Kĩ thuật tạo vector tái tổ hợp

Vector chuyển gen là 1 đoạn phân tử DNA nhỏ có khả năng mang 1 đoạn DNA ngoại lai cần thiết và khi xâm nhập vào tế bào chủ thì có khả năng tự tái bản không phụ thuộc vào sự sao chép của

NHÓM CÁC PHƯƠNG PHÁP KĨ THUẬT SINH HỌC

Chủ Đề: Kĩ Thuật Tạo Vector Tái Tổ Hợp

KHÁI QUÁT CHUNG

Vector tái tổ hợp Phần mở đầu

Vector biểu hiện Gen.

Nội dung 02

CÁC KĨ THUẬT CHỦ YẾU

CÁC KĨ THUẬT CHỦ YẾU

- Là CN cốt lõi của CNSH hiện đại được ra đời từ 1977 Bao gồm các kĩ thuật thực hiện trên axit Nucleic, nhằm nghiên cứu cấu trúc gen, điều chỉnh và biến đổi gen

KỸ THUẬ

T GEN

+ Kĩ thuật tách chiết gen

+ Nhân dòng gen + Xác định trình tự gen

+ Thiết kế các vecto chuyển gen

+ Biểu hiện gen ở cơ thể nhân.

là sự ghép nối hay biến đổi có định hướng gen và bộ gen tạo ra các gen , bộ gen mới, để tạo protein tái tổ hợp hoặc hình thành nên những đặc điểm , tính trạng mới của sinh vật theo mong muốn của con người

BẢN CHẤT KỸ THUẬT GEN

PHẦN MỞ

ĐẦU

Khái niệm :

Vector là phân tử DNA nhỏ( ngắn) dạng

thẳng hoặc dạng vòng , trong đó người ta

sẽ cài 1 mảnh DNA ( gen quý) cần nghiên

cứu

Vector chuyển gen là 1 đoạn phân tử DNA

nhỏ có khả năng mang 1 đoạn DNA ngoại

lai cần thiết và khi xâm nhập vào tế bào chủ

thì có khả năng tự tái bản không phụ thuộc

vào sự sao chép của tế bào chủ

Vector chuyển gen

Đặc điểm :

-Vector chuyển gen phải có điểm khởi đầu sao chép để tự sao chép mà tồn tại độc lập trong tế bào.

-Có các đoạn trình tự nhận biết cho emzym giới hạn cắt rồi để hở tạo nơi lắp ráp.

-Có đoạn trình tự khởi điểm ( pranoter).

- Có dấu chuẩn chọn lọc để dễ dàng phát hiện nhận biết trong tế bào chủ nhận là các gen kháng sinh chất, hoặc gen tổng hợp chất màu.

Vector chuyển gen

+ Chứa các đoạn gen vô hiệu hóa

các đoạn DNA không mong muốn

+ Có khả năng tạo ra nhiều bản

sao nhằm có số lượng lớn, đảm

bảo sự khuếch đại của gen.

Các đặc tính quan trọng

- Vector plasmid:

+ Plasmid là những phân tử DNA có kích thước nhỏ (2-5kb), dạng vòng, nằm độc lập trong tế bào chất, có khả năng sao chép độc lập Mỗi tế bào vi khuẩn có trung bình khoảng 20 plasmid.

+Có nhiều loại plasmid khác nhau

Các loại vector

Vector phage:

-Các phage (virut của vi khuẩn) được dùng làm vector chuyển gen do khả năng thực hiện việc mang gen từ tế bào vi khuẩn cho sang tế bào chủ nhận (tải nạp)

-Phage λ được dùng rộng rãi để giải trình

tự và lập ngân hàng gen

Có cần điều kiện gì không vậy????

Những yêu cầu tối thiểu của 1 vector chuyển gen:

+ Vector phải có 1 vùng nhận biết đối với 1 enzym giới hạn loại II

+ Vector phải tồn tại trong tế bào chủ qua nhiều thế hệ và ít gây xáo trộn trong tế bào chủ.

+ Vector có kích thước càng nhỏ càng tốt để thu nhận lượng DNA tối đa và dễ biến nạp vào tế bào chủ.

+ Có khả năng tự sao chép tích cực trong tế bào chủ, không phụ thuộc vào sự sao chép

bộ gen của tế bào chủ.

+ Đảm bảo sự di truyền bền vững của 1 DNA tái tổ hợp

+ Có khả năng thẩm tốt vào tế bào chủ của vector mang gen tái tổ hợp

+ Dễ theo dõi sự biểu hiện của gen tái tổ hợp yêu cầu này là cần thiết cho việc phát hiện dòng cần tìm.

+ Tinh chế dễ dàng với khối lượng lớn bản sao của gen gắn vào vector.

