Biểu hiện và tiết Enzym Nattokinase tái tổ hợp ở Bacillus subtilis

Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi thực hiện các nội dung như sau:  Phân lập chủng Bacillus subtilis natto từ 4 mẫu sản phẩm Natto có nguồn gốc từ Nhật Bản  Thu nhận gen mã hóa Natto

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS LÊ THỊ THÚY ÁI

THÀNH PHỐ HỐ CHÍ MINH – 2012

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT i

DANH MỤC CÁC BẢNG iii

DANH MỤC CÁC HÌNH iv

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 BỆNH NGHẼN MẠCH DO HUYẾT KHỐI 3

1.1.1 Khái niệm về huyết khối 3

1.1.2 Tình hình nghẽn mạch do huyết khối 3

1.1.3 Cơ chế hình thành huyết khối 4

1.1.4 Sự phân hủy huyết khối bởi enzym nội sinh plasmin 8

1.1.5 Các nhân tố trong điều trị bệnh nghẽn mạch do huyết khối 9

1.2 NATTOKINASE 12

1.2.1 Nguồn gốc, đặc tính của Nattokinase 12

1.2.2 Cơ chế phân hủy fibrin của Nattokinase 14

1.2.3 Sinh tổng hợp và sản xuất Nattokinase 15

1.2.4 Tình hình nghiên cứu sản xuất Nattokinase tái tổ hợp trong và ngoài nước 17

1.3 CÁC HỆ THỐNG VECTOR BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG TẾ BÀO VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS 19

1.3.1 Biểu hiện gen trong tế bào vật chủ E coli và Bacillus subtilis 19

1.3.2 Hệ thống biểu hiện dựa trên vector sát nhập 20

1.3.3 Hệ thống biểu hiện dựa trên vector plasmid có khả năng tự sao chép 25

1.4 HỆ THỐNG TIẾT CỦA BACILLUS SUBTILIS 27

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU 29

2.1.1 Dụng cụ 29

2.1.2 Thiết bị 29

2.1.3 Hóa chất 30

2.1.4 Môi trường 33

2.1.5 Vật liệu sinh học 34

2.2 PHƯƠNG PHÁP 37

2.2.1 Phân lập Bacillus subtilis từ mẫu sản phẩm Natto 37

2.2.2 Phương pháp thử nghiệm khả năng phân hủy fibrin người 38

2.2.3 Tách chiết genom của vi khuẩn Bacillus subtilis 38

2.2.4 Thu nhận gen aprE bằng phản ứng PCR 39

2.2.5 Tinh sạch sản phẩm khuếch đại gen aprE 40

2.2.6 Thu nhận plasmid bằng phương pháp SDS kiềm 40

2.2.7 Tạo dòng tế bào E coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein Nattokinase trong vector pBluescript II KS (+) 41

2.2.8 Tạo dòng tế bào E coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein Nattokinase trong hệ thống vector pAX01 43

2.2.9 Tạo dòng tế bào E coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein Nattokinase trong hệ thống vector pBG01 46

2.2.10 Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5và hóa biến nạp sản phẩm nối vào tế bào khả nạp E coli DH5 48

2.2.11 Tinh chế sản phẩm cắt qua cột 49

2.2.12 Chuẩn bị tế bào khả nạp Bacillus subtilis và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả nạp B subtilis 49

2.2.13 Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pAX01 chứa

gen aprE 50

2.2.14 Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pBG01 chứa gen aprE 52

2.2.15 Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis 53

2.2.16 Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pBG01 trong Bacillus subtilis DB104 54

2.2.17 Phân tích protein biểu hiện bằng SDS-PAGE 54

2.2.18 Phương pháp xác định hoạt tính Nattokinase 55

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC CHỦNG BACILLUS SUBTILIS NATTO TỪ SẢN PHẨM NATTO 56

3.2 PHÂN TÍCH ĐA DẠNG GEN MÃ HÓA SUBTILISIN VÀ CHỌN TRÌNH TỰ GEN MÃ HÓA ĐẠI DIỆN 59

3.2.1 Tách chiết DNA bộ gen Bacillus sp phân lập từ Natto 59

3.2.2 Thu nhận gen mã hóa Nattokinase 60

3.2.3 Tạo dòng tế bào E coli mang gen aprE 61

3.2.3.1 Sàng lọc dòng tế bào E coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprE 61

3.2.3.2 Sàng lọc dòng tế bào E coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprE bằng phương pháp PCR 61

3.2.3.3 Kiểm tra dòng tế bào E coli DH5 có mang plasmid chứa gen aprE bằng phương pháp cắt bằng enzym cắt hạn chế 63

3.2.3.4 Giải trình tự gen aprE, nhận định và tuyển chọn gen mã hóa thích hợp cho Nattokinase 64

3.3 DÒNG HÓA GEN aprE VÀO CÁC VECTOR ĐƯỢC CẤU TRÚC CHO BIỂU

HIỆN Ở BACILLUS 68

3.3.1 Hệ thống biểu hiện pAX01 68

3.3.2 Hệ thống biểu hiện pBG01 72

3.4 TẠO CÁC DÒNG BACILLUS SUBTILIS MANG CASSET BIỂU HIỆN NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP 74

3.4.1 Sát nhập casset biểu hiện gen aprE được kiểm soát của Pxyl vào bộ gen các chủng Bacillus subtilis 75

3.4.2 Dòng hóa casset biểu hiện gen aprE được kiểm soát của Pgrac vào bộ gen các chủng Bacillus subtilis DB104 78

3.5 KIỂM TRA SỰ BIỂU HIỆN CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP NATTOKINASE 80

3.5.1 Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE dưới sự kiểm soát của Pxyl 80

3.5.2 Kiểm tra sự biểu hiện của gen aprE trong hệ thống pBG01 83

3.6 KIỂM TRA HOẠT TÍNH ENZYM NATTOKINASE TÁI TỔ HỢP 85

3.6.1 Kiểm tra hoạt tính sơ bộ 85

3.6.2 Xác định hoạt độ phân hủy fibrin 86

CHƯƠNG 4 : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN 88

4.2 ĐỀ NGHỊ 88

TÀI LIỆU THAM KHẢO 89

PHỤ LỤC 93

distilled water DeoxyriboNucleotide Triphosphate DeoxyriboNucleic Acid

Ethylene Diamine TetraAcetic Acid Ethylene Glycol Tetraacetic Acid Erythromycin

Generally recognized as safe organism

Kilobaze kilo Dalton Luria – Bertani Linsmaier - Skoog Multicloning site Neomycin

Optical Density Plasminogen Activator Inhibitor 1

Nước cất Các loại axít nucleotid Axít deoxyribonucleic

Kháng sinh erythromycin

Vi sinh vật an toàn

Trọng lượng kDa Môi trường LB Môi trường LS

Vị trí tạo dòng Kháng sinh neomycin Mật độ quang học Chất kìm hãm hoạt hóa plasminogen

