LUẬN văn THẠC sĩ SINH học (FULL) NC tạo KN tái tổ hợp STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOXIN b (SEN) dạng ko độc từ đoạn GEN SEB tự nhiên làm NL phục vụ chế tạo que thử PHN độc tố SEB

Độc tố của tụ cầu vàng được xếpvào họ những siêu kháng nguyên, chúng có tính ổn định cao, kháng với hầu hết cácenzym phân hủy protein và vì thế chúng giữ được hoạt tính trong đường tiêu

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và nhóm nghiên cứu, các

số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa có ai công bốtrong một công trình nào khác

Tác giả

Luận văn thạc sỹ sinh học

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể Phòng Công nghệ sinh học Môi

trường, Viện Công nghệ sinh học và đặc biệt là TS Bùi Văn Ngọc đã chỉ bảo, giúp đỡ

tận tình cho tôi trong quá trình thực nghiệm cũng như chia sẽ những kinh nghiệm chuyên môn.

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo thuộc chuyên ngành Hóa sinh, các thầy cô giáo của Khoa đào tạo sau đại học, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật cùng với Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi học tập cũng như hoàn thành đề tài nghiên cứu.

Đề tài được thực hiện trong khuôn khổ của đề tài cấp Nhà nước 15: “Nghiên cứu chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố Staphylococcal enterotoxin B (SEB) của tụ cầu vàng” do PGS TS Nghiêm Ngọc Minh làm chủ nhiệm giai đoạn

KC.04.14/11-2013 – 2015.

Cuối cùng, tôi xin dành lời cảm ơn đặc biệt tới gia đình, người thân và bạn bè

đã giúp đỡ, tạo điều kiện, động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu.

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Học viên

MỤC LỤC

Trang

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH MỤC HÌNH iii

DANH MỤC BẢNG v

MỞ ĐẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus) 3

1.1.1 Trên thế giới 3

1.1.2 ạ i Vi T ệ t Nam 6

1.2 Giới thiệu về Staphylococcus aureus 8

1.2.1 Phân loại 8

1.2.2 Hình thái, đặc điểm sinh hóa 8

1.2.3 Các độc tố của Staphylococcus aureus 11

1.3 Độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B 15

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc 15

1.3.2 chế Cơ gây độc 16

1.3.3 Những triệu chứng thường gặp 17

1.3.4 Các phương pháp phát hiện S aureus và SEB 17

1.3.5 Protein tái tổ hợp SEB và tiềm năng ứng dụng 21

1.4 Hệ biểu hiện gen 23

1.4.1 biểu Hệ hiện E coli 23

1.4.2 Chủng biểu hiện E coli BL21(DE3) 24

1.4.3 Vector biểu hiện pET22b(+) 25

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu 26

2.1.1. liệu Vật 26

2.1.2. Hóa chất 26

2.1.3 Môi trường nuôi cấy 28

2.1.4 Thiết bị máy móc 28

2.2 Các phương pháp nghiên cứu 28

2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 28

2.2.2 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) 29

2.2.3 PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (Colony – PCR) 30

2.2.4 Tách dòng bằng vector pJET1.2/blunt 30

2.2.5 định Xác trình tự acid nucleic 31

2.2.6 đột Tạo biến điểm định hướng theo phương pháp Mega -primer 31

2.2.7 Phản ứng nối ghép gen 32

2.2.8 Phương pháp biến nạp DNA plasmid vào tế bào khả biến Escherichia coli .33

2.2.9 Phương pháp tách chiết DNA plasmid 33

2.2.10 Cắt plasmid bằng enzym giới hạn 34

2.2.11 Tinh sạch phân đoạn DNA 34

2.2.12 Phương pháp biểu hiện gen đích trong chủng E coli BL21(DE3) 35

2.2.13 Phương pháp điện di DNA trên gel agarose 35

2.2.14 Phương pháp điện di protein trên gel polyacrylamide 36

2.2.15 Phương pháp tinh sạch protein tái tổ hợp 37

2.2.16 Phương pháp định lượng protein theo phương pháp Bradford 38

2.2.17 Phương pháp kiểm tra độc tính của protein tái tổ hợp 38

2.2.18 Phương pháp Western blot 40

Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 42

3.1 Tách chiết DNA tổng số S aureus và nhân dòng gen seb 42 3.1.1 Tách chiết DNA tổng số S aureus 42

3.1.2 Nhân dòng gen seb 42

3.1.3 định Xác trình tự gen seb 44

3.2 Tạo đột biến điểm trên gen seb 45

3.2.1 Tạo gen seb đột biến 45

3.2.2 định Xác trình tự gen seb đột biến 47

3.3 Thiết kế vector biểu hiện pET22b(+) mang gen seb đột biến 48

3.3.1 Thiết kế vector pET22 (b+) mang gen seb đột biến 48

3.3.2 G iải trình tự gen seb đột biến trên vector biểu hiện 49

3.4 T ối ưu các điều kiện biểu hiện gen seb đột biến trong tế bào E coli BL21 và

tinh sạch protein mtSEB 50

3.4.1 Biểu hiện gen seb đột biến trong tế bào E c oli BL21 50

3.4.2 Tối ưu các điều kiện biểu hiện gen seb đột biến 51

3.4.3 Tinh sạch ptotein tái tổ hợp mtSEB 55

3.4.4 định Xác hàm lượng protein mtSEB theo phương pháp Bradford 57

3.5 Đánh giá tính kháng nguyên của protein mtSEB 58

3.6 Đánh giá độc tính của protein mtSEB trên động vật thử nghiệm 58

3.6.1 Đánh giá độc tính giữ a protein wtSEB và mtSEB ở liều tiêm 1x LD 50 và lô

đối chứng 58

3.6.2 Đánh giá độc tính giữ a protein wtSEB và mtSEB ở liều tiêm 3x LD 50 60

3.6.3 Đánh giá độc tính giữ a protein wtSEB và mtSEB ở liều tiêm 10xLD 50 61

Ế T LU Ậ N 63

KIẾN NGHỊ 63

TÀI LIỆU THAM KHẢO 64

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 75

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid

PBS Phosphate buffer saline

PCR Polymerase Chain Reaction

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SEB Staphylococcal enterotoxin B

SEs Staphylococcal enterotoxins

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình ảnh các vi khuẩn S aureus dưới kính hiển vi điện tử 9

Hình 3.1 Điện di đồ sản phẩm DNA tổng số của chủng S aureus 42

Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm khuếch đại gen seb từ DNA tổng số của S.

Hình 3.3 Điện di đồ plasmid mang gen seb được tách chiết từ thể biến nạp 43

Hình 3.4 Điện di đồ sản phẩm cắt pJET1.2/seb bằng enzym hạn chế EcoRI và

Hình 3.7 Điện di đồ sản phẩm PCR trên gel agarose 1 % 47Hình 3.8 Trình tự amino acid sai khác giữa dòng đột biến (mtSEB) và dòng

Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm PCR trực tiếp từ khuẩn lạc để chọn dòng mang

Hình 3.10 Điện di đồ DNA plasmid tái tổ hợp cắt bằng enzym EcoRI,

Hình 3.11 So sánh trình tự nucleotide của wtSEB và mtSEB 50

Hình 3.12 Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E coli BL21 (DE3) sau 5 giờ

Hình 3.13 Protein tổng số từ chủng E coli BL21 mang gen mã hóa mtSEB

9

Hình 3.14 Khả năng sinh tổng hợp mtSEB của chủng E coli tái tổ hợp với

nồng độ chất cảm ứng IPTG khác nhau sau 5 giờ cảm ứng 54Hình 3.15 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cảm ứng lên hàm lượng protein

Hình 3.18 Phân tích khả năng bắt cặp đặc hiệu của kháng nguyên tái tổ hợp

Hình 3.19 Kết quả tiêm chuột ở lô 2 với liều tiêm 1xLD50 sau 7 ngày theo dõi 60Hình 3.20 Kết quả tiêm chuột ở lô 3 với liều tiêm 3xLD50 sau 7 ngày theo dõi 61Hình 3.21 Kết quả tiêm chuột ở lô 4 với liều tiêm 10xLD50 sau 7 ngày theo

Bảng 3.1 Độ tương đồng của gen seb ở chủng S aureus nghiên cứu với một

số chủng vi khuẩn trên ngân hàng gen thế giới (NCBI) 45Bảng 3.2 Kết quả đo độ hấp thụ BSA ở bước sóng 595nm 57Bảng 3.3 So sánh số chuột chết sau tiêm dung dịch wtSEB, mtSEB ở liều

