Nghiên cứu thiết kế vector tái tổ hợp helper dependent adenovirus mang gen mã hóa interleukin 12 người và định hướng ứng dụng

Các hệ vector virus đã được thương mại hóa ứng dụng trong các nghiên cứu gen trị liệu phải kể đến hệ thống ViralPower của hãng Invitrogen được tạo ra bởi công nghệ Gateway, bao gồm các h

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -

NGUYỄN VIỆT HÀ

Nghiên cứu thiết kế vector tái tổ hợp Helper Dependent Adenovirus mang gen mã hóa Interleukin 12 người

và định hướng ứng dụng

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS Hoàng Quốc Trường

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự được thực hiện dưới sự

hướng dẫn khoa học của Tiến sĩ Hoàng Quốc Trường, khoa Sinh học phân

Lời cảm ơn

Để có thể hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn

sâu sắc tới TS Hoàng Quốc Trường đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo tận tình trong

suốt thời gian tôi thực hiện đề tài

Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Lê Hữu Song, TS Bs Phan Quốc Hoàn

đã tạo điều kiện để tôi thực hiện luận văn tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108; tới các anh chị tại khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian qua

Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ Sinh học và

Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã giảng dạy và tạo

điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện để tôi có thể hoàn thành được luận văn này

Hà Nội, tháng 10 năm 2014

Học viên

Nguyễn Việt Hà

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 6

DANH MỤC CÁC HÌNH 7

DANH MỤC CÁC BẢNG 10

MỞ ĐẦU 11

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

1.1 Tổng quan về liệu pháp gen 13

1.2 Vector adenovirus 15

1.2.1 Đặc điểm sinh học của adenovirus 15

1.2 2 Chu kỳ nhân lên của adenovirus 17

1.2.2.1 Quá trình bám và xâm nhập vào bên trong tế bào 17

1.2.2.2 Gen sớm và quá trình sao chép ADN 19

1.2.2.3 Gen muộn và đóng gói virus 21

1.2.3 Các hệ vector adenovirus 21

1.2.3.1 Vector adenovirus thế hệ thứ nhất 22

1.2.3.2 Vector adenovirus thế hệ thứ hai 23

1.2.3.3 Helper-Dependent Adenovirus (HDAd) 24

1.3 Tổng quan về Interleukine-12 người 26

1.3.1 Cấu trúc của Interleukine-12 26

1.3.2 Vai trò của Interleukine-12 trong điều trị ung thư 27

1.3.3 Một số nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam sử dụng hệ vector adenovirus mang gen IL12 trong nghiên cứu điều trị ung thư 28

1.4 Công nghệ Gateway 31

CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35

2.1 Nguyên liệu……… 35

2.2 Hóa chất, thiết bị 37

2.2.1 Hóa chất 37

2.2.2 Thiết bị, máy móc 39

2.3 Phương pháp nghiên cứu 40

2.3.1 Phương pháp khuếch đại gen bằng phản ứng PCR 40

2.3.2 Phương pháp điện di trên gel agarose 41

2.3.3 Phương pháp xác định trình tự axit nucleic 41

2.3.4 Phương pháp tách dòng hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL12 người vào vector thể nhận pENTR/D-TOPO 43

2.3.4.1 Khuếch đại hộp gene biểu hiện IL12 người từ vector pcDNA3.1(+)/Felix12 43

2.3.4.2 Tách dòng hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL12 người vào vector thể nhận pENTR/D-TOPO 45

2.3.4 Phương pháp thiết kế vector Helper-Dependent Adenovirus biểu hiện gen mã hóa Interleukine-12 người (HDAd-GFP-Felix12) 48

2.3.5 Phương pháp nuôi cấy tế bào 50

2.3.5.1 Nuôi cấy dòng tế bào Q293A và 293Cre4 từ stock 50

2.3.5.2 Cấy chuyển tế bào 51

2.3.6 Phương pháp đánh giá khả năng biểu hiện của vector virus HDAd-GFP mang gen mã hóa IL-12 người (HDAd-GFP/Felix12) trên dòng tế bào Q-293A 51

2.3.6.1 Cắt mở vòng vector HDAd-GFP/Felix12 51

2.3.6.2 Chuyển gen vào dòng tế bào Q293A sử dụng Lipofectamin 2000 (Invitrogen) 53

2.3.6.3 Phương pháp tách chiết và tinh sạch ARN 54

2.3.6.4 Kĩ thuật PCR phiên mã ngược (RT-PCR) 55

2.3.6.5 Khuếch đại cDNA bằng phản ứng PCR 56

2.3.7 Phương pháp sản xuất virus HDAd-GFP mang gen mã hóa IL-12 người (HDAd-GFP/Felix12) trên dòng tế bào 293Cre4 57

2.3.7.1 Chuyển gen vào dòng tế bào 293Cre4 sử dụng Lipofectamin 2000 (Invitrogen) 57

2.3.7.2 Nhiễm helper virus H14 vào trong tế bào 293Cre4 đã chuyển gen 57

2.3.7.3 Nuôi cấy và tăng sinh số lượng virus HDAd-GFP-Felix12 57

2.3.7.4 Kiểm tra đánh giá kết quả sản xuất virus HDAd-GFP-Felix12 59

CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 62

3.1 Kết quả tách dòng hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 người, CMV promoter - IL12B(p40) – Linker - IL12A(p35) - bGH_pA từ vector pcDNA3.1(+)/Felix12 vào vector tiếp nhận pENTR/D-TOPO 62

3.1.1 Kết quả khuếch đại hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 người từ vector pcDNA3.1(+)/Felix12 62

3.1.2 Kết quả tách dòng hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 người vào vector entry pENTR/D-TOPO 63

3.1.3 Kết quả giải trình tự xác nhận hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 người trong vector tiếp nhận pENTR/D-TOPO 65

3.2 Kết quả thiết kế vector Helper-Dependent Adenovirus biểu hiện gen mã hóa Interleukine-12 người 67 3.2.1 Tạo vector tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12 bằng phản ứng LR tái tổ hợp 67 3.2.2 Kết quả giải trình tự xác định vùng nối đầu 5’ và đầu 3’ của trình tự hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 người trong vector HDAd-GFP-DEST 70 3.3 Kết quả đánh giá khả năng biểu hiện của vector virus HDAd-GFP mang gen mã hóa IL-12người trên dòng tế bào Q-293A 72 3.3.1 Kết quả chuyển vector HDAd-GFP/Felix12/NotI vào dòng tế bào Q293A 72 3.3.2 Kết quả đánh giá khả năng biểu hiện của vector virus HDAd-GFP/Felix12 trên dòng tế bào Q-293A 74 Chương IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 80 Tài liệu tham khảo 81

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

ADN : Acid Deoxyribonucleic

HDAd : Helper-Dependent Adenovirus

hIL-12 : Interleukine-12 người (human Interleukine-12)

PCR : Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction)

RT-PCR : Phản ứng phiên mã ngược (Reverse Transcription Polymerase)

Chain Reaction)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang

Hình 1 Cấu trúc của adenovirus 16

Hình 2 Quá trình bám và xâm nhập tế bào của Adenovirus 18

Hình 3 Mô phỏng quá trình vận chuyển vào trong nhân tế bào của Ad2 19

Hình 4 Sơ đồ phiên mã hệ gen của adenovirus type 5 20

Hình 5 Sơ đồ cấu trúc hệ gen của adenovirus type 5 và các thế hệ vector adenovirus 22

Hình 6 Sơ đồ thiết kế tạo gutless adenovirus hay helper dependent adenovirus sử dụng hệ thống Cre/loxP 26

Hình 7 Cấu trúc phân tử Interleukine-12 27

Hình 8 Tái tổ hợp tương đồng của phage lamda trong tế bào E coli 32

Hình 9 Sơ đồ mô tả công nghệ Gateway ứng dụng cơ chế tái tổ hợp tương đồng của phage lamda trong tế bào E coli 33

Hình 10 Sơ đồ cấu trúc vector pcDNA3.1(+)/Felix12 (Vector 1) 35

Hình 11 Sơ đồ cấu trúc vector pENTR/D-TOPO (Vector 2) 36

Hình 12 Sơ đồ cấu trúc vector HDAd-GFP-DEST (Vector 3) 37

Hình 13 Sơ đồ quá trình sản xuất virus Helper - dependent Adenovirus 58

Hình 14 Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 người từ vector pcDNA3.1(+)/Felix12 62