Plasmid pB Phản ứng PCR Enzym Rnase Trình tự gắn ribosom

Streptokinase Spectinomycin Tris-EDTA tissue Plasminogen Activator Tris-Acetic acid- EDTA urokinase Plasminogen Activator

5-bromo-4 chloro-3 glactoside

indolyl-beta-D-Dung dịch SDS Điện di SDS-PAGE

Thuốc chống đông máu Kháng sinh spectinomycin Dung dịch TE

Chất hoạt hóa plasminogen mô Dung dịch đệm chạy điện di TAE Chất hoạt hóa plasminogen urokinase

- iii -

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1.1 Các yếu tố đông máu 6

Bảng 2.1 Thành phần môi trường HS 33

Bảng 2.2 Thành phần môi trường LS 34

Bảng 2.3 Các trình tự mồi được sử dụng trong luận văn 36

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR 39

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt plasmid pB bằng EcoRV 42

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nối pB và aprE 43

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt kiểm tra pB-aprE bằng BamHI 43

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 và gen aprE bằng BamHI 45

Bảng 2.9 Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 và gen aprE bằng SacII 45

Bảng 2.10 Thành phần phản ứng nối 45

Bảng 2.11 Thành phần phản ứng cắt plasmid pBG01 và gen aprE bằng BamHI và XbaI 47

Bảng 2.12 Thành phần phản ứng nối 47

Bảng 3.1 So sánh hoạt độ phân hủy fibrin của dịch ngoại bào ở các chủng Bacillus 87

- iv -

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1.1 Cơ chê hình thành huyết khối 5

Hình 1.2 Sự hoạt hóa và tác động lẫn nhau của các yếu tố đông máu 7

Hình 1.3 Cơ chế phân hủy fibrin in-vivo 9

Hình 1.4 Sản phẩm Natto 13

Hình 1.5 Cơ chế phân giải fibrin in-vivo bởi Nattokinase 14

Hình 1.6 Sơ đồ vector sát nhập chứa promoter xylA được sử dụng trong luận văn 23

Hình 1.7 Sự sát nhập pAX01 vào DNA Bacillus subtilis nhờ trao đổi đồng dạng tại locus lacA 24

Hình 1.8 Sơ đồ vector biểu hiện pBG01 được sử dụng trong luận văn 26

Hình 2.1 Sơ đồ vector pBluescript II KS (+) 35

Hình 2.2 Thang chuẩn DNA 1kb và protein 37

Hình 2.3 Chương trình PCR thu nhận gen aprE 40

Hình 3.1 Sản phẩm Natto dùng phân lập được thử nghiệm hoạt tính sơ bộ 57

Hình 3.2 Các dạng khuẩn lạc Bacillus phân lập được từ sản phẩm Natto 58

Hình 3.3 Kết quả thử nghiệm nhanh hoạt tính phân hủy fibrin người ở các chủng phân lập sau 6 giờ ủ 59

Hình 3.4 DNA bộ gen chủng Bacillus sp phân lập từ sản phẩm Natto và sản phẩm khuếch đại gen aprE trên gel agarose 1% 60

Hình 3.5 Kết quả sàng lọc dòng tế bào E coli DH5  có mang pB-aprE bằng phản ứng PCR 62

Hình 3.6 Kết quả sàng lọc 12 dòng tế bào E coli DH5  có mang pB-aprE tương ứng bằng phản ứng PCR, bản mẫu là các plasmid 63

Hình 3.11b Một phần trình tự mã hóa gen aprE của chủng B2 được so sánh với

Nattokinase cho thấy khác biệt ở vị trí quan trọng Valin 298 (tương ứng vị trí 193 ở

Hình 3.20 Kết quả kiểm tra chủng B subtilis DB104 khả nạp bằng phản ứng PCR

khuẩn lạc với mồi pAX01-F/aprE-R 77

- vi -

Hình 3.21 Kết quả kiểm tra chủng B subtilis DB104 khả nạp bằng phản ứng PCR với

bản mẫu là bộ gen, mồi pAX01-F/aprE-R 78

Hình 3.22 Kết quả sàng lọc chủng Bacillus subtilis DB104 khả nạp trên đĩa môi trường

có bổ sung kháng sinh chloramphenicol 79

Hình 3.23 Kết quả kiểm tra sự dòng hóa aprE bằng PCR khuẩn lạc, cặp mồi

Hình 3.26 Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml dịch môi trường nuôi cấy

chủng B subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi Pxyl 82

Hình 3.27 Phân tích Nattokinase tái tổ hợp ngoại bào từ 2,5 ml môi trường nuôi cấy chủng B subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi P Sgrac 84

Hình 3.28 Phân tích Nattokinase tái tổ hợp nội bào ở Bacillus subtilis DB104 ở trường hợp kiểm soát bởi P Sgrac 85

Hình 3.29 Kết quả thử khả năng phân giải fibrin của dịch ngoại bào ở chủng B subtilis

DB104 mang pBG01-aprE được cảm ứng IPTG sau 2 giờ ủ 86

MỞ ĐẦU

- 1 -

Ngày nay, tỉ lệ bệnh nghẽn mạch (như chứng nhồi máu cơ tim hay nhồi máu não) đang tăng cao ở một số nước châu Á như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Việt Nam, Philippin do xu hướng “âu hóa” trong các chế độ ăn uống Nếu huyết tụ ở não sẽ làm cản trở việc cung cấp oxy cho các mô não gây ra các bệnh lý nguy hiểm như: tai biến mạch máu não, suy não, giảm trí nhớ, đột quỵ Nếu huyết khối ở tim gây ra các bệnh lý như: co thắt động mạch vành, nhồi máu cơ tim… Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới mỗi năm có khoảng 17 triệu người chết vì bệnh tim mạch và dự báo rằng bệnh do nghẽn mạch (hay huyết khối xơ vữa) sẽ là nguyên nhân gây tử vong hàng đầu vào các năm tới đây Huyết khối

xơ vữa đã thật sự trở thành mối đe dọa đối với sức khỏe con người

Tại Nhật Bản, sản phẩm lên men truyền thống Natto đã rất được phổ biến và thu hút nhiều sự chú ý Nó được xem là một loại thức ăn giúp giảm thiểu sự nghẽn mạch máu vì Natto chứa enzym phân hủy huyết khối “Nattokinase”, một nhân tố mang đến sự trường thọ cho người Nhật Nattokinase (còn gọi là Subtilisin natto) là một serine protease được chiết

tách từ sản phẩm lên men đậu tương với vi khuẩn Bacillus subtilis natto Enzym này có khả

