Khảo sát đáp ứng miễn dịch ở cá tra (pangasianodon hypophthalmus) đối với protein màng ompn tái tổ hợp của vi khuẩn edwardsiella ictaluri

Một trong những hướng nghiên cứu để sản xuất vaccine là sản xuất vaccine tiểu phần bằng cách sử dụng protein màng outer membrane protein - Omp của vi khuẩn E.. Trong nghiên cứu này, chún

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ LƯU PHƯƠNG HẠNH

KHẢO SÁT ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH Ở CÁ TRA

(PANGASIANODON HYPOPHTHALMUS) ĐỐI VỚI

PROTEIN MÀNG OmpN TÁI TỔ HỢP CỦA VI KHUẨN

EDWARDSIELLA ICTALURI

Chuyên ngành: Hóa sinh

Mã số chuyên ngành: 60 42 30 1

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS NGUYỄN QUỐC BÌNH

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012

Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến Thầy giáo - TS Nguyễn Quốc Bình

đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện

Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Trung tâm Công nghệ Sinh học TP.HCM đã cung cấp toàn bộ kinh phí và hỗ trợ máy móc, trang thiết bị

để tôi có thể hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi xin chân thành cảm ơn ThS Ngô Huỳnh Phương Thảo, ThS Lâm Vỹ Nguyên, ThS Vũ Thị Thanh Hương, ThS Dương Vân Anh cùng các anh chị em bạn bè trong phòng CNSH Thủy Sản, CNSH Y Dược, CNSH Vi Sinh, CNSH Thực Vật … đã có những giúp đỡ quý báu, tạo điều kiện thuận lợi cũng như chia sẻ với tôi những khó khăn trong quá trình thực hiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cám ơn đến bạn bè của tôi, những người

đã luôn bên cạnh, quan tâm, cổ vũ, và giúp tôi vượt qua những khó khăn trong suốt thời gian thực hiện