Hình 15 Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm khuếch đại hộp gene biểu hiện IL12 người, CMV– Felix12–bGH_PA trong entry vector pENTR/D-TOPO bằng phản ứng plasmid PCR 64

Hình 16 Kết quả điện di kiểm tra plasmid tái tổ hợp pENTR/D-TOPO mang và không mang hộp gene biểu hiện IL12 người, CMV–Felix12–bGH_PA 65

Hình 17 Sơ đồ vị trí các cặp mồi sử dụng để xác định trình tự hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL12 người trong vector pENTR/D-TOPO 66

Hình 18.Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR tinh sạch của 04 đoạn gene tương ứng với trình

tự 2566 bp của hộp gene biểu hiện IL12 người 67

Hình 19.Sơ đồ vị trí cặp mồi pC4HSU phát hiện sự có mặt của hộp gen mang thiết kế biểu hiện IL-12 người CMV promoter-IL12(p40)-Linker-IL12(p35)-bGH_pA trong vector HDAd-GFP-

Hình 20.Kết quả điện di sản phẩm khuyếch đại trình tự hộp gen biểu hiện IL12 người trong vector

HDAd-GFP-DEST với cặp mồi đặc hiệu vector pC4HSU bằng phản ứng Clony-PCR 69

Hình 21.Kết quả điện di sản phẩm khuyếch đại trình tự hộp gen biểu hiện IL12 người trong vector

HDAd-GFP-DEST với cặp mồi đặc hiệu vector pC4HSU bằng phản ứng PCR 69

Hình 22 Sơ đồ vị trí các cặp mồi sử dụng để xác định trình tự hộp gen mang thiết kế biểu hiện

Hình 23 Kết quả điện di sản phẩm khuyếch đại và sản phẩm tinh sạch sử dụng 2 cặp mồi

Hình 27 Hình ảnh tế bào Q-293A biểu hiện protein phát huỳnh quang GFP sau 24h chuyển gen

với vector HDAd-GFP/Felix-12 được cắt mở vòng với enzyme giới hạn NotI. 75

Hình 28 Kết quả điện di kiểm tra mẫu RNA tổng số trước và sau khi xử lý loại ADN bằng enzyme

Hình 29 Kết quả RT-PCR kiểm tra khả năng biểu hiện của gen mã hóa IL-12 và GFP trên dòng tế

Hình 30 Hình ảnh nuôi cấy dòng tế bào 293Cre4 trên môi trường nuôi cấy MEMα Ảnh chụp sử

Hình 31 Hình ảnh tế bào 293Cre4 sau 48h đồng nhiễm vector virus HDAd-GFP-Felix12 và virus

Hình 32 Kết quả điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho thiết kế A) cặp mồi đặc

hiệu cho gen GFP (GFPFor&Rev), B) cặp mồi đặc hiệu IL12 (RT-Felix12 For&Rev) 79

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 1 Các plasmid sử dụng trong nghiên cứu 35

Bảng 2 Trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu 38

Bảng 3 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại hộp gen biểu hiện IL12 người

sử dụng cặp mồi H1&H2 43

Bảng 4 Thành phần và điều kiện phản ứng Colony-PCR sử dụng cặp mồi H1&H2 46

Bảng 5 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu vector M13

Bảng 8 Thành phần phản ứng cắt vector bằng enzyme giới hạn NotI 53

Bảng 9 Thành phần và điều kiện cho phản ứng tổng hợp cDNA 55

Bảng 10 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá sự biểu hiện của gen mã hóa

Bảng 11 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR đánh giá kết quả sản xuất virus

MỞ ĐẦU

Thành công trong thử nghiệm lâm sàng của liệu pháp gen phụ thuộc vào việc phát triển các hệ vector dẫn chuyển gen phù hợp với các mục tiêu quan trọng phải đạt: (1) có hiệu quả chuyển gen cao; (2) an toàn; (3) có thể sản xuất quy mô lớn Tính đến năm 2013 có hơn 1800 nghiên cứu thử nghiệm gen trị liệu, trong đó có

438 công trình nghiên cứu dùng hệ vector adenovirus, đây là hệ vector được sử dụng với tần suất cao nhất Vector adenovirus được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu cơ bản và tạo vaccine tái tổ hợp Một số hệ thống vector adenovirus đã được nghiên cứu và phát triển, bao gồm: Thế hệ vector thứ nhất là những vector được thiết kế xóa bỏ vùng gen E1A và E1B của virus, thế hệ vector thứ hai là các vector

đã lược bỏ vùng gen E1 và các gen khác của virus Hệ vector thứ ba, Dependent Adenovirus (HDAd) có nhiều ưu điểm vượt trội so với hai hệ thống vector adenovirus đã đề cập ở trên Với thiết kế loại bỏ tất cả các gen gây độc của virus, HDAd có khả năng mang gen trị liệu với tổng kích thước lên tới 36 kb, đồng thời làm giảm tối đa độc tính của vector virus tái tổ hợp

Helper-Trong những năm gần đây, Interleukine-12 người (hIL-12) là một trong những cytokine triển vọng trong liệu pháp miễn dịch chống ung thư Được phát hiện vào năm 1990, IL-12 là yếu tố chủ chốt kích hoạt và khơi mào các tế bào T trợ giúp (Th1); kích thích biệt hóa các tế bào T gây độc (CD8+ T cell); thúc đẩy các tế bào T duy trì sản xuất IFN-γ cần thiết cho việc ức chế khối u; đồng thời tác động trực tiếp đến các tế bào giết tự nhiên tiêu diệt kháng nguyên ung thư

Các hệ vector virus đã được thương mại hóa ứng dụng trong các nghiên cứu gen trị liệu phải kể đến hệ thống ViralPower của hãng Invitrogen được tạo ra bởi công nghệ Gateway, bao gồm các hệ thống vector biểu hiện Lentivirus và Adenovirus được sử dụng theo hai hướng: Tăng cường mức biểu hiện gen trị liệu hoặc biểu hiện siRNA, miRNA ức chế các gen ung thư ở mức độ phiên mã Việc tích hợp công nghệ Gateway để thiết kế hệ thành công thống vector biểu hiện Helper-Dependent Adenovirus dẫn chuyển gen mã hóa cho Interleukine-12 người là

mục tiêu phải đạt khi thực hiện đề tài “Nghiên cứu thiết kế vector tái tổ hợp Helper Dependent Adenovirus mang gen mã hóa Interleukin 12 người và định hướng ứng dụng”

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan về liệu pháp gen

Liệu pháp gen là phương pháp dùng kỹ thuật di truyền để đưa gen trị liệu từ bên ngoài vào tế bào với mục đích sửa chữa, phục hồi các gen khiếm khuyết theo một trong những phương pháp sau:

- Đưa một gen hoạt động bình thường vào vị trí không đặc hiệu trong bộ gen

(genome) để thay thế các gen không còn chức năng Đây là phương pháp phổ biến

nhất

- Một gen dị thường có thể được thay đổi bằng một gen bình thường thông qua tái tổ hợp tương đồng

- Một gen dị thường có thể được sửa chữa thông qua các đột biến chọn lọc

ngược (selective reserse mutation) để chuyển gen trở lại chức năng bình thường của

nó

- Điều hòa một gen đặc biệt nào đó đã bị biến đổi

- Đưa một gen bình thường vào tế bào hoạt động đồng thời với các gen gây bệnh để hạn chế tác động của gen gây bệnh hoặc hỗ trợ cho các gen bị khiếm khuyết

- Đưa một gen bất hoạt vào tế bào thay thế cho một gen bình thường nào đó nhằm hạn chế các sản phẩm không cần thiết của gen lành nhằm tạo ra một trạng thái mới cho tế bào