năng làm tan đặc hiệu fibrin là một protein dạng sợi cấu trúc nên huyết khối Hơn nữa, Nattokinase còn hỗ trợ tăng cường sản sinh ra Plasmin (enzym do cơ thể sản sinh làm tan huyết khối bám chặt nội mạc) Nattokinase thực sự mạnh hơn những thuốc làm tan huyết tụ thông thường khác như Urokinase, Streptokinase, và tissue Plasminogen Activator (t-PA) Tuy nhiên, Urokinase và Streptokinase có tính đặc hiệu thấp với fibrin, chỉ hiệu quả khi dùng đường tiêm tĩnh mạch và thường không hiệu quả khi động mạch của bệnh nhân đột quỵ và đau tim đã chai cứng ở nhiều vị trí t-PA thể hiện hoạt tính phân hủy fibrin mạnh nhưng t-PA có giá thành khá cao và thời gian bán phân hủy ngắn trong cơ thể Nattokinase

có hoạt tính phân hủy huyết tụ cao gấp 4 lần Plasmin, thực nghiệm cho thấy Nattokinase phân cắt plasminogen activator inhibitor type 1 (PAI-1) dẫn tới việc loại bỏ hiệu quả cấu trúc huyết khối trong cơ thể Nattokinase đã được chứng minh có hiệu quả trong điều trị lâm sàng và không gây phản ứng phụ

- 2 -

Từ trước đến nay, Nattokinase được thu nhận chủ yếu bằng con đường lên men bán

rắn chủng Bacillus subtilis natto trên cơ chất đậu nành nấu chín hay lên men dịch thể Thực

tế, Nattokinase được ly trích từ cơ chất hay môi trường lỏng thường có hàm lượng không cao và hoạt tính ít ổn định Vì thực nghiệm đã cho thấy rằng sự tổng hợp Nattokinase trong

tự nhiên ở Bacillus subtilis natto khá phức tạp và chỉ đạt mức độ giới hạn Hay nói cách

khác, cách tiếp cận trên thường chỉ hiệu quả nếu đi kèm công nghệ lên men hoàn hảo với các thông số đã được nghiên cứu tối ưu hóa Tuy nhiên, các công nghệ này thường ít được công

bố

Theo thống kê, nhu cầu sản phẩm Nattokinase ngày càng tăng cao ở thị trường Nhật Bản và Đài Loan Ở các nước đang phát triển như Trung Quốc và Việt Nam, người dân đã bắt đầu quan tâm sử dụng Trong nước, các công ty dược phẩm cũng bắt đầu cho ra các sản phẩm từ Nattokinase với nguyên liệu ngoại nhập chủ yếu từ Nhật Bản với giá thành cao Việc tìm kiếm nguồn nguyên liệu Nattokinase có hoạt tính ổn định và giá cả phù hợp là định hướng của nhiều công ty trong nước Do vậy, việc tìm hiểu và thu nhận nguồn gen mã hóa

Nattokinase tốt từ các chủng Bacillus natto và xây dựng hệ thống tái tổ hợp là tiếp cận mở ra

triển vọng cho công nghệ sản xuất và thu nhận Nattokinase hoạt tính cao nhằm làm nguyên liệu cho dược phẩm, thực phẩm chức năng

Trong khuôn khổ luận văn, chúng tôi thực hiện các nội dung như sau:

 Phân lập chủng Bacillus subtilis natto từ 4 mẫu sản phẩm Natto có nguồn gốc từ Nhật

Bản

 Thu nhận gen mã hóa Nattokinase từ các chủng phân lập bằng phương pháp PCR

 Dòng hóa gen mã hóa Nattokinase cùng trình tự tiết tự nhiên vào các hệ thống vector

khác nhau ở Escherichia coli

 Biến nạp vector tái tổ hợp trên vào chủng Bacillus subtilis DB104

 Điện di phân tích sự biểu hiện ngoại bào của Nattokinase tái tổ hợp

Chương 2

VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP

2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Dụng cụ

Một số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm Vi sinh như sau: que cấy, que trải, đèn cồn, eppendorf, bộ pipetman (0,5-10l, 10-100l, 20-100l, 100-1000l), đầu típ các loại, ống đong, ống falcon các loại, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống nghiệm thủy tinh, đĩa petri, tăm vô trùng, bình tia, thùng đá, giấy thấm, kéo, kẹp, bông thấm, bông không thấm, giấy bạc, găng tay cao su, đồng hồ bấm giây…

2.1.2 Thiết bị

- Bộ điện di ngang DNA Horizon 58 (Life Technology)

- Hộp soi đèn tử ngoại Hoefer (UVTM – 19 – 230V)

- Bộ điện di protein (Biorad)

- Máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettich Zentrifugen)

- Máy đo quang phổ Ultrospec 2000

- Máy đo quang phổ chuyên dụng GenQuantpro (Amersham Biosciences)

- Máy lắc ổn nhiệt (Stualrt Scientific)

- Máy chụp hình gel Imagemaster VDS (Amersham Biosciences)

- Nồi hấp khử trùng Autoclave (SS325-TOMY)

- Máy điều nhiệt theo chu kì Eppendorf Mastercycler Personal

- Máy Vortex (IKA, Mỹ)

- Máy đo pH (Orion, Anh)

- Tủ ấm Memmert (Đức), Tủ sấy Memmert (Đức)

- Tủ cấy vô trùng Class II (Mỹ)

- Bể ổn nhiệt (Memmert)

- Cân kỹ thuật Ohaus (Mỹ), Cân phân tích Precica (Thụy Sỹ)

- Máy khuấy từ gia nhiệt Bibby (Anh )

- Tủ mát 4oC (Nhật ), Tủ lạnh -20oC (Nhật )

2.1.3 Hóa chất

Các hóa chất sử dụng trong luận văn bao gồm:

a) Hóa chất dùng cho tách chiết DNA vi khuẩn

- Lysis buffer: 0,1M NaCl, 0,05M EDTA, pH 8,0

- Dung dịch SDS 10%,

- Lysozym 20mg/ml, Proteinase K 20mg/ml

- Phenol bão hòa trong TE, pH 8,0

- Chloroform, Sodium acetat 3M

- Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20oC), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20oC)

- Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0

b) Hóa chất dùng cho tách chiết plasmid từ vi khuẩn

- Dung dich I: glucose 50mM, Tris-HCl 25mM pH 8,0, EDTA 10mM pH 8,0

- Dung dịch II (pha trước khi dùng): SDS 10%, NaOH 5N

- Dung dịch III: glacical acetic acid 0,2M, CH3COOK 0,2M pH 4,8

- RNase 10mg/ml

- Phenol bão hòa trong TE, pH 8,0

- Chloroform, Sodium acetat 3M

- Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20oC), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20oC)

- Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM pH 8,0, EDTA 1mM pH 8,0

c) Hóa chất dùng cho phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)