MỞ ĐẦU

Ngộ độc thực phẩm là hiện tượng đau bụng, nôn mửa, nóng sốt, tiêu chảy… củangười do ăn phải thức ăn không đảm bảo vệ sinh hoặc bị hư hỏng Có nhiều nguyênnhân dẫn đến thực phẩm không an toàn, nhiễm vi khuẩn là một trong những nguyên

nhân phổ biến gây bệnh trên toàn cầu Tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus – S aureus) là một trong những nguyên nhân chính gây ngộ độc thực phẩm do chúng tiết

ra các độc tố ruột staphylococcal enterotoxins (SEs) Độc tố của tụ cầu vàng được xếpvào họ những siêu kháng nguyên, chúng có tính ổn định cao, kháng với hầu hết cácenzym phân hủy protein và vì thế chúng giữ được hoạt tính trong đường tiêu hóa saukhi được ăn vào bụng Chúng còn kháng với chymotrypsine, rennin và papain Đặcbiệt, tính bền nhiệt là một trong những tính chất quan trọng nhất của các SE trong lĩnhvực an toàn thực phẩm Chúng không bị phân hủy ở 100oC trong 30 phút, thậm chí ở

121oC trong 28 phút, các SE vẫn giữ đươc hoạt tính sinh học Tính kháng nhiệt của SEtrong thực phẩm cao hơn so với trong môi trường nuôi cấy Tụ cầu vàng sản sinh đượchơn 20 loại độc tố khác nhau từ SEA đến SEE, từ SEG đến SER và SEU Trong các

nhóm độc tố (siêu kháng nguyên) do S aureus sản sinh kể trên thì độc tố ruột nhóm B

(Staphylococcal enterotoxin B – SEB) là một độc tố mạnh, bền với nhiệt và hòa tantrong nước, chúng có phổ phân bố rộng rãi và là nguyên nhân gây nhiễm trùng nhiễmđộc thực phẩm thường gặp nhất Bên cạnh đó, SEB có khả năng kháng kháng sinh, ví

dụ tính kháng nhóm ß-lactam như methicillin Nguy hiểm hơn, SEB còn là một trongnhững nhóm độc tố được sử dụng làm vũ khí sinh học dùng để tấn công trong khủng

bố sinh học và chiến tranh sinh học Vì thế việc xác định sự có mặt của SEB nhằmđánh giá nguy cơ ngộ độc là vô cùng quan trọng

Hiện nay, một số hãng trên thế giới đã sản xuất que thử phát hiện trực tiếp độc

tố SEB như: hãng Tetracore, hãng Advnt, hãng Alexeter… Tuy nhiên, các que thử nàygiá thành cao, không phù hợp với điều kiện kinh tế Việt Nam; kháng nguyên trongnước có thể biến đổi không phù hợp với que thử nhập ngoại và nếu nhập que thửnhanh, chúng ta sẽ không chủ động được nguồn khi cần thiết Do đó, việc nghiên cứutạo ra kháng nguyên tái tổ hợp không những loại bỏ được độc tố mà còn giữ nguyênđược đặc tính miễn dịch như kháng nguyên dại để gây miễn dịch sản xuất kháng thể

Luận văn thạc sỹ sinh học

12

đơn dòng, đa dòng kháng SEB là cần thiết và đây là nguồn nguyên liệu quan trọng chếtạo que thử phát hiện nhanh SEB phục vụ nhu cầu hiện nay ở trong nước.

Xuất phát từ lý do trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo kháng nguyên tái tổ hợp Staphylococcal enterotoxin B (SEB) dạng không độc từ đoạn gen seb tự nhiên để làm nguyên liệu phục vụ cho việc chế tạo que thử phát hiện nhanh độc tố SEB”

Mục tiêu nghiên cứu

Tạo được kháng nguyên SEB mất độc tính hoặc có độc tính thấp và vẫn đảmbảo tính kháng nguyên để ứng dụng cho việc tạo kháng thể đơn dòng gắn lên que thửnhanh để phát hiện nhanh độc tố SEB của tụ cầu vàng

Nội dung nghiên cứu

- Tách dòng và xác định trình tự của gen seb tự nhiên có kích thước khoảng 534

bp được phân lập từ chủng S aureus ở Việt Nam

- Tạo gen seb đột biến điểm ở 04 vị trí bộ ba mã hóa lần lượt là 12, 32, 105 và

121 để thay thế amino acid Histidine thành Tyrosine

- Thiết kế vector biểu hiện mang gen seb đột biến, biểu hiện và tối ưu các điều kiện ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng biểu hiện gen seb đột biến.

- Tinh sạch, định lượng protein tái tổ hợp SEB dạng đột biến và đánh giá tínhkháng nguyên của protein tái tổ hợp mtSEB bằng phương pháp Western blot

- Kiểm tra độc tính của protein tái tổ hợp SEB trên động vật thử nghiệm

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng (Staphylococcus aureus)

1.1.1 Trên thế giới

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), lương thực, thực phẩm nuôi con ngườinhưng cũng chính là nguyên nhân gây ra khoảng 50% các trường hợp tử vong trêntoàn thế giới hiện nay Hiện có tới 400 bệnh lây qua thực phẩm không an toàn, chủ yếu

là dịch tả, tiêu chảy, thương hàn, cúm Thực phẩm ô nhiễm bởi vi sinh vật hoặc độc tốcủa chúng là một trong những nguyên nhân chính và chủ yếu gây ngộ độc thực phẩm(NĐTP) Theo WHO/FAO (tháng 5/2005), ngộ độc thực phẩm ảnh hưởng rất lớn đếnsức khỏe con người và kinh tế, ở các nước công nghiệp 30% dân số bị ngộ độc thựcphẩm hàng năm

Ở Hoa Kỳ, ước tính mỗi năm có khoảng 76 triệu ca bệnh, 325 nghìn ca nhậpviện và 5 nghìn ca tử vong do các bệnh truyền qua thực phẩm, chi phí điều trị cho cácbệnh nhân khoảng 6,5 tỷ đô la, thiệt hại do nghỉ điều trị khoảng 34,9 tỷ đô la/năm

(Mead et al., 1999) S aureus là nguyên nhân chủ yếu của các bệnh lây truyền qua thực phẩm, nó gây ra khoảng 241 ca bệnh mỗi năm tại Hoa Kỳ (Scallan et al., 2011).

Ngộ độc thực phẩm do tụ cầu vàng là một trong những bệnh truyền qua thựcphẩm phổ biến nhất trên thế giới do tiêu thụ thức ăn có chứa độc tố của tụ cầu vàng

được sinh ra từ các staphylococci dương tính với coagulase mà chủ yếu là S aureus

(Jablonski, Bohach, 1997)

Trên thế giới, vụ ngộ độc lớn đầu tiên được phát hiện trong pho mát có liênquan đến tụ cầu xảy ra vào năm 1884 ở Michigan (Mỹ) Mười năm sau (1894), tạiPháp, Denys kết luận rằng một gia đình bị ngộ độc thực phẩm do ăn thịt của bò bị chết

do sốt vitallary liên quan tới sự hiện diện của tụ cầu sinh mủ (Denys, 1894) Năm

1907, từ một ổ dịch, Owen đã phân lập được tụ cầu từ các mẫu thịt bò khô (Dack et al., 1930) Năm 1914, ở Philippines, Barber xác định rằng sữa lấy từ bò bị viêm bầu

vú đã gây ra ngộ độc ở người (Barber, 1914)

Năm 1930, Dack lại xác định được vụ ngộ độc do S aureus từ bánh giáng sinh.

Một vài năm sau, vào năm 1934, Jordan và Burrows tìm thấy sự hiện diện củastaphylococci trong 9 vụ ngộ độc thực phẩm (Jordan, Burrows, 1934)

Từ giữa những năm 1969 và 1990, tại Anh, 53% trường hợp ngộ độc thực phẩm

do S aureus được ghi nhận là do tiêu thụ các sản phẩm từ thịt (đặc biệt là ruốc); 22%

các trường hợp từ thịt gia cầm, 8% từ các sản phẩm liên quan sữa, 7% từ cá, sò, ốc v.v

và 3,5% từ trứng (Wieneke et al., 1993) Tại Hoa Kỳ, trong số các trường hợp ngộ độc thực phẩm do S aureus được báo cáo giữa các năm 1975 và 1982 thì 36% là do

tiêu thụ thịt đỏ nhiễm khuẩn, 12,3% từ sa lát, 11,3% từ gia cầm, từ bánh ngọt: 5,1%đến 1,4%, còn lại là từ các sản phẩm liên quan tới sữa và hải sản (Genigeorgic, 1989)

Tại Pháp, trong số các thực phẩm nhiễm S aureus được ghi nhận trong hai năm

(1999-2000) có các sản phẩm từ sữa (đặc biệt là pho-mát) (32%), thịt (22%), xúc xích(15%), cá và hải sản (11%), trứng và các sản phẩm từ trứng (11%) hoặc các sản phẩm

khác từ gia cầm (9,5%) (Haeghebaert et al., 2002).

