquinon và những chuỗi

bên polyisoprenoit với chiều dài khác nhau tại vị trí thứ 6 của vòng benzen Các dạng

ubiquinon được xác định gồm: Q-6, Q-7, Q-8, Q-9 v àQ -1 0 và dạng đồng đảng có chuỗi bên isoprenoit khử nước được ký hiệu là Q-IO (H 2), các tên được đậi theo số dơn

vị isoprenoit ở chuỗi bên Số lượng của các đơn vị isopren rất khác nhau, nhung mỗi loài chỉ có m ột loại ubiquinon đặc trưng, loại này thường chiếm 90% tổng số ubiquinon và dược coi là ubiquinon chính Hệ thống ubiquinon là tiêu chuẩn phân loại nấm men có hiệu quả ở mức độ chi [20, 89, 96, 97]

b Phân tích thành phẩn đường trong rê'bào.

N hà hoá học người Pháp Henri Braconnot đã sử dụng thành phần carbohydrat trong nghiên cứu tính chất của nấm cách đây gần 200 năm Việc so sánh thành phần polysaccarit cấu tạo nên thành tế bào, có tầm quan trọng lớn trong việc phân loại nấm men Các đặc điểm của cấu tạo thành tế bào có thể phân biệt định loại ở mức độ chi hoặc trên chi [74] Prillinger và đtg đã phân biệt 7 loại thành tế bào trong nấm men dựa vào các phân tích định tính và định lượng Các tác giả cho rằng thành tế bào trong nấm túi chứa glucoza, m annoza, galactoza chiếm tỷ lệ thấp [73] K itin thường có trong nấm túi nhưng ở tỷ lệ thấp (<2%) Trong khi đó ở nấm men đảm tý lệ kitin thường cao hơn (lên đến 10%) Sự có mặt hay không của xyloza trong thành tế bào hoặc trong dịch thuỷ phân tế bào đóng vai trò quan trọng trong việc phân biệt các nấm men đảm ở cấp

độ chi và trên chi Theo von Arx và W eijim an (1979) có thể phân chia các nấm men dị đảm dạng sợi ở mức họ dựa vào sự có hay không có xyloza Họ Filobasidiaceae dược đậc trưng bởi chứa xyloza Họ Sporobolomycetaceae được đặc trung bởi không chứa xyloza [89] Sau này Nakase và đtg cũng chứng minh vai trò của thành phần cấu tạo thành tế bào, đặc biệt là sự có hay không có mặt của xyloza cùng các đặc điểm khác như loại CoQ và cấu trúc vách ngăn trong việc phân loại nấm men sinh bào tử bấn [57, 64],

22

được gọi là tỷ số bazơ, thường được biểu diễn bẳng tỷ lệ % các bazơ G và c Tý số này

rất khác ở các sinh vật khác nhau, nhưng ở mỗi loài lại là một hằng số, Đặc trưng này được coi như m ột tiêu chí về hóa phân loại dược dùng trong phân loại đến loài [21, 89], Thành phần bazơ ADN là sự phản ánh của mối quan hệ phát sinh chủng loại Hàm

lượng G+C dao động lớn giữa các nhóm nấm men: nấm túi có tỷ lệ G+C khoảng 28-

50 %, trong khi nấm đảm là 50-70% Các chủng có hàm lượng G +C khác nhau từ 2-

2,5 % được xem là các loài khác biệt, tuy nhiên giá trị G +C giống nhau không biểu thị

mối quan hệ họ hàng gần gũi [46, 89]

I.4.5.2 Sinh học ph â n tử

M ột nhân tố quan trọng dùng làm căn cứ cho các nghiên cứu sinh thái nấm men

là việc định tên loài chính xác trong hệ sinh thái Trước khi ra đời ký nguyên phân loại nấm men nhờ sử dụng các trình tự gen và các tiêu chuẩn sinh học phân tử khác thì việc xác định loài chỉ dựa trên các đặc điểm kiêu hình M ặc dù kiểu hình đôi khi được sử dụng để xác định loài một cách chính xác, nhưng khi so sánh với phương pháp phân tử cho thấy nhiều xác định trước kia dựa trên kiểu hình là không chính xác Điéu này không có nghĩa là việc nghiên cứu trước dây trong sinh thái nấm men là không có giá trị, m à cần phải nói rằng các kết luận đã rút ra từ việc nghiên cứu đó có thế phái được kiểm tra lại bằng việc xác định loài chính xác [46]

a- Xác định trình tự A D N

Khi hai quần thể tách biệt nhau sẽ không thể giao phối VỚI nhau thì sẽ không

có sự trao đổi gen với nhau Nếu như có dột biến xảy ra trong quần thê này thì khống

có nghĩa đột biến tương tự sẽ xảy ra trong quần thể thứ hai Trải qua thời gian, sự khác biệt về gen (nghĩa là những khác biệt về trình tự ADN) giữa hai quần thê tăng dần Khi

sự khác biệt này đủ lớn, hai quần thể này sẽ tách biệt nhau và hình thành các loài mới

Để xem xét m ối quan hệ di truyền giữa hai quần thể, trước tiên cần so sánh trinh tự ADN của mỗi cá thể trong quần thể đó [7, 23, 46].

Cảc trình tự A R N r và các vùng m ã hoá của nó (ADNr) được sử dụng phổ biến

trong những năm gần đây để đánh giá sự đa dạng và mối quan hệ họ hàng giữa các loài sinh vật Tính hiệu quả của việc so sánh trình tự ARNr/ ADNr xuất phát từ 2 dặc

tính quan trọng: (1) Các riboxom có mặt ở tất cả các sinh vật có cấu tạo tế bào và xuất

hiện từ cùng m ột nguồn gốc tiến hoá, do vậy tất cả các sinh vật đều có bầng chứng lịch

sử phân t ử ; (2) M ột số trình tự A RN r/A D N r được bảo tồn đầy đủ ở tất cả các sinh vật,

do vậy cho phép liên kết sự so sánh các vùng ít bảo thủ hơn được dùng để đánh giá mối

quan hệ tiến hoá Các gen m ã hoá cho các A R N r lớn (25S-28S), A R N r nhỏ (18S) và

ARNr 5,8S được sắp xếp theo trật tự trước sau với khoảng từ 100 đến 200 bản sao Gen

ARNr 5S sao chép tách biệt có thẻ cũng ở trong đoạn lập lại Việc so sánh trình tự gen

của ARNr đóng vai trò quan trọng hàng đầu trong định loại nấm men [89]

Hình 3 Cấu trúc nhóm gen A R N r

Trên ADNr, cấu trúc nhóm gen mã hóa cho ARNr được chia thành các vùng:

Vùng m ã hóa gồm các gen được sắp xếp theo trật tự là 18S, 5,8S, 26S (Large subunit A RN ) và 5S Các gen này tập hợp lại thành đơn vị phiên mã A RN r (rRNA transcription unit)

Vùng không m ã hóa gồm các đoạn trình tự IGS (Inter - Genic Spacer) được chia làm hai vùng: NTS (N on-Transcripbed Spacer) và ETS (Externally Transcripbed Spacer) nằm tiếp nối giữa 5S và 18S k ế tiếp sau Vùng không mã hóa khác nữa gồm

ITS1 nằm giữa hai gen 18S và 5,8S và ITS2 nằm giữa gen 5,8S và 26S.

Các vùng không m ã hóa cũng được phiên m ã là ITS và ETS còn vùng không mã hóa cũng không được sao chép là vùng NTS

Sản phẩm của gen 18S (là ARN) kết hợp với các phân tử protein để hình thành tiểu

24

phần nhỏ của riboxom sản phẩm của gen 5,8S, gen 5S và 26S kết hợp với các phân tử protein để hình thành tiểu phần lớn của riboxom [41],

V iệc đọc trình tự gen dược xem là một phương pháp nhanh chóng để nhận biết loài và giải quyết không hạn chế đối với các taxa có quan hệ họ hàng gần

" I tsmfC'htMikM o rttin iith r, ì

- G ntnnionìyKuri ịftio !rn :lin n i

-C

, - P s trtíú ữ ih ts c ìm iĩt b o yơ iỉ

ỉ - M/CIVŨSCUS cU rosus GlomoreHa c in g u la ta

Ẹ rem V&cuế ù lb iti

2

- ĂscoSộhềửtõ ê»í>-5 1

Thof/m m aGus c ro s ỉa c m is

T íiiã ro m yce s llđ vu s MonaổCUS (ĩu ip íỉro u s Pem cH liuỉn n a ííiiư m

ã yssoch /on yys nlvữẽ

A ịp à tợ U u s ỉú ỡ ĩiợ à h rs 3

- ÀĩpậểỌỈtlưì ỉtxrứgohrt 2

A & p Q iỳ ĩtiu t fu ffiig h tu s 1 ty d V ? G S i& t.h u ttttũ ff.M ỊM fih » ĩ I- ift.h )? < ìịw tJ liifu fii'/ơ tà (tỉ/M hếỉ y