- PCR buffer Taq DNA polymerase 10X

- PCR buffer DeepVent DNA polymerase 10X

- Dung dịch MgCl2, MgSO4 25mM

- dNTP 8mM

- Mồi aprE-F-BamHI, aprE-R-SacII, E-anh-R, pAX01-F-seq, pMTL-R

- Nước cất hai lần (ddH2O)

d) Hóa chất dùng cho điện di trên gel agarose

- Agarose (Sigma), Safe View

e) Hóa chất dùng cho điện di SDS-PAGE

- Dung dịch tạo gel polyacrylamide 12,5%: gel polyacrylamide 100x100x0,75mm nồng độ 12,5% polyacrylamide có thành phần như sau:

+ Gel phân tích 12% (4 gel): nước cất 4,46ml, Tris-HCl 1,5M (pH 8,8) 3,95ml, 30% Acrylamide/Bisacrylamide 0,8% 7,1ml, 157,5l SDS 10%, 79l ammonium persulfate 10%, 7,9l TEMED

+ Gel gom 4% (4 gel): nước cất 3,5ml, Tris-HCl 0,5M (pH 6,8) 1,625ml, 30% Acrylamide/Bisacrylamide 0,8% 2,264 ml, 75l SDS 10%, 15l ammonium persulfate 10%, 5l TEMED

- Dung dịch điện di 5X: Tris-HCl 15,1g, glycine 94g, SDS 5g, nước cất đủ 1000ml,

- Enzym: BamHI, SacII, HindIII, EcoRV, EcoRI, XbaI

- Buffer Blue 10X, Green 10X, Red 10X

g) Hóa chất dùng cho tinh chế phản ứng PCR và phản ứng cắt

- Chloroform, Sodium acetat 3M

- Ethanol 99% lạnh (giữ ở -20oC), Ethanol 70% lạnh (giữ ở -20oC)

h) Hóa chất dùng cho phản ứng nối

- Enzym T4 DNA ligase

Ampicillin, Spectinomycin, Erythromycin, Neomycin, Chloramphenicol

k) Hóa chất làm tế bào khả nạp E coli DH5 

- Glycerol 50% (hấp riêng) (giữ ở 4oC)

- CaCl2 1M (hấp riêng) (giữ ở 4oC)

- Hỗn hợp dung dịch CaCl2 0.1M và Glycerol 15% vô trùng (giữ ở 4oC)

l) Hóa chất cho xác định hoạt tính Nattokinase

- Tris-HCl 1M (pH 7,8)

- Fibrin heo 0.12%

- TCA 0,1M

2.1.4 Môi trường

a) Môi trường LB (Luria – Bertani)

- Thành phần môi trường lỏng như sau: 1,0% trypton, 0,5% cao nấm men, 0,5% NaCl

- Môi trường LB thạch: bổ sung 2% agar trong LB lỏng

- Môi trường LB-Amp: bổ sung kháng sinh ampicillin trong môi trường LB để có nồng độ cuối là 100g/ml

- Môi trường LB-Spec: bổ sung kháng sinh spectinomycin trong môi trường LB để

b) Môi trường thử hoạt tính tan fibrin

Thành phần môi trường: agarose 2% w/v, fibrinogen 0,6% w/v, đệm phosphate 50

mM, thrombin (10 NIH unit/ml)

c) Môi trường HS (môi trường làm tế bào khả nạp Bacillus subtilis)

 Thành phần 10X-S-base, Mg2+: (NH4)2SO4 2,0g, K2HPO4 14,0g, KH2PO4 6,0g, Natrium citrate 1,0g

Cho nước vào đủ 100ml, đem hấp khử trùng ở 121oC, 15 phút Sau đó bổ sung thêm 0,1ml MgSO4 1M đã hấp khử trùng riêng

d) Môi trường LS (môi trường dùng biến nạp tế bào Bacillus subtilis)

- Chủng Escherichia coli DH5 [F- endA1 hsdR17 (rk/mk-) sup E44 thi l- recA1

gyrA96 DlacU169 (f80lacZDM15)] (Takara) được sử dụng làm tế bào chủ để

nhân bản các plasmid

Bảng 2.2 Thành phần môi trường LS

- Chủng vi sinh vật dùng để biểu hiện vector tái tổ hợp mang gen mục tiêu aprE: + Bacillus subtilis 1012 được dùng làm tế bào chủ biểu hiện protein tái tổ hợp

bằng vector pAX01

+ Bacillus subtilis DB104 [his, nprR2, nprE18, aprED3](Bacillus Gentics

Stock Centre at Ohio) được dùng làm tế bào chủ biểu hiện protein tái tổ hợp bằng các vector pAX01 và pBG01

b) Plasmid

- Plasmid pBluescript II KS (+) được sử dụng làm vector dòng hóa, mang gen

kháng kháng sinh AmpR, gen lacZ mã hóa cho 146 acid amin đầu N của enzym galactosidase, vùng MCS được chèn vào giữa gen lacZ, cho phép dòng hóa gen mục tiêu vào

-vector pBluescript II KS (+) (Hình 2.1)

- Plasmid pAX01 được sử dụng làm vector dòng hóa và vector biểu hiện gen mục

tiêu Plasmid này có kích thước 7781bp chứa promoter xylA được cảm ứng bằng xylose Trên plasmid có đoạn trình tự lacA mang gen mã hóa cho enzym -galactosidase tương ứng với vùng lacA trên bộ gen của Bacillus subtilis, mang gen kháng kháng sinh AmpR (chọn lọc

Hình 2.1 Sơ đồ vector pBluescript II KS (+)

cho tế bào E coli và erythromycin EryR (chọn lọc cho B subtilis) Sơ đồ đặc điểm của

plasmid pAX01 được trình bày ở Hình 1.6

Plasmid pBG01 là vector biểu hiện protein dựa trên vector plasmid có khả năng tự

sao chép Đặc điểm plasmid này được trình bày ở Hình 1.8

c) Mồi

Các mồi được sử dụng trong phản ứng khuếch đại gen, tạo dòng và giải trình tự được thiết kế bởi Phòng thí nghiệm Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh có trình tự như sau:

pMTL-R GGTATAAACTTTTCAGTTGCAGACAAAGAT Kiểm tra sự hiện diện

của gen aprE trên pBG01

của gen aprE trên

pBluescript

d) Thang chuẩn DNA và protein

- Thang 1 kb (Fermentas, Đức), Ladder, # SM0311/2/3

Bảng 2.3 Các cặp mồi được sử dụng trong luận văn

- Thang phân tử lượng protein (Low weigh molecular, LWM) (Amersham Bioscience)

e) Các bộ kít

Bộ kít (EZ – 10 Spin Columm DNA gel Extration Kit của Bio Basis INC) dùng để tinh chế DNA được thu nhận từ gel agarose, quy trình tinh sạch được thực hiện qua các bước: làm tan gel, hấp thu DNA trên cột, rửa và dung ly để thu nhận DNA

Trường hợp cần tinh chế sản phẩm PCR, hỗn hợp PCR sau phản ứng được bơm vào cột tinh chế DNA (EZ – 10 Spin Column PCR purification Kit của Bio Basis INC), ly tâm

và rửa, DNA sẽ được giữ lại trên cột Sau đó dung ly và thu nhận DNA đã được tinh sạch