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i 

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv 

DANH MỤC CÁC BẢNG v 

DANH MỤC CÁC HÌNH vi 

DANH MỤC SƠ ĐỒ viii 

LỜI MỞ ĐẦU 1 

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 

1.1 Tình hình nuôi cá tra và bệnh gan thận mủ 3 

1.2 Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mũ

trên cá Tra 5 

1.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 5 

1.2.2 Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 6 

1.3 Sơ lược về protein màng và vai trò của protein màng OmpN

(outer membrane protein N) trong vi khuẩn Edwarsiella ictaluri 8 

1.3.1 Sơ lược về protein màng 8 

1.3.2 Protein màng OmpN của vi khuẩn E ictaluri 9 

1.4 Tình hình nghiên cứu vaccine kháng khuẩn Edwardsiella ictaluri

cho cá Tra 13 

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13 

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 14 

1.5 Sơ lược về các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp 16 

1.5.1 Hệ thống vi khuẩn E coli 16 

1.5.2 Hệ thống nấm men Pichia pastoris 17 

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 

2.1 Thiết bị, hóa chất và dụng cụ 20 

2.1.1 Thiết bị và dụng cụ 20 

2.1.2 Hóa chất và môi trường 21 

2.1.2.1 Hóa chất và môi trường dùng để biểu hiện OmpN trong hệ thống E

coli 21

2.1.2.2 Hóa chất dùng trong tinh sạch OmpN tái tổ hợp từ E coli 21

2.1.3 Chủng vi sinh vật 26 

2.1.3.1 Chủng vi khuẩn Escherichia coli: 26

2.1.3.2 Chủng nấm men Pichia pastoris 26

2.1.4 Các plasmid 26 

2.1.5.1 Plasmid pET 28 26

2.1.5.2 Plasmid pPIC9K 28

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30 

2.2.1 Thu nhận và khảo sát gây đáp ứng miễn dịch ở cá tra

của OmpN tái tổ hợp trên hệ thống E.coli 30 

2.2.1.1 Biểu hiện protein OmpN trong E coli 30

2.2.1.2 Thu nhận protein OmpN từ hệ thống biểu hiện E coli 31

2.2.1.3 Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN 32

2.2.2 Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN 35 

2.2.2.1 Tạo dòng E coli DH5α mang đoạn gen OmpN 36

2.2.2.2 Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN 38

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 40 

3.1 Kết quả thu nhận OmpN tái tổ hợp trên hệ thống E coli 40 

3.1.1 Biểu hiện protein OmpN trong E coli 40 

3.1.2 Tinh sạch protein OmpN từ hệ thống biểu hiện E coli 42 

3.1.2.1 Mức độ hòa tan của protein OmpN ở dạng thể vùi với urea 42

3.1.2.2 Tinh sạch protein OmpN bằng sắc ký ái lực 43

3.1.2.3 Loại muối dung dịch protein OmpN tinh sạch bằng sắc lý lọc gel Superfine Sephadex G-25 50

3.1.3 Khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN 51 

3.1.3.1 Kiểm tra kháng thể kháng OmpN từ thỏ bằng phương pháp Western blot 51

3.1.3.2 Kết quả khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN 52

3.2 Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN 55 

3.2.1 Tạo dòng E coli DH5α mang plasmid PIC9K nối với đoạn gen OmpN 55 

3.2.1.1 Thu nhận đoạn gen OmpN và pPIC9K từ chủng E coli DH5α 55

3.2.1.2 Tạo dòng chủng E coli DH5α mang đoạn gen OmpN nối với pPIC9K 57

3.2.2 Tạo dòng Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN 59 

3.2.3 Kết quả sàn lọc dòng tế bào nấm men P pastoris có khả năng biểu hiện ompN cao 63 

CHƯƠNG 4 – KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 65 

4.1 Kết luận 65 

4.2 Kiến nghị 65 

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66 

MCS Multi cloning site

MD Minimal dextrose medium

OD Optical density

PBS Phosphate buffered saline

PCR Polymerase chain reaction

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang 

Bảng 2.1 Thành phần của phản ứng PCR 24 

Bảng 2.2 Thành phần gel SDS-PAGE 25 

Bảng 2.3 Thành phần các dung dịch dùng trong điện di SDS-PAGE 25 

Bảng 2.4 Đặc điểm của plasmid pET28 a+ 28 

Bảng 2.5 Đặc điểm của pPIC9K 29 

Bảng 2.6 Thí nghiệm khảo sát độc tính của protein OmpN tinh sạch đối với cá Tra 34 

Bảng 2.7 Thành phẩn phản ứng cắt plasmid 37 

Bảng 2.8 Thành phần phản ứng nối pPIC9K và OmpN 38 

Bảng 3.2 Các chất hỗ trợ cho quá trình tái gấp cuộn [28] 46 

Bảng 3.3 Tóm tắt kết quả quá trình loại muối từ 6M đến 0M bằng sắc ký lọc gel trên cột gel sephadex G25 51 

Bảng 3.4 Kết quả đo OD của phản ứng tạo màu trong ELISA 54 

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 5 

Hình 1.2 Cá Tra khỏe mạnh và cá Tra bị bệnh gan thận mủ 7 

Hình 1.3 Màng ngoài của vi khuẩn Gram âm 8 

Hình 1.4 So sánh amino acid của OmpN1, OmpN2 và ompN3 12 

Hình 1.5 Cấu trúc mẫu tương đồng của OmpN1, OmpN2, OmpN3 13 

Hình 1.6 Hình ảnh của cấu trúc OmpN1, OmpN2 và OmpN3 xếp chồng lên nhau13  Hình 1.7 Hình thái vi khuẩn Escherichia coli 16 

Hình 1.8 Hình thái nấm men Pichia pastoris 17 

Hình 2.1 Vector pET28 a+ 26 

Hình 2.2 Vùng MCS của vector pET28 a+ 27 

Hình 2.3 Vector pPIC9K 28 

Hình 2.4 Vùng MSC của vector pPIC9K 29 

Hình 3.1 Kết quả điện di trên gel SDS PAGE 12.5% protein OmpN được biểu hiện trong E coli 40 