Hennekinne và cộng sự đã thống kê có tới 24 vụ ngộ độc phẩm do tụ cầu liên

quan tới sự hiện diện của các độc tố ruột SEs (Hennekinne et al., 2012).

S aureus là một tác nhân gây bệnh phổ biến của bệnh viêm vú bò trong đàn bò sữa Một số nghiên cứu ước tính rằng S aureus thường có trong các bể chứa sữa với 31% ở Pennsylvania và 35% trong các mẫu sữa bò ở Louisiana (Haran et al., 2012) Nghiên cứu từ Argentina (Neder et al., 2011), Brazil (Arcuri et al., 2010), Ireland (Murphy et al., 2010), và Thổ Nhĩ Kỳ (Unaydin et al., 2011) đã ghi nhận sự hiện diện

của gen mã hóa cho độc tố ruột được tạo ra từ tụ cầu vàng có căn nguyên từ bò Viêmbầu vú bò lâm sàng hoặc cận lâm sàng do tụ cầu vàng có thể gây ô nhiễm sữa thông

qua sự bài tiết trực tiếp của các sinh vật trong sữa (Syne et al., 2013) dẫn đến sự thay

đổi lớn về số lượng từ 0 đến 108 CFU/ml (Peles et al., 2007) Ví dụ, năm 1999, ở Brazil bệnh viêm bầu vú bò có nguồn gốc do nhiễm S aureus đã gây ảnh hưởng đến

328 người tiêu thụ sữa chưa tiệt trùng (Do Carmo et al., 2002) Tương tự như vậy, từ các bể chứa sữa dê và cừu ở Thụy Sỹ đã phân lập được 293 chủng S aureus (Scherrer

et al., 2004) Gần đây, S aureus đã được tìm thấy từ bầu vú của bò bị viêm và từ các

bể chứa sữa được tạo ra từ trang trại bò sữa ở Hungari, điều đó cho thấy rằng S aureus

từ bầu vú bị nhiễm bệnh có thể gây ô nhiễm cho lượng lớn sữa thu được và sau đó có

thể gây ô nhiễm cho các sản phẩm tạo ra từ sữa (Peles et al., 2007) Tuy nhiên, S aureus ô nhiễm trong sữa có thể là do từ môi trường hoặc do quá trình xử lý và chế biến từ sữa nguyên liệu không tốt (Peles et al., 2007).

Năm 2013, điều tra ô nhiễm vi sinh vật trong các thực phẩm ăn sẵn được sản

xuất tại một nhà máy chế biến lớn ở Trinidad, West Indies thì S aureus là tác nhân gây bệnh phổ biến nhất được phát hiện (Syne et al., 2013) Tỷ lệ S aureus được phát hiện

trong không khí, thực phẩm, và các mẫu môi trường chiếm 27,1% (46/170) Số lượng

của S aureus tăng lên sau khi xử lý nhiệt, và thực phẩm ăn sẵn có thể bị nhiễm tụ cầu vàng trong quá trình cắt thái và đóng gói sản phẩm S aureus cũng thường xuyên tìm thấy trên găng tay xử lý thực phẩm (Syne et al., 2013).

Trong báo cáo cho hệ thống giám sát ổ dịch bệnh truyền qua thực phẩm tại Hoa

Kỳ từ 1998-2008 (Bennett et al., 2013) chỉ ra rằng các món ăn từ thịt và gia cầm là những loại thực phẩm phổ biến nhất (chiếm 55% các dịch bệnh do S aureus) Thực phẩm liên quan đến các dịch bệnh do S aureus thường gặp trong các nhà hàng hoặc

quầy hàng bán đồ ăn nhanh (44%) do sai sót trong khâu chuẩn bị và chế biến thựcphẩm (93%) là những yếu tố phổ biến nhất góp phần vào sự bùng phát dịch bệnhtruyền qua thực phẩm

Mới đây tại Mỹ có 45% (45/100) các sản phẩm từ thịt lợn và 63% (63/100) các

sản phẩm từ thịt bò được kiểm tra ở Georgia cho kết quả dương tính với S aureus Tỷ

lệ S aureus kháng methicillin là 3% đối với thịt lợn bán lẻ và 4% với thịt bò bán lẻ (Jackson et al., 2013) Một cuộc kiểm tra khác tại Louisiana (Mỹ) kết quả là phân lập

được 6 chủng tụ cầu vàng kháng methicillin trong số 120 mẫu thịt bán lẻ được kiểm tra

(chiếm 5%), và 39,2% (47/120) mẫu dương tính với bất kỳ loại S aureus (Pu et al., 2009) Tỷ lệ nhiễm S aureus cao chiếm 64,8% (256/395) được phát hiện trên các sản

phẩm từ thịt lợn bán lẻ thu thập từ Iowa, Minnesota và New Jersey của Mỹ (O’Brien

et al., 2012) Các nghiên cứu khác ở Mỹ cũng đã tìm thấy 27 mẫu thịt nhiễm S aureus trong tổng số 165 mẫu (Hanson et al., 2011); 71 mẫu nhiễm S aureus trong

136 mẫu thịt và gia cầm được kiểm tra (Waters et al., 2011) Những nghiên cứu trên

cung cấp

cho chúng ta những hiểu biết sâu sắc rằng việc phân phối thương mại thịt như một

phương tiện tiềm tàng để lưu truyền S aureus từ các nông trại tới người tiêu dùng.

Như vậy, giữa các nước khác nhau loại thực phẩm dễ nhiễm tụ cầu nhất cũng

khác nhau do thói quen tiêu thụ thực phẩm là không giống nhau (Loir et al., 2003) Ví

dụ, ở Anh và Mỹ, thịt và các sản phẩm từ thịt là những thực phẩm thường gặp trongcác vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu (Genigeorgis, 1989), ngoài ra thì thịt gia cầm,salad và bánh cuộn kem cũng khá phổ biến (Minor, Marth, 1972) Ở Pháp, đa số cácloại thực phẩm đều liên quan đến ngộ thực phẩm do tụ cầu nhưng bơ sữa chưa tiệttrùng thì phổ biến hơn ở các nước Anglo-Saxon, các sản phẩm từ sữa thì tần suất cao ở

các nước khác (De Buyser et al., 2001).

1.1.2 Tại Việt Nam

Theo số liệu từ cục Quản lý chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong những

vụ dịch được tổng kết từ năm 1997 đến 2002 thì ngộ độc thực phẩm do tác nhân visinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 40-45% trong các loại gây ngộ độc, trong số đó có nhiều vụ

được xác định tác nhân là S aureus (Nguyễn Đỗ Phúc et al., 2003).

Qua các cuộc khảo sát tình hình vệ sinh thức ăn đường phố và các thực phẩm

chế biến sẵn tại các chợ cho thấy mức độ nhiễm S aureus là rất cao, phù hợp với các

kết quả xét nghiệm trong các vụ ngộ độc tại thành phố Hồ Chí Minh trong những nămqua Đáng chú ý hơn cả là ở các mẫu bánh mì thịt nguội là 16/30 mẫu (53%), các mẫu

thịt quay là 18/20 mẫu (90%) (Nguyễn Đỗ Phúc et al., 2003; Nguyễn Lý Hương et al.,

2005)

Giai đoạn từ năm 2006 đến năm 2010, cả nước đã ghi nhận 944 vụ ngộ độc thựcphẩm, với 33.168 người mắc và 259 người tử vong Theo số liệu năm 2012 của Cục

An toàn thực phẩm – Bộ Y tế, trên toàn quốc có 164 vụ ngộ độc thực phẩm, trong đó

có 33 người tử vong, nguyên nhân ngộ độc do vi sinh vật gây ra chiếm tỷ lệ cao nhất(chiếm hơn 45% tổng số vụ ngộ độc) Cũng theo báo cáo này, ở một số địa phươngtrong cả nước tỷ lệ thực phẩm nhiễm vi sinh vật gây bệnh như sau: tại Hà Nội (46,7%),Hải Phòng (76,4%), Đà Lạt (73,7%), Quảng trị (72 - 88%), Kon tum (88 - 100%),thành phố Hồ Chí Minh (53,8%)

Cũng theo thống kê của Cục An toàn thực phẩm (Bộ Y tế), trong năm 2013 cảnước đã xảy ra 163 vụ ngộ độc thực phẩm với hơn 5000 nạn nhân, trong đó có 28người tử vong.