2.2 PHƯƠNG PHÁP

2.2.1 Phân lập Bacillus subtilis từ mẫu sản phẩm Natto

Các bước thực hiện bao gồm:

- Lấy một ít hạt đậu từ mẫu Natto hòa với 9ml nước cất vô trùng

- Hút 100l dịch pha loãng trải lên đĩa LB

- Ủ đĩa ở 37oC qua đêm, sau đó quan sát các dạng khuẩn lạc mọc trên đĩa

Hình 2.2 Thang chuẩn DNA 1kb và protein

- Lấy từng khuẩn lạc có hình dạng đặc trưng ria lại trên đĩa LB mới, ủ ở 37oC qua đêm Tiến hành lặp lại cho đến khi thu được các khuẩn lạc riêng rẽ, đồng nhất

- Dùng que cấy vòng cấy khuẩn lạc lên đĩa thạch chứa Ủ ở 37oC qua đêm

Quan sát vòng phân giải và tiến hành chọn lọc những dòng có khả năng phân hủy fibrin mạnh để tiến hành nuôi cấy cho các thí nghiệm sau

2.2.2 Phương pháp thử nghiệm khả năng phân hủy fibrin người

Hoạt tính thủy phân fibrin được xác định theo phương pháp Astrup và Mullertz cải tiến (Choi et al., 2004): 10ml hỗn hợp agarose (2% w/v) và fibrinogen (0,6% w/v) trong đệm 50mM phosphate pH 7,4 Thêm 100µl dung dịch Thrombin (10 NIH unit/ml) khuấy đều, đổ dung dịch agarose vào đĩa petri, ổn định 1 giờ ở nhiệt độ phòng Tạo các lỗ đường kính 4mm

trên lớp agarose, 50µl dịch nổi môi trường nuôi cấy Bacillus phân lập được chuyển vào mỗi

lỗ, ủ trong 3 -18 giờ ở 37oC Nhận diện sơ bộ hoạt tính theo diện tích vòng phân hủy fibrin [40]

2.2.3 Tách chiết genom của vi khuẩn Bacillus subtilis

Các bước tiến hành như sau:

- Nuôi cấy qua đêm chủng vi khuẩn Bacillus subtilis trong 20ml môi trường LB, lắc

- Thêm 2ml PCI (hỗn hợp gồm phenol: chloroform: isoamyl alcohol), mix đều tạo hiện tượng trắng sữa toàn bộ Sau đó, ly tâm 5.000 vòng/phút, 20 phút và thu lấy pha trên

- Chiết lại bằng chloroform theo tỷ lệ 1:1 v/v, ly tâm 10.000 vòng/phút, 10 phút,

4oC

- Thêm 0,1V sodium acetate 3M pH5,2 và 2,5V EtOH 99% lạnh, mix cho đến khi thấy xuất hiện những sợi DNA kết thành lưới Sau đó, rửa lại bằng EtOH 70% Thu lấy cặn và phơi khô ở nhiệt độ phòng

- Hòa tan cặn trong 100l dung dịch TE pH 8,0 và giữ ở 4oC

2.2.4 Thu nhận gen aprE bằng phản ứng PCR

Sử dụng bộ gen của vi khuẩn B subtilis vừa tách chiết làm khuôn để khuếch đại gen

mã hóa Nattokinase bằng PCR với thành phần và chương trình phản ứng như sau:

Hỗn hợp phản ứng được đặt vào máy điều nhiệt với chương trình chạy như hình dưới

Bảng 2.4 Thành phần phản ứng PCR

2.2.5 Tinh sạch sản phẩm khuếch đại gen aprE

- Bổ sung chloroform vào mẫu sản phẩm PCR với tỉ lệ thể tích là 1v/1v Ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC, thu dịch nổi

- Bổ sung Na-acetat 3M với tỉ lệ là 1/10 thể tích mẫu và bổ sung ethanol 99% lạnh với tỉ lệ là 2,5 thể tích mẫu Ử ở 4oC khoảng 30 phút, sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC, thu tủa

- Rửa tủa bằng 500l ethanol 70% lạnh, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở

4oC, thu tủa Tủa được để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, sau đó bổ sung 30l nước cất vô trùng

- Điện di kiểm tra lại sản phẩm tinh sạch trên gel agarose 1% cùng với thang DNA chuẩn 1kb

2.2.6 Thu nhận plasmid bằng phương pháp SDS kiềm

Quy trình tách chiết plasmid pAX01 từ E coli DH5 bao gồm các bước sau:

- Cấy chuyền chủng E coli mang plasmid sang 5ml LB lỏng có bổ sung kháng sinh

ampicillin ở nồng độ 100g/ml, lắc qua đêm ở 37oC

- Ly tâm thu sinh khối tế bào ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

95oC

1 phút

45giây

72oC 72oC 3,5 phút 15 phút

- Hút bỏ phần dịch, bổ sung 100l dung dịch I, vortex mạnh để phá màng Thêm 200l dung dịch II, đảo nhẹ vài lần Thêm 150l dung dịch III lạnh, đảo nhẹ thật

kĩ và ủ trong đá 15 phút

- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC Chuyển dịch nổi sang một eppendorf mới, bổ sung 1l RNase 10mg/ml, đảo nhe Ủ hỗn hợp ở 37oC trong 1 giờ 30 phút

- Bổ sung 500l hỗn hợp phenol: chloroform (1v:1v), đảo nhẹ nhiều lần Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC Hút nhẹ nhàng dịch nổi sang một eppendorf mới

- Bổ sung 500l chloroform, đảo nhẹ nhiều lần Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút Hút nhẹ nhàng dịch nổi sang một eppendorf mới

- Thêm sodium acetat 3M với tỉ lệ là 1/10 thể tích mẫu và bổ sung ethanol 99% lạnh với tỉ lệ là 2,5 thể tích mẫu Ử ở 4oC khoảng 30 phút, sau đó ly tâm 13.000 vòng/phút trong 30 phút ở 4oC, thu tủa

- Rửa tủa bằng 500l ethanol 70% lạnh, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút ở

4oC Thu tủa, để tủa khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng

- Hòa tan tủa trong 50l nước cất vô trùng và giữ ở -20oC

- Điện di kiểm tra sản phẩm tách chiết trên gel agarose 1%

2.2.7 Tạo dòng tế bào E coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein

Nattokinase trong vector pBluescript II KS (+), kí hiệu pB

Đoạn gen aprE được dòng hóa vào vector pB theo chiến lược tạo dòng đầu bằng Sản phẩm tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E coli DH5 nhằm lưu trữ plasmid tái tổ hợp

in vivo Các bước thực hiện như sau:

- Cắt mở vòng plasmid pB bằng EcoRV

- Tinh chế sản phẩm cắt bằng bộ kít tinh chế DNA

- Đoạn DNA của gen mã hóa cho enzym Nattokinase được nối vào plasmid pB đã chuẩn bị ở trên để tạo plasmid tái tổ hợp

- Hóa biến nạp hỗn hợp dịch nối vào tế bào khả nạp E coli DH5

- Trải hỗn hợp hóa biến nạp lên môi trường LB-Amp100 có bổ sung X-gal

- Chọn khuẩn lạc màu trắng làm khuẩn lạc dự tuyển

- Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi T3, T7, khuôn DNA là tế bào E

coli DH5 từ khuẩn lạc màu trắng mọc trên môi trường LB-Amp100

- Chọn khuẩn lạc cho kết quả phản ứng PCR dương tính Khuẩn lạc này được dùng

làm khuôn cho phản ứng PCR khuẩn lạc với cặp mồi aprE-F-BamHI

aprE và đặt phản ứng nối pB với aprE với thể tích đoạn chèn-insert (gen aprE) và vector pB

được tính theo công thức sau:

ng vector x (kb kích thước insert/kb kích thước vector) x (tỷ lệ insert/vector)

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng cắt plasmid pB bằng EcoRV

Tính toán dựa vào công thức trên, cuối cùng ta có được thành phần phản ứng nối

Phản ứng nối trên để ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ, hết thời gian ủ thêm 0,5l enzym

EcoRV cho một phản ứng và ủ sản phẩm ở 37oC trong 1 giờ Sau đó, sản phẩm nối được hóa

biến nạp vào tế bào khả nạp E coli DH5

2.2.8 Tạo dòng tế bào E coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein

Nattokinase trong hệ thống vector pAX01

Gen aprE được nối với plasmid pAX01 tại vị trí enzym cắt hạn chế BamHI và SacII, và biến nạp vào E coli bằng hóa biến nạp Các dòng E coli mang vector có gen chèn

được sàng lọc bằng nuôi cấy trên môi trường LB có ampicillin 100µg/ml và bằng phản ứng PCR khuẩn lạc với mồi xuôi thiết kế trên khung plasmid pAX01 và mồi ngược là trình tự bắt

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng nối pB và aprE

Bảng 2.7 Thành phần phản ứng cắt kiểm tra pB-aprE bằng BamHI

cặp bổ sung với đầu 3’ gen aprE Dòng E coli chọn lọc được tách chiết thu nhận plasmid, kiểm tra cấu trúc plasmid bằng enzym cắt hạn chế EcoRV Gen mã hóa được giải trình tự và

phân tích sự đa dạng

Đoạn gen aprE được dòng hóa vào plasmid pAX01 theo chiến lược tạo dòng đầu so

le Sản phẩm tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E coli DH5Các bước thực hiện như sau:

- Plasmid pAX01 sau khi tách chiết và kiểm tra bằng điện di sẽ được cắt bằng hai

enzym BamHI và SacII không đồng thời cùng lúc

- Đoạn gen aprE sau khi tinh sạch cũng sẽ được cắt bằng hai enzym BamHI và

SacII không đồng thời cùng lúc

- Nối đoạn gen aprE và plasmid pAX01 đã cắt ở trên với nhau và sản phẩm nối được hóa biến nạp vào tế bào khả nạp E coli DH5

- Trải tế bào trên môi trường LB-Amp100, ủ ở 37oC qua đêm Chọn các khuẩn lạc

có mọc trên môi trường LB-Amp100

- Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với khuôn DNA là tế bào E coli mọc được trên môi trường LB-Amp100 với cặp mồi aprE-F-BamHI và aprE-R-SacII Những khuẩn lạc cho kết quả phản ứng PCR dương tính với đoạn gen aprE được

cấy vào môi trường lỏng LB-Amp100 để thực hiện tách chiết plasmid

- Thực hiện phản ứng PCR với khuôn là plasmid được tách chiết từ các khuẩn lạc

dự tuyển với cặp mồi xuôi trên khung plasmid và mồi ngược trên gen mã hóa

- Các plasmid có phản ứng PCR cho sản phẩm khuếch đại tương ứng kích thước dự

đoán sẽ được cắt bằng enzym BamHI/SacII

- Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% với thang DNA 1kb chuẩn để kiểm tra

lại kích thước của plasmid và đoạn gen aprE

Ủ hỗn hợp cắt bằng BamHI ở 37oC trong 2 giờ Sau đó, tinh chế sản phẩm cắt qua

cột tinh chế và tiếp tục cắt bằng enzym thứ hai là SacII, ủ ở 37oC trong 6 giờ

Sau đó, tiếp tục tinh chế sản phẩm cắt plasmid và gen aprE bằng SacII qua cột và

thực hiện phản ứng nối, ủ qua đêm ở 22oC

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 và gen aprE bằng BamHI

Bảng 2.9 Thành phần phản ứng cắt plasmid pAX01 và gen aprE bằng SacII

Bảng 2.10 Thành phần phản ứng nối

Enzym ligase l

Sau đó, sản phẩm nối được hóa biến nạp vào tế bào khả nạp E coli DH5

2.2.9 Tạo dòng tế bào E coli DH5 tái tổ hợp mang gen mã hóa cho protein

Nattokinase trong hệ thống vector pBG01

Gen aprE được nối với plasmid pBG01 tại vị trí enzym cắt hạn chế BamHI và XbaI,

và biến nạp vào E coli bằng hóa biến nạp Các dòng E coli mang vector có gen chèn được

sàng lọc bằng nuôi cấy trên môi trường LB có ampicillin 100µg/ml và bằng phản ứng PCR

khuẩn lạc với mồi xuôi là trình tự bắt cặp bổ sung với đầu 5’ gen aprE và mồi ngược được thiết kế trên khung plasmid pBG01 là pMTL-R Dòng E coli chọn lọc được tách chiết thu nhận plasmid, kiểm tra cấu trúc plasmid bằng enzym cắt hạn chế EcoRI

Đoạn gen aprE được dòng hóa vào plasmid pBG01 theo chiến lược tạo dòng đầu so

le Sản phẩm tái tổ hợp được biến nạp vào tế bào E coli DH5 Các bước thực hiện như sau:

- Plasmid pBG01 sau khi tách chiết và kiểm tra bằng điện di sẽ được cắt bằng hai

enzym BamHI và XbaI đồng thời cùng lúc

- Đoạn gen aprE sau khi tinh sạch cũng sẽ được cắt bằng hai enzym BamHI và

XbaI đồng thời cùng lúc

- Nối đoạn gen aprE và plasmid pBG01 đã cắt ở trên với nhau và sản phẩm nối được hóa biến nạp vào tế bào khả nạp E coli DH5