Về mặt lý thuyết của liệu pháp gen, có thể phân biệt giữa liệu pháp gen đối với

tế bào soma và liệu pháp gen đối với các tế bào mầm (germ) làm nhiệm vụ sinh sản

- Liệu pháp gen soma (Somatic gene therapy) là phương pháp điều trị thay thế

hoặc sửa chữa các gen hỏng, gen gây bệnh của các tế bào soma trong cơ thể Liệu

pháp này có thể sử dụng một số loại tế bào như lympho (lymphocyte), nguyên bào sợi (fibroblast), tế bào máu (hematocyte), tế bào biểu bì (keratinnocyte) Liệu pháp

gen soma có thể được ứng dụng đối với các bệnh như ung thư, thiếu hụt miễn dịch

tổ hợp trầm trọng (SCID), thiếu máu do hồng cầu hình lưỡi liềm,

- Liệu pháp gen tế bào mầm (germline gene therapy) là phương pháp điều trị,

sửa chữa hay thay thế các gen hỏng của giao tử (tinh trùng hoặc tế bào trứng) đưa các tế bào mầm trở lại trạng thái sinh lý bình thường

Hiện nay, liệu pháp gen được nghiên cứu theo 2 hướng chính:

- Liệu pháp gen in vivo: Trong đó, gen trị liệu được chuyển trực tiếp vào tế

bào nhờ các vector chuyển gen, điển hình là vector virus Tuy nhiên, phương pháp này có hạn chế là việc chuyển gen bị phụ thuộc vào kiểu tế bào và hiệu suất chuyển

gen thấp [68]

- Liệu pháp gen ex vivo: Theo cách này, các tế bào phân lập được lấy ra khỏi

cơ thể, gen trị liệu được chuyển vào bên trong tế bào để tạo thành các tế bào mang

và biểu hiện gen trị liệu Các tế bào này sau đó được nuôi cấy ở môi trường thích hợp và đưa trở lại vào cơ thể [68]

Hiện nay, các vector virus được xem là công cụ chuyển gen hiệu quả trong các nghiên cứu liệu pháp gen Với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật, các vector này đã và đang được nghiên cứu biến đổi, cải tiến để làm giảm tối đa độc tính đối với tế bào, đồng thời làm tăng khả năng chuyển gen trị liệu vào bên trong tế bào Một số loại vector virus khác nhau đã được sử dụng trong nghiên cứu như:

dịch cho cơ thể vật chủ hoặc làm tăng tính nhạy của tế bào ung thư với các thuốc hóa trị liệu

Đặc biệt, vector adenovirus có những đặc điểm, lợi thế ưu việt hơn hẳn các hệ thống chuyển gen khác bao gồm: - i) Có khả năng nhiễm vào nhiều loại tế bào khác nhau kể cả tế bào phân chia và không phân chia; - ii) Hướng đích các tế bào cơ, gan, phổi; - iii) Có hiệu suất chuyển gen cao;- iv) Có khả năng tách dòng gen trị liệu kích thước lớn Ngoài ra, vector adenovirus có bản chất là ADN dạng thẳng, tái bản ở trong nhân, không cài ADN của chúng vào hệ gen vật chủ vì vậy đây là hệ vector được chứng minh là an toàn nhất trong các thử nghiệm về gen trị liệu [46] Cho đến nay vẫn chưa có một công bố nào chứng minh adenovirus có khả năng gây ung thư, tạo ra khối u trên cơ thể người, do đó adenovirus được sử dụng như một vaccine sống trong các nghiên cứu về liệu pháp gen

Tuy nhiên, nhược điểm chính của các hệ vector adenovirus là gây đáp ứng miễn dịch đối với vật chủ làm hạn chế thời gian biểu hiện của gen chuyển bên trong

tế bào, làm giảm hiệu quả chức năng của gen chuyển Các nghiên cứu về gen trị liệu hiện nay tập trung trực tiếp đến việc thiết kế các hệ vector virus hướng đích tế bào nhưng giảm tính sinh miễn dịch của chính vector đối với tế bào đích Hệ vector adenovirus đã được sử dụng trong các nghiên cứu thử nghiệm tiền lâm sàng trên người cho các bệnh như: bệnh xơ nang, bệnh thiếu hụt omithine transcarbamolyse [15], ung thư đầu mặt cổ, ung thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt, ung thư buồng trứng, ung thư vú, … [41]

1.2 Vector adenovirus

1.2.1 Đặc điểm sinh học của adenovirus

Adenovirus (Ad) được phát hiện và phân lập bởi Rowe và cộng sự qua các thí nghiệm nuôi cấy các chủng virus phân lập từ vòm họng [52] Mặc dù adenovirus gây bệnh đường hô hấp, các bệnh lý về mắt và bệnh lý đường tiêu hóa, nhưng virusnày đã được tập trung nghiên cứu trong nhiều năm qua như là mô hình để nghiên cứu các cơ chế của tế bào có nhân bậc cao, bao gồm: quá trình phiên mã, xử

lý ARN, khuếch đại ADN, dịch mã và cơ chế bệnh sinh ung thư Gần đây, adenovirus được lựa chọn chủ yếu trong các nghiên cứu liệu pháp gen và chỉ đứng thứ hai sau hệ thống vector retrovirus

Adenovirus thuộc họ Adenovirus với 51 kiểu huyết thanh được chia thành sáu nhóm (từ A – F) dựa trên trình tự tương đồng và khả năng ngưng kết tế bào hồng cầu người [57] Các virus thuộc nhóm A và B tiềm ẩn khả năng gây ung thư trên các loài gặm nhấm mới sinh, các virus dùng trong chuyển gen từ nhóm C trở đi không có khả năng gây khối u mà chỉ gây ra các bệnh hô hấp nhẹ trên người, chiếm khoảng 5-15% các trường hợp cúm thông thường Hệ gen của adenovirus là chuỗi đôi có kích thước 36kb Ở hai đầu tận cùng của hệ gen là hai trình tự lặp lại tận

cùng đảo ngược (ITR, inverted terminal repeat) với kích thước từ 100 – 140bp, liên kết với protein kết thúc (TP, terminal protein) bằng liên kết hóa trị Về hình thái,

adenovirus có vỏ và protein cấu trúc bao bọc hệ gen của virus này và có cấu trúc hình khối 20 mặt Trên cấu trúc tiếp giáp giữa hai mặt của vỏ có cấu trúc penton

base, có vai trò neo giữ protein sợi (fibre protein), chịu trách nhiệm bám dính virus

với bề mặt của tế bào Mỗi mặt của vỏ virus bao gồm 03 protein hexon và các

protein pIIIa, pVI, pVIII và pIX (Hình.1)

Hình 1 Cấu trúc của adenovirus A) Cấu trúc mô phỏng của adenovirus dựa trên sự hiểu biết về thành phần polypeptide và ADN; B) Ảnh chụp kính hiển vi điện tử của adenovirus [3]

Protein VII, có trình tự peptide nhỏ được gọi là mu [3], liên kết chặt chẽ với ADN virus, trong khi protein V được đóng gói với phức hợp ADN-protein cung cấp liên kết cấu trúc với vỏ qua protein VI [40] Các thành viên của họ adenovirus có khả năng lây nhiễm các loại tế bào sau phân bào, thậm chí cả các mô biệt hóa cao như cơ vân, phổi, não và tim Với khả năng vận chuyển hệ gen và khả năng khuếch đại với hiệu quả cao, adenovirus là sự lựa chọn số một để biểu hiện và vận chuyển các gen trị liệu đến các tế bào chủ với phạm vi rộng

1.2 2 Chu kỳ nhân lên của adenovirus

1.2.2.1 Quá trình bám và xâm nhập vào bên trong tế bào

Trong tất cả các nhóm, loại trừ adenovirus nhóm B, hạt virus ban đầu bám vào

bề mặt tế bào thông qua liên kết của fibre Knob với thụ thể bề mặt tế bào tương thích cho Coxsackie B virus [8] được gọi là thụ thể coxsackie/adenovirus receptor (CAR) Đây là một protein huyết tương màng có trọng lượng phân tử 46kDa thuộc siêu họ immunoglobulin, cấu trúc bao gồm các domain bên ngoài màng tế bào, chuyển màng và domain trong tế bào chất [63], với phần domain ngoại bào cần thiết

để liên kết giữa virus với tế bào [8] CAR có chức năng như phân tử liên kết tế bào với tế bào trên bề mặt màng đáy của tế bào biểu mô [29] Phân tử CD46, là proten điều hòa bổ trợ, được biết đến như một thụ thể tế bào cho adenovirus nhóm B [24]