Trong báo cáo Sơ kết 6 tháng đầu năm 2014 vừa được Bộ Y tế

công ty Foremart vào chiều 10/07/2013 là do trong giò bị nhiễm S aureus làm cho gần

200 người phải vào viện cấp cứu Trong ngày 15/07/2013 đã xuất hiện vụ ngộ độc

bánh mì ở Phú Yên do dăm bông có độc tố Staphylococcal enterotoxin của S aureus.

Đại diện Sở Y tế Phú Yên cho biết: Nguyên nhân gây 3 vụ ngộ độc liên tiếp sau khi ănbánh mì que của cơ sở Thiện và Tín (Tuy Hòa, Phú Yên) là do thịt dăm bông bị nhiễm

S aureus Theo kết quả xét nghiệm của Trung tâm Y tế dự phòng Phú Yên và Viện Pasteur Nha Trang, mẫu thịt dăm bông của cơ sở trên nhiễm S aureus với số lượng

5,4.104 CFU/g, trong khi ngưỡng cho phép là dưới 10 CFU/g Căn nguyên gây ngộ độc

là độc tố Staphylococcal enterotoxin của tụ cầu vàng Hậu quả làm cho 33 người bịngộ độc sau khi ăn bánh mì của cơ sở này phải nhập viện cấp cứu Vào ngày20/09/2013 ở Hà Giang có 47 học sinh bị ngộ độc nhập viện là do ăn phải thịt lợn

nhiễm vi khuẩn tụ cầu vàng S aureus

(http://vietq.vn/10-vu-ngo-doc-%C4%83n-uong-nghiem-trong-nam-2013-d26359.html) Gần đây, ngày 1/7/2014, trên địa bàn thànhphố Cẩm Phả đã xảy ra vụ ngộ độc thực phẩm tại bếp ăn tập thể của Đội cô ng trình45.1 của Công ty CP Lilama thuộc Tổng Công ty lắp máy Việt Nam làm 23 ngườinhập viện Nguyên nhân bước đầu được xác định do người chế biến thực phẩm mang

vi khuẩn tụ cầu vàng, trong quá trình chế biến đã lây truyền vi khuẩn vào thực phẩm.Mới đây nhất là vụ ngộ độc thực phẩm tại gia đình bà Nguyễn Thị Sáng trên địa bàntỉnh Bắc Ninh xảy ra vào ngày 1/10 đã làm 6 người mắc và 1 người tử vong Kết quả

kiểm nghiệm mẫu chất nôn đã phát hiện có vi khuẩn Salmonella và vi khuẩn sinh độc

tố tụ cầu (Staphylococci)

Nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm có nguyên nhân do vi sinh vật chiếm tỷ lệ

cao từ 32,8% - 55,8% và cao hơn hẳn so với các nguyên nhân khác Trong đó, S aureus được xem là một trong ba tác nhân chính của các vụ ngộ độc thực phẩm ở nhiều nước chỉ sau Salmonella và Clostridium perfringens (Rosec, Gigaud, 2002; Normanno et al., 2004).

1.2 Giới thiệu về Staphylococcus aureus

1.2.1 Phân loại

Vi khuẩn tụ cầu vàng thuộc giới Eubacteria, ngành Firmicutes, lớp Cocci, bộ

Bacillales, họ Staphylococcaceae, chi Staphylococcus, loài Staphylococcus aureus Tên khoa học: Staphyococcus aureus Rosenbach 1884.

Trên phương diện gây bệnh thì tụ cầu khuẩn được chia làm hai nhóm chính: cómen Coalugase và không có men Coagulase

Tụ cầu có men Coagulase: Nhờ men coagulase này mà trên môi trường nuôi cấy

có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn lạc màu vàng Do vậy vi khuẩn này còn gọi là tụcầu vàng

Tụ cầu không có men Coagulase: Do không có men coagulase nên trên môitrường nuôi cấy có máu, khuẩn lạc có màu trắng ngà Trên lâm sàng thường gọi các vikhuẩn này là tụ cầu trắng

Phân loại tụ cầu dựa trên kháng nguyên: Các tụ cầu có nhiều loại khángnguyên: protein, polysaccharid, acid teichoic của vách tế bào vi khuẩn Nhưng dựa vàokháng nguyên, việc định loại vi khuẩn rất khó khăn

Phân loại tụ cầu dựa trên phage (phage type): tụ cầu được phân vào các nhóm I,

II, III, IV Đây là phương pháp sử dụng nhiều trong phân loại S aureus.

1.2.2 Hình thái, đặc điểm sinh hóa

Hình dạng và kích thước:

S aureus thuộc giống Staphylococcus, do đó mang những tính chất chung của Staphylococcus S aureus là những vi khuẩn hình cầu, không di động, gram dương,

đường kính 0,5-1,5 µm, tế bào xếp thành hình chùm nho, không di động (Hình 1.1).Thành tế bào kháng với lysozyme và nhạy với lysotaphin, một chất có thể phá hủy cầunối pentaglycin của tụ cầu

Hình 1.1 Hình ảnh các vi khuẩn S aureus dưới kính hiển vi điện tử

(Nguồn: http://www.bacteriainphotos.com/)

Đặc điểm sinh hóa:

S aureus là những vi khuẩn hiếu khí hay kị khí tùy nghi, có catalase phân giải oxy già giải phóng oxy và nước S aureus cho phản ứng đông huyết tương dương tính

do chúng tiết ra enzym coagulase Đây được xem là tính chất đặc trưng của S aureus,

là tiêu chuẩn để phân biệt S aureus với các tụ cầu khác Có hai dạng coagulase:

coagulase “cố định” (“bound” coagulase) gắn vào thành tế bào và coagulase “tựdo”(“free” coagulase) được phóng thích khỏi thành tế bào Có hai phương pháp đểthực hiện thử nghiệm coagulase là thực hiện trên lam kính và trong ống nghiệm.Phương pháp lam kính giúp phát hiện những coagulase “cố định” bằng cách phản ứngtrực tiếp với fibrinogen, phương pháp ống nghiệm phát hiện những coagulase “tự do”bằng phản ứng gián tiếp với fibrinogen qua cộng hợp với những yếu tố khác trong

huyết tương tạo thành từng khối hay thành cục (Collins et al., 1995).

Ngoài ra, chúng còn cho phản ứng DNAse, phosphatase dương tính, có khả

năng lên men và sinh acid từ manitol, trehalose, sucrose Tất cả các dòng S aureus đều

nhạy với Novobicine, có khả năng tăng trưởng trong môi trường chứa đến 15% muốiNaCl (Trần Linh Thước, 2002).

Một số dòng S aureus có khả năng gây tan máu trên môi trường thạch máu,

vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhưng chúng đều có vòng tan máu hẹp hơn so

với đường kính khuẩn lạc Hầu hết các dòng S aureus đều tạo sắc tố vàng, nhưng các

sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà thường thấy rõ sau 1-2 ngày nuôicấy ở nhiệt độ phòng Sắc tố được tạo ra nhiều hơn trong môi trường có hiện diệnlactose hay các nguồn hidrocacbon khác mà vi sinh vật này có thể bẻ gãy và sử dụng

(Collins et al., 1995).

Trên môi trường BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trưng của S aureus có màu

đen nhánh, bóng, lồi, đường kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2-5

mm (do khả năng khử potassium tellurite K2TeO3 và khả năng thủy phân lòng đỏ trứngcủa lethinase) (Sande, McKillip, 2002) Trên môi trường MSA (Manitol salt agar) haycòn gọi là môi trường Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đếnvàng đậm và làm vàng môi trường xung quanh khuẩn lạc (do lên men đường manitol)(Sande, McKillip, 2002)

Điều kiện tăng trưởng:

S aureus thuộc loại dễ nuôi cấy, phát triển ở dải nhiệt độ rộng (7oC đến 48oC,khoảng nhiệt độ tối ưu là 30oC đến 37oC) (Schmitt et al., 1990), pH (4,2 đến 9,3 và tối

ưu là 7 đến 7,5) (Bergdoll, 1989), và nồng độ muối NaCl lên đến 15% S aureus là

sinh vật chịu khô, nó có thể sống sót trong môi trường khô và khắc nghiệt, như trongmũi người, trên da và trên bề mặt các vật vô tri vô giác như quần áo (Chaibenjawong,Foster, 2011) Những đặc tính này tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của vi

khuẩn tụ cầu vàng trong thực phẩm (Loir et al., 2003) S aureus có thể tồn tại trên tay

và trên bề mặt môi trường trong một khoảng thời gian dài sau khi tiếp xúc

(Kusumaningrum et al., 2002).