- Trải tế bào trên môi trường LB-Amp100, ủ ở 37oC qua đêm Chọn các khuẩn lạc

có mọc trên môi trường LB-Amp100

- Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với khuôn DNA là tế bào E coli mọc được

trên môi trường LB-Amp100 với cặp mồi aprE-F-BamHI và pMTL-R Những

khuẩn lạc cho kết quả phản ứng PCR dương tính với đoạn gen aprE được cấy vào

môi trường lỏng LB-Amp100 để thực hiện tách chiết plasmid

- Thực hiện phản ứng PCR với khuôn là plasmid được tách chiết từ các khuẩn lạc

dự tuyển với cặp mồi xuôi trên gen mã hóa và mồi ngược trên khung plasmid

- Các plasmid có phản ứng PCR cho sản phẩm khuếch đại tương ứng kích thước dự

đoán sẽ được cắt bằng enzym BamHI/XbaI

- Điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% với thang DNA 1kb chuẩn để kiểm tra

lại kích thước của plasmid và đoạn gen aprE

Thành phần Thể tích sử dụng Thể tích sử dụng

Phản ứng nối được giữ ở 22oC trong 4 giờ Sau đó, sản phẩm nối được hóa biến nạp

vào tế bào khả nạp E coli DH5

Bảng 2.11 Thành phần phản ứng cắt plasmid pBG01 và gen aprE bằng

BamHI và XbaI

Bảng 2.12 Thành phần phản ứng nối

2.2.10 Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5 và hóa biến nạp sản phẩm nối vào tế bào khả nạp E coli DH5

a) Chuẩn bị tế bào khả nạp E coli DH5

- Cấy một khuẩn lạc đơn E coli DH5α vào 5ml môi trường LB lỏng, nuôi cấy lắc

- Bỏ dịch nổi và huyền phù nhẹ nhàng trong 10ml CaCl2 0,1M lạnh 4oC

- Ủ trong đá lạnh, thời gian 20 phút

- Sau đó ly tâm thu sinh khối ở 6.000 vòng/phút, trong 3 phút, 4oC

- Bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào và huyền phù lại trong 5ml dung dịch hỗn hợp 0,1M CaCl2 lạnh và glycerol 15% lạnh

- Dịch huyền phù tế bào được chia vào các eppendorf 1,5ml vô trùng, lạnh (khoảng 200l/eppendorf) và giữ ở -20oC

b) Hóa biến nạp sản phẩm nối vào tế bào khả nạp E coli DH5 

- Cho toàn bộ thể tích sản phẩm nối vào eppendorf tế bào khả nạp đã được chuẩn bị

ở trên, để vào đá lạnh trong 30 phút

- Sau đó cho sốc nhiệt ở 42oC trong 2 phút

- Nhanh chóng chuyển mẫu vào đá lạnh, tiếp tục để trong 5 phút

- Thêm 900l môi trường LB vào các ống eppendorf trên Ủ ở 37oC trong 30 phút

- Ly tâm thu sinh khối ở 8.000 vòng/phút, thời gian 1 phút

- Bỏ 900l dịch nổi, huyền phù khoảng 100l dịch còn lại và trải toàn bộ trên đĩa môi trường LB-Amp100, ủ ở 37oC trong 16-18 giờ

- Tiến hành đồng thời hai mẫu đối chứng: đối chứng dương biến nạp 3l plasmid và đối chứng âm không có plasmid

2.2.11 Tinh chế sản phẩm cắt qua cột

- Thêm 1v Binding buffer Đảo nhẹ Xem màu của dung dịch, màu vàng là pH tối ưu cho DNA bám vào cột Nếu dung dịch cam hoặc tím,, thêm 10l sodium acetate 3M, pH 5,2, đảo nhẹ dung dịch sẽ chuyển màu vàng

- Nếu đoạn DNA < 500bp, bổ sung isopropanol với thể tích là 1v Đảo nhẹ Tuy nhiên khi xử lý isopropanol lượng DNA thu được sẽ thấp

- Chuyển toàn bộ dịch mẫu từ giai đoạn 1 hoặc giai đoạn 2 vào cột tinh chế Ly tâm

ở 12.000 vòng/phút trong 1 phút Thu dịch cho lên cột và ly tâm lại lần nữa Bỏ dịch

- Thêm 700l Wash buffer (đã thêm ethanol) vào cột Ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 1 phút, bỏ dịch

- Đặt cột vào eppendorf mới Ly tâm cột thêm 1 phút ở tốc độ 12.000 vòng/phút để sạch cồn và chuyển cột vào eppendorf mới

- Thêm 50l buffer Elution (80oC) vào giữa cột Để cột khô ở nhiệt độ 37oC trong thời gian 15-20 phút Sau đó ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 1 phút

- Thu dịch và bảo quản sản phẩm ở -20oC

2.2.12 Chuẩn bị tế bào khả nạp Bacillus subtilis và biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả nạp B subtilis

Hai chủng Bacillus subtilis được sử dụng làm tế bào khả nạp và biểu hiện gen là B

subtilis 1012, B subtilis DB104

a) Chuẩn bị tế bào khả nạp Bacillus subtilis

- Nuôi cấy lắc chủng Bacillus subtilis trong ống nghiệm 5ml môi trường LB qua

đêm

- Chuyển 1ml dịch nuôi cấy qua đêm vào 50ml môi trường HS (tỉ lệ 1/50 hoặc 1/20), nuôi cấy lắc ở 37oC với tốc độ 250 vòng/phút trong khoảng 3 – 5h để giá trị OD578 đạt khoảng từ 2.5 – 3

- Khi OD578 đạt giá trị từ 2.5 – 3, lấy 10ml dịch nuôi cấy cho vào erlen 100ml vô trùng mỗi 30 phút Sau đó bổ sung 1ml glycerol 99% lạnh, giữ trong đá lạnh trong thời gian

30 phút

- Chuyển nhanh dịch nuôi cấy vào các eppendorf 1,5ml (1ml/eppendorf) và bảo quản ở -20oC

b) Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả nạp B subtilis

- Lấy một eppendorf chứa tế bào khả nạp B subtilis đã chuẩn bị sẵn ở trên để ở nhiệt

độ phòng hoặc 37oC cho rả đông

- Chuyển tế bào khả nạp trong eppendorf vào một ống nghiệm lớn vô trùng Thêm vào ống nghiệm 10ml môi trường LS (tỉ lệ 1/10) và lắc ở tốc độ 80 vòng/phút trong 2 giờ ở

30oC

- Sau đó dùng pipetman hút 1ml dịch nuôi cấy cho vào eppendorf mới vô trùng và

bổ sung 100l EGTA nồng độ 0,1M, pH 7,2 lọc, không hấp Để yên ở nhiệt độ phòng trong

5 phút

- Tiếp tục bổ sung DNA tái tổ hợp (0,5-2g) vào eppendorf và nuôi cấy lắc với tốc

độ 250 vòng/phút ở 37oC trong 2 giờ

- Ly tâm thu sinh khối với tốc độ 4.000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