Sau khi bám dính với bề mặt tế bào (Hình 2), bộc lộ motif RGD trên penton tương

tác với họ protein αv integrin cho phép virus vào bên trong tế bào theo cơ chế phụ thuộc clathrin, thụ cảm thể qua trung gian nhập bào [59, 42] Integrins hình thành

họ lớn thụ cảm thể dimer dị hợp như integrin αvβ3 và αvβ5, cả 2 hỗ trợ cho adenovirus xâm nhập vào bên trong tế bào, αvβ5 biểu hiện ở tế bào mô cuống phổi người, là vị trí chính của quá trình lây nhiễm adenovirus in vivo [43] Tương tác giữa virus với màng tế bào cảm ứng một loạt các con đường truyền tín hiệu như hoạt hóa con đường phosphoinositide - 3- OH kinase (Pi-3k), kích hoạt họ protein Rho của GTPases và polymer hóa, tái tổ chức cấu trúc của actin thuận lợi cho quá trình nhập bào [31, 48]

Hình 2.Quá trình bám và xâm nhập tế bào của Adenovirus A) Tương tác giữa virus

và thụ thể tế bào liên quan đến liên kết ái lực mạnh qua phần nhô ra của sợi fibre Thụ thể

bề mặt tế bào để adenovirus serotype 5 nhận biết tương tự như thụ thể nhận biết của coxsackie B virus, và được đặt tên là thụ thể Coxsackie/Adenovirus receptor (CAR) Sau

khi tiếp xúc tế bào, B) tương tác giữa penton base và αν integrin trên bề mặt tế bào cho

phép virus xâm nhập vào tế bào qua quá trình nhập bào [8]

Sau 20 phút lây nhiễm, con đường truyền tín hiệu RAF/mitogen hoạt hóa protein Kinase (MAPK) được kích hoạt và sản xuất IL-8 [13] Trong tế bào chất

(Hình 3), protein dynein chuyên trở các hạt virions theo suốt vi ống tế bào

(microtubeles) tới nhân, tại đây chúng tiếp xúc với phức hệ lỗ nhân (nuclear pore complex, NPC) [30] Loại bỏ vỏ capsid tại NPC cho phép hệ gen virus xâm nhập và

bắt đầu quá trình phiên mã

Hình 3 Mô phỏng quá trình vận chuyển vào trong nhân tế bào của Ad2. Hạt virus Ad2 tập trung trên sợi tế bào chất của lỗ nhân bằng cách bám với phức hợp protein CAN/Nup214 Protein histone H1 giải phóng từ nhân và bám vào protein hexon trênn bề mặt gần nhất của vỏ capsid Protein importin β hình thành liên kết dimer với protein importin 7 liên kết protein H1, cảm ứng xâm nhập phức hệ H1-hexon và kích hoạt tháo bỏ

vỏ capsid ADN virus được giải phóng gần vị trí mở của lỗ nhân để chuyển vào trong nhân

tế bào [30]

1.2.2.2 Gen sớm và quá trình sao chép ADN

Chu kỳ lây nhiễm của adenovirus có thể được chia thành 2 phase: phase

“sớm” và “muộn” tương ứng trước và sau quá trình sao chép ADN virus (Hình 4)

Pha sớm bao gồm quá trình xâm nhập của virus vào bên trong tế bào và vận chuyển

hệ gen virus vào trong nhân, tiếp đến là quá trình phiên mã và dịch mã của những gen “sớm” Quá trình này sẽ thúc đẩy các chức năng của tế bào tạo điều kiện sao chép ADN virus dẫn đến kết quả phiên mã và dịch mã các gen “muộn” Điều này cũng dẫn đến sự hình thành các protein cấu trúc và hình thành virus hoàn chỉnh Pha sớm kéo dài từ 6-8 giờ, trong khi pha muộn thường diễn ra nhanh, thời gian tạo virus từ 4 - 6 giờ sau đó

Vùng gen được phiên mã đầu tiên là E1A để tạo ra rất nhiều mRNA và protein Hai vùng gen phiên mã E1A được tạo ra suốt quá trình lây nhiễm sớm là 13S mRNA mã hóa cho 289R (trong đó R là kí hiệu cho các amino acid) protein

của virus Ad5 và 12S mRNA mã hóa cho 234R Những protein này tồn tại vĩnh viễn trong tế bào nuôi cấy, khi chúng biểu hiện và kết hợp với protein E1B, gây hình thành khối u ở động vật gặm nhấm [6] Trong suốt quá trình xâm nhiễm,

protein E1A có chức năng tăng cường hoạt hóa mức độ phiên mã (trans-activate)

của các vùng gen khác như: E1B, E2, E3 và E4 và cảm ứng tế bào đi vào phase S của chu kỳ tế bào, tạo môi trường tối ưu cho quá trình sao chép của virus [9] Protein E1A còn tham gia vào quá trình kiểm soát chu trình của tế bào, E1A bám trực tiếp và ức chế các thành phần tham gia kiểm soát chu kỳ của tế bào như cyclin-dependent kinase inhibitor p21 [15]

Hình 4 Sơ đồ phiên mã hệ gen của adenovirus type 5 Hệ gen adenovirus có kích thước khoảng 36 kb, gồm 4 vùng gen phiên mã sớm: E1-E4 và 5 vùng gen phiên mã muộn: L1-L5; Trình tự lặp lại tận cùng đảo ngược (ITR) cần thiết cho việc tái bản của virus; Ψ: tín hiệu đóng gói-vùng nằm trong khoảng 194-358 bp gần phía cánh trái ITR tham gia vào việc đóng gói ADN tạo thành các hạt virus; MLP: promoter muộn chính [6]

Vùng gen E2 mã hóa cho một số protein cần thiết cho quá trình nhân lên của

hệ gen virus như: ADN polymerase, protein tiền kết thúc (pTP) và protein với kích thước 72kDa bám chuỗi đơn ADN (DBP) Những protein này cần thiết cho cơ chế nhân lên của virus và cho quá trình sao chép của những gen muộn, toàn bộ quá trình

sẽ được xúc tác thông qua tương tác với các yếu tố nội bào

Sản phẩm vùng gen E3 của virus là các protein phục vụ cho mục đích nhân lên của virus trong môi trường nuôi cấy mô, với vai trò phá vỡ đáp ứng miễn dịch của vật chủ, loại trừ các tế bào đã bị nhiễm virus

Vùng E4 chứa ít nhất 7 khung đọc mở (ORFs) có chức năng khác nhau Các sản phẩm của gen E4 có liên quan tới việc điều hòa biểu hiện protein của tế bào và protein virus, sự sao chép AND, tích trữ mARN và sự tổng hợp protein của virus, từ

đó điều chỉnh sự tổng hợp protein của vật chủ [35]

1.2.2.3 Biểu hiện gen muộn và đóng gói virus

Promoter muộn chính (MLP, major late promoter) của Ad phiên mã cho các

gen muộn của virus được biểu hiện từ 5 vùng gen (L1-L5) Đơn vị sao chép muộn

chính (MLTU, the major late transcription unit) mã hóa cho khoảng 15 đến 20

mRNA khác nhau, đều có nguồn gốc từ một tiền mRNA bởi quá trình cắt nối khác nhau và polyadenylation Những đơn vị phiên mã này ban đầu mã hóa cho các protein cấu trúc của virus và các protein khác tham gia vào quá trình đóng gói virus

Sự điều khiển của các gen muộn mã hóa cho cấu trúc protein lớp vỏ capsid đã được nghiên cứu phát hiện như một chiến lược nhằm thay đổi định hướng của các vector liệu pháp gen [23]

Trình tự đóng gói của adenovirus là chuỗi 7 trình tự lặp (trình tự Ψ) và ở vị trí

tận cùng trái của hệ gen [28] Sau khi lắp ráp và đóng gói ADN, adenovirus protease cắt các protein cấu trúc thành các protein chức năng để sản xuất các hạt virus hoàn chỉnh Tế bào ly giải và giải phóng ác hạt virus hoàn chỉnh sau 30 giờ lây

nhiễm với sự tham gia của protein ADP (adenovirus death protein) , protein này chỉ

được tạo thành trong suốt pha muộn của quá trình lây nhiễm và được sao chép từ MLP [39, 61, 62]