Khả năng đề kháng:

S aureus có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi khuẩn

có nha bào khác

S aureus cũng có thể gây bệnh sau một thời gian dài tồn tại ở môi trường.

Sự kháng kháng sinh của tụ cầu vàng là một đặc điểm rất đáng chú ý Hầu hết

các dòng S aureus kháng với nhiều loại kháng sinh khác nhau Một vài dòng kháng

với tất cả các loại kháng sinh ngoại trừ vancomycin, và những dòng này ngày càng

tăng Những dòng MRSA (Methicilin resistant Staphylococcus aureus) rất phổ biến và

hầu hết các dòng này cũng kháng với nhiều kháng sinh khác Trong phòng thí nghiệm,người ta đã tìm thấy plasmid kháng vancomycin ở Enterococcus faecalis có thể chuyển

sang S aureus, và người ta nghĩ rằng việc chuyển này có thể xảy ra ngoài tự nhiên, trong đường tiêu hóa chẳng hạn Ngoài ra, S aureus còn kháng với chất khử trùng và

chất tẩy uế (Todar, 2005)

Từ khi sử dụng penicillin vào những năm 1940, tính kháng thuốc đã hình thành

ở tụ cầu trong thời gian rất ngắn Nhiều dòng hiện nay đã kháng với hầu hết khángsinh thông thường, và sắp tới sẽ kháng cả những kháng sinh mới Thật sự là trong hainăm gần đây, việc thay thế kháng sinh cũ bằng vancomycin đã dẫn đến sự gia tăng các

dòng kháng vancomycin VRSA (Vancomycin Resistant Staphylococcus aureus)

(Todar, 2005)

1.2.3 Các độc tố của Staphylococcus aureus

Tụ cầu vàng sản sinh ra 11 độc tố (bảng 1.1, hình 1.2): độc tố gây hội chứng sốcnhiễm độc (TSST-Toxic shock syndrome toxin); độc tố hemolysin (alpha, beta, delta),độc tố exfoliatin hay độc tố epidermolitic; độc tố alpha; độc tố bạch cầu (leucocidin);ngoại độc tố sinh mủ (pyrogenic); dung huyết tố (hemolysin hay staphylolysin);

fribrinolysin (staphylokinase); catalase, coagulase; hyaluronidase; β–lactamase, một

số enzym (Tnase, Dnase, FAME)… và 20 độc tố ruột (từ SEA đến SEE, từ SEG đến

SER và SEU) (Martin et al., 2004).

K16 – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật 24

Exfloliative exotoxin (ETA, ETB) Trệu chứng tụ cầu làm bong vảy

Gây ra phỏng da ở trẻ sơ sinh, gây chốc lở ở

Độc tố đường ruột Gây nôn mửa và tiêu chảy, thường xảy ra ở

các vụ ngộ độc thực phẩmFribrinolysin(enzym

α-toxin (α - hemolysin) Độc tố tạo lỗ làm tan bào

Hoạt động như một dạng C photphatase, qua

đó thủy phân sphingomyelinto thànhphotphorylcholine và creamide

cầu, bạch cầu và protoplas vi khuẩn

Làm tan tế bào hồng cầu và bạch cầu

Có thể tạo nên các tổ hợp hoạt động với cácthành phần Panton-Valentine leukocidinGây ra hoại tử nhẹ ở da thỏ, chuột, có thể gâychết thỏ

Panton – Valentine leukocidin Làm tan các tế bào bạch cầu

Hình 1.2 Các yếu tố gây bệnh của S aureus

(Nguồn: http://www.hal.kagoshima- u.ac.jp/dental/Saikin/english/study1)

Chính những khả năng tạo ra nhiều yếu tố độc lực mà S aureus trở thành một

trong những tác nhân gây bệnh chính ở người Chúng có thể xâm nhiễm ở nhiều nơitrên cơ thể và gây ra nhiều triệu chứng bệnh khác nhau (Balaban, Rasooly, 2000),Trong đó enterotoxin là dạng độc tố chịu nhiệt gây bệnh đường ruột thường gặp trongcác vụ ngộ độc thực phẩm liên quan đến tụ cầu

Các độc tố của S aureus được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1960 và được đặt

tên các độc tố đường ruột (enterotoxins), do nó gây ra các triệu chứng về tiêu hóa như

ói mửa và tiêu chảy khi bị ngộ độc (Sugiyama et al., 1960) Khi các enterotoxin này gắn vào chuỗi Vβ của thụ thể tế bào Lympho T sẽ kích hoạt một lượng lớn các tế bào Lympho T, vì vậy chúng được đặt tên là các siêu kháng nguyên (Marrack et al., 1989).

Qua nghiên cứu người ta thấy rằng chỉ cần 0,1 pg/ml siêu kháng nguyên đủ kích hoạtcác tế bào Lympho T phân bào không kiểm soát được, dẫn đến bệnh nhân sốc và tử

vong (Marrack et al., 1989) Thông thường khi các kháng nguyên vào cơ thể chúng sẽ

được thực bào bởi các tế bào Langerhans hoặc các tế bào trình diện kháng nguyên

khác, trong túi thực bào các kháng nguyên sẽ được phân hủy thành các peptides miễndịch Các peptides miễn dịch này sẽ được gắn vào rãnh các phân tử phức hợp tương

mô nhóm II (histocompatibility complex class II molecules) và được vận chuyển ra bề

mặt của các tế bào trình diện kháng nguyên (Sundstrom et al., 1996) Và sau đó các kháng nguyên sẽ được gắn vào các thụ thể chuyên biệt của các tế bào Lympho T (Li et al., 1998) Ngược lại, các siêu kháng nguyên là các proteins có khối lượng phân tử 24 -

30 kDa, không cần thực bào và xử lý bởi các tế bào trình diện kháng nguyên, nó gắn

kết trực tiếp vào các phân tử phức hợp tương mô nhóm II và chuỗi Vβ của thụ thể tế

bào Lympho T Các siêu kháng nguyên có thể kích hoạt được 10 - 20% tổng số tế bào

Lympho T (Papageorgiou et al., 1998) Như vậy, các siêu kháng nguyên có khả năng

kích hoạt các tế bào Lympho T lớn hơn rất nhiều lần so với kháng nguyên thôngthường

Thông qua phản ứng huyết thanh và thực nghiệm trên động vật người ta đã xácđịnh được và phân loại thành các nhóm độc tố ruột khác nhau Nhóm độc tố chính bao

gồm: Enterotoxin A (Betley, Mekalanos,1988); B (Johns, Khan, 1988); C1 (Bohach, Schilievert, 1987); C2 (Bohach, Schilievert, 1989); C3 (Couch, Betley, 1989; Hovde et al., 1990); D (Bayles, Iandolo, 1989); và E (Couch et al., 1988) Bên cạnh đó, còn có một số nhóm độc tố: G, H và I (Munson et al., 1998; Omoe et al., 2002); K, L và M (Chiang et al., 2006); và gần đây là N, O, P, Q, R và U (Chiang et al., 2008; Letertre et al., 2003) Trong các nhóm nội độc tố (siêu kháng nguyên) do S aureus sản sinh kể

trên thì nội độc tố ruột nhóm B (Staphylococcal enterotoxins B - SEB) là một độc tốmạnh, bền với nhiệt và hòa tan trong nước, chúng có phổ phân bố rộng rãi và lànguyên nhân gây nhiễm trùng nhiễm độc thực phẩm thường gặp nhất Bên cạnh đó,

SEB có khả năng kháng kháng sinh (Van der Donk et al., 2013), ví dụ tính kháng nhóm ß-lactam như methicillin (Monaco et al., 2013) Nguy hiểm hơn, SEB còn là

một trong những nhóm độc tố được sử dụng làm vũ khí sinh học (Henghold, 2004)dùng để tấn công trong khủng bố sinh học (Leggiadro, 2000) và chiến tranh sinh học

(Ler et al., 2006) Chính vì vậy, trong thế chiến thứ II và chiến tranh lạnh Cục Chiến

tranh Hóa học Quân đội Hoa kỳ đã cung cấp SEB cho Cơ quan tình báo Hoa kỳ sửdụng làm vũ khí sinh học Bởi thế cho nên, việc phát triển các kỹ thuật có khả năng

phát hiện nhanh siêu kháng nguyên SEB đóng một vai trò cực kỳ quan trọng và ýnghĩa to lớn trong công tác phòng bệnh.

1.3 Độc tố ruột Staphylococcal enterotoxin B

1.3.1 Đặc điểm cấu trúc

Năm 1986, gen mã hóa protein SEB của chủng S aureus S6 đã được

Christopher và cộng sự xác định trình tự (CAST, 1994) Cho đến nay nhiều trình tự

gen seb từ các chủng khác nhau đã được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen (NCBI)

như gen từ PM36 (mã số AB479118), gen từ chủng ATCC14458 (mã số AY518386),gen từ chủng COL (mã số CP000046)…

SEB hoàn chỉnh bao gồm một trình tự tín hiệu (signal peptide) gồm 27 aminoacid ở đầu N (Jones, Khan, 1986) Đoạn peptide tín hiệu này có chức năng “dẫn” SEBtiết ra ngoài môi trường nuôi cấy, sau đó trình tự này sẽ bị cắt bởi protease ở vị trí nhấtđịnh SEB ở dạng hoạt động là 1 chuỗi polypeptide đơn gồm 239 amino acid với khốilượng phân tử khoảng 28,336 kDa, SEB có sự tương đồng cao với SEC1, cũng baogồm 239 amino acid Cấu trúc không gian của SEB gồm: 7 vùng xoắn α; 14 phiến gấp

nếp β và một cầu nối disulfite nối cysteine ở vị trí 120 và 140 (Kijek et al., 2000).

Protein SEB hình thành 2 vùng cấu trúc đặc biệt phức tạp được đóng gói nhỏ gọn chặtchẽ, cho phép SEB chống lại sự tác động của các protease trong dịch ruột, dạ dày nhưtrypsin, chymotrypsin và papain (Gleason, 2011)

Cấu trúc tinh thể của protein SEB được mô phỏng ở hình 1.3

Hình 1.3 Cấu trúc tinh thể của protein SEB (Nguồn: Papageorgiou, Acharya, 2000)

bị kích hoạt, sự hoạt hóa trực tiếp và sự tăng nhanh của tế bào T với vùng biến đổi trên

chuỗi β của thụ thể tế bào T sẽ xảy ra ngay sau đó (Kappler et al., 1989) Khi tiếp xúc

với SEB, tế bào T chín mang đáp ứng của vùng Vβ đích sẽ tiết ra lượng lớn cytokine

là chất trung gian gây độc của SEB (Stiles et al., 2001) SEB liên kết trực tiếp với

phức hợp tương mô nhóm II của tế bào trình diện kháng nguyên bên ngoài vị trí bámcủa kháng nguyên thông thường Phức hợp này chỉ nhận diện các chuỗi Vβ chuyênbiệt của thụ thể kháng nguyên tế bào T Độc tố này có thể liên kết chéo với thụ thểkháng nguyên tế bào T và phức hợp tương mô nhóm 2 của tế bào nhận diện khángnguyên Do việc hoạt hóa không chuyên biệt này đã làm tăng nhanh lượng tế bào T vàsản xuất hàng loạt các Cytokine như IL-1, TNF, IL-2… gây ra tình trạng nhiễm độc vàviêm trên lâm sàng Cơ chế gây độc của SEB được mô phỏng trong hình 1.4

Hình 1.4 Cơ chế gây độc của siêu kháng nguyên

(Nguồn: http://www.medscape.com/)

(Kháng nguyên liên kết trực tiếp với phân tử phức hợp tương mô lớp II của tế bào trình diện kháng nguyên và vùng Vβ của thụ thể tế bào T theo cách thức không đặc hiệukháng nguyên, điều đó dẫn đến việc sản sinh lượng lớn cytokine và chemokine.)

1.3.3 Những triệu chứng thường gặp

Các triệu chứng của nhiễm độc SEB khởi phát là sốt đột ngột, khoảng 40oC đến

41oC, ớn lạnh, nhức đầu, đau cơ và ho khan Trường hợp nặng, bệnh nhân cảm thấykhó thở và tức ngực Sốt có thể kéo dài 2-5 ngày và ho có thể kéo dài đến một tháng.Khi ăn phải độc tố, bệnh nhân bị viêm ruột dẫn tới buồn nôn, nôn và tiêu chảy (Ulrich

et al., 1997) Các triệu chứng nghiêm trọng hơn đối với những người tiếp xúc đang

trong trạng thái căng thẳng, ví dụ như: các binh sĩ chiến đấu trong quân đội Nó có thểgây giãn mạch, giảm huyết áp, suy hô hấp, sốc và tử vong trong vòng 40-60 giờ tiếpxúc Trong một phát hiện gần đây, những người làm việc trong phòng thí nghiệm đãđược chẩn đoán bị viêm kết mạc mắt hoặc sưng mặt là hậu quả của việc mắt hoặc datiếp xúc với độc tố này Đây là báo cáo đầu tiên về việc mắt bị kích ứng liên quan đếnSEB Điều này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc sử dụng mặt nạ để bảo vệ mặt và

mắt cho những cá nhân tiếp xúc với SEB (Rusnak et al., 2004) Mặc dù SEB không

được coi là độc tố gây chết, nhưng với mức độ phơi nhiễm cao có thể dẫn đến nhiễmtrùng, sốc và tử vong

1.3.4 Các phương pháp phát hiện S aureus và SEB

Phương pháp phân lập và nuôi cấy trên môi trường thích hợp và sử dụng cáctính chất hoá sinh học để xác định chủng loại vi sinh chẳng hạn như huyết thanh học,hình thái học, nhuộm tiêu bản Đây là phương pháp thường sử dụng trong xétnghiệm đầu tiên và làm cơ sở cho các xét nghiệm tiếp theo

Ưu điểm: Dựa trên tính chất sinh lý, sinh hóa, hình thái của vi khuẩn nên phương pháp

nuôi cấy được coi là phương pháp chuẩn để phân lập, xác định vi sinh vật

Nhược điểm: Phương pháp chỉ được thực hiện trong phòng thí nghiệm, đòi hỏi nhiều

trang thiết bị, hóa chất và mất nhiều thời gian

Phương pháp PCR và Real- time PCR, Quick PCR dựa trên các đoạn DNA đặchiệu của các chủng vi sinh vật Đoạn DNA đặc trưng của tác nhân được nhân lên nhờchu trình nhiệt và đoạn DNA được giới hạn bởi cặp mồi Đây là phương pháp cho kếtquả chính xác cao là cơ sở để kết luận xác định loại vi khuẩn Trên cơ sở này một sốhãng đã thiết kế thành các thiết bị PCR dã chiến có thể tiến hành tại hiện trường đềphục vụ công tác phát hiện tác nhân sinh học:

Ưu điểm: Phát hiện trực tiếp tác nhân gây bệnh, đây là một phương pháp chuẩn trong

chẩn đoán có độ chính xác cao

Nhược điểm: Đòi hỏi phải thao tác trong phòng thí nghiệm, cần nhiều thiết bị; Đòi hỏi

người xét nghiệm phải có tay nghề và có chuyên môn vững vàng; Các hoá chất chomột mẫu thử đắt tiền; Tính cơ động và sự tiện lợi kém; Mất nhiều thời gian để pháthiện

Dựa trên nguyên lý phản ứng kháng nguyên – kháng thể, chẩn đoán mầm bệnhthông qua phức hợp kháng nguyên – kháng thể Thường dùng động vật để gây miễndịch bằng kháng nguyên hoặc độc tố của vi sinh vật nhằm tạo ra kháng thể đặc hiệu

Để có chẩn đoán chính xác, kháng thể thu được phải có tính đặc hiệu chỉ với khángnguyên của mầm bệnh Tuy nhiên, khả năng phản ứng đặc hiệu kháng nguyên – khángthể còn phụ thuộc vào độ ổn định của kháng nguyên dưới tác động của các yếu tố nhưnhiệt độ, chất bảo quản, acid, muối hoặc các hoá chất khác có trong thực phẩm

Các phương pháp xác định nội độc tố dựa trên phân loại huyết thanh với cáckháng thể là một kỹ thuật hữu ích, nó như một công cụ dịch tễ học trong việc điều tracác bệnh truyền nhiễm khác nhau Tuy nhiên, huyết thanh ít nhậy đối với lượng nhỏcác SE so với phương pháp dựa trên DNA, hơn nữa nó tương đối phức tạp, tốn nhiềuthời gian và không thiết thực cho phát hiện và xác định một nhóm lớn các SE liên

quan với các kháng nguyên tương đồng (King et al., 1999).

Phát hiện nội độc tố SE trên môi trường dịch nổi bằng phương pháp phân loạikhuyếch tán miễn dịch, ngưng kết và ELISA thường tốn nhiều thời gian, phải thao táctrong phòng thí nghiệm, chi phí hoá chất xét nghiệm đắt và đòi hỏi cán bộ nghiên cứu

phải có trình độ chuyên môn cao và khéo về thao tác thí nghiệm Sử dụng phươngpháp ELISA phát hiện SEB trong phomat ở nồng độ thấp từ 0,1 đến 1 ng/ml nhưng

quá trình phát hiện hoàn thành mất 3,5 giờ (Korolev et al., 2003).