- Hút bỏ 0,9ml dịch nổi và huyền phù tế bào trong 0,1ml dịch nổi còn lại Sau đó đem trãi trên môi trường có kháng sinh chọn lọc

2.2.13 Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis có mang plasmid biểu hiện pAX01 chứa gen aprE, viết tắt là pAX01-aprE

a) Bacillus subtilis 1012

Chủng Bacillus subtilis 1012 lacA::spec là chủng mang cassette lacA::spec - là cassette chứa locus lacA mang gen mã hóa cho enzym -galactosidase tương ứng với vùng

lacA trên plasmid pAX01 và mang gen kháng kháng sinh spectinomycine Plasmid

pAX01-PxylA -aprE có vị trí tương đồng tại locus lacA trên bộ gen Bacillus subtilis Khi plasmid được biến nạp vào tế bào Bacillus subtilis, sẽ xảy ra sự trao đổi chéo kép đồng dạng tại vùng

thượng và hạ nguồn gen lacA trên bộ gen và kết quả là casset biểu hiện aprE được sát nhập vào bộ gen Bacillus subtilis Phần chèn của plasmid có mang đoạn gen kháng kháng sinh

erythromycin nên thể biến nạp có khả năng kháng và phát triển được trên đĩa môi trường kháng sinh này Hơn nữa, việc trao đổi đồng dạng này còn dẫn đến sự thay thế gen kháng

spectinomycin vốn đã được cấu trúc sẵn tại locus lacA của chủng chủ Bacillus Do vậy, thể

biến nạp sẽ trở nên nhạy cảm với spectinomycin nếu trao đổi đúng vị trí

Quá trình tạo dòng gồm các bước như sau:

- Tách plasmid tái tổ hợp pAX01-aprE từ dòng tế bào E coli DH5 đã tạo dòng

Chủng Bacillus subtilis DB104 là chủng đã được loại bỏ các gen mã hóa các

protease có hoạt tính phân hủy fibrin không mong muốn Do vậy chủng này được sử dụng làm chủng chủ trong biểu hiện Nattokinase tái tổ hợp là một trong những phương cách giúp

dễ dàng kiểm soát hoạt tính thô của enzym trong suốt quá trình lên men Quá trình tạo dòng

chủng B subtilis DB104 mang plasmid tái tổ hợp pAX01-aprE gồm các bước như sau:

Quá trình tạo dòng gồm các bước như sau:

- Tách plasmid tái tổ hợp pAX01-aprE từ dòng tế bào E coli DH5 đã tạo dòng

thành công

- Biến nạp plasmid đã tách vào tế bào khả nạp Bacillus subtilis DB104 Lúc này ta được tế bào B subtilis DB104 đã biến đổi mang gen kháng kháng sinh

erythromycin

- Trải tế bào trên môi trường LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc là erythromycin nồng độ 100g/ml, ủ ở 37oC qua đêm

- Quan sát và chọn các khuẩn lạc có mọc trên môi trường LB-Ery100

- Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với khuôn DNA là tế bào B subtilis DB104

mọc được trên môi trường LB-Ery100 với cặp mồi là mồi xuôi trên khung

plasmid pAX01-F-seq và mồi ngược trên gen aprE-R-SacII Những khuẩn lạc cho kết quả phản ứng PCR dương tính với đoạn gen aprE được cấy vào môi

trường lỏng LB-Ery1 để thực hiện tách chiết bộ gen

- Thực hiện phản ứng PCR với khuôn là bộ gen được tách chiết từ các khuẩn lạc dự tuyển với cặp mồi xuôi và ngược như trên

- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% với thang DNA 1kb để đọc kết quả

2.2.14 Tạo dòng tế bào Bacillus subtilis DB104 có mang plasmid biểu hiện pBG01 chứa gen aprE, viết tắt là pBG01-aprE

Quá trình tạo dòng gồm các bước như sau:

- Tách plasmid tái tổ hợp pBG01-aprE từ dòng tế bào E coli DH5 đã tạo dòng

- Quan sát và chọn các khuẩn lạc có mọc trên môi trường LB-Cm10.

- Thực hiện phản ứng PCR khuẩn lạc với khuôn DNA là tế bào B subtilis DB104 mọc được trên môi trường LB-Cm10 với cặp mồi là mồi xuôi trên gen aprE-F-

BamHI và mồi ngược trên khung plasmid pMTL-R Những khuẩn lạc cho kết quả

phản ứng PCR dương tính với đoạn gen aprE được cấy vào môi trường lỏng

LB-Cm10 để thực hiện tách chiết plasmid

- Thực hiện phản ứng PCR với khuôn là plasmid được tách chiết từ các khuẩn lạc

dự tuyển với cặp mồi xuôi và ngược như trên

- Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% với thang DNA 1kb để đọc kết quả

2.2.15 Biểu hiện gen aprE bằng hệ thống pAX01 trong Bacillus subtilis

a) Bacillus subtilis 1012

Hoạt hóa tế bào Bacillus subtilis 1012 mang plasmid tái tổ hợp pAX01-aprE trong

môi trường LB-Ery100, lắc qua đêm ở 37oC, 250 vòng/phút Cấy 500l chủng đã hoạt hóa sang một erlen chứa 10ml môi trường LB nuôi cấy lắc ở 37oC, 250 vòng/phút, trong 1,5-2 giờ để đạt OD578 khoảng 0,6 – 0.8 Sau đó bổ sung xylose vào môi trường trên sao cho nồng

độ cuối là 0,5%, tiếp tục nuôi cấy lắc ở 250 vòng/phút, 37oC Cứ sau 1 giờ, tiến hành ly tâm thu dịch lên men Xử lý mẫu với dung dịch nạp mẫu 5X cho điện di SDS-PAGE Phân tích

sự biểu hiện của protein tái tổ hợp AprE bằng SDS-PAGE

b) Bacillus subtilis DB104

Quy trình cảm ứng biểu hiện gen aprE gồm các bước sau:

- Hoạt hóa chủng B subtilis DB104 mang plasmid tái tổ hợp pAX01-aprE trong 5

ml môi trường LB-Ery1, lắc qua đêm ở 37oC, 250 vòng/phút

- Chuyển 600l chủng đã hoạt hóa sang erlen 250ml chứa 30ml môi trường LB, nuôi cấy lắc ở 37oC, 250 vòng/phút, trong khoảng 3 giờ để đạt OD578 khoảng 0,6 – 0.8

- Sau đó bổ sung xylose vào môi trường nuôi cấy sao cho nồng độ cuối là 0,5%, tiếp tục nuôi cấy lắc ở 250 vòng/phút, 37oC Lấy 10ml dịch nuôi cấy tại các thời điểm 0 giờ, 1,5 giờ và 3 giờ cảm ứng xylose

- Ly tâm lạnh dịch nuôi cấy ở các thời điểm cảm ứng trên trong 10 phút thu tế bào

và dịch nổi Xử lý mẫu tế bào và mẫu dịch nổi như sau: