Tạo dòng, biểu hiện và tinh chế hFGF2 (FIBROBLAST GROWTH FACTOR2) tái tổ hợp từ Escherichia coli

Để ngăn ngừa ngừa hiện tượng đó, FGF-2 đã được chứng minh là có khả năng thúc đẩy sự phát triển của các nguyên bào sợi, hỗ trợ quá trình tổng hợp collagen, hình thành mạch máu giúp ngăn

1.1.1 Giới thiệu chung

Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGF được Armelin tìm thấy trong dịch chiết

tuyến yên vào năm 1973 Năm 1974, Gospodarowicz công bố nghiên cứu tìm thấy nhân tố tăng trưởng này trong dịch chiết não bò Nghiên cứu này cũng tiến hành thử nghiệm hoạt tính sinh học và kết luận protein được tìm thấy có tác dụng làm tăng sinh các nguyên bào sợi Sau đó, Gospodarowicz tinh chế phân đoạn dịch chiết được tìm thấy ở pH acid và basic Thí nghiệm đã cô lập được hai dạng FGF khác nhau tương ứng với mỗi phân đoạn pH Nhân tố tăng trưởng thu nhận được ở pH acid được gọi là FGF-1 còn nhân tố tăng trưởng thu nhận ở pH bazơ được gọi là FGF-2 Hai loại

protein có độ tương đồng cao về trình tự amino acid Hiện nay, trên 20 thành viên của

họ nhân tố tăng trưởng FGF đã được tìm thấy và nghiên cứu về cấu trúc, hoạt tính…

để ứng dụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau [5, 8]

Nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF) được tìm thấy ở rất nhiều loài, từ giun tròn đến con người Ở động vật có xương sống, trên 20 thành viên của họ nhân tố tăng trưởng FGF đã được tìm thấy với khối lượng phân tử từ 17 đến 34 kDa Có 18 loại nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FGF1–FGF10 and FGF16–FGF23) được phân vào sáu họ nhỏ dựa vào sự tương đồng trình tự cũng như sự phát sinh giống loài:

FGF1 và FGF2; FGF3, FGF7, FGF10, FGF22; FGF4, FGF5 và FGF6; FGF8, FGF17và FGF18; FGF9, FGF16 và FGF20; FGF19, FGF21 và FGF23 Những nhân tố FGFs không được xếp vào họ nào (FGF11-FGF14) có sự tương đồng trình tự cao với họ FGF nhưng không gắn được lên thụ thể của FGF và vì thế không được coi là thành viên của họ FGF (như FGF15 tìm thấy ở chuột là dạng tương đồng với FGF19 ở

người) FGF hầu hết là những nhân tố cận tiết (paracrine), có vai trò trong sự hình thành mô và các cơ quan ở những giai đoạn phát triển của phôi (năm phân họ FGF đầu tiên đều nằm trong nhóm này) Ngược lại, phân họ cuối cùng gồm FGF19, FGF21, FGF23 có vai trò như những nhân tố nội tiết (endocrine), có vai trò điều hòa sự cân bằng acid mật, cholesterol, glucose, vitamin D và phosphate trong cơ thể [6]

Phần lớn các gen fgf nằm rải rác trên toàn bộ gen Ở người, 22 gen fgf và vị trí của

chúng (trừ FGF-16) đã được xác định Nhiều gen của protein FGF được nhóm lại trên cùng một nhiễm sắc thể, ví dụ như FGF-3, FGF-4 và FGF-19 có gen nằm ở nhiễm sắc thể số 11, cánh dài, cách nhau lần lượt là 40 và 10kb Điều này cho thấy các gen mã hóa cho họ protein FGF được tạo nên bởi cơ chế nhân đôi, chuyển vị gen và nhiễm sắc thể trong quá trình tiến hóa [8, 18]

Họ nhân tố tăng trưởng FGF không những tương đồng cao về trình tự amino acid 71%) mà cấu trúc gen của chúng cũng được bảo tồn cao giữa các loài động vật có

(13-xương sống Các protein thuộc họ nhân tố tăng trưởng này có ái lực cao với heparan sulfate proteoglycan Sự tương tác với heparan sulfate giúp hoạt hóa một trong bốn loại receptor của FGF trên bề mặt tế bào [7, 17]

Hình 1.1 Sơ đồ các thành phần trong chuỗi polypeptide của FGF [8]

Tất cả các FGF đều có những peptide tín hiệu Tuy nhiên, FGF9, 16 và 20 được tiết thông qua mạng lưới nội chất và bộ máy golgi; còn FGF1 và FGF2 được tiết theo những con đường riêng biệt độc lập nhau Các họ FGFs có một vùng lõi tương đồng bao gồm 120 – 130 amino acids xếp trật tự tạo thành 12 phiến β không song song

(β1β12) nối với nhau bằng những đầu carboxyl và amino Vị trí gắn của Heparan

sulphate glucosaminoglycan (HSGAG) gọi là các HBS nằm ở bên trong lõi FGF bao

gồm một vòng nối β1-β2 và phần cầu nối giữa β10-β12 Đối với những FGFs cận tiết, những nhân tố hình thành các HBS là các bề mặt tích điện dương và giáp nhau Ngược lại, các HBS của phân họ FGF19, 21 và 23 chứa một trình tự hình thành bởi vòng nối β1-β2 và phần cầu nối giữa β10-β12 làm hạn chế vùng HSGAG gắn lên lõi FGF, nên những phân họ này được tạo ra theo cơ chế nội tiết [6]

Họ nhân tố tăng trưởng FGF là một họ protein đa chức năng Trong quá trình phát triển phôi, FGF có nhiều vai trò trong điều hòa sự tăng sinh tế bào, di chuyển và biệt hóa Trong cơ thể trưởng thành, họ protein FGF là các yếu tố cân bằng nội môi Ngoài ra họ protein này còn có chức năng sửa chữa các mô, đáp ứng với các tổn thương Một nhóm nhỏ các protein thuộc họ FGF biểu hiện ở các mô trưởng thành có vai trò quan trọng trong dẫn truyền tín hiệu thần kinh trong hệ thần kinh trung ương và ngoại vi Tuy

nhiên, khi biểu hiện bất thường, các nhân tố tăng trưởng này có thể gây ung thư [5, 8]

Bảng 1.1 Các chức năng cơ bản của họ nhân tố FGF [34]

Tăng sinh tế bào FGF-1, FGF-2

FGF-4 FGF-7, FGF-10 FGF-18

Tế bào mỡ tiền thân

Tế bào biểu mô, tế bào nội mô,

tế bào gốc thần kinh

Tế bào gốc lá phôi

Tế bào biểu mô

Tế bào tạo xương, tế bào sụn, hủy cốt bào

Sự di trú tế bào FGF-2

FGF-4 FGF7 FGF8

Tế bào thần kinh đệm, tế bào cơ

Tế bào cơ

Tế bào nội mô, tế bào sừng

Tế bào mào thần kinh

Sự biệt hóa tế bào FGF1, FGF2

FGF7

Tế bào thần kinh biểu mô

Tế bào sừng FGF20 Tế bào gốc khỉ

Sự hình thành mạch FGF1, FGF2 Tế bào biểu mô

Chức năng Phân họ Tế bào đích

1.1.2 Nhân tố tăng trưởng FGF-2

1.1.2.1 Cấu trúc của nhân tố tăng trưởng FGF-2

Hình 1.2 Cấu trúc gene mã hóa protein FGF-2[17]

Gen mã hóa FGF-2 người nằm trên vùng q26-27 của nhiễm sắc thể số 4 Gen dài

khoảng 71kb gồm một vùng không dịch mã 5’UTR (Untranslated Region), 3 exon, 2

intron và vùng không dịch mã lớn 3’UTR (hình 1.2) Vùng không dịch mã 5’UTR và

3’UTR chứa các yếu tố điều hòa sự biểu hiện nhân tố tăng trưởng FGF-2, mật độ tế bào, các chất dẫn truyền thần kinh, con đường truyền tín hiện thứ cấp…[17, 20]

Hình 1.3 Cấu trúc ba chiều của FGF-2[6]

FGF-2 có hình dạng gần giống với một hình chóp tam giác Mỗi mặt bên hợp thành bởi hai chuỗi β Ba mặt bên của hình chóp hình thành một khoang trống do sáu chuỗi β song song ngược chiều nhau tạo thành Phần đáy của hình chóp gồm thêm sáu chuỗi β

Như vậy, toàn bộ phân tử FGF-2 được cấu tạo bởi 12 chuỗi β xếp song song ngược

chiều nhau (hình 1.3) FGF-2 được tìm thấy lần đầu tiên là dạng protein có 146 amino

acid với trọng lượng phân tử khoảng 16,5kDa được phân lập từ tuyến yên Khi cDNA của FGF-2 được tạo dòng, codon AUG được xác định như là codon mở đầu cho quá trình dịch mã cho protein gồm 155 amino acid Ngoài ra không còn tìm thấy bất cứ codon AUG nào khác ở thượng nguồn mRNA Vì vậy, codon AUG được cho là codon

mở đầu cho quá trình dịch mã Tuy nhiên, dựa vào trình tự cDNA tìm thấy trong não lợn, não chuột, gan, phôi người, tuyến tiền liệt và một số tế bào được nuôi cấy khác, người ta nhận thấy rằng phân tử FGF-2 trên thực tế có dài hơn hoặc ngắn hơn kích trước đây Các dạng có ngắn hơn được cho là kết quả của việc phân giải dạng 155 amino acid Các dạng dài hơn và có trọng lượng phân tử lớn hơn (196, 201, và 210

amino acid) đã được chứng minh thông quá việc phân tích phiên mã/dịch mã in vitro

Và kết quả cho thấy codon CUG ở đầu 5’ so với codon AUG (vị trí khởi đầu phiên mã dạng FGF-2 gồm 155 amino acid) được sử dụng làm codon mở đầu cho quá trình dịch

mã các dạng FGF-2 có trọng lượng phân tử lớn này [4, 5, 11]

Kết quả của quá trình dịch mã này sẽ tạo ra 5 dạng protein FGF-2 khác nhau với các trọng lượng phân tử và đặc điểm khác nhau Khi cDNA FGF-2 được biểu hiện trong tế bào, dạng mở đầu bằng codon AUG có trọng lượng phân tử thấp (LMW) là 18kDa Dạng còn lại được mở đầu bằng codon CUG có trọng lượng phân tử cao

tự lặp lại Gly-Arg (hình 1.4) Trong đó, ít nhất sáu arginines trong motif Glu-Arg đã

được methyl hóa Chưa có nghiên cứu nào về ảnh hưởng của những trình tự arginines

đã được methyl hóa này nhưng nó có thể ảnh hưởng đến sự di chuyển hay ở lại trong

nhân của FGF-2 khi vận chuyển qua màng nhân Điều này lý giải phần nào nguyên nhân FGF-2 trọng lượng phân tử thấp tồn tại chủ yếu trong tế bào chất và có vai trò tác động theo cơ chế cận tiết (paracrine) và tự tiết (autocrine) Trong khi đó, FGF-2 trọng lượng phân tử cao tồn tại trong nhân, trong các tiểu phần ribosom và có vai trò tác động theo cơ chế nội tiết (endocrine) [7, 19, 21]

Kết quả sắp gióng cột các trình tự amino acid của FGF-2 và FGF-1 cho thấy có độ tương đồng cao về trình tự amino acid (53%), do đó, dạng gấp cuộn của hai phân tử này cũng giống nhau Ngoài ra, các amino acid bảo tồn của họ protein FGF được tìm thấy trong vùng lõi của FGF-2 Điều này củng cố thêm dự đoán rằng các thành viên khác thuộc họ protein FGF sẽ có cấu trúc tương tự với FGF-2 [6, 21]

Các vị trí tích điện dương (Lys-138, Lys-134, Lys-128, Arg-129, Lys-144) trên

protein FGF-2 được xác định là vị trí gắn heparin của protein FGF Vị trí gắn receptor của protein được tạo thành nhờ đoạn peptide 115-124 (chứa Tyr-123 and Trp-124) trên protein FGF-2 Trên cấu trúc không gian 3 chiều, phân tử FGF có hai gốc cysteine (Cys-78 và Cys-96) được lộ ra ngoài và hai gốc cysteine khác (Cys-34 và Cys -101) được quay vào phía bên trong lõi kị nước Do đó, bốn cysteine có thể tạo thành hai cầu nối diusulfide Tuy nhiên, khi phân tích cấu trúc tinh thể thì khoảng cách giữa hai cặp cysteine này quá xa để có thể hình thành cầu nối bội phân tử nhưng có khả năng hình thành cầu nối liên phân tử [7, 19]

Phân tử FGF-2 tích điện dương ở vị trí Lys (vị trí gắn với heparin), sinh ra năng lượng trong phân tử, làm cấu trúc của protein không ổn định Những phân tử tích điện âm như heparin tương tác với những vị trí này, làm cho FGF-2 trở nên ổn định hơn, bảo

vệ FGF-2 chống lại tác động của nhiệt độ, pH cũng như tác động của protease Do đó,

có thể kết luận rằng, những gốc sulfate trên heparin giúp ổn định hoạt tính của FGF-2 Hơn nữa, khi có những ion sulfate tồn tại trong dung dịch, nó cũng gắn vào các vị trí lysine trên FGF và đóng vai trò giúp ổn định hoạt tính của protein này giống như

heparin Tuy nhiên, cả ion sulfate và heparin đều không ngăn được việc hình thành cầu nối disulfide nội/ngoại phân tử của các cystein tự do trong protein Ngoài ra, cũng do

có khả năng tương tác đặc hiệu với heparin nên chất này thường được sử dụng để tinh chế FGF-2 bằng phương pháp sắc kí ái lực [25, 32]

Sự tương tác giữa heparin và FGF-2 còn làm các phân tử này gắn lại với nhau tạo các cấu trúc dimer và tetramer Cơ chế heparin đóng góp vào việc hoạt hóa các receptor của FGF-2 vẫn chưa được biết rõ Sự dimer hóa của FGF-2 là điều kiện cần thiết để FGF-2 gắn và hoạt hóa các receptor của chúng Heparin là một phân tử

glycoaminoglycan được sulfate hóa Một đơn vị heparin disaccharide cơ bản của chuỗi heparin bao gồm phân tử L-iduronic acid (Idu) và D-glucosamine (GlcN) nối với nhau

bởi cầu nối α(1-4) glycoside (hình 1.5) Một đơn vị heparin disaccharide có 3 nhóm

sulfate, một nhóm sulfate liên kết với gốc 2-hydroxyl của Idu và hai nhóm sulfate còn lại liên kết với nhóm 2-amino và 6-hydroxyl của GlcN Heparin có dạng chuỗi xoắn

quay về bên phải trong đó các đơn vị cấu tạo nên chuỗi heparin lệch nhau một góc 180o

[25, 32]

Hình 1.5 Đơn vị heparin saccharide của chuỗi heparin [32]

Các nghiên cứu cho thấy, chuỗi bên của nhóm các amino acid Asn-27, Arg-120, Lys-125 tạo thành cầu nối hydrogen với nhóm sulfate liên kết với gốc 2-hydroxyl của chuỗi heparin [25]

Ngoài tác dụng tương tác với FGF-2 để tạo cấu trúc dimer và tetramer giúp FGF-2 có thể gắn với receptor của nó với ái lực cao hơn, heparin còn bảo vệ nhân tố tăng trưởng

FGF-2 khỏi sự bất hoạt do nhiệt hoặc acid và sự phân giải protein (hình 1.6) [25]

FGF-2 có điểm đẳng điện pI = 9,6 Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy FGF-2 bền ở

pH 7 [25] Với giá trị pI cực đoan như vậy nên việc tinh chế FGF-2 bằng sắc kí trao đổi ion dễ dàng hơn so với các protein có pI gần pH trung tính

Hình 1.6 Cấu trúc dimer dạng cis (a), dimer dạng trans (b) và tetramer (c)

của FGF (hình tròn)và chuỗi heparin [25]

1.1.2.2 Hoạt tính sinh học của FGF-2

FGF-2 là một nhân tố tăng trưởng đa chức năng, nó có vai trò trong sự tăng sinh, di chuyển và biệt hóa tế bào FGF-2 kích thích tăng sinh nguyên bào sợi, nguyên bào cơ,

nguyên bào xương, tế bào thần kinh, tế bào nội mô, tế bào sừng… Trong phôi sớm, FGF-2 có vai trò biệt hóa các mô ngoại phôi bì thành các mô trung phôi, duy trì tính đa năng của tế bào FGF-2 cũng có vai trò quan trọng trong quá trình hình thành mạch máu nhờ khả năng tăng sinh các tế bào nội mô mạch máu, chữa lành vết thương và sửa chữa mô FGF-2 là một chất kích thích phân bào mạnh trên nhiều loại tế bào có nguồn gốc từ trung phôi bì và thần kinh ngoại bì Ở cấp độ hệ cơ quan, FGF-2 cũng đóng vai

trò quan trọng trong sự phát triển các hệ cơ quan khác nhau (bảng 1.2) FGF2 kích

thích các nguyên bào sợi tăng sinh tạo mô hạt lấp đầy khoảng trống do vết thương gây

ra trong quá trình làm lành vết thương FGF-2 tiết ra bởi những tế bào nội mô lót bên trong thành mạch tác động theo cơ chế autocrine kích thích tế bào nội mô thành mạch phân bào, tổ chức các tế bào mới tạo thành theo cấu trúc dạng hình ống và đóng vai trò

là chất hóa hướng động giúp hình thành mạch máu mới [4, 11, 34]

Gần đây, đã tìm thấy nhiều chất kích thích tế bào nội mô phân bào với khối lượng phân

tử 13-18kDa, có ái lực cao với heparin và điểm đẳng điện basic Những chất kích thích phân bào đó bao gồm nhân tố tăng trưởng tế bào hình sao, nhân tố tăng trưởng gắn β heparin và các nhân tố tăng trưởng từ tế bào máu, sụn, võng mạc, đại thực bào, vùng dưới đồi… đều là các dạng của FGF-2, chỉ khác nhau ở đầu N Quá trình xử lý nhân tố tăng trưởng FGF-2 ở các mô khác nhau với các dạng protease đặc trưng cho từng mô

đã tạo nên nhiều dạng FGF-2 như đã liệt kê ở trên Tuy chức năng của FGF-2 trong

môi trường invivo vẫn chưa được biết rõ nhưng những tính chất của FGF-2 trong điều kiện nghiên cứu in vitro cho thấy FGF-2 có vai trò quan trọng trong hình thành mạch

máu mới, làm lành vết thương và có khả năng gây ung thư nếu biểu hiện bất thường [26, 29, 33]