Hình 3.2 Kết quả điện di trên gel SDS PAGE 12.5% protein OmpN sau khi phá vỡ tế bào E coli bằng sonicator 41 

Hình 3.3 Kết quả hòa tan OmpN với Urea ở các nồng độ khác nhau 42 

Hình 3.4 Kết quả lượng protein không bám trong cột sắc ký ở các điều kiện khác nhau 43 

Hình 3.5 Kết quả tinh sạch OmpN tái tổ hợp trong điều kiện tái gấp cuộn 45 

Hình 3.6 Kết quả điện di trên gel SDS PAGE 12.5% quá trình tinh sạch protein His tag-OmpN trong điều kiện tái gấp cuộn 47 

Hình 3.7 Kết quả tinh sạch OmpN-His tag trong điều kiện biến tính 48 

Hình 3.8 Kết quả điện di trên gel SDS PAGE 12.5% quá trình tinh sạch OmpN-His tag trong điều kiện biến tính 49 

Hình 3.9 Kết quả điện di trên gel SDS PAGE qua trình loại muối protein sau tinh

sạch 50 

Hình 3.10 Kết quả kiểm tra sự hiện diện của protein OmpN-His tag trong huyết

thanh của cá Tra bằng SDS-PAGE12.5% (A) và Western Blot(B) 52 

Hình 3.11 Kết quả điện di trên gel agarose1% plasmid pGEX4T1::OmpN 56 

Hình 3.12 Kết quả điện di trên gel agarose 1% đoạn gen OmpN đã được tinh sạch

57 

Hình 3.13 Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp

mồi 3’AOX1 và 5’AOX1 58 

Hình 3.14 pPIC9k được tách từ các chủng E coli DH5α đã kiểm tra bằng PCR

Hình 3.17 Các khuẩn lạc Pichia pastoris mọc trên đĩa môi trường MD

sau khi biến nạp pPIC9K::OmpN 61 

Hình 3 18 Kết quả PCR kiểm tra kết quả tạo dòng P pastoris mang đoạn gen

OmpN 62 

Hình 3.19 Kết quả chọn các chủng P pastoris có số copy cao nhât 63 

Hình 3.20 Các dòng P pastoris đã tạo dòng thành công 64 

  Đồ thị 3.1 Số lượng trung bình cá chết ở mỗi nghiệm thức đánh giá độc lực của

OmpN trên cá tra ……… 53

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Trang

Sơ đồ 2.1 Tổng quát quá trình thu nhận protein OmpN tái tổ hợp trên hệ thống E

coli và khảo sát đáp ứng miễn dịch ở cá Tra đối với protein OmpN tái tổ hợp 30 

Sơ đồ 2.2 Tổng quát quá trình tạo dòng P pastoris mang đoạn gen OmpN 35 

LỜI MỞ ĐẦU

Trong nền kinh tế Việt Nam, thủy sản là thế mạnh và là ngành kinh tế mũi nhọn Với hơn 3260 km bờ biển, 112 cửa sông, lạch, hơn 2 triệu km2 thềm lục địa, hơn 1triệu km2 mặt nước, sự phong phú về các loại thủy sản nên ngành thủy sản của nước ta có điều kiện rất thuận lợi để phát triển và thực tế nó đã trở thành một bộ phận quan trọng trong nền kinh tế quốc dân Trong những năm qua, ngành thủy sản

đã đạt được tốc độ phát triển cao, ổn định và mức tăng tổng bình quân hàng năm về tổng sản lượng thủy sản trên 4% năm, giá trị kim ngạch xuất khẩu bình quân chiếm 10-15% trong tổng kim ngạch xuất khẩu của Việt Nam hàng năm

Cá Tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá da trơn nước ngọt có giá trị

kinh tế cao, phân bố tự nhiên tập trung chủ yếu ở vùng hạ lưu sông Mekong Ở Việt Nam đối tượng này được nuôi với quy mô công nghiệp ở một số tỉnh Đồng bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) như: An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Bến Tre, Tiền Giang [2]