- Kỹ thuật ELISA (Enzym - Linked ImmunoSorbent Assay)

ELISA là kỹ thuật phân tích sử dụng enzym liên kết với kháng thể để nhận diện

và liên kết kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyênđược gắn vào đáy bản nhựa 96 giếng, chất cần phát hiện nằm trong mẫu thử được trộnlẫn cùng chất chuẩn có liên kết enzym Khi cho hỗn hợp vào các giếng trên đĩa, giếngnào có chất cần phát hiện trong mẫu sẽ cạnh tranh với chất chuẩn làm cho giếng đó saukhi bắt màu sẽ nhạt hơn So kết quả với giếng chuẩn chỉ có chất chuẩn sẽ biết đượclượng chất cần phát hiện trong mẫu thử là bao nhiêu ELISA được sử dụng nhiều trongchẩn đoán Y học, vi sinh vật học

Ưu điểm: Phương pháp ELISA có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.

Nhược điểm: Phải thao tác trong phòng thí nghiệm, chi phí hoá chất xét nghiệm đắt và

đòi hỏi cán bộ nghiên cứu phải có trình độ chuyên môn, khéo về thao tác thí nghiệm

và mất nhiều thời gian

- Kỹ thuật Western Blot (immunoblot)

Western Blot là kỹ thuật có thể sử dụng để phát hiện các kháng nguyên proteinđặc hiệu của vi khuẩn, qua đó có thể nhận dạng được chúng Hỗn hợp protein trongmàng tế bào được chạy điện di trên gel polyacrylamid để phân tách theo trọng lượng.Các protein sau khi phân tách bằng phương pháp điện di được điện chuyển sang mànglai có thể là màng PVDF, các protein được cố định trên màng Sau khi các proteinchuyển sang màng lai, màng được phủ bằng dung dịch blocking để khoá các gốc tự do

Sử dụng kháng thể thứ nhất để liên kết đặc hiệu với kháng nguyên trên màng lai sau

đó, sử dụng kháng thể thứ 2 cộng hợp enzym cho lên màng lai để liên kết với khángthể 1 Sau đó bổ sung cơ chất tương ứng với enzym, phản ứng màu xuất hiện và xácđịnh được protein cần phát hiện

Ưu điểm: có độ nhạy và độ đặc hiệu cao

Nhược điểm: Đòi hỏi phải tiến hành trong phòng thí nghiệm, nhiều thao tác và mất

nhiều thời gian; Đòi hỏi cán bộ nghiên cứu phải có chuyên môn về kỹ thuật phòng thínghiệm; Giá thành chi phí về nguyên vật liệu và hoá chất đắt

- Phương pháp phát hiện nhanh dạng que nhúng (lateral flow test strip)

Để phát hiện nhanh và khá chính xác các tác nhân sinh học cụ thể là vi khuẩnvirus, bào tử vi khuẩn ngay tại hiện trường cho kết quả trong vài phút hiện nay chủyếu là các test nhanh trên cơ sở sắc kí miễn dịch (Immunochoromatography test haylateral flow test strip) Đây cũng là dạng que thử được sử dụng phổ biến, rộng rãi trongnhiều lĩnh vực như chẩn đoán bệnh trong Y học, phát hiện các chất gây nghiện, dấu vếttrong khoa học hình sự, phát hiện độc chất

Que thử dạng sắc kí miễn dịch mà cơ sở là phản ứng đặc hiệu giữa khángnguyên và kháng thể đặc hiệu của nó Phản ứng được thực hiện trên màng mỏng theokiểu sắc kí nên dạng que thử này được gọi là sắc kí miễn dịch Trong đó kháng nguyêncần phát hiện là yếu tố đặc hiệu của vi khuẩn hay bào tử vi khuẩn Kháng thể phát hiện(detector) thường là một kháng thể đơn dòng di động trên màng Một kháng thể khác

có thể là kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng cố định trên màng Phản ứng kết hợp giữaphức hợp – kháng nguyên - kháng thể di động và kháng thể cố định trên màng để tạothành vạch T (Test line) vạch C (control line) theo dạng “bánh mỳ kẹp” (Sandwichassay)

Kết quả là khi mẫu cần phát hiện có vi khuẩn, độc tố trên que thử sẽ xuất hiệnhai vạch mầu đỏ gạch tại vị trí vạch kiểm tra (test line "T") và trên vạch đối chứng

“C”, nếu không có trên que thử chỉ xuất hiện một vạch tại vùng “C”

Ưu điểm của que thử sắc kí miễn dịch: Test có kết cấu gọn nhẹ chỉ dưới dạng một “que

nhúng” cho kết quả nhanh (không quá 10 phút) với độ nhạy cỡ ng/ml và độ đặc hiệucao

Tính tiện lợi: Que thử miễn dịch áp dụng kiểm tra mẫu tại hiện trường, cách sử dụng

rất dễ dàng với thao tác đơn giản, vận chuyển và bảo quản test dễ dàng

Giá thành: Giá thành rẻ so với các phương pháp phân tích khác

Phạm vi áp dụng: Que thử miễn dịch có thể áp dụng trong nhiều lĩnh vực, Y, Dược,

khoa học hình sự, kiểm tra các chất gây nghiện…Đặc biệt là với công tác phát hiện các

vi sinh vật độc hại trong phòng dịch và trong phòng chống khủng bố thì đây là mộtgiải pháp lí tưởng

Nhược điểm: Kết quả phân tích bằng test thử nhanh mang tính chất định tính có ý

trong sàng lọc mẫu nhanh

Ngoài ra, có một phương pháp miễn dịch khác sử dụng các hạt từ tính gắnkháng thể, các hạt này có nhiệm vụ gắn (bắt giữ) với tế bào và tập trung các tế bào từmẫu thực phẩm Các tế bào đã bị bắt giữ sau đó được phát hiện bằng nhiều kỹ thuật,trong đó có kỹ thuật sử dụng các biosensor

1.3.5 Protein tái tổ hợp SEB và tiềm năng ứng dụng

SEB là một siêu kháng nguyên tác động kích thích viêm và tăng tiết cytokine ởtất cả các mô, cơ quan SEB gây độc cho đường tiêu hoá, đường hô hấp, các vếtthương thậm chí có thể xâm nhập qua da lành, trong tấn công sinh học nó có thể đượcphân tán vào thức ăn, nguồn nước hoặc dạng khí phun trong không khí SEB bền với

nhiệt là tác nhân chính thường gặp nhất trong các vụ ngộ độc thực phẩm do S aureus

(Jones, Khan, 1986) Như vậy, làm thế nào để chúng ta có phát hiện và phòng ngừacác bệnh do độc tố này Theo các nghiên cứu trên thế giới, có nhiều phương pháp làmgiảm hay mất hoàn toàn độc tố của SEB nhằm phục vụ cho nghiên cứu biểu hiện SEBhay xa hơn nữa là nghiên cứu sản xuất vaccine an toàn nhằm ngăn ngừa ngộ độc thựcphẩm do SEB gây nên

Năm 1997, Woody và cộng sự đã nghiên cứu tạo được 2 loại protein SEB mangđột biến thay thế asparagine bằng lysine tại vị trí 23 (N23K) và phenylalanine bằngserine tại vị trí 44 (F44S) trên trình tự polypeptid SEB không độc Theo đó, khi thửnghiệm 10 µg SEB N23K và F44S (tương đương liều 30 LD50) đã không gây chếtchuột thử nghiệm Một điều thú vị là mặc dù protein SEB N23K và F44S thử nghiệm ởliều lượng thấp nhưng vẫn được phát hiện bởi phương pháp miễn dịch liên kết enzymELISA nhờ kháng thể đa dòng kháng SEB Sử dụng SEB tái tổ hợp N23K, F44S sẽthúc đấy phản ứng kháng SEB bảo vệ 80 - 87% chuột Huyết thanh lấy từ những con

chuột được tiêm chủng có hiệu quả ngăn chặn độc tố SEB gây ra tế bào T trong ốngnghiệm Chuột thí nghiệm dùng kháng huyết thanh sống sót sau khi tiêm độc tố từ 1, 2,hoặc 4 giờ, trong khi các kháng huyết thanh không còn tác dụng khi dùng 6 hoặc 8 giờsau khi tiêm độc tố Những nghiên cứu này cho thấy protein SEB đột biến N23K và

F44S làm giảm độc lực, nhưng vẫn giữ lại các vị trí epitope đặc hiệu (Woody et al.,

1997)

Năm 2002, Coffman và cộng sự thử nghiệm thành công trên mô hình chuột với

vaccine độc tố tụ cầu SEB tái tổ hợp trong vi khuẩn E coli, gây ra những đáp ứng miễn dịch ở chuột và bảo vệ chuột ở mức độc tố < 0,6 EU/mg (Coffman et al., 2002).