Bảng 1.2 Chức năng của FGF-2 ở các hệ cơ quan khác nhau [4]

Não Duy trì và biệt hóa tế bào thần kinh

Mạch máu Hình thành mạch, tăng sinh tế bào cơ trơn

Hạn chế xơ vựa động mạch và điều hòa huyết áp

Phổi Phân nhánh hình thái, ngăn ngừa xơ hóa

Chi Phát triển chi

Cơ Hình thành cơ

Xương Chữa lành xương tổn thương, hình thành sụn

Cơ quan Chức năng

Quá trình tạo máu Kích thích tạo bạch cầu hạt, tăng tế bào nhân khổng lồ,

duy trì tế bào gốc Chống lại quá trình apoptosis

Hệ sinh sản Tạo tinh trùng

Mắt Duy trì tế bào tiếp nhận ánh sáng và truyền tín hiệu

Da Hình thành hắc tố da

Hình thành tế bào sừng Sửa chữa mô

1.1.2.3 Các hướng ứng dụng của FGF-2

a) Trong nghiên cứu

- Vai trò của FGF-2 trong việc nuôi tế bào gốc phôi người

Khi nuôi tế bào gốc phôi người, cần bổ sung các nhân tố tăng trưởng như FGF-2,

activin A, TGFβ1, Wnt1, Wnt3… vào môi trường nuôi để ức chế sự biệt hóa tế bào

Trong tất cả các cách nuôi tế bào gốc phôi, FGF-2 là thành phần không thể thiếu trong môi trường

Ngoài ra, FGF-2 còn được tạo ra bởi chính tế bào gốc phôi người FGF-2 tạo thành tác động trở lại lên tế bào bằng hai cách Nếu FGF-2 có trình tự tín hiệu giúp điều hòa sự biểu hiện của các gen liên quan đến kiểu hình sơ khai của tế bào Cơ chế tác động của dạng FGF-2 này đang được tiếp tục nghiên cứu Đối với các FGF-2

không gắn thêm các trình tự tín hiệu sẽ được tiết ra ngoài tế bào và tương tác với các thụ thể giúp tế bào gốc phôi người tăng sinh trong tình trạng không biệt hóa

Hiện nay, cách nuôi tế bào gốc phôi trên môi trường xác định trong đó có bổ sung các nhân tố tăng trưởng được ưu tiên sử dụng hơn khi nuôi tế bào dùng cho các ứng dụng trong y học vì tránh được nguy cơ nhiễm chéo mầm bệnh từ lớp tế bào đồng nuôi cấy Các nghiên cứu cho thấy việc kết hợp giữa FGF-2 với các nhân tố tăng trưởng khác noggin, activin A… giúp duy trì trạng thái không biệt hóa của tế bào gốc phôi khi nuôi cấy tế bào gốc phôi trong khoảng thời gian dài [4, 34]

Như vậy, trạng thái không biệt hóa của tế bào gốc người được duy trì nhờ nhân

tố tăng trưởng FGF-2 Cơ chế duy trì trạng thái không biệt hóa của FGF-2 trên tế bào gốc phôi người cần được nghiên cứu cụ thể để có thể tối ưu hóa quy trình nuôi loại tế

bào gốc này [4, 34]

b) Trong y học

- Ngăn ngừa hình thành sẹo lồi

Sự hình thành sẹo lồi được cho là do tình trạng tăng sinh quá mức của nguyên bào sợi cơ và mô đàn hồi của da tại lớp trung bì trong quá trình làm lành các tổn

thương trên da hoặc do đường khâu của vết mổ Những nghiên cứu gần đây cho thấy việc sử dụng FGF-2 có khả năng ngăn ngừa sẹo hiệu quả do tác dụng ức chế quá trình chuyển nguyên bào sợi thành tế bào cơ trơn Ngoài ra, FGF-2 còn thúc đẩy quá trình lành vết thương, giảm khả năng tạo sẹo bằng cách điều chỉnh sự cân bằng chất nền ngoại bào Do đó, FGF-2 được ứng dụng trong xử lý, ngăn ngừa sự hình thành sẹo lồi trên da do phẫu thuật [33, 34]

ra FGF-2 đóng vai trò làm cho quá trình lành hóa vết thương ở da nhanh hơn bằng cách hoạt hóa các đại thực bào (macrophage), kích thích tăng sinh tế bào gốc trung mô giúp đẩy nhanh quá trình co rút đóng kín vết thương [33, 34]

- Điều trị bệnh nhân thiếu máu cục bộ

Trong y học, bệnh thiếu máu cục bộ được định nghĩa là hiện tượng hạn chế sự cung cấp máu đến các mô, gây ra tình trạng thiếu oxy và các chất dinh dưỡng cần thiết cho việc trao đổi chất của tế bào dẫn đến tế bào bị chết và hoại tử mô Thiếu máu cục

bộ thường xuất hiện trong các bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim, thiếu máu cục bộ não, thiếu máu cục bộ chi Tuy nhiên, bệnh thiếu máu cục bộ cơ tim và chi dưới thường là phổ biển nhất và có tỷ lệ tử vọng cao nhất Nguyên nhân gây ra bệnh thiếu máu cục bộ thường là do gặp các vấn đề về mạch máu như xơ vữa động mạch, hạ huyết áp, chèn

ép từ bên ngoài bởi khối u… Bệnh thiếu máu cục bộ thường được điều trị bằng cách phẫu thuật Ví dụ như bệnh nhân thiếu máu cục bộ tim thường được điều trị bằng cách khai thông động mạch bị tắc nghẽn bằng một ống stent hoặc phẫu thuật mở đường lưu thông máu đến mô bị thiếu máu Tuy nhiên, cả hai cách đều có mặt hạn chế là gây nên những tổn thương, cho nên đó không phải là biện pháp điều trị phát huy hiệu quả lâu dài Để khắc phục hạn chế của những phương pháp trước đó, hiện nay người ta sử dụng nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi FGF-2 để điều trị chứng thiếu máu cục bộ tim Một khi vào mô bị thiếu máu, FGF-2 kích thích sự tăng trưởng tế bào và thúc đẩy

sự phát triển mạch máu mới từ mạch máu đã tồn tại trước đó [13, 18]

c) Trong mỹ phẩm

Các tính chất cơ học, bảo vệ, phục hồi của da suy giảm dần theo thời gian và tuổi tác Ngoài ra, các yếu tố gây stress của môi trường bên ngoài như ô nhiễm, tia tử

ngoại… làm đẩy nhanh quá trình lão hóa của da Sự tác động của tuổi tác và môi

trường dẫn đến làn da bị khô ráp, nhăn nheo cũng như thay đổi sắc tố Về mặt mô học, theo thời gian lượng collagen trong da sẽ suy giảm, da sẽ mất dần các nguyên bào sợi

và mạng lưới mạch máu Để ngăn ngừa ngừa hiện tượng đó, FGF-2 đã được chứng minh là có khả năng thúc đẩy sự phát triển của các nguyên bào sợi, hỗ trợ quá trình tổng hợp collagen, hình thành mạch máu giúp ngăn ngừa và đẩy lùi tiến trình lão hóa của da [4, 34]

Nhờ có khả năng ngăn ngừa sự lão hóa da mà hiện nay FGF-2 được ứng dụng rất nhiều trong công nghệ mỹ phẩm Một số sản phẩm đã được thương mại chứa FGF-2

đã được đưa ra thị trường chăm sóc sắc đẹp và nhận được những phản hồi tích cực

1.2 BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP Ở Escherichia coli

1.2.1 Giới thiệu chung

Vào những năm 1970, các thí nghiệm sản xuất protein tái tổ hợp đầu tiên đã thành công ở vi khuẩn như hormon somatostatin, sau đó là insulin đều có giá trị cao ứng

dụng trong công nghiệp dược phẩm và công nghệ sinh học Hiện nay, Escherichia coli

là chủng chủ đang được sử dụng phổ biến nhất trong sản xuất protein tái tổ hợp do có

những ưu thế nổi bật về tốc độ tăng trưởng nhanh chóng, đạt được mật độ tế bào cao,

phát triển trên môi trường đơn giản, rẻ tiền, các đặc tính di truyền được hiểu biết rõ, sản lượng protein sản xuất cao (có thể lên đến 50%), có nhiều chủng đột biến, nhiều vector tạo dòng thích hợp và thao tác di truyền dễ dàng [22, 30]

Bảng 1.3 Các chủng E coli thường được dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp[9]