Từ năm 1996 – 2006, diện tích nuôi cá tra, basa tăng gấp 7 lần, sản lượng tăng 36,2 lần Hiện nay, cá tra đã được xuất khẩu sang 80 quốc gia và vùng lãnh thổ, chiếm 29% giá trị xuất khẩu thủy sản của cả nước [13]

Để có sản lượng cao cung cấp cho xuất khẩu, bên cạnh việc tăng diện tích nuôi trồng thì người dân còn nuôi cá tra ở mật độ cao và nuôi thâm canh, làm xuất hiện nhiều loại bệnh trên cá Trong đó, bệnh gan thận mủ gây thiệt hại nghiêm trọng nhất cho người nuôi [4]

Bệnh gan thận mủ xuất hiện lần đầu tiên trên cá tra nuôi ở ĐBSCL vào năm

1998 Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết cao khoảng 10-90%, và có thể lên tới 100% tùy thuộc vào cách quản lý và cỡ cá nuôi [2] Khi cá bệnh, người nuôi thường dùng

thuốc hóa học và thuốc kháng sinh để chữa trị Tuy nhiên, vi khuẩn Edwardsiella

ictaluri gây bệnh cho cá kháng với một số loại thuốc kháng sinh như Oxytetracylin,

Oxolinic acid, Sulphonamid … Hơn thế, các sản phẩm thủy sản sau đó thường

không được ưa chuộng do sự tích lũy thuốc, hóa chất trong thịt, tạo chủng kháng thuốc

Việc tìm kiếm các loại vaccine cho cá tra kháng lại bệnh gan thận mủ là vấn

đề cấp bách cho công nghiệp nuôi cá ở Việt Nam Một trong những hướng nghiên cứu để sản xuất vaccine là sản xuất vaccine tiểu phần bằng cách sử dụng protein

màng (outer membrane protein - Omp) của vi khuẩn E ictaluri Sản xuất vaccine

tiểu phần từ OmpN để phòng ngừa bệnh trên cá da trơn là một hướng phát triển có

nhiều tiềm năng Protein OmpN là một tiểu phần của E ictaluri, trợ giúp cho quá

trình bám dính, là một kháng nguyên quan trọng kích thích đáp ứng miễn dịch [5] Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ dừng ở bước đánh giá đáp ứng miễn dịch của

cá Tra đối với protein màng ompN nhằm tạo tiền đề cho việc sản xuất vaccine tiểu phần ngừa bệnh gan thận mủ cho cá tra

Từ những thực tế trên, chúng tôi mạnh dạn tiến hành đề tài “Khảo sát đáp

ứng miễn dịch ở cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) đối với protein màng OmpN tái tổ hợp của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri”

Mục tiêu của đề tài

Khảo sát đáp ứng miễn dịch ở cá Tra đối với protein màng OmpN tái tổ hợp

của vi khuẩn E ictaluri

Nội dung đề tài bao gồm

- Tinh sạch protein OmpN tái tổ hợp từ hệ thống biểu hiện E coli

- Đánh giá đáp ứng miễn dịch của cá Tra đối với OmpN

- Tạo dòng nấm men Pichia pastoris mang đoạn gen OmpN

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tình hình nuôi cá tra và bệnh gan thận mủ

Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là loài cá nước ngọt, không vảy,

giống cá trê nhưng không có ngạnh Cá tra được nuôi chủ yếu ở khu vực ĐBSCL

Đi sâu vào hình thức và mô hình nuôi, nghề nuôi cá tra đã có sự chuyển đổi rất lớn

từ mô hình nuôi nước chảy trong lồng bè, đăng quần trên sông vùng thượng nguồn sông Tiền và sông Hậu sang mô hình nuôi ao dọc cồn bãi ven sông và dịch chuyển

về phía hạ lưu với chất lượng cá tốt hơn, chi phí giá thành rẻ hơn do khả năng thay nước dựa vào thủy triều tốt hơn Điều này tạo ra triển vọng phát triển nghề nuôi cá tra ít chịu ảnh hưởng của việc biến đổi khí hậu toàn cầu và sự nhiễm mặn sâu hơn ở