1.2.3 Các hệ vector adenovirus

Adenovirus có thể lây nhiễm nhiều loại tế bào bao gồm tế bào phân chia và không phân chia, đặc tính này kết hợp với các phương pháp chuẩn bị và tinh chế đơn giản cho phép sử dụng vector này như một vật liệu di truyền hữu hiệu để

chuyển gen trị liệu vào tế bào Một số hệ thống vector adenovirus đã được nghiên

cứu và phát triển có tiềm năng trong các nghiên cứu liệu pháp gen (Hình 5), có thể

được sử dụng cho: i) liệu pháp ung thư bằng cách vận chuyển các gen có khả năng

ức chế khối u; ii) liệu pháp gen; iii) liệu pháp bổ sung vận chuyển gen, biểu hiện gen chống lại tiến triển của bệnh

Hình 5 Sơ đồ cấu trúc hệ gen của adenovirus type 5 và các thế hệ vector

adenovirus Hệ gen adenovirus có 4 vùng gen phiên mã sớm: E1-E4 và 5 vùng gen phiên

mã muộn: L1-L5; MLP: promoter muộn chính; ITR-trình tự lặp lại tận cùng đảo ngược; Ψ: tín hiệu đóng gói

hệ đầu tiên cũng được thiết kế theo hướng khác là loại bỏ thêm vùng E3, vì sản phẩm của gen E3 không cần thiết trong quá trình tái bản của virus, do đó xóa bỏ vùng gen E1 và E3 sẽ làm tăng kích thước tiếp nhận gen trị liệu của vector lên 8,2

kb

Mặc dù vector adenovirus thế hệ thứ nhất đã được chứng minh là có triển vọng cho mục đích nghiên cứu gen trị liệu nhưng vẫn có một số mặt hạn chế còn tồn tại Hạn chế đầu tiên được bộc lộ trong quá trình sản xuất vector Cụ thể, sự tái

tổ hợp giữa trình tự vùng gen E1 trong dòng tế bào trợ giúp và virus tái tổ hợp có thể làm tăng số lượng virus với vùng gen chức năng E1 không bị loại bỏ nhưng vẫn nhân lên trong quá trình sản xuất virus Hạn chế tiếp theo liên quan đến việc sử dụng vector adenovirus thế hệ thứ nhất đó là khả năng kích hoạt phản ứng miễn dịch của tế bào chủ dẫn đến các tế bào được chuyển gen sẽ bị đào thải bởi chính cơ chế miễn dịch của tế bào chuyển gen Ngoài ra, vì thiết kế xóa bỏ vùng E1 không đồng nghĩa với việc loại bỏ hoàn toàn gen gây độc của virus Điều này là nguyên nhân trực tiếp gây ra độc tính của vector sau khi thâm nhiễm vào cơ thể Đồng thời, thế hệ vector adenovirus đầu tiên không thích hợp để biểu hiện ổn định và lâu dài các gen trị liệu trong cơ thể Thực tế, một số nghiên cứu đã chứng mình rằng khi tiêm các vector đã loại bỏ vùng gen E1 vào tế bào động vật thì sự biểu hiện của gen trị liệu sau khi được chuyển vào tế bào chỉ mang tính chất tạm thời [18]

Mặc dù việc sử dụng bị hạn chế bởi các đáp ứng miễn dịch mạnh của vật chủ nhưng hệ vector adenovius thế hệ thứ nhất vẫn hứa hẹn cho các nghiên cứu ứng dụng đòi hỏi việc dẫn chuyển biểu hiện gen trị liệu trong thời gian ngắn, như các nghiên cứu liệu pháp ung thư và vaccine tái tổ hợp

1.2.3.2 Vector adenovirus thế hệ thứ hai

Để khắc phục những hạn chế của vector Adenovirus thế hệ đầu tiên, các vector thế hệ thứ hai đã được thiết kế xóa bỏ vùng E1/E2 hay E1/E4 Quá trình sao chép ADN của adenovirus phụ thuộc vào gen E2 Gen E2A mã cho protein bám ADN

virus; gen E2B dịch mã tạo ra protein tiền kết thúc (preterminal protein) và ADN

polymerase [5] Sản phẩm của gen E2A không chỉ cần thiết cho quá trình tái bản ADN virus mà nó còn điều khiển quá trình phiên mã từ promoter muộn, kiểm soát tổng hợp tất cả protein cấu trúc của virut Các gen E1 và E4 đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa biểu hiện gen của virus Sự xóa bỏ vùng gen1/E4 ở thế hệ vector thứ hai được nghiên cứu là có sự giảm nhiễm độc gan và cải thiện đáp ứng miễn dịch vật chủ so với vector thế hệ đầu [19, 25]

Tuy nhiên, việc xây dựng thiết kế vector adenovirus thế hệ này tương đối khó khăn Yêu cầu đặt ra là phải tạo được các dòng tế bào mang các trình tự gen có chức

năng in trans đã bị xóa của adenovirus Mặc dù, hạn chế này có thể khắc phục

nhưng tốn thời gian, công sức Hơn nữa, các vector được đóng gói trong các dòng tế bào này ít có khả năng tiếp tục tái tổ hợp để tạo nên virus có khả năng sao chép Ví

dụ trường hợp của gen E2, dòng tế bào sử dụng phải biểu hiện ổn định các protein

cần thiết cho việc đóng gói adenovirus như: protein bám sợi đơn ADN (single binding protein), các protein tiền kết thúc và ADN polymerase của virus [4]

ADN-Tóm lại, thế hệ vector thứ hai có ưu điểm là tính an toàn của virus đã được nâng cao nhưng các vấn đề liên quan đến miễn dịch vật chủ thì chưa được cải thiện

và cách xây dựng vector tương đối khó khăn

1.2.3.3 Helper-Dependent Adenovirus (HDAd)

Hệ vector Helper-Dependent Adenoviral (HdAd) ưu việt hơn tất cả các hệ vector chuyển gene khác trong các thí nghiệm về liệu pháp gene bởi khả năng kéo dài thời gian biểu hiện được quan sát ở chuột và khỉ, độc tính của virus giảm đáng

kể thậm chí không còn gây độc tính HdAd được thiết kế bằng cách loại bỏ tất cả các gene gây độc của virus, chỉ giữ lại duy nhất trình tự lặp đảo ngược (ITRs) ở hai đầu tận cùng cần thiết cho sự nhân lên của vector virus, và trình tự Ψ cần thiết để đóng gói thành các virus tái tổ hợp hoàn chỉnh Toàn bộ trình tự gene bị xóa bỏ của virus sẽ được thay thế bởi những thiết kế mang gene trị liệu hoặc bởi các trình tự ADN không mang mã được gọi, “stuffer”, để giữ cho vector có kích thước tương thích cho việc đóng gói Qui trình sản xuất và tinh chế HdAd tái tổ hợp bắt buộc cần

hai yếu tố: (1) helper virus (ΔE1/ΔE3) là virus đã xóa bỏ vùng gene E1 và E3 với trình tự Ψ được xen giữa hai vị trí trình tự nhận biết loxP; (2) dòng tế bào 293Cre4,

là dòng tế bào được thiết kế để biểu hiện protein tái tổ hợp Cre recombinase, là protein xúc tác cho quá trình tái tổ hợp giữa trình tự loxP cắt vị trí đóng gói của virus Helper Như vậy, việc cắt bỏ trình tự Ψ khiến virus helper không thể đóng gói nhưng tất cả gene chức năng khác của virus thì được giữ nguyên giúp duy trì khả năng sao chép và cung cấp chức năng trợ giúp cho vector HdAd có thể sao chép và đóng gói thành virus tái tổ hợp hoàn chỉnh

Vì HDAds bị xóa tất cả bộ mã di truyền của virus do đó cần phải có một virus trợ giúp cho sự nhân lên của chúng Phương pháp hiệu quả đầu tiên để phát triển

HDAds là hệ thống Cre-loxP được Graham và cs phát triển vào năm 1996 [27]