AD494 Đột biến trxB hỗ trợ tạo cầu disulfide tại vùng tế bào chất

BL21(DE3) Bất hoạt protease lon và ompT

Hỗ trợ biểu hiện protein eukaryote với các codon hiếm như

AGG, AGA, CCC Bất hoạt protease lon và ompT

BLR

Đột biến recA làm ổn định các vùng lặp Bất hoạt protease lon và ompT

C41/ C43 Đột biến dành cho biểu hiện protein màng

JM 83 Tiết protein tái tổ hợp ra vùng ngoại vi tế bào chất

Bất hoạt protease lon và ompT Đột biến trxB/gor hỗ trợ tốt

cho việc tạo liên kết disulfide ở tế bào chất

Protein tái tổ hợp được sản xuất ở E coli có thể thực hiện theo ba hướng: sản xuất nội

bào, trong chu chất, và sản xuất ngoại bào Trong đó, sản xuất protein tái tổ hợp trong nội bào là chiến lược được sử dụng phổ biến nhất Protein tái tổ hợp tạo ra có thể ở dạng tan hay không tan (thể vùi), do đó khuyết điểm chủ yếu của chiến lược này là hình thành protein ở dạng thể vùi không có hoạt tính, đặc biệt là khi biểu hiện vượt mức Protein mục tiêu sau khi thu nhận phải được tái gấp cuộn để có hoạt tính Nhiều cải tiến đã được tiến hành như nuôi cấy vi sinh vật ở nhiệt độ thấp, thay thế các acid

amin, sử dụng các chủng E coli khác nhau(bảng 1.3), đồng biểu hiện với chaperone

gấp cuộn, thay đổi pH, nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện ở điều kiện stress…[9]

Một khía cạnh khác cần được quan tâm là sản xuất các protein có cầu nối disulfide

trong tế bào chất của E coli Do tế bào chất của E coli là môi trường có tính

oxy hoá khử thấp, thiếu hệ thống protein DsbA và DsbB để hình thành cầu nối

disulfide hay có cơ chế ngăn chặn sự hình thành cầu nối này nên protein mục tiêu có thể không có cầu nối disulfide hay có nhưng cấu hình sai Hướng giải quyết là đồng biểu hiện DsbA và DsbB giúp tăng khả năng hình thành cầu nối disulfide [9, 30]

1.2.2 Các vị trí biểu hiện protein tái tổ hợp

1.2.2.1 Biểu hiện ở tế bào chất

Hầu hết protein được biểu hiện ở E coli đều được thiết kế biểu hiện ở tế bào chất của tế bào Việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào chất của E coli gặp nhiều khó

khăn như protein thường được tạo ra ở dạng không tan, không có hoạt tính sinh học

gọi là thể vùi (inclusion body), tế bào chất của E coli không có cơ chế thúc đẩy sự hình

thành cầu nối disulfide… Tuy nhiên, hiện nay việc biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế

bào chất của E coli vẫn là phương án được sử dụng phổ biến nhất do mức độ biểu

hiện cao hơn so với các vị trí khác trong tế bào, việc thiết kế plasmid cũng đơn giản hơn Ngoài ra, hiện nay người ta cũng phát triển nhiều phương pháp nhằm cải thiện tính tan của protein trong tể bào chất như đồng biểu hiện các phân tử chapreron; sử

dụng các chủng E.coli đột biến gen trx…[9, 30, 31]

1.2.2.2 Biểu hiện ở chu chất

Khoang chu chất của tế bào E coli là nơi có tính oxi hóa cao do có chứa các enzyme

xúc tác cho việc hình thành liên kết disulfide Tuy nhiên trong khoang chu chất lượng protein thường được biểu hiện với hiệu suất thấp Mặt khác, để protein có thể chuyển

từ màng trong ra ngoài khoang chu chất là đoạn peptide tín hiệu Không phải peptid tín

hiệu nào cũng hoạt động tốt trong tế bào E coli Khi tăng sự tổng hợp peptide tín hiệu

sẽ làm giảm mức độ biểu hiện của protein để tránh tình trạng ùn tắc hệ thống vận

chuyển qua màng, làm tăng sự tổng hợp protein đóng vai trò chuyển màng Bên cạnh

đó khi biểu hiện ở chu chất, protein cũng có thể tồn tại ở dạng thể vùi [9, 30, 31]

18

Hình 1.7 Sự hình thành cầu nối disuldide trong chu chất ở E coli [9]

1.2.2.3 Tiết ra môi trường

E coli tiết rất ít (hầu như không có) protein ra ngoài môi trường nuôi cấy Protein

được định hướng tiết ra ngoài môi trường sẽ phải qua hai màng: màng trong và màng

ngoài của E coli Cơ chế chuyển qua màng là rất đặc hiệu Người ta cho rằng có hai

cách để định hướng protein được tiết ra ngoài môi trường đó là sử dụng con đường tiết sẵn thông qua việc sử dụng các đoạn peptide tín hiệu; cách thứ hai là sử dụng các yếu tố thẩm thấu ảnh hưởng tới việc tiết protein có lựa chọn nhưng lại hạn chế được tính thấm của màng ngoài Nhìn chung protein tạo ra bằng những phương pháp này là rất hiếm gặp [9, 30, 31]

1.2.3 Một số hệ thống cảm ứng biểu hiện ở E coli 1.2.3.1

Hệ thống cảm ứng bởi IPTG

a Giới thiệu

Hệ thống cảm ứng operon lac bởi lactose đã được phát triển từ lâu nhưng lại có một

khuyết điểm lớn, lactose vừa là chất cảm ứng vừa là cơ chất cho -galactosidase nên lượng lactose sẽ bị hao hụt dẫn đến phải bổ sung trong quá trình cảm ứng Người ta đã

sử dụng các đồng đẳng của lactose để thay thế là IPTG

(Isopropyl-β-D-thiogalactoside) Do không phải là cơ chất của -galactosidase, nên IPTG vẫn được duy trì trong quá trình điều hoà Như vậy, IPTG là phân tử có khả năng thay thế

lactose trong sự điều hoà operon lac

Hệ thống cảm ứng bằng IPTG hiện nay rất phổ biến trong sản xuất protein tái tổ hợp

do chất cảm ứng IPTG ổn định, có nhiều loại chủng chủ cũng như hệ thống vector

được thiết kế thích hợp cho cảm ứng IPTG Chủng chủ E coli BL21(DE3) và hệ thống

vector pET là hệ thống biểu hiện được sử dụng phổ biến trong biểu hiện protein tái tổ hợp [3, 24, 31]

b Hệ thống vector pET

Các vector pET được xây dựng đầu tiên bởi Studier và cộng sự Những vector pET hiện nay được bổ sung thêm nhiều đặc tính mới giúp việc tạo dòng, phát hiện và tinh chế protein mục tiêu trở nên dễ dàng hơn Việc lựa chọn một loại vector pET phù hợp

để biểu hiện protein mục tiêu phụ thuộc vào nhiều yếu tố Trong đó, ba yếu tố quan trọng cần xét đến là mục tiêu ứng dụng của protein đích, các đặc tính sinh học về

protein này và chiến lược tạo dòng

Hệ thống vector pET thường được sử dụng để tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp

trong E coli Vector có vùng MCS chứa các enzyme cắt giới hạn giúp tạo dòng gen mục tiêu vào vector Vùng MCS được thiết kế nằm ở vùng hạ lưu của T7 promoter Khi tế bào chủ tạo ra enzyme T7 RNA polymerase và gắn vào T7 promoter gen mục

tiêu nằm ở vùng hạ lưu của promoter sẽ được phiên mã, dịch mã và tạo protein tái tổ hợp tương ứng

Vì T7 promoter chỉ gắn đặc hiệu với enzyme T7 RNA polymerase có nguồn gốc từ

thực khuẩn thể nên protein mục tiêu được điều hòa biểu hiện một cách hiệu quả Mặt

khác, T7 promoter là một promoter mạnh, T7 RNA polymerase có hoạt tính cao nên

protein mục tiêu được sản xuất rất hiệu quả Vài giờ sau cảm ứng, protein tái tổ hợp có thể chiếm đến hơn 50% tổng protein của tế bào sản xuất ra Hệ thống vector pET còn

có khả năng duy trì gen mục tiêu ở trạng thái không biểu hiện khi được tạo dòng vào tế

bào chủ không có gen mã hóa cho T7 RNA polymerase Điều này giúp plasmid tồn tại

ổn định trong tế bào chủ do protein tái tổ hợp khi tạo ra có thể gây độc cho tế bào

Tuy nhiên, việc điều hòa biểu hiện T7 polymerase dựa vào promoter lac có hạn chế là

trong một số trường hợp không cảm ứng mà vẫn có sự biểu hiện rò rỉ Nếu gen cần biểu hiện có khả năng gây độc thì việc biểu hiện rò rỉ làm ảnh hưởng đến sức sống của

tế bào Để giải quyết vấn đề này, có thể đồng biểu hiện T7 lysozyme để phân hủy các

T7 RNA polymerase được sản xuất với số lượng nhỏ khi chưa được cảm ứng Nhờ

vậy protein có khả năng gây độc đối với tế bào sẽ không được biểu hiện cho đến khi có chất cảm ứng trong môi trường Hướng giải quyết này sẽ tạo ra có một khoảng thời gian ức chế giữa thời điểm cảm ứng và biểu hiện cực đại của protein mục tiêu vì nồng

độ của polymerase phải tăng lên đủ lớn để vượt qua được sự ức chế của lysozyme [3,

24, 31]

c Cơ chế cảm ứng biểu hiện bằng IPTG

Ở hệ thống biểu hiện được cảm ứng bằng IPTG, chủng chủ được biến đổi di truyền để

có gen mã hóa cho T7 polymerase trong bộ gen Gen này được đặt dưới sự kiểm soát của lac promoter Ngoài ra, gen lacI cũng được chèn vào bộ gen để tạo lac repressor Khi không có sự hiện diện của IPTG trong môi trường, lac repressor tạo thành gắn với

lac operator làm promoter lac bị bất hoạt, gen mã hóa cho T7 polymerase không được

biểu hiện

Hình 1.8 Cơ chế điều hòa của T7 promotor [24]