Vector biểu hiện gen

• Khái niệm:

• Là những vector tách dòng mang các promoter mạnh, cho phép biểu

hiện đồng thời cả gen chỉ thị và gen tách dòng để tạo các protein lai

*Có đặc điểm :

+ Có khả năng tạo số lượng lớn bản sao trong tế bào chủ

+ promoter hoạt động mạnh, dịch mã tạo nhiều protein lai

+ các vecto vẫn giữ được hoạt tính khi cài gen tách dòng có kích thước lớn

+ Hoạt động của vecto không gây ảnh hưởng hoặc ức chế tế bào chủ + Gen chỉ thị dễ dàng nhận biết

Vecto biểu hiện gen

* Hệ thống biểu hiện gen:

+ biểu hiện gen tạo sản phẩm protein tái tổ hợp là kĩ thuật quan trọng , quy định sự thành bại của kĩ thuật gen.

+ Tế bào chủ thường được sử dụng trong tế bào vi khuẩn,

tế bào nấm men, tế bào trứng của động vật có vú, baculovirus,….

➔Mỗi loại hệ thống biểu hiện gen có đặc điểm , có đặc

trưng riêng cùng với những thuận lợi và hạn chế nhất định

Dựa vào đặc điểm của gen biểu hiện, bản chất của protein tách

dòng và protein lai, cũng như điều kiện cụ thể của từng phòng thí

nghiệm để lựa chọn hệ thống biểu hiện phù hợp.

CHUẨN

BỊ NGUYÊN

R

TÁ

I T

Ổ H ỢP

B ướ

c 4

Bước 5

NUÔI CẤY

VÀ THU SẢN PHẨM

Gen cần tách dòng Vecto tách dòng Enzyme

Chuẩn bị nguyên liệu

- Sinh vật mang nguồn gen tự

nhiên.

+ Tách DNA, RNA từ mô hoặc tế

bào sinh vật bậc cao hoặc từ bộ

gen của vi sinh vật

+ Tinh sạch và chọn lọc

+ Sử dụng kĩ thuật nhân gen PCR

để nhân gen cần tách dòng lên

một số lượng các bản sao cần thiết

- Tổng hợp nhân tạo đoạn gen cần

+ Sử dụng kĩ thuật nhân gen PCR

để nhân gen cần tách dòng lên

một số lượng các bản sao cần

thiết

- Chọn vecto dựa theo kích thước

và bản chất của gen cần tách dòng.

- Vecto phải thích hợp với TBC,

có khả năng tái bản trong TBC.

- Enzyme cắt giới hạn: RE (Restristion enzyme)

- Enzyme xúc tác tổng hợp DNA, RNA

- Enzyme nối DNA: (DNA ligase)

CHUẨN

BỊ NGUYÊN

R

TÁ

I T

Ổ H ỢP

B ướ

c 4

Bước 5

NUÔI CẤY

VÀ THU SẢN PHẨM

Chọn lọc dòng tế

bào tái tổ hợp

Sử dụng chất chỉ thị kháng sinh

Sử dụng chất chỉ thị màu.

Lai phân tử

Tăng sinh khối Thu sinh khối protein tái tổ hộpTách và tinh chế

Nuôi cấy dòng tái tổ hợp thu sinh khối và protein tái

tổ hợp

Phương pháp sử dụng đầu lệch

Phương pháp sử dụng đoạn nối

Phương pháp sử dụng ETT

CÁC PHƯƠNG

PHÁP TẠO

VECTOR TÁI

TỔ HỢP

PHƯƠNG PHÁP DÙNG ĐẦU LỆCH

B1: Chọn và xử lý DNA plasmid

Plasmid được tách từ tế bào E.coli hoặc tế bào nấm men theo phương pháp chiết tách DNA plasmid sau đó dùng enzyme RE II (như EcoRI) cắt để tạo ra plasmid hở có hai đầu lệch nhau

B2: Chọn và xử lý đoạn cài

DNA đoạn cài được thu nhận và lựa chọn, tinh chế theo mục đích của từng nghiên cứu Cắt DNA bằng enzyme RE II cùng loại với enzyme cắt plasmid (EcoRI) để tạo ra các vết cắt giống nhau

B3: Tạo plasmid tái tổ hợp

Ghép đoạn cài vào plasmid bằng cách ủ các DNA đoạn cài plasmid với sự có mặt của enzyme DNA ligase, ta thu được DNA tái tổ hợp

PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ĐOẠN NỐI (LINKER)