ĐBSCL

Cá tra hiện là mặt hàng xuất khẩu chủ lực của ngành Thủy sản Việt Nam, chiếm đến 32,4% tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản của cả nước vào năm 2008, với giá trị hơn 1480 tỷ đô la Mỹ Thị trường nuôi cá tra bắt đầu khởi sắc từ khoảng năm 1999, sau 10 năm sản lượng cá tra Việt Nam đã tăng hơn 50 lần, giá trị xuất khẩu tăng 65 lần [4] Năm 2009, cả nước có khoảng 100 nhà máy chế biến cá, có công suất 1,5 triệu tấn sản phẩm mỗi năm Năm 2010, dự kiến sản lượng cá tra của vùng đồng bằng sông Cửu Long sẽ đạt đến mục tiêu là 1,5 triệu tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 1,5 tỷ đô la Mỹ, và tạo được việc làm cho hơn 20 vạn lao động [1]

Ngày 4/10/2011, tại Hội thảo Cá tra Việt Nam- Tầm nhìn 2015 –Xu hướng xuất khẩu, phân tích lợi thế cạnh tranh và giải pháp phát triển bền vững được trung tâm nghiên cứu và phân tích dữ liệu Gafin tổ chức tại thành phố Hồ Chí Minh, Tiến

sĩ Nguyễn Thị Hồng Minh nguyên thứ trưởng bộ Thủy sản cũ cho biết “Thủy sản là

mỏ vàng của Việt Nam” trong đó tôm và cá tra là 2 sản phẩm chủ lực Theo dự báo của Gafin, kim ngạch xuất khẩu thủy sản năm 2011 của Việt Nam sẽ đạt 5,3 tỷ đô la

Mỹ, trong đó xuất khẩu cá Tra đạt 1,8 tỷ đô la Mỹ

Tuy nhiên, theo hiệp hội chế biến và xuất khẩu thủy sản Việt Nam (VASEP) đây là mức phát triển không bền vững Việc mở rộng ồ ạt vùng nuôi trồng, chất

lượng con giống không đảm bảo, thiếu kiểm soát chất lượng nguồn nước, sử dụng hóa chất cấm … đang làm cho nguồn nước ngày càng ô nhiễm, khó kiểm soát khi

có dịch bệnh lây lan Đặc biệt, việc lạm dụng thuốc kháng sinh và thuốc thú y thủy sản đang làm cho sản phẩm cá tra và cá basa Việt Nam gặp nhiếu bất lợi khi xuất khẩu sang các thị trường khó tính Một số hàng thủy sản Việt Nam bị các nước nhập khẩu trả lại do nhiễm các hóa chất cấm [1]

Tại hội thảo về phát triển bền vững nghề nuôi cá tra và basa tại thành phố Cần Thơ năm 2007 do bộ Thủy sản đã phối hợp với Đại sứ quán Hà Lan tổ chức đã cho biết đa số các mặt hàng này đều nhiễm Malachite Green, Oxytetracyline, Leucomalachite Green, Chloramphenicol, Nitrofurans, CuSO4, β-lactam, Quinolone, Aminosid, các phụ gia giữ nước có nhóm phosphate … và nhiều loại kháng sinh khác [1]

Hằng năm, số lượng cá nuôi bị thiệt hại bởi các bệnh truyền nhiễm do vi khuẩn, ký sinh trùng, nấm gây nên không ngừng gia tăng Chính vì dịch bệnh phát sinh, bà con ngư dân đã lạm dụng không ít loại kháng sinh và thuốc thú y thủy sản

để cứu lấy đàn cá Giải pháp thiết thực nhất cho vấn đề này là hạn chế sự lây nhiễm của các vi khuẩn gây bệnh bằng cách sử dụng vaccine phòng bệnh [1]

Feguson và cộng sự (2001) đã có công trình nghiên cứu đầu tiên mô tả về bệnh gan thận mủ ở cá tra, cá basa nuôi tại Việt Nam [14] Tuy nhiên, phải sau đó

một năm, nguyên nhân gây bệnh gan thân mủ trên cá tra do vi khuẩn E ictaluri mới

được xác định bởi Crumlish và cộng sự (2002) [11]