Vector pET được thiết kế có T7 promoter và vùng MCS nằm sau T7 promoter

Gen mục tiêu sẽ được thiết kế chèn vào vector ở vùng MCS để được kiểm soát biểu

hiện bởi T7 promoter Ngoài ra, trên vector pET cũng có vị trí lac operator và gen lacI

mã hóa cho lac repressor để kiểm soát sự biểu hiện của T7 promoter

Khi có sự hiện diện của IPTG, IPTG sẽ gắn vào lac repressor ở vị trí allosteric, làm protein này thay đổi cấu hình và không thể gắn vào lac operator Nhờ đó lac promoter được hoạt hóa, gen mã hóa cho T7 polymerase được biểu hiện tạo T7 polymerase IPTG cũng giải phóng T7 promoter trên vector pET khỏi sự kiểm soát của lac

repressor Enzyme T7 polymerase tạo thành sẽ gắn vào T7 promoter đã được hoạt hóa giúp biểu hiện gen mục tiêu đã được tạo dòng vào vector (hình 1.8) [3, 16, 24, 31]

1.2.3.2 Hệ thống cảm ứng bởi L - arabinose

Promoter được sử dụng là pBAD với nhân tố kích hoạt AraC Khi môi trường có

arabinose thì có sự điều hoà dương, ngược lại khi chỉ có glucose thì sự biểu hiện của operon bị ức chế Protein AraC hoạt động ở dạng dimer gắn vào 3 vị trí của operon arabinose là O1, O2, và I Khi vắng mặt arabinose thì dimer AraC sẽ tiếp xúc với vị trí O2 nằm trong vùng gen araC, cách promoter araBAD khoảng 210 cặp base Phần kia của dimer sẽ tiếp xúc với vị trí O1 trong vùng promoter, do đó hình thành DNA dạng vòng Sự phiên mã của promoter AraBAD và araC sẽ bị ức chế bởi cấu hình vòng này Khi có mặt arabinose thì chính arabinose sẽ gắn vào dimer araC làm dimer này thay đổi cấu hình, lúc đó dimer không gắn vào vị trí O2 nữa mà gắn vào vị trí I, nhờ đó RNA polymerase bắt đầu hoạt động phiên mã

Đây là một hệ thống điều hoà mạnh, với chất cảm ứng không đắt tiền, trong quá trình lên men với hàm lượng cảm ứng 1% có thể đạt được sự biểu hiện tối ưu [31]

1.2.3.3 Hệ thống cảm ứng bởi muối

Cảm ứng bởi muối là phương pháp mới đơn giản, hiệu quả có thể áp dụng cho sản xuất

vượt mức protein tái tổ hợp Hệ thống sử dụng chủng chủ E coli GJ1158 được thiết kế

có promoter proU được cảm ứng bởi NaCl Để tăng cường biểu hiện, hệ thống cảm ứng muối có nhân tố phiên mã T7 RNA polymerase, do đó protein được biểu hiện

vượt mức với lượng lớn [31]

1.3 TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP

Protein được tinh sạch dựa trên những đặc tính căn bản như độ hòa tan, kích thước, điện tích và liên kết ái lực Thông thường, một hỗn hợp protein sẽ trải qua

nhiều giai đoạn phân tách, mỗi giai đoạn dựa trên một đặc tính nhất định, để cuối cùng thu nhận được protein tinh sạch Các kỹ thuật tinh sạch thường dùng: tủa bằng muối, màng bán dẫn, sắc ký [15]

1.3.1 Tủa bằng muối

Ở nồng độ muối cao, phần lớn protein sẽ giảm tính tan, hiện tượng này gọi là tủa bằng muối (salting out) Mỗi loại protein sẽ kết tủa ở một nồng độ muối nhất định Vì vậy, hiện tượng tủa bởi muối có thể được dùng để phân đoạn protein [15]

1.3.2 Sự thẩm tích

Protein có thể được phân tách bằng sự thẩm tách thông qua màng bán dẫn, chẳng hạn màng cellulose với nhiều lỗ Những phân tử có cấu trúc không gian nhất định lớn hơn đường kính của lỗ sẽ bị giữ lại bên trong túi thẩm tách, trong khi đó, những phân

tử nhỏ hơn và các ion sẽ đi qua các lỗ đó ra ngoài túi Kỹ thuật này dùng để loại bỏ muối hay tách những phân tử nhỏ, nhưng với kỹ thuật này không phân biệt được các loại protein với nhau [15]

1.3.3 Sắc ký

Sắc ký là một phương pháp phân tách quan trọng nhất trong sinh học phân tử vì thích hợp với nhiều loại hợp chất và sản phẩm tinh sạch có thể được sử dụng ngay cho việc định lượng và định danh

Một hệ sắc ký gồm pha tĩnh, pha động và mẫu cần phân tách Trong đó, tùy vào loại mẫu cần phân tách ta có thể lựa chọn loại sắc ký cũng như nguyên liệu cho pha cố định và pha di động

Trong tinh sạch protein, có bốn phương pháp được ứng dụng nhiều nhất là sắc ký lọc gel dựa vào kích thước của phân tử (Size Exclusion Chromagraphy), sắc ký trao đổi ion dựa vào điện tích của phân tử (Ion Exchange Chromagraphy), sắc ký ái lực dựa vào ái lực của phân tử với một loại phân tử khác (Affinity Chromagraphy) và sắc ký tương tác kỵ nước (Hydrophobic Interaction chromatography, HIC) dựa vào mức độ

kị nước của protein ở các nồng độ muối khác nhau

Xây dựng một quy trình tinh chế hiệu quả là một trong những yếu tố quyết định thành công của việc sản xuất protein Tùy theo yêu cầu về độ tinh sạch, sự cần thiết phải duy trì hoạt tính protein cũng như mức độ tạp trong nguồn mẫu ban đầu, các phương pháp được sử dụng để tinh chế và sự phối hợp giữa các phương pháp này sẽ khác nhau Thông thường, đối với một protein được sử dụng làm thuốc, quá trình tinh chế đầy đủ gồm 3 giai đoạn:

- Giai đoạn bắt giữ: Đây là bước cô lập nhanh protein mục tiêu khỏi vật liệu thô ban đầu Đồng thời, protein được cô đặc và chuyển qua dung dịch giúp duy trì hoạt tính protein Ở bước này, protein thường được phân tách theo nhóm bằng cách sử dụng sắc ký ái lực hoặc sắc ký trao đổi ion

- Giai đoạn tinh chế trung gian: giai đoạn này tập trung vào mục đích phân tách protein mục tiêu khỏi các thành phần tạp lớn như nucleic acid, endotoxin, virus và các protein khác Giai đoạn này không cần phải tiến hành nhanh do các thành phần tạp gây ra sự phân hủy và thủy giải protein đã bị loại đi trong giai đoạn trước đó Tuy nhiên, các kỹ thuật tinh chế được sử dụng trong giai đoạn này cần phải có khả năng phân tách cao Do vậy, cần phải lựa chọn biện pháp dung ly protein hiệu quả, như sử dụng gradient nồng độ hoặc dung ly nhiều bước

- Giai đoạn tinh chế cuối: Mục đích của giai đoạn này là loại những thành phần tạp nồng độ thấp và điều chỉnh pH, nồng độ muối cũng như bổ sung các chất hỗ trợ để bảo quản protein Trong giai đoạn này cần phải sử dụng những kỹ thuật tinh chế

có độ phân tách cao để đạt đến độ tinh sạch cần thiết

Đây là quy trình tinh chế protein đầy đủ, điều đó không có nghĩa là bất cứ protein nào cũng cần tinh chế theo quy trình ba bước này Ví dụ, giai đoạn bắt giữ và tinh chế trung gian có thể nhập lại thành một bước duy nhất, tương tự có thể nhập giai đoạn trung gian và giai đoạn cuối lại với nhau Trong một số trường hợp, nếu nguồn mẫu ban đầu đã tinh sạch thì chỉ cần một tinh chế qua một bước cuối cùng Ngược lại, một

số protein dùng làm thuốc cần bốn, năm bước tinh chế để đạt được yêu cần về độ tinh sạch và tính an toàn [15, 28]

1.3.3.1 Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography – IEC)

Ra đời từ những năm 1960, IEC với khả năng phân tách và khả năng nạp mẫu cao là một trong những kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất để tinh sạch protein,

peptid, nucleic acid và các phân tử sinh học tích điện khác Kỹ thuật này giúp phân tách những phân tử sinh học dựa vào sự khác nhau về đặc tính tích điện giữa chúng IEC phân tách các phân tử dựa vào điện tích bề mặt của nó Chất nền IEC là những hạt nhỏ chứa những nhóm tích điện dương (cation) và tích điện âm (anion) Phân tử protein được tạo thành từ những amino acid chứa nhóm acid và base yếu, do vậy điện tích của protein thay đổi theo sự thay đổi pH của dung dịch chứa chúng Giá trị pH mà tại đó protein không tích điện gọi là điểm đẳng điện (pI) Ở pH cao hơn điểm đẳng điện, protein tích điện âm và gắn vào chất nền của cột trao đổi anion Ở pH thấp hơn điểm đẳng điện, protein tích điện dương và gắn với chất nền của cột trao đổi

cation Để bắt đầu quá trình tinh chế, cột trao đổi ion cần được cân bằng với buffer có lực ion và pH thích hợp cho phép protein mục tiêu có thể gắn vào chất nền sắc ký trong khi các phần tử tạp đi ra khỏi cột nhiều nhất có thể Trong phương pháp này, pha tĩnh

là những hạt mang sẵn một điện tích nhất định, những hạt này sẽ tương tác với các phân tử (protein) mang điện tích trái dấu với chúng Vì thế, những protein cùng dấu với cột sẽ chạy ra khỏi cột trong khi những protein trái dấu bị giữ lại cột Để phóng thích những protein này, tăng nồng độ ion của pha động, những ion này sẽ thế phân tử

protein tương tác với các hạt mang điện tích Ví dụ, trong sắc ký trao đổi ion dương, thêm muối natri clorua hay muối khác trong dung dịch dung ly bởi vì ion natri sẽ tranh bám vào cột với các protein có điện tích dương, do đó, những protein mang điện tích dương được phóng thích ra ngoài cột lần lượt theo độ lớn về điện tích Trong một số trường hợp đặc biệt, protein được dung ly bằng cách thay đổi pH của dung dịch [15, 28]

Hình 1.9 Minh họa sắc ký trao đổi ion [15]

1.3.3.2 Sắc ký ái lực (Affinitive chromatography, AC)

Sắc ký ái lực là phương pháp rất hiệu quả, được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh

sạch protein Kỹ thuật này dựa trên ái lực của protein với một số nhóm hóa học chuyên biệt Khi nạp hỗn hợp protein vào cột, protein có khả năng nhận biết một nhóm X hay dẫn xuất của nó được gắn trên cột bằng nối cộng hóa trị Sau đó cột được rửa để loại

bỏ những protein không tạo được nối hoặc nối không đặc hiệu, cuối cùng là dung ly protein mục tiêu bằng dung dịch X với nồng độ cao hoặc thay đổi điều kiện để làm

giảm lực liên kết (hình 1.10) Kỹ thuật này có thể được sử dụng trong pha bắt giữ hoặc

tinh chế trung gian AC có tính đặc hiệu protein nên đây là kỹ thuật tinh chế có độ phân

tách và hiệu suất cao

Trong kỹ thuật này, protein mục tiêu được gắn đặc hiệu và thuận nghịch với ligand tương ứng Ban đầu, mẫu được nạp vào dưới điều kiện cho phép sự gắn đặc hiệu xảy ra Những protein không gắn được với ligand thì bị rửa đi sau đó Cuối cùng, protein mục tiêu được tách ra dưới điều kiện chuyên biệt bằng cách sử dụng chất gắn cạnh tranh, hoặc được tách ra dưới điều kiện không chuyên biệt bằng cách thay đổi pH hoặc lực ion Sau quá trình tinh chế bằng AC, protein thu được có độ tinh sạch cao và được cô đặc [15, 28]

Hình 1.10 Hình minh họa sắc ký ái lực [17]

Nhằm mục đích ứng dụng trong nuôi cấy tế bào, y học và mỹ phẩm, FGF-2 tái tổ hợp cần phải có độ tinh sạch tối thiểu là 95% Dựa vào đặc điểm của FGF-2 có pI=9,6,

có ái lực cao với heparin, bền ở pH 7 và dựa vào các tính chất của các phương pháp sắc ký đã được nêu ở trên, trong luận văn này, chúng tôi sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi cation và sắc ký ái lực heparin nhằm thu nhận FGF-2 có độ tinh sạch đạt yêu

cầu từ pha tan của dịch đồng nhất tế bào E coli

- Erlen 100ml, 250ml, 1000ml, ống đong, bercher, đĩa petri

- Đèn cồn, que cấy, bình tia chứa cồn, nước cất

- Bộ chuyển màng lai (Hoefer mini VE, Amersham Pharmacia Biotech)

- Bộ điện di ngang DNA (HORIZON ®58, Life Technology™, Mỹ) và hộp đèn soi

UV (Hoefer, Mỹ)

- Bộ điện di protein (Hoefer mini VE, Amersham Pharmacia Biotech) và bộ nguồn (Amersham Biosciences)

- Cân kỹ thuật Ohaus (Mỹ)

- Cân phân tích Precica (Thụy Sỹ)

- Cột tinh chế Hitrap SP FF 5ml, Hitrap Heparin HP 5ml (GE Healthcare)

- Hệ thống lên men tự động BioTron-LiFlus GX GX-05-12302 và các thiết bị phụ trợ như: máy nén khí, hệ thống nước giải nhiệt…

- Hệ thống tinh chế AKTA (GE Healthcare)

- Máy chụp hình gel (Amersham Biosciences)

- Máy đo nồng độ DNA Nanodrop

- Máy điều nhiệt theo chu kỳ Eppendorf Mastercycler Personal

- Máy đo quang phổ chuyên dụng GeneQuantpro (Amersham Biosciences) dùng cho DNA, RNA và protein

- Máy đo pH (ORION, Anh)

- Máy khuấy từ gia nhiệt Bibby (Anh)

- Máy lắc nước Grant GLS400 (Cambridge, Anh) và thiết bị làm lạnh đi kèm

- Máy ly tâm lạnh Mikro 22R (Hettich, Nhật)

- Máy lắc ổn nhiệt Orbital Incubator S150 (Stuard Scientific, Anh)

- Máy phá tế bào Model M-110EH-30 Microfluidizer Processor và hệ thống làm lạnh đi kèm

- Máy Vortex (IKA, Mỹ)

- Nồi hấp khử trùng Autoclave (SS325-TOMY)

- Phần mềm Quantity One (Biorad)

a) Hóa chất dùng cho phản ứng PCR

- Dung dịch MgCl2 25mM (Fermentas, Đức)

- dNTPs 8mM (Fermentas, Đức)

- Taq polymerase 1u/µl (Fermentas, Đức)

- Buffer Taq polymerase 10X (Fermentas, Đức)

- Pfu DNA polymerase 1u/µl (Fermentas, Đức) - Buffer Pfu DNA polymerase

10X(Fermentas, Đức)

b) Dung dịch tách plasmid bằng phương pháp SDS- kiềm

- Dung dịch I: Tris-HCl 25mM; EDTA 10mM; glucose 50mM, pH 8

- Dung dịch II: NaOH 0,2N; SDS 1% (pha trước khi dùng)

- Dung dịch III: CH3COOK 3M, pH 4,8

- Chloroform

- Dung dịch TE: Tris-HCl 10mM; EDTA 1M, pH 8,0

- Ethanol 70% và ethanol tuyệt đối lạnh (giữ ở -20oC)

- Isopropanol lạnh (giữ ở -20oC)

- Phenol bão hòa trong TE (pH 8,0)

- Sodium acetate 3M (pH 4,8)

c) Hóa chất dùng cho phản ứng cắt và nối -

Enzyme BamHI, NdeI (Fermentas, Đức)

- Buffer Tango 10X (Fermentas, Đức)

- Buffer ligation 10X (Fermentas, Đức)

- T4 DNA ligase (Fermentas, Đức)

- Phenol bão hòa trong TE (pH 8,0)

- Hóa chất dùng cho tinh chế DNA

- Bộ kit tinh chế EZ-10 spin column (Biobasic)

e) Hóa chất dùng cho biến nạp DNA plasmid vào E coli

- Dung dịch CaCl2 100mM vô trùng

- Dung dịch MgCl2 20mM, CaCl2 80mM vô trùng (giữ ở 4oC)

- Dung dịch glycerol 80% vô trùng

f) Hóa chất dùng cho điện di DNA trên gel agarose

- Agarose (Biobasic)

- Dung dịch chạy điện di TAE 50X: Tris acetate 40mM, EDTA 0,1M (pH 8,0)

- Dung dịch nạp mẫu DNA: 0,05% xylene cyanol, 0,09% bromophenol blue; 60% glycerol và 60mM EDTA - Ethidium bromide 10 mg/ml

g) Hoá chất dùng cho điện di SDS - PAGE

- Dung dịch điện di 5X (Tris - glycine buffer pH 8,3): Tris 15,1g, SDS 5g, glycine 94g pha trong 1 lít nước

- Tris - HCl 1,5M pH 8,8 (giữ ở 4oC)

- Tris - HCl 0,5M pH 6,8 (giữ ở 4oC) - SDS 10%

- 40% acrylamide - 0,8% bis acrylamide (giữ ở 4oC)

- Ammonium persulphate (APS) (giữ ở 4oC)

- TEMED (N, N, N’, N’- tetramethylethylene diamine) (giữ ở 4oC)

Thành phần gel phân tích (15%) và gel gom được trình bày như bảng 2.1

Bảng 2.1 Công thức đổ gel phân tách và gel gom trong điện di SDS-PAGE

Gel phân tách Gel gom

Tris-HCl 1,5M pH 8,8 1,75ml 0 ml

Tris-HCl 0,5M pH 6,8 0 ml 0,505ml

+ Dung dịch cố định mẫu 1: Ethanol 50ml, acetic acid 5ml, nước cất 50ml

+ Dung dịch cố định mẫu 2: Methanol 50ml, nước cất 50ml

+ Natrithiosulfate 0,02%

+ AgNO3 0,2%

+ Developer: Na2CO3 10g, Formaldehyde 0,54ml, nước cất đủ 50ml

+ Stopper: Glycine 0,5g, nước cất đủ 100ml

h) Hoá chất lai Western-Blot

- Dung dịch Towbin: 3g Tris-HCl, 14,4g glycine, 1g SDS trong 800ml nước cất

Bổ sung 200ml methanol trước khi dùng

- Dung dịch PBS (Phosphate Buffer Saline): Na2HPO4 80mM, NaH2PO4 20mM, NaCl 100mM, pH = 7,5

- Dung dịch PBST: 0,1% Tween 20 trong PBS

- Dung dịch khoá màng: 0,5g sữa gầy trong 10ml dung dịch PBST

- Dung dịch chứa kháng thể kháng FGF: 10ml dung dịch PBST; 1µl kháng thể kháng FGF-2 (10mg/ml) (Sigma)

- Dung dịch chứa kháng thể anti-Ig chuột-HRP: 10ml dung dịch PBST; 1µl kháng thể anti-Ig chuột-HRP (10mg/ml) (Sigma)

- Dung dịch phát hiện (Amersham): detection 1: detection 2= 1:1

i) Hóa chất dùng cho tinh chế protein

- Buffer A (dung dịch cân bằng cột): Na2HPO4 0,1M, NaH2PO4 0,1M, EDTA 1mM,

- Ampicillin 100mg/ml (Biobasic) (giữ ở -30oC)

- IPTG (Isopropyl1-β-D-thiogalactoside) 1M (giữ ở -30oC)

- Các chất điều chỉnh pH trong quá trình lên men: NH4OH 15%, H3PO4 30% - Chất phá bọt trong quá trình lên men: polyglycon

- Môi trường LB-Amp100 agar: môi trường LB-Amp100 lỏng bổ sung thêm 2% agar (giữ ở 4oC)

- Môi trường lên men:

+ Trace: ZnSO4.7H2O 0,288g/l; MnSO4.7H2O 0,142g/l; H3BO3 0,062g/l;

NaMoO4.2H2O 0,048g/l; CoCl2.6H2O 0,048g/l; KI 0,083g/l; CaSO4.5H2O 0,125g/l;

2.1.3.1 Chủng vi sinh vật

Chủng E coli DH5 [F-, 80lacZ M15, recA1, endA1, hsdR17(rk-, mk+), phoA, supE44, -, thi-1, gyrA96, relA1] dùng để dòng hóa

Chủng E coli BL21(DE3) (F+ ompT hsdSB (rB- mB-) gal dcm(DE3)) là chủng E

coli đột biến khiếm khuyết protease ompT và lon, dùng để biểu hiện

2.1.3.2 Plasmid

Plasmid do Bộ môn Công nghệ Sinh học phân tử - môi trường, trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG TPHCM cung cấp

Plasmid pIDT-fgf2 chứa gene mã hóa protein FGF-2 với các vị trí cysteine đã

được biến đổi được gửi tổng hợp hoá học ở công ty IDTDNA, Hoa Kỳ

Plasmid pET-His có kích thước 4636bp, có chứa gen kháng kháng sinh ampicillin

(amp r ), trình tự khởi đầu sao chép pBR322 ori, promoter T7 Đây là một promoter

mạnh giúp cho việc biểu hiện protein trong vi khuẩn Ngoài ra, trên vùng MCS còn có

vị trí cắt giới hạn duy nhất của hai enzyme BamHI và NdeI giúp gắn chèn đoạn gen

mong muốn vào vector Gen quan tâm có thể được dung hợp với đuôi His 6x tại đầu

Nterminal giúp cho việc tinh chế dễ dàng hơn

A, thang 1 Kb (Fermentas); B, thang 1Kb plus (Fermentas);

C, thang phân tử lượng protein (Sigma)

2.2 PHƯƠNG PHÁP

Quy trình tạo plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 và dòng hóa tế bào E coli DH5α được thể hiện như trên hình 2.3

Hình 2.3 Quy trình tạo plasmid tái tổ hợp pET-fgf2

2.2.1 Cấu trúc chủng E coli DH5α mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2

2.2.1.1 Thu nhận gen fgf-2 bằng phản ứng PCR

Gene fgf-2 được thu nhận với lượng lớn nhờ phản ứng PCR plasmid pIDT-fgf2

với cặp mồi đặc hiệu của gene nhằm phục vụ cho công đoạn tạo dòng vào plasmid

pET-His với chương trình được thiết kế như hình 2.4

DNA plasmid pIDT 1,0µl

dH2O đủ 50µl

Gen fgf2 thu nhận sau phản ứng PCR được tinh chế bằng bộ kít EZ-10 Spin

Column DNA Gel Extraction Kit

2.2.1.2 Tách chiết, thu nhận plasmid pET-His

a) Nguyên tắc của phương pháp tách chiết bằng SDS-kiềm

Có thể tách chiết plasmid bằng nhiều phương pháp như dùng nhiệt độ cao,

lithium, SDS kiềm… Trong đó, sử dụng SDS kiềm là cách tách chiết phổ biến nhất do thực hiện đơn giản nhưng cho hiệu quả tách chiết cao Phương pháp dựa trên sự hồi tính nhanh chóng của DNA plasmid so với DNA bộ gen Tế bào được xử lý lần lượt với dung dịch 1, 2 và 3 Dung dịch 1 chứa glucose tạo môi trường nhược trương giúp

tế bào dễ vỡ và EDTA ức chế DNAse Màng tế bào bị phá vỡ bởi NaOH và SDS Dưới tác dụng của SDS trong dung dịch 2, protein của tế bào sẽ bị biến tính Sự hiện diện

của kiềm ở nồng độ cao trong giai đoạn đầu của quá trình tách chiết làm DNA bộ gen

và DNA plasmid bị biến tính Việc trung hòa nhanh bằng dung dịch 3 có tác dụng làm phục hồi cấu trúc DNA Do kích thước của plasmid nhỏ hơn nên phục hồi dễ dàng và hiện diện trong phần dịch nổi sau ly tâm Trong khi đó DNA bộ gen có kích thước lớn nên khó phục hồi và tạo phức hợp với các protein bị biến tính thành tủa trong dung dịch DNA plasmid được tủa dưới tác dụng của ethanol tuyệt đối và sau đó hòa tan lại trong dung dịch TE [12]

b) Các bước tiến hành

- Nuôi cấy dòng E coli mang plasmid pET-His trong 5ml môi trường LB có bổ

sung Ampicillin 100 g/ml, nuôi cấy lắc 250 vòng/phút qua đêm ở 37oC

- Ly tâm 10.000 vòng/phút, 5 phút để thu sinh khối

- Bổ sung 100µl dung dịch I vào eppendorf 1,5ml chứa sinh khối, vortex thật kỹ

- Bổ sung 200µl dung dịch II, đảo nhẹ

- Bổ sung ngay 150µl dung dịch III, đảo nhẹ

- Ly tâm thu dịch nổi ở 10.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC

- Bổ sung vào dịch nổi 1,5µl RNase (1 mg/ml), ủ ở 37oC, 1 giờ

- Thêm 250µl phenol pH 8 và 250µl chloroform, đảo đều, ly tâm 10.000rpm, 5 phút, thu dịch nổi

- Tủa DNA plasmid bằng 1ml ethanol 99o lạnh, ly tâm 13.000 vòng/phút, 30 phút,

4oC

- Rửa tủa trong 500µl ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/phút, 5 phút, 4oC

- Thu tủa, phơi khô tự nhiên Bảo quản mẫu trong 30µl TE, -20oC Điện di kiểm tra kết quả trên gel agarose 1%

2.2.1.3 Xử lý gen fgf2 và plasmid pET-His bằng enzyme cắt hạn chế

a) Xử lý gen fgf2 bằng hai enzyme cắt hạn chế BamHI và NdeI Thành

phần phản ứng cắt:

Buffer Tango 10X 10µl

Enzyme BamHI (10u/µl) 1µl

Enzyme NdeI (10u/µl) 1µl

Enzyme NdeI (10u/µl) 1µl Enzyme BamHI (10u/µl) 1µl

dH2O 8µl

Tổng thể tích 50µl Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 37oC, 4 giờ Sản phẩm cắt được tinh chế bằng bộ EZ10 Spin Column PCR Products Purification Kit

2.2.1.4 Phản ứng nối tạo vector tái tổ hợp pET-fgf2

Nhằm mục đích dòng hoá, gen mục tiêu được đưa vào vector thông qua phản ứng nối dưới hoạt động của enzyme T4 DNA ligase T4 DNA ligase có khả năng nối hai trình tự DNA thông qua việc hình thành liên kết phosphodiester giữa đầu 5’phosphate

và đầu 3’OH của hai đoạn DNA

Dưới tác dụng của T4 DNA ligase, gen fgf-2 được nối vào plasmid pET-His, plasmid tái tổ hợp được tạo thành gọi là pET-fgf2

Thành phần phản ứng nối như sau:

Buffer T4 DNA ligase 1,5 l Plasmid pET 3,0 l

Gen fgf-2 9,5 l T4 DNA ligase 1,0 l

Tổng thể tích 15,0 l Phản ứng nối được tiến hành ở 11 oC trong 4 giờ Sau đó hỗn hợp sản phẩm nối

được biến nạp vào tế bào E coli DH5α

2.2.1.5 Biến nạp sản phẩm nối vào E coli DH5α

a) Chuẩn bị tế bào E coli DH5 khả nạp

Phương pháp hóa biến nạp dựa trên sự xáo trộn của màng tế bào do ion Ca2+ gây

ra giúp DNA xâm nhập vào tế bào dễ dàng hơn Quá trình sốc nhiệt ở 42oC trong 90 giây kích thích sự chuyển plasmid vào bên trong tế bào Sau đó tế bào được nuôi lại trong môi trường LB giúp tế bào hồi phục

Thực hiện:

- Cấy một khuẩn lạc đơn E coli DH5 vào 5ml môi trường LB lỏng, nuôi cấy lắc

qua đêm ở 37oC Hút 2,5ml dịch nuôi cấy trên vào erlen 1 lít chứa 250ml môi trường

LB lỏng, nuôi cấy lắc 250 vòng/phút ở 37oC cho đến khi giá trị OD600 của dịch nuôi cấy đạt 0,6-0,8

- Ngâm các erlen vào nước đá trong 20-30 phút Cho dịch nuôi cấy vào các ống falcon ly tâm đã được làm lạnh sẵn và ly tâm thu sinh khối tế bào ở 5.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC

- Rửa sinh khối tế bào bằng dung dịch CaCl2-MgCl2 (20mM-80mM), vortex nhẹ,

ly tâm thu sinh khối tế bào ở 5.000 vòng/phút, 10 phút, 4oC

- Thêm 3ml CaCl2 100mM và 1ml glycerol 80%, trộn nhẹ đều và cất giữ tế bào ở

tủ âm

Tất cả các bước được thực hiện vô trùng

b) Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào khả nạp

15µl hỗn hợp sản phẩm nối được trộn đều vào 100µl tế bào E coli DH5α khả nạp

trong eppendorf Rồi thực hiện sốc nhiệt theo qui trình sau:

- Để lạnh 4oC trong 10 phút

- Giữ 42oC trong 90 giây

- Giữ lạnh 4oC trong 15 phút

Sau đó trải hỗn hợp này lên đĩa LB-Amp100, ủ 37oC trong khoảng 16-18 giờ

Tiến hành đồng thời mẫu đối chứng là tế bào khả nạp E coli DH5α không được biến

nạp sản phẩm nối

2.2.1.6 Sàng lọc thể biến nạp mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2

a) Sàng lọc thể biến nạp trên môi trường kháng sinh

Sau khi ủ ở 37oC, kiểm tra kết quả biến nạp bằng cách quan sát sự phát triển của

vi khuẩn trên đĩa biến nạp và đĩa đối chứng Trên môi trường LB-Amp100, chỉ những

tế bào E coli DH5α nào thu nhận được plasmid pET-fgf2 (plasmid tái tổ hợp) hoặc

plasmid pET (plasmid tự nối) mới mọc được trên môi trường này Các tế bào này sẽ được thu nhận để kiểm tra trong các bước tiếp theo

b) Sàng lọc thể biến nạp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc

Nguyên tắc: Phương pháp PCR khuẩn lạc cũng tương tự như phương pháp PCR

DNA thông thường Dưới tác dụng nhiệt độ cao màng tế bào sẽ bị phá vỡ DNA

plasmid được giải phóng ra ngoài và trở thành khuôn cho phản ứng PCR

FGF2-R (10 pmol/µl) 1µl

dH2O 15,5µl

Tổng thể tích 25µl

Chương trình chạy PCR được trình bày như hình 2.5

Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% Những khuẩn lạc cho vạch DNA có kích thước đúng như dự đoán sẽ được chọn lọc nuôi cấy và tách chiết plasmid, chuẩn bị cho các bước kiểm tra tiếp theo

c) Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET-fgf2

Thu nhận plasmid của các khuẩn lạc cho kết quả dương tính với phản ứng PCR theo phương pháp SDS-kiềm Plasmid sau khi tách được tiến hành bằng các phương pháp sau:

- Kiểm tra bằng PCR plasmid với mồi đặc hiệu

- Kiểm tra bằng PCR plasmid với mồi thương mại

- Kiểm tra bằng phương pháp enzyme cắt hạn chế

- Giải trình tự, so sánh độ tương đồng trình tự lý thuyết và sự đồng khung

55o C

94o C

72o C

4o C

* Kiểm tra bằng PCR plasmid với mồi đặc hiệu FGF2-F/FGF2-R

Plasmid sau khi tách được PCR kiểm tra với chương trình chạy và thành phần phản ứng tương tự như kiểm tra PCR khuẩn lạc ở mục 2.2.1.6b

* Kiểm tra bằng PCR plasmid với mồi T7promoter/T7terminator

Thành phần phản ứng:

dNTP (8mM) 2,5µl Mồi T7promoter (10 pmol/µl) 1µl Mồi T7terminator (10 pmol/µl) 1µl Plasmid 0,5µl

dH2O 15µl

Tổng thể tích 25µl

Chương trình chạy PCR được trình bày như hình 2.6

Hình 2.6 Chương trình PCR plasmid bằng mồi thương mại

* Kiểm tra bằng phương pháp enzyme cắt hạn chế

Ngoài ra, plasmid cũng được xử lý với enzyme EcoRI để kiểm tra kích thước plasmid và đồng thời cũng được xử lý với 2 enzyme NdeI và BamHI để xác nhận sự

hiện diện của gen fgf2 trong plasmid pET-fgf2 Thành phần phản ứng cắt được trình

Macrogene, Hàn Quốc Sau đó được đem so sánh độ tương đồng trình tự lý thuyết và

sự đồng khung dịch mã bằng phần mềm Jelly fish

Chủng được bảo quản trong 20% glycerol, ở -80oC

2.2.2 Cấu trúc chủng E Coli BL21(DE3) mang plasmid tái tổ hợp pET-fgf2 2.2.2.1 Thu nhận plasmid pET-fgf2

Các plasmid tái tổ hợp pET-His-fgf2 được tách chiết bằng phương pháp

SDSkiềm tương tự như mục 2.2.1.2

2.2.2.2 Biến nạp plasmid pET-fgf2 vào E coli BL21(DE3)

Chuẩn bị tế bào E coli BL21(DE3) khả nạp, biến nạp plasmid pET-fgf2 vào tế bào khả nạp E coli khả nạp và quá trình biến nạp tương tự như mục 2.2.1.5

Sau khi biến nạp và trải lên đĩa LB-Amp100 Đĩa sau khi trải sẽ được ủ 37oC

trong khoảng 16-18 giờ Tiến hành đồng thời mẫu đối chứng là tế bào khả nạp E coli BL21(DE3) không được biến nạp plasmid

2.2.2.3 Sàng lọc thể biến nạp bằng phương pháp PCR khuẩn lạc

Khuẩn lạc E.coli BL21(DE3) được PCR kiểm tra với cặp mồi đặc hiệu

FGF2F/FGF2-R tương tự như kiểm tra PCR khuẩn lạc E.coli DH5α ở mục 2.2.1.6

2.2.3 Biểu hiện protein FGF-2 tái tổ hợp dạng tan trong E coli BL21(DE3)

2.2.3.1 Cảm ứng biểu hiện protein FGF-2

- Hoạt hóa tế bào E coli BL21(DE3) mang plasmid pET-His-fgf2 tái tổ hợp vào

ống nghiệm chứa 5ml LB-Amp100 Lắc 250 vòng/phút ở 37°C qua đêm

- Cấy chuyền 500μl dịch vi khuẩn đã nuôi cấy qua đêm vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường LB-Amp100 Lắc 250 vòng/phút ở 37°C qua đêm

- Bổ sung IPTG đạt nồng độ cuối 0,3mM vào ống nghiệm Lắc 250 vòng/phút ở 37°C qua đêm

- Tiến hành song song trong cùng điều kiện mẫu nghiệm thức đối chứng là

BL21(DE3) mang plasmid pET-His-fgf2 không được cảm ứng với IPTG

2.2.3.2 Thu mẫu và xử lý mẫu

- Hút 1ml dịch vi khuẩn vào eppendorf và thu 2 eppendorf Ly tâm thu sinh khối ở

13000 vòng/phút trong 5 phút

- Rửa tủa bằng nước cất: Hòa tủa thu được trong 1ml nước cất, vortex cho tủa hòa đều vào nước cất, li tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi và thu tủa

- Hòa tủa trong 300µl nước cất

- Tiến hành sonicate dịch vừa thu nhận ở 4oC trong ba chu kì (mỗi chu kì phá 30 giây và nghỉ 30 giây) với công suất 15watts Ly tâm một eppendorf ở 13000 vòng/phút

ở 4oC trong 10 phút, thu tủa và nổi riêng Eppendorf còn lại chỉ sonicate mà không ly tâm để làm mẫu tổng

2.2.4 Bước đầu lên men bằng hệ thống lên men ở quy mô 1 lít để thu nhận protein FGF-2 tái tổ hợp ở dạng tan

2.2.4.1 Các bước chuẩn bị

a Chuẩn bị và hoạt hóa giống:

Chủng E coli BL21(DE3)/pET-FGF được cấy chuyền hoạt hóa lên đĩa petri chứa

môi trường thạch LB có bổ sung ampicillin để sàng lọc chủng Đĩa petri này được ủ ở

37oC trong 10 - 14 giờ, sau đó giữ ở tủ mát 4oC

Cấy một khuẩn lạc đơn của chủng từ đĩa petri vào ống nghiệm chứa 5ml môi

trường LB-Amp100 Lắc 250 vòng/phút, 37oC trong 12-14 giờ