(Hình 6) Để việc đóng gói của HDAds đạt hiệu quả thì kích thước của bộ gen phải

được thiết kế sao cho chúng nằm trong phạm vi có kích thước từ 27,7 – 38 Kb, do vậy ADN "chèn" thường có trong hệ vector HDAds Kích thước của ADN chèn có thể có ảnh hưởng đến hiệu suất đóng gói của vector [55] Để giải phóng vector HDAd (chuyển đổi bộ gen HDAd từ “dạng plasmid" sang "dạng virus" ), các plasmid đầu tiên được cắt với các enzyme giới hạn thích hợp để giải phóng bộ gen HDAd từ các trình tự dạng plasmid và được chuyển vào dòng tế bào 293Cre4 Dòng

tế bào 293Cre4 là dòng tế bào mang thiết kế biểu hiện enzyme recombinase nhận biết vị trí đặc hiệu loxP trên trình tự của vector HDAd, đồng thời chuyển bộ gen HDAd vào dòng tế bào 293Cre4 thì virus trợ giúp H14 cũng được gây đồng nhiễm vào dòng tế bào này Các virus trợ giúp, là một FGAd (bị xóa gen E1), mang trình

tự tín hiệu đóng gói hai đầu tận cùng được thiết kế hai trình tự nhận biết loxP, là vị

trí nhận biết cho enzyme cắt recombinase Khi tế bào 293Cre4 được nhiễm với H14 thì tín hiệu đóng gói được cắt ra từ bộ gen của virus trợ giúp này Kết quả bộ gen của virus trợ giúp không thể đóng gói nhưng vẫn có thể trải qua sự sao chép ADN

và do đó bổ sung trực tiếp cho sự sao chép và đóng gói bộ gen của vector HDAd Tuy nhiên việc sản xuất hiệu quả số lượng lớn các vector chất lượng cao còn gặp nhiều khó khăn, chưa đáp ứng được các nghiên cứu tiền lâm sàng (trên mô hình

động vật lớn) và trên lâm sàng Để giải quyết vấn đề này, người ta đã phát triển một

hệ thống cải biến gồm dòng tế bào sản xuất thích ứng dưới dạng hỗn dịch có biểu hiện Cre ở mức độ cao và một loại virus trợ giúp kháng đột biến kèm theo là các phương pháp tinh chế hiện đại

Hình 6 Sơ đồ thiết kế tạo gutless adenovirus hay helper dependent adenovirus sử

dụng hệ thống Cre/loxP [45]

1.3 Tổng quan về Interleukine-12 người

Trong những năm gần đây, liệu pháp miễn dịch điều trị ung thư đóng vai trò không nhỏ trong các nghiên cứu về gen trị liệu Với tiến bộ của khoa học kĩ thuật, rất nhiều kháng nguyên, cytokine, chemokine… tiềm tăng đã được phát hiện, tuy nhiên riêng với điều trị ung thư thì mới chỉ có một số dạng tái tổ hợp của các cytokine được cơ quan quản lý dược phẩm và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép

sử dụng như interleukine-2, interferon-alpha 2a, 2b [33] Gần đây nhất, một số cytokine khác nữa đang được triển khai nghiên cứu trên mô hình động vật và các pha thử nghiệm lâm sàng trên người ví dụ như IL-7 [38], IL-12 [67]…

1.3.1 Cấu trúc của Interleukine-12

Interleukine-12 là một cytokine dị hợp, tham gia chủ yếu vào việc điều hòa đáp ứng miễn dịch trung gian tế bào Cytokine này có trọng lượng phân tử 70 kDa

(Hình 4) gồm hai tiểu đơn vị chuỗi α (p35) (35 kDa) và chuỗi β (p40) (40 kDa),

liên kết với nhau bởi cầu nối disulfide Hai tiểu đơn vị của IL-12 được mã hóa bởi gen nằm trên hai nhiễm sắc thể khác nhau [37]

Về nguồn gốc, IL-12 được sản xuất bởi các thực bào đã được hoạt hóa như: tế

bào bạch cầu đơn nhân (monocyte), đại thực bào (macrophage), bạch cầu trung tính (neutrophils), các tế bào tua (Denritic cells –DCs) Gần đây, các nghiên cứu còn chỉ

ra rằng IL-12 còn được sản sinh bởi dòng tế bào IFN-producing killer DC lineage (IKDCs) [13] Mặc dù, ở nhiều loại tế bào có sự biểu hiện IL-12 p35 ở mức độ thấp nhưng IL-12 p40 không được biểu hiện nên không thể tạo thành phân tử IL-12 p70 hoàn chỉnh, có đầy đủ chức năng miễn dịch Chỉ khi các tế bào trình diện kháng

nguyên (antigen present cells, APCs) nhận diện, hấp thụ và xử lý kháng nguyên ung

thư thì quá trình phiên mã, dịch mã IL-12 p35 và p40 mới được kích hoạt Sau đó, nhờ các biến đổi sau dịch mã như: glicosyl hóa, hình thành cầu nối disunfit S-S… hai tiểu phần IL-12 p35 và p40 được kết hợp và tạo thành phân tử IL-12 p70 hoàn chỉnh

Hình 7 Cấu trúc phân tử Interleukine-12 [69].

1.3.2 Vai trò của Interleukine-12 trong điều trị ung thƣ

Theo các nghiên cứu đã công bố, tác dụng của IL-12 trong điều trị ung thư đó

là: i) kích thích quá trình biệt hóa và định hình tính đặc hiệu thụ thể (T cell receptor

- TCR) trên bề mặt CD4 lympho T trợ giúp (helper T cell) thông qua việc kích thích

quá trình tăng sinh của tế bào trình diện kháng nguyên DC (Dendritic cell); ii) định

hướng độc tính của cytotoxic CD8 T lymphocyte [19, 61]; iii) ức chế quá trình tạo mạch máu: một trong những thay đổi căn bản của tế bào ung thư so với tế bào thông thường đó là liên tục tham gia phân bào, nhu cầu dinh dưỡng cao hơn mức bình thường, vì thế chúng tiết ra các hormone làm tăng quá trình phát triển của mạch

máu tới khối u (angiogenesis), cho đến nay người ta biết rằng IL-12 là một trong

những cytokine ức chế quá trình đó, nhờ vậy gián tiếp làm ức chế sự phát triển của khối u [19]

Gần đây, một khám phá quan trọng liên quan đến tính chất sinh học của IL-12

đó là cytokine này có khả năng ức chế quá trình phát triển của khối u trên mô hình

động vật thử nghiệm thiếu hụt miễn dịch (nude mice) [21] Một điều quan trọng đối

với nude mice là hệ lympho bị bất hoạt, điều đó có nghĩa tác dụng kháng ung thư của IL-12 không phụ thuộc hệ lympho

Cho đến nay, các thử nghiệm lâm sàng sử dụng protein tái tổ hợp IL-12 được triển khai và đã đi đến việc tái khẳng định tính chất ức chế khối u của IL-12, tuy nhiên độc tính của IL-12 rất mạnh thậm trí gây chết người [17], điều này làm chậm quá trình triển khai ứng dụng IL-12 trong điểu trị ung thư Mặc dù vậy những thử nghiệm mới nhất cho thấy khi kết hợp sử dụng Il-12 với các cytokine khác như IL-

2, interferon alpha, B7.1, IL-7, IL-21, IL-15 [67] và đặc biệt là IL-18, độc tính của IL-12 giảm một xuống mưc gần như không có [50], điều này mở ra triển vọng cho ứng dụng một trong các interleukine có tính ức chế ung thư mạnh nhất – IL 12 vào các pha thử nghiệm lâm sàng tiếp theo Đương nhiên việc làm chủ công nghệ sản xuất Interleukine tái tổ hợp IL-12 sẽ không chỉ đem lại lợi ích cho việc phát triển các liệu pháp điều trị bệnh ung thư liên quan đến IL-12 mà còn có thể phối kết hợp

sử dụng IL-12 với các interleukine tiềm năng khác như IL-7, IL-15, IL-18, IL-21 trong điều trị các căn bệnh ác tính khác nữa

1.3.3 Một số nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam sử dụng hệ vector adenovirus mang gen mã hóa IL12 trong nghiên cứu điều trị ung thƣ

Sử dụng liệu pháp gen để làm tăng đáp ứng miễn dịch tiêu diệt khối u là mục tiêu phải đạt trong điều trị ung thư Trong một nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên

chuột công bố năm 2001, nhóm nghiên cứu của Miguel Barajas và cộng sự đã tiến hành thử nghiệm khả năng loại bỏ khối u của adenovirus tái tổ hợp mang gen IL-12 (AdCMVIL-12) trên 3 mô hình gây ung thư biểu mô tế bào gan khác nhau ở chuột Khi tiêm trực tiếp AdCMVIL-12 vào khối u được ghép trong gan đã đạt được các kết quả ức chế đáng kể sự phát triển khối u theo các liều điều trị với AdCMVIL-12

Kết quả cho thấy 50% động vật khi được điều trị với liều tiêm 5  109đơn vị virus tái tổ hợp mang gene IL-12 đã ức chế hoàn toàn khối u sau hai tuần điều trị với thời gian sống của động vật được kéo dài lên tới 60% [44] Trên mô hình chuột gây ung thư bởi diethylnitrosamine với khối u có đường kính 1-5 mm, khi AdCMVIL-12 được tiêm vào động mạch gan với liều tiêm 5  109đơn vị virus thì chỉ có 20% chuột được điều trị mất hoàn toàn khối u và 60% trường hợp quan sát có ức chế phát triển u với thời gian sống được kéo dài So với protein tái tổ hợp thì việc sử dụng virus tái tổ hợp tỏ ra có ưu thế hơn Do vậy, ý tưởng dùng hệ vector adenovirus để dần truyền biểu hiện IL-12 đến đúng vị trí của khối u để hạn chế các tác dụng phụ trong khi vẫn duy trì hoạt tính kháng u của cơ thể sau khi điều trị [16]

Trong các nghiên cứu trước đây phần lớn hai tiểu đơn vị p35 và p40 của IL-12

hoặc được biểu hiện riêng lẻ hoặc liên kết với nhau bởi trình tự IRES (Internal ribosome entry site) Tuy nhiên, mức độ biểu hiện từ các thiết kế này lại phụ thuộc

vào kiểu tế bào [10] Việc thiết kế đồng nhất hai tiểu đơn vị của IL-12 thành một chuỗi đơn (scIL-12) sẽ hạn chế yếu điểm về mức độ biểu hiện của IL-12 Trong công trình nghiên cứu công bố trên tạp chí Nature Biotech, Lieschke và cộng sự đã thiết kế thành công phân tử IL-12 đơn chuỗi bằng việc liên kết hai tiểu đơn vị p35

và p40 qua cầu lối peptide Gly6Ser, phân tử IL-12 đơn chuỗi này có hoạt tính sinh học cao hơn rõ rệt so với các thiết kế chỉ biểu hiện những tiểu đơn vị IL-12 đơn lẻ [32] Việc điều chỉnh liều lượng IL-12 trong điều trị lâm sàng hết sức quan trọng

bởi IL-12 biểu hiện nhiều hay ít liên quan trực tiếp đến hoạt tính của INF- Các hệ vector biểu hiện adenovirus thường được thiết kế mang CMV promoter, đây là một

promoter biểu hiện mạnh và chỉ duy trì khả năng biểu hiện khoảng 2 tuần ở tế bào gan [36], như vậy với đặc tính này của CMV promoter sẽ hạn chế những tác dụng phụ khi biểu hiện IL-12 Thời gian biểu hiện của cytokine trong 2 tuần là đủ để gây kích thích đáp ứng miễn dịch Một khi tế bào miễn dịch được kích hoạt, chúng sẽ tiếp tục duy trì vai trò tiêu diệt khối u của chúng sau đó

Mặc dù liệu pháp điều trị IL-12 cho người và chuột là khác nhau nhưng giới hạn về độc tính cho cả hai loài thì đã được biết Trong thử nghiệm lâm sàng và tiến hành điều trị, nếu liều điều trị nằm trong giới hạn cho phép thì có thể tiến hành theo phác đồ điều trị Giới hạn cho phép của protein tái tổ hợp IL-12 trong máu bệnh nhân là 6ng/ml [34], giới hạn được coi là an toàn đối với INF- tái tổ hợp trong huyết thanh là 100ng/ml Các nghiên cứu đã chứng minh rằng để đạt được nồng độ

an toàn của IL-12 trong huyết thanh của chuột và người thì đơn vị virus Ad.scIL-12

cần sử dụng để tiêm trực tiếp vào khối u sẽ là 1  109pfu, khi đó nồng độ scIL-12 trong máu được xác định là 0.13ng/ml, tương ứng nồng độ INF- tiết trong huyết thanh xấp xỉ 9pg/ml khi được kích hoạt bởi IL-12 Như vậy, giá trị này thấp hơn 5 lần so với liều điều trị cho phép trong thử nghiệm lâm sàng sử dụng protein tái tổ hợp IL-12 [22] Kết quả đạt được từ công trình nghiên cứu này khẳng định hai mục tiêu khoa học: 1) Chứng minh tính hiệu quả của việc thiết kế hệ vector adenovirus tái tổ hợp biểu hiện IL-12 là an toàn và có hoạt tính ức chế mạnh đối với khối u, kéo dài thời gian sống cho chuột trên các mô hình gây ung thư gan thực nghiệm; 2) Xác định được liều điều trị an toàn khi tiêm 1  109 đơn vị virus tái tổ hợp Ad.scIL-12 cho chuột

Thử nghiệm lâm sàng giai đoạn I trên người đã được tiến hành bởi nhóm nghiên cứu do Jesus Prieto dẫn đầu vào năm 2004 [12] Đây là nhóm nghiên cứu đầu tiên sử dụng hệ vector adenovirus biểu hiện gene IL-12 người (Ad.IL-12) điều trị cho 21 bệnh nhân: 9 bệnh nhân ung thư gan, 5 bệnh nhân ung thư đại trực tràng

và 7 bệnh nhân ung thư tụy Kết quả từ nghiên cứu này cho thấy liệu pháp điều trị ung thư khi tiêm trực tiếp Ad.IL-12 vào tổ chức u là khả thi và an toàn Liều tiêm

Ad.IL-12 cho bệnh nhân được đánh giá với các liều điều trị khác nhau cho tới 7.5 x

1013đơn vị virus, Ad.IL-12 được dung nạp tốt ở bệnh nhân và không gây độc tính đối với các liều điều trị Biểu hiện lâm sàng quan sát được trên bệnh nhân như: sốt, khó chịu, đổ mồ hôi và giảm tế bào lympho, các triệu chứng lâm sàng này dường như liên quan đến phản ứng của cơ thể đối với virus hơn là phản ứng của cơ thể đối với IL-12 Không xuất hiện độc tính tích lũy trên các bệnh nhân được điều trị 4 trong số 10 bệnh nhân theo dõi phát hiện sự tăng đáng kể các tế bào có chức năng miễn dịch ở bên trong của khối u Tình trạng bệnh ổn định được quan sát trong số 29% bệnh nhân tham gia điều trị, chủ yếu là bệnh nhân ung thư gan nguyên phát

Ở Việt Nam trong những năm gần đây, đã có một vài nghiên cứu liên quan đến việc sử dụng Adenovirus, đi đầu phải kể đến kết quả nghiên cứu của PGS TS

Lê Thanh Hòa và cộng sự vào năm 2010 Đây là kết quả của đề tài KC04.24/06-10 ứng dụng hệ thống adenovirus làm mô hình vector mang gen VP2 của virus Gumboro tạo vaccine cho gia cầm Kết quả của nghiên cứu đã thiết kế thành công hộp gen, plasmid con thoi và tái tổ hợp vào adenovirus HAd5 tạo adenovirus tái tổ hợp HAd5-VP2; và vào adenovirus gia cầm FAd9, tạo adenovirus tái tổ hợp FAd9-VP2 làm vaccine; nuôi cấy thành công tế bào gan phôi gà một lớp (CEL) cho cấy giống adenovirus tái tổ hợp VP2 (FAd9-VP2); đã sản xuất được 5000 liều vaccine kiểm nghiệm miễn dịch [2]

PCR Hơn nữa, các phản ứng tiến hành đơn giản, dễ thực hiện, nhanh chóng và tự động