tru e

h íih id io m v c c tc s

Glomus tfilfflteiJMS G'rgii&pQfa m à tg ã íitâ

M ucóS M C e n io s u i Bifliforjpdioih omỹrgonit

A D N r 18S Các nhà phân loại học đã sử dụng trình tự ADNr 18S đê đánh giá

sự phát sinh loài V ùng m ã hoá A D N r 18S đủ lớn và chứa các vùng rất báo thủ cũng như các vùng biến đổi V iệc xác định trình tự A D N r I8S cho phép đánh giá mối quan hệ họ hàng củ a các sinh vật từ cấp ngành đến loài V iệc xếp theo trình tự có thể đặt các sinh vật sống vào m ột cây phả hệ V ào nãm 1992, Berbee và Taylor đã phân tích m ột s ố lượng lớn trình tự A D N r 18S của nấm túi, nấm đảm , nấm tiếp hợp

và nấm sinh bào tử túi (A scom ycetes, B asidiom ycetes, T ygom ycetes và

Chytridiom ycetes) kết hợp với các báo cáo nấm hoá thạch thu được và suy ra lịch sử tiến hoá của nấm .

Việc giải trình tự A DN r 18S dược sử dụng rộng rãi để đánh giá mối quan hệ họ hàng giữa các nấm m en túi cũng như các nấm men đảm Rất hiệu quả khi kết hợp với các đặc trưng khác như hàm lượng G+C, loại CoQ và thành phần cấu tạo thành tế bào

để phân loại nấm m en có hình thành bào tử bắn Tuy nhiên, hiệu quả sử dụng của các trình tự ADN r 18S bị cản trở do thiếu cơ sở dữ liệu sẵn có Với kỹ thuật giải trình tự hiện nay, toàn bộ 1800 nucleotit của ADNr 18S vẫn còn tương đối lớn đế dùng cho phép định loại loài thông thường [46],

T r ìn h tự A D N r 26S đ o ạ n D1/D2 Một thành tựu mới đây trong nghiên cứu đa dạng sinh học nấm m en là việc thiết lập một cơ sở dữ liệu của các trình tự ADNr 26S đoạn D 1/D 2 cho tất cả các loài nấm men đã biết Tính toàn nãng của cơ sở dữ liệu cho phép so sánh bất kỳ m ột loài mới phân lập được với tất cả các loài đã biết, và do vậy bất kỳ loài nghi n gờ mới nào cũng có thể được phát hiện dễ dàng Điều này đã thúc đẩy việc nghiên cứu đa dạng sinh học phát triển trong những năm gần đày, Phần lớn cơ sở

dữ liệu này được đóng góp bởi K urtzm an và Robnett (1998) đã đọc trình tư cả đoạn 1

và 2 (khoảng 600 nucleotit) của A DN r 26S với các nấm men túi, còn nấm men đãm là

do Fell và đtg (2000), sau đó là Scorzetti và đtg (2002) hoàn thiện Phần D1/D2 của ADNr 26S được chọn do đoạn này thích hợp cho việc đánh giá về các chi và loài Các kết quả giải trình tự trên diện rộng này về cơ bản đã sắp xếp lai hệ thống nấm men bằng cách chỉ ra những loài cùng tên (đồng nghĩa, giống nhau), mối quan hệ họ hàng giữa các dạng hình thái toàn vẹn (teleom orph), hình thái biến đổi (anam orph) và tính hỗn tạp của m ột số chi [27, 46, 47, 48, 77]

V iệc phân loại dựa vào đoạn D1/D2 được đánh giá bằng việc so sánh các taxon

26

có quan hộ họ hàng gần nhờ lai di truyền và tái tổ hợp ADN Nói chung, các chủng của

cùng 1 loài khác nhau không quá 0 '3 nucleotit (0-0.5% ), và các chủng có từ 6 hoặc hơn 6 nucleotit khác nhau (1% ) là các loài tách biệt Các chủng có sự khác biệt ở giữa khoảng đó có khả năng là các loài khác nhau Một vai trò của dữ liệu D1/D2 là đẽ xác