+ Ủ linker có chứa chuỗi đích G/AATTC với cDNA

và enzym DNA ligase để tạo phân tử lai

+ Cắt phân tử DNA lai bởi enzym EcoRI, ta được phân tử lai có hai đầu lệch

B3: Tạo vector tái tổ hợp

Ghép phân tử DNA lai có hai đầu lệch vào plasmid mà cũng được cắt bởi emzym EcoRI Nhờ tác dụng của emzym DNA ligase mà vector tái tổ hợp được tạo thành

PHƯƠNG PHÁP SỬ DỤNG ETT

Nguyên tắc:

Dựa vào đặc tính của enzyme terminal transferase có khả năng gắn cùng một loại nucleotide vào đầu 3’(OH) của phân tử DNA

B1:

+Chọn và phân lập DNA lạ đầu bằng và plasmid, giả sử ta phân lập plasmid có chứa chuỗi đích được nhận biết bởi enzyme BamHI (G-5’/3’-GATCC)

+ Cắt plasmid bằng enzyme BamHI để tạo plasmid hở có hai đầu dính

+ Cắt DNA lạ bằng enzyme exonuclease theo hướng 5’→ 3’ để tạo DNA có hai đầu lệch nhau

B2:

+ Ủ DNA lạ với cùng một loại nucleotide dCTP với sự có mặt của enzyme terminal transferase để tạo đuôi polyC ở đầu 3’(OH) của DNA lạ

+ Ủ plasmid với cùng một loại nucleotide dGTP với sự có mặt của enzyme terminal transferase để tạo đuôi polyG ở đầu 3’(OH) của plasmid hở

B3:

Đưa DNA lạ vào plasmid với sự có mặt của enzyme DNA ligase, các đầu mút của homopolymer có trình tự bổ sung ( -GGGG 3’/3’CCCC -) sẽ bắt cặp với nhau

B4:

Bổ sung enzyme DNA-polymerase I để gắn các nucleotide tương ứng vào chỗ trống theo nguyên tắc bổ sung Enzyme ligase nối liên kết phosphodiester và cuối cùng tạo

được plasmid tái tổ hợp có hai chuỗi đích

được nhận biết bởi enzyme BamHI

Phương pháp hóa học

Sốc nhiệt:

Thông thường các tế

bào sẽ được ngâm trong

dung dịch chứa cation hóa

trị 2 (thường dùng CaCl2)

trong điều liện lạnh trc khi

tiếp xúc vs xung nhiệt (sốc

nhiệt) rồi sau đó đưa trở lại

điều kiện lạnh

Calcium phosphate:

Một phương pháp đơn giản khác liên quan đến việc

sử dụng calcium phosphate

“liên kết” với DNA và sau đó cho nó tiếp xúc với các tế bào Phần dung dịch, cùng với DNA, được hấp phụ bởi các tế bào và một lượng nhỏ DNA có thể được tích hợp vào bộ gen

Phương pháp vật lý

Xung điệnCác tế bào sẽ bị sốc điện trong 1 thời gian ngắn với điện trường khoảng 10-

20 kV/cm, để từ đó tạo ra các lỗ hổng ở mằng tế bào (làm dãn mằng tế bào) và qua đo các DNA có thể đi vào tế bào Cần sử dụng máy xung gen

Vi tiêm

sử dụng micropipette để đưa

một lượng chất lỏng dung

dịch có chứa DNA ngoài vào

đối tượng ở cấp độ vi mô Các

đối tượng tiêm thường là tế

bào nhưng cũng có thể là các

khoảng trống giữa chúng

Chuyển gen nhờ virus

Việc truyền gen qua trung gian virus sử dụng khả năng virus tiêm DNA của chúng vào bên trong tế bào chủ và tận dụng khả năng của chính virus để sao chép vật liệu di truyền của chính chúng

Sự tải nạp là quá trình mô tả sự chèn DNA qua trung gian là virus vào tế bào chủ Virus là một hình thức chuyển gen đặc biệt hiệu quả vì cấu trúc của virus ngăn chặn sự thoái hóa thông qua lysosome của DNA mà nó đang phân phối đến nhân của tế bào chủ

Các phương pháp chuyển gen của virus có nhiều khả năng gây ra phản ứng miễn dịch, nhưng chúng

có hiệu quả cao

Phương pháp lai phân tử

Dùng chỉ thị kháng sinh

Là phương pháp đơn giản, dễ sử dụng

Dựa vào gen kháng chất kháng sinh trog

vector tái tổ hợp, chuẩn bị môi ttường

dinh dưỡng có bổ sung chất kháng sinh

tương ứng để nuôi cấy tế bào sau biến

nạp Các tế bào phát triển và tồn tại được

là các tế bào có DNA tái tổ hợp do có gen

kháng kháng sinh

Dùng chỉ thị màu

Dựa trên sự biểu hiện màu của các tế bào khi nuôi cấy trong môi trường nhất định Sự biểu hiện màu thường do một gen nhất định quy định Trong kỹ thuật sàng lọc, gen LacZ là một gen chỉ thị màu có giá trị cao, thường được sử dụng kết hợp với ITPG và X-gal.