Về bản chất, công nghệ Gateway ứng dụng cơ chế tái tổ hợp tương đồng của

thực khuẩn thể (phage) lamda trong tế bào vi khuẩn E coli (Hình 8) Cụ thể, khi

phage nhiễm vào E coli dưới sự xúc tác của enzyme Intergrase của vật chủ, ADN phage sẽ được tích hợp vào hệ gen vi khuẩn thông qua hai trình tự đặc hiệu attP và attB Ngược lại, ADN của phage cũng có thể tách ra khỏi hệ gen vi khuẩn khi môi

trường có mặt enzyme excision Đây cũng là nguyên lí cơ bản của phản ứng BP hay

LR recombinase trong công nghệ Gateway

Hình 8 Tái tổ hợp tương đồng của phage lamda trong tế bào E coli (Manual

Gateway Cloning Technolgy Invitrogen)

Công nghệ Gateway được thực hiện bởi 2 bước chính:

- Tạo dòng tiếp nhận “entry clone” bằng cách chèn gen biểu hiện vào vector entry

- Tạo dòng biểu hiện (expression clone) bằng cách tái tổ hợp giữa “entry clone” với một vector đích (destination vector) có chứa các trình tự attR1 và attR2

và marker có khả năng kháng chọn lọc ccdB (Hình 9)

Hình 9 Sơ đồ mô tả công nghệ Gateway ứng dụng cơ chế tái tổ hợp tương đồng

của phage lamda trong tế bào E coli (Manual Gateway Cloning Technolgy Invitrogen)

Hình 9 cho thấy dòng vector tiếp nhận có các điểm tái tổ hợp attL1 và attL2

dưới sự xúc tác của hỗn hợp enzyme LR clonase sẽ phản ứng với các điểm tái tổ

hợp trên vector đích attR1 và attR2 để tạo ra một cấu trúc mới attB1 và attB2 Mặt khác, đoạn gen quan tâm được gắn trên vector nhận sẽ trao đổi chéo với đoạn ccdB

trên vector đích vì thế thu được dòng biểu hiện có cấu trúc của đoạn gen mong muốn

Hiện nay, một số hệ thống vector biẻu hiện virus của hãng Invitrogen đã được thương mại hóa như: Lentivirus, Adenovirus Tuy nhiên, hệ thống vector biểu hiện Helper-Dependent Adenovirus ứng dụng công nghệ Gateway chưa được đề cập

nghiên cứu Do vậy, đề tài: “Nghiên cứu thiết kế vector tái tổ hợp Helper

Dependent Adenovirus mang gene mã hóa Interleukin 12 người và định hướng ứng dụng” được thực hiện với 3 mục tiêu:

- Thiết kế vector thể nhận mang hộp gene biểu hiện Interleukin 12 người

- Thiết kế vector tái tổ hợp Helper Dependent Adenovirus mang hộp gene biểu hiện Interleukin 12 người

- Bước đầu đánh giá khả năng nhiễm và hiệu quả biểu hiện IL-12 người của virus tái tổ hợp trên dòng tế bào Q-293A bằng các kỹ thuật sinh học phân tử

CHƯƠNG II NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu

Bảng 1: Các plasmid sử dụng trong nghiên cứu

Plasmid Kích thước (bp) Nguồn cung cấp

(*) - Vector pcDNA3.1(+)/Felix12 (Vector 1): Vector này chứa hộp gen biểu hiện

IL-12 người có cấu trúc được mô tả như sau:

Hình 10 Sơ đồ cấu trúc vector pcDNA3.1(+)/Felix12 (Vector 1) mang hộp gen biểu

hiện IL-12 người được thiết kế tối ưu với trình tự IL-12 p40 và IL-12 p35 được nối với nhau bởi linker

Trình tự gen lai mã hóa cho 2 tiểu phần p40 và p35 của Interleukin 12 người được lấy từ bản quyền đăng ký tại Mỹ năm 1999, số đăng ký bản quyền (Patent

Number: 5,994,104) bởi các tác giả Robert James Anderson; Hugh Grant Prentice và Ian Duncan MacDonald Trình tự kết nối giữa hai tiểu phần p40 và p35 của

Interleukin 12 (Linker) được thiết kế dựa trên bài báo công bố trên tạp chí Human

Gene Therapy 8:1125 – 1135 (June 10, 1997) Như vậy, toàn bộ trình tự gen lai mã hóa cho Interleukin 12 người kể cả trình tự Linker có kích thước 1623bp Trình tự này sau đó được gửi đặt tổng hợp hóa học bởi hãng GenScript và được tách dòng trực tiếp bởi hãng vào vector pcDNA3.1(+) Hộp gen mang thiết kế biểu hiện gen lai IL-

12 có kích thước 2566 bp với cấu trúc (CMV_immearly promoter – IL12(p40) LINKER – IL12(p35) – bGH_PA_Terminator) Vector tái tổ hợp này được đặt tên p cDNA3.1(+)/Felix12 (Số liệu giải trình tự gen mã hóa IL12 không đề cập trong kết quả số liệu của luận án)

(**) – Vector pENTR/D-TOPO (Vector 2) được cung cấp bởi Invitrogen có cấu trúc như sau:

Hình 11 Sơ đồ cấu trúc vector pENTR/D-TOPO (Vector 2)

(***) - Vector HDAd-GFP-DEST (Vector 3) có khả năng tái tổ hợp tương đồng với

vector pENTR/D-TOPO mang thiết kế IL-12 để tạo thành vector virus tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix-12 Vector HDAd-GFP-DEST được Ts Hoàng Quốc Trường, Khoa Sinh học phân tử hợp tác thiết kế với các nhà khoa học Hàn Quốc tại Viện

Nghiên cứu Ung thư học phân tử KIRAMS (số liệu chưa công bố) Sơ đồ cấu trúc của vector HDAd-GFP-DEST được mô tả như sau:

Hình 12 Sơ đồ cấu trúc vector HDAd-GFP-DEST (Vector 3) với các trình tự attR1

và attR2 có khả năng tái tổ hợp tương đồng với trình tự attL1 và attL2 trên vector tiếp nhận pENTR/D-TOPO để tạo thành vector virus tái tổ hợp HDAd-GFP/Felix12

- Các chủng vi khuẩn: E coli DH-5α, E coli Stbl3 (Khoa Sinh học phân tử,

Bệnh viện TƯQĐ 108)

- Dòng tế bào nuôi cấy: Q293A, 293Cre4 (Microbix, Canada)

- Virus Helper (H14) H14 sau khi tiếp nhận được tăng sinh sản xuất trên dòng

tế bào Q-293A tại Khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện TƯQĐ 108 bởi Ts Hoàng Quốc

Trường Hoạt độ virus H14 được xác định bằng phương pháp TCID50 (Tissue Culture Infectious Dose 50) đạt 1.6 x 109 VP/mL (virus particles/ml) (Số liệu quy

trình sản xuất không đề cập trong phần kết quả của luận án) (Khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện TƯQĐ 108)

2.2 Hóa chất, thiết bị

2.2.1 Hóa chất

- Gateway LR Clonase II enzyme mix kit (Invitrogen)

- pENTR - Directional TOPO Cloning Kits

- GenJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo)

- PureLinkHiPure Plasmid DNA Purification Kits Maxiprep (Invitrogen)

- GenJET PCR Purification Kit (Thermo)

- DNAseI (Thermo)

- Các hóa chất, vật tư tiêu hoa thông dụng trong nuôi cấy tế bàovà sinh học phân

tử của các hãng Sigma, Merk, Invitrogen, Bio-Rad, Corning

- Các hóa chất dùng cho nuôi cấy tế bào: môi trường DMEM low glucose (Q293A), môi trường MEM-α (293Cre4), trypsin-EDTA, PBS

- Các hóa chất dùng cho chuyển gen vào tế bào Q293A, 293Cre4: Lipofectamin

2000, môi trường Opti-MEM được cung cấp bởi hãng Invitrogen

- Môi trường nuôi cấy vi khuẩn LB gồm 1% trypton, 0,5% cao nấm men, 0,5% NaCl

Các cặp mồi dùng trong nghiên cứu được đặt tổng hợp tại hãng IDT (Mỹ)

Trình tự các mồi được trình bày trong Bảng 2

Bảng 2 Trình tự các mồi được sử dụng trong nghiên cứu

11) pC4HSU Reverse 5'-CTTGAAGATCCTGCAGA-3'

12) GAPDH Forward 5’-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3’