định số lượng lớn các loài mới, kết quả là đã có gần gấp đỏi số lượng loài đã biết kể từ

khi xuất bản sách The yeasts, a taxonomic study (K urtzm an và Fell 1998) tái bán gần

đây nhất M ột cách sử dụng khác mà các nhà khoa học không thuộc lĩnh vực phân loại

có thể xác định nhanh chóng và chính xác hầu hết các loài đã biết cũng như nhận biết các loài mới, bằng cách đọc trình tự khoảng 600 nucleotit và sử dụng BLAST tìm kiếm trên GenBank [46, 89]

A D N r IT S Vùng này nằm giữa ADNr 18S và A DN r 26S, có kích thước khoảng

500 bp Các vùng ITS1 và ITS2 bị chia cắt bởi gen 5.8S của rADN cũng có hiệu quả cho xác định loài Nhưng đối với một số loài, các trình tự ITS có khá nãng xác định loài kém hiệu quả so với vùng D1/D2 [35, 49] Scorzetti và đtg (2002) đã cho rang việc phân loại nhiều loài nấm men đảm dựa vào trình tự ITS tốt hơn so với dùng D1/D2 Berbee và đtg (1995); Fell và đtg (2000) đã sử dụng trình tự vùng ITS như một thước

đo phân loại hữu ích, do vùng này có tý lệ sai khác cao hơn hản so với các vùng ADNr 18S và 26S Fell và đtg (2000); Sugita và đtg (1999 a,b) cũng dã chứng minh rằng tý lệ nucleotit trong vùng ITS ở cùng một loài thường khác nhau nhỏ hơn 1% [12, 27, 79, 82] N hư vậy sẽ hiệu quả hem khi đọc trình tự kết hợp cả D1/D2 và ITS trong so sánh các loài có quan hệ họ hàng gần [46]

b- Phân tích sự p h á t sinh chủng loại

Sau khi tiến hành các kỹ thuật xác định trình tự ADN, người ta sẽ phân tích mối quan hệ giữa các sinh vật dựa trên lý thuyết tiến hóa và dựng cây phá hệ Cây phả hệ được xây dựng trên nguyên tắc: sử dụng m ã di truyền lấy từ protein loài khác đế xác định số iượng nucleotit thay thế thấp nhất của gen cần biết trẽn phân tử ADN và sử dụng chương trình ứng dụng m áy tính xác định đường dẫn ngắn nhất liên kết các phân tử với nhau [51]

Cây phả hộ là cấu trúc dữ liệu lưu trữ thông tin về mối quan hệ của một số trình

tự và mối quan hệ này được đo bằng mức độ tương đồng về sinh học Ví dụ như độ tương đổng trình tự được tính bằng sự sắp hàng hai hay nhiểu trình tự trong tổng sỏ' các

đoạn trình tự được sắp xếp Do đó, cây phả hộ chính là cách đơn giản dể sắp xếp dữ

liệu có sẩn giữa vô số các đoạn trình tự xếp hàng trong cây phả hộ Công việc này giúp

ích rất nhiều cho các nhà sinh học vì nó tổ chức các đoạn trình tự thành nhóm theo lịch

sử tiến hóa Theo cách dựng cây phả hệ thì mỗi một nút thể hiện cho một tổ tiên chung, khoảng cách từ các nhánh đến tổ tiên chung chính là mức độ khoảng cách tiến hóa giữa các nhánh.

Hình 1.14 là sơ đồ biểu diễn sự sắp xếp dữ liệu trong cây phả hệ Cây phả hệ thứ nhất khác cây phả hệ thứ hai ở chỗ trình tự thứ 4 có mối liên hệ gần với các trình tự khác trong cây hơn (z, < Z 2) Mức độ tiến hóa giữa các trình tự thứ 1, thứ 2 như nhau thể hiện ở khoảng cách đường nối phân nhánh tới chúng (X| = x2) và trình tự thứ 3 có

mối liên hệ gần vói hai trình tự này (Yi = y2).

Hình 5 Sơ đồ biểu diễn cây phả hệ

Trong phân loại học phân tử hiện nay, việc dựng cây phả hệ giúp các nhà khoa học có thể thấy được toàn cảnh phân bố loài, dễ dàng xác định vị trí loài mới, thuận lợi hơn trong quá trinh nghiên cứu

28