Swaminathan và cộng sự (1992) đã nhận thấy những thay đổi nhỏ trên bề mặtphân tử SEB tại vị trí hoạt động rãnh 4α tạo ra các SEB không độc trong khi vẫn bảo

thủ khả năng miễn dịch của phân tử (Swaminathan et al., 1992) Năm 1994, Thibodeau

đã phân tích cấu trúc tinh thể SEB đột biến và tìm ra vị trí hoạt động gây nên triệuchứng nôn mửa gồm 14 amino acid nằm trong vùng từ amino acid 113 – 126 (rãnhα4) 14 amino acid này nối vùng 1 và 2 của phân tử SEB và trong 14 amino acid có 11amino acid là giống nhau với mọi SEs Tại rãnh α4 có từ 3 tới 5 vị trí có histidine(H32, H121, và H166) rất quan trọng cho các tế bào T (TCR - T Cell Receptor) bám

vào (Thibodeau et al., 1994) Năm 1982, Stelma và Bergdoll đã khá thành công trong

nghiên cứu làm giảm độc tính của SEA và SEB bằng cách methyl hóa nhóm carboxyl

ở các phân tử histidine trong cấu trúc protein SEB Các phân tử SEA, SEB khi đượcmethyl hóa nhóm carbonxyl của các histidine không những có thể làm giảm độc tínhcủa các kháng nguyên mà còn bảo tồn được khả năng gây miễn dịch của chúng(Stelma, Bergdoll, 1982) Vì tyrosine có cấu trúc gần giống histidine nên thay thếhistidine tích điện dương bằng tyrosine ưa nước sẽ không làm thay đổi cấu trúc bề mặtphân tử, do đó có thể thay thế việc methyl hóa nhóm carbonxyl của histidine ở thínghiệm trên Dựa trên cơ sở đó, năm 2003, Korolev và cộng sự đã nghiên cứu tạo 4đột biến điểm thay thế các amino acid histidine bởi các tyrosine tại 4 vị trí có codon

mã hóa cho histidine (codon 12; 32; 105 và 121) (Korolev et al., 2003) Các protein là sản phẩm của gen seb mang bốn đột biến đã được biểu hiện và tinh sạch, sau đó được

kiểm tra khả năng gắn kết với HLA-DR4 ở người cũng như khả năng phân bào trong

nuôi cấy tế bào lách của chuột Kết quả này đã khẳng định sản phẩm protein của gen

seb đột biến đã được loại bỏ hoàn toàn độc tố của SEB nguyên thủy, và đây cũng là

nguồn nguyên liệu cho việc sản xuất vaccine an toàn nhằm ngăn ngừa sự nhiễm độc tố

ruột nhóm B của tụ cầu vàng (Korolev et al., 2003) Thêm vào đó, năm 2004 tác giả

Savransky đã đưa ra kết luận protein SEB mang 4 đột biến thay thế histidine bằngtyrosine tại vị trí các codon 12; 32; 105 và 121 đã tạo ra một kháng nguyên tái tổ hợpkhông mang độc tố, và có khả năng kích ứng ở mức độ cao các kháng thể IgG đặc hiệu

(Savransky et al., 2004) Dựa trên những cơ sở khoa học đó, chúng tôi đã tiến hành tạo

đột biến điểm thay thế Histidine thành Tyrosine tại bốn vị trí 12, 32, 105 và 121 trên

đoạn gen seb tự nhiên có chiều dài 534 nucleotide thay vì đoạn gen mã hóa cho protein

SEB có chiều dài khoảng 720 nucleotide đã được Korolev, Savransky và nhiều tác giảtrên thế giới đã công bố Các nghiên cứu này được tiến hành trên các chủng được phân

lập từ nhiều vùng địa lý khác nhau, trình tự gen seb đã được công bố trên ngân hàng

dữ liệu gen (NCBI) với các chủng khác nhau như PM36 (accession number:AB479118), ATCC14458 (accession number: AY518386), COL (accession number:

CP000046), DQ997830… Sau khi tiến hành thu thập các trình tự gen seb quan tâm

trên ngân hàng gen quốc tế (www.ncbi.nlm.nih.gov) và phân tích trình tự gen bằngphần mềm CLC Sequence Viewer để xác định khung đọc mở (ORF) và các bộ ba mãhóa cho histidine (CAC, CAT) thuộc trung tâm hoạt động của SEB Từ trình tự protein

thuộc khung đọc mở, chúng tôi nhận thấy có 3 đoạn gen seb với các kích thước khác

nhau lần lượt là 339 bp, 534 bp và 720 bp đều chứa bốn vị trí Histidine cần thay đổi;

chúng tôi đã lựa chọn thiết kế mồi đặc hiệu để nhân đoạn gen seb có kích thước 534 bp

và các mồi tạo đột biến điểm trên đoạn gen này Bởi lẽ, gen seb (534 bp) thỏa mãn cả

hai điều kiện là giữ nguyên vị trí epitop (tức là đảm bảo phản ứng đặc hiệu khángnguyên – kháng thể, cấu hình không gian) và cũng chứa đầy đủ bốn vị trí Histidinequan tâm

1.4 Hệ biểu hiện gen

1.4.1 Hệ biểu hiện E coli

E coli là vi khuẩn Gram âm, hình que, dài khoảng 2 μm, đường kính khoảng 0,25-1 μm E coli hiếu khí, kị khí tùy tiện, thường gặp trong đường ruột, phát triển dễ

dàng trong các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ tối ưu là 37oC E coli có 1

nhiễm sắc thể nằm trong thể nhân, là một chuỗi DNA trần với khoảng 4.106 căp base

E coli có quá trình biểu hiện gen gồm quá trình phiên mã, dịch mã xảy ra đồng

thời Sau khi mARN tổng hợp được sẽ sử dụng ngay để dịch mã mà không quá trình

sửa đổi sau phiên mã vì E coli không có các intron Do sự đơn giản và tiện lợi đó mà

E coli là loại tế bào biểu hiện gen rộng rãi nhất hiện nay thông qua quá trình sử dụng

các plasmid đặc thù cho các loại sản phẩm (protein ngoại lai) mà ta cần quan tâm Đặc

điểm các loại protein được biểu hiện ở E coli là: Không quá lớn (< 500 amino acid) và

không quá nhỏ (>80 amino acid), không quá kị nước; Không chứa quá nhiều gốc

disulfur do môi trường bên trong tế bào E coli có tính khử cao; Các đoạn protein hay

peptid nhỏ không bền vững trong tế bào, nên nếu muốn biểu hiện tốt nên gắn vào đoạnprotein khác

E coli được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực biểu hiện gen do có nhiều ưu điểm:

Dễ nuôi; môi trường nuôi cấy, thiết bị, dụng cụ đơn giản, rẻ tiền - góp phần hạ giá

thành sản phẩm Trong ứng dụng là dòng E coli đã được xử lý nên dễ dàng tiếp nhận plasmid tái tổ hợp cũng như quá trình nhân lên và biểu hiện của đoạn gen đó E coli

dễ dàng biểu hiện rất nhiều gen có nguồn gốc cả Prokaryota và Eukaryota E coli có một số promoter mạnh, có khả năng biểu hiện tốt E coli có tốc độ sinh trưởng và phát

triển nhanh, khả năng biểu hiện gen tái tổ hợp mạnh, chỉ sau 8 giờ nuôi cấy trong điềukiện thích hợp đã có sản phẩm protein tái tổ hợp Khả năng tạo sản phẩm cao từ 50

mg/l đến 500 mg/l Cấu trúc bộ gen của E coli và đặc điểm di truyền đã được nghiên

cứu khá đầy đủ tạo điều kiện thuận lợi trong quá trình nghiên cứu và sản xuất khi sử

dụng E coli Dòng tế bào E coli được sử dụng trong sản xuất tương đối an toàn,

không có hoạt tính gây bệnh, ít gây hại ở người và động vật

1.4.2 Chủng biểu hiện E coli BL21(DE3)

Chủng biểu hiện E coli BL21 là chủng khỏe có thể sinh trưởng trong môi

trường tối thiểu, được làm suy thoái hai protease chìa khóa là lon protease (proteasenội bào) và ompT protease (protease màng ngoài tế bào) Vì vậy, chủng có ưu điểm là

hạn chế được sự phân cắt của protease đối với protein ngoại lai, giúp cho protein ngoạilai ổn định hơn trong tế bào sau khi được tổng hợp.