Phương pháp lai phân tử

Là 1 trong những phương pháp có độ chính xác cao, tuy nhiên kỹ thuật thực hiện tương đối phức tạp, tốn kém hóa chất và đòi hỏi các thiết bị chuyên dùng

Các giai đoạn cơ bản:

+ Nuôi cấy tế bào sau biến nạp, cho phát triển thành khuẩn lạc

+ Đậy màng lai lên để “in” các khuẩn lạc lên

+ Lấy màng lai xử lý NaOH sau đó đem lai phân

tử với mẫu dò đánh dấu phóng xạ hoặc huỳnh quang (tương ứng với DNA tái tổ hợp)

+ Rửa màng lai, thực hiện kỹ thuật phóng xạ tự ghi thu được tấm phim có đánh dấu vị trí khuẩn lạc

có tái tổ hợp

+ Lựa chọn khuẩn lạc ở vị trí tương ứng

ỜNG

Nông nghiệp

1 Ưu điểm:

- Mở ra nhiều ứng dụng mới trong trồng trọt.

- Rút ngắn thời gian tạo giống.

2 Phương pháp:

- Chuyển gen bằng plasmit, virus.

- Chuyển gen bằng kỹ thuật vi tiêm.

- Chuyển gen bằng súng bắn gen.

- Chuyển gen qua ống phấn.

3 Thành tựu:

+ Cà chua chuyển gen

+ Lúa chuyển gen tổng hợp β – carôten

CÂY TRỒNG

* Thành tựu:

+ Cà chua chuyển gen:

- Tạo được giống cà chua làm bất hoạt gen sản sinh ra

etilen, kéo dài thời gian chín của quả.

- Tạo được cà chua chuyển gen kháng virus, kháng bệnh : Đã không sử dụng thuốc hóa học.

- Hạn chế ô nhiễm môi trường.

+ Lúa chuyển gen tổng hợp β – carôten:

-Là loại gạo biến đổi gen nhằm tạo ra nhìều tiền tố

Vitamin A (β – carôten ) và một số lượng lớn chất Sắt.

Gồm 2 loại:

+GR1 được tạo ra khi chuyển gen sinh tiền tố vitamin

A từ cây thủy tiên và Erwinia Uredovora vào giống lúa

+ Tạo giống cừu sản xuất prôtêin người

- Vi tiêm: Gen được bơm vào hợp

tử giai đoạn nhân non.

Ưu điểm

+Tạo giống bò chuyển gen

Tạo giống cừu sản xuất prôtêin người:

Tạo giống bò chuyển gen:

Gồm hai phương pháp.

- Phương pháp vi tiêm:

- Phương pháp cấy nhân có gen đã cải biến.

Ví dụ: Tạo được giống bò chuyển gen sản xuất prôtêin của người trong sữa dùng để chữa bệnh máu vón cục gây tắc mạch máu.

Y DƯỢC

CHẾ PHẨM SINH HỌC

INSULIN

LIỆU PHÁP GEN

CHẾ PHẨM SINH HỌC:

Khái niệm: Chế phẩm sinh học là sản phẩm có chứa vi sinh vật sống nhằm mục đích cải thiện sức khỏe con người và vật nuôi

ĐỐI TƯỢNG: VI KHUẨN E.COLI

- Chuẩn bị đoạn oligonucleotide mã hoá cho insulin: - Chuẩn bị vertor: có thể dùng plasmid của vi khuẩn hay nấm men

- Dùng enzym hạn chế cắt plasmid và nối đoạn gene mã hoá cho insulin để tạo vertor tái tổ hợp (thường dùng

là pBR322)

- Chuyển vertor tái tổ hợp pBR322 vào vi khuẩn E.coli

- Nuôi cấy (lên men) vi khuẩn E.coli trong môi trường thích hợp

- Tách chiết và thu sản phẩm là 2 loại polypeptid A và B riêng biệt

- Trộn hai loại peptid lại với nhau và xử lý bằng phương pháp hoá học hay enzym để tạo cầu disulfur

- Kiểm tra chất lượng sản phẩm

LIỆU PHÁP GEN

Có nhiều nhiều khái niệm khác nhau về liệu pháp gen, có thể hiểu chung nhất : Liệu pháp gen là tập hợp các gen cần thiêt( còn gọi là gen liệu pháp) nhằm mục đích chữa bệnh cho con người

Gen liệu pháp( Therepeutic gene) là thuật ngữ để chỉ các gen có chức năng có thể sử dụng vào mục đích

điều trị và chữa bệnh cho con người

Thanks for watching