Năm 2006, cá Tra chết hàng loạt chủ yếu là do bệnh gan thận mủ trên sông Tiền và sông Hậu, cụ thể là khu vực Cao Lãnh (Đồng Tháp), An Giang, Cần Thơ,

… Tốc độ lây lan của dịch bệnh rất nhanh, xác cá và các cơ quan nội tạng không được xử lí tiếp tục gây nhiễm theo môi trường nước Trước tình hình dịch bệnh gây

ra trên diện rộng, vào năm 2008, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn Việt Nam

đã có quyết định phê duyệt các đề án nghiên cứu vaccine để phòng bệnh do vi

khuẩn E ictaluri gây ra [1]

Vaccine phòng bệnh do nhiễm khuẩn E ictaluri được đánh giá là có hiệu quả,

an toàn và có lợi ích kinh tế do hạn chế sử dụng thuốc kháng sinh Đây là xu thế cần hướng đến khi các thị trường Mỹ, EU, Nhật, Nga … đang dần thắt chặt các quy định về các mặt hàng thủy sản nhập khẩu

1.2 Sơ lược về vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá

tra

1.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Edwardsiella ictaluri thuộc giống Edwardsiella, họ Enterobacteriaceae, bộ Enterobacteriales, lớp Gammaproteobacteria, ngành Proteobacteria

Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn Edwardsiella ictaluri [43]

E ictaluri là tác nhân gây ra bệnh nhiễm trùng máu đường ruột (ESC) trên cá

Nheo ở Mỹ và bệnh gan thận mủ trên cá tra ở Việt Nam E ictaluri được mô tả và

công bố đầu tiên vào năm 1976 tại Southern Cooperative Fish Disease Laboratory

of Auburn University trên cá da trơn (Hawke 1979) [38]

E ictaluri là vi khuẩn gram âm, hình que, ở dạng đơn hoặc đôi và một ít ở

dạng chuỗi, kích thước 1x2-3 µm, yếm khí không bắt buộc [16],[29],[38],[40]

E ictaluri sinh sản vô tình [3], chuyển động nhờ tiêm mao, phát triển thuận lợi

ở nhiệt độ 25-300C [10],[40]

E ictaluri được phân lập từ cá nhiễm lâm sàn trên môi trường thạch BHI hoặc

TSA Chúng phát triển chậm trên môi trường nuôi cấy, cần 36-48h để hình thành những khuẩn lạc nhỏ li ti Sau 48h, trên môi trường EIM - môi trường giúp tăng

cường sự phân lập và định danh E ictaluri – khuẩn lạc E ictaluri và E tarda có

đường kính 0,5 – 1,0 mm, màu xanh mờ

Vi khuẩn E ictaluri kén chọn vật chủ hơn so với E tarda và gây thiệt hại

nặng hơn

Quá trình phân tích sự phát sinh loài dựa trên rRNA 16S-23S ở vùng ISR

(intergenic spacer region ) đã cho thấy một sự tương đồng hơn 96% giữa E ictaluri

và E tarda (tác nhân gây ra bệnh làm thối rữa khí thũng ở cá da trơn và nhiễm

trùng cơ hội ở người ) [38]

Bộ gen của E ictaluri bao gồm một nhiễm sắc thể đơn dạng vòng Những nghiên cứu bằng cách cho lai DNA lại một lần nữa xác nhận rằng E ictaluri có liên quan mật thiết nhất với E tarda, với tỷ lệ giống nhau tương đối 56-60% ở 600C E

ictaluri đã có tỷ lệ tương đồng khoảng 31% với E coli ở 600C Số lượng G+C của

E ictaluri được ước lượng khoảng 53% bằng cách ly tâm mật độ nổi Hai plasmid

(5.6 kb và 4.8 kb) có mặt phù hợp với nhữnh phân tích ở cá da trơn [13], [40]

Về mặt sinh hóa, nó âm tính với cytochrome oxidase, citrate, phenyl alanine deaminase, indole và H2S Vi khuẩn này có khả năng lên men và oxi hóa glucose giải phóng khí và giảm khả năng chịu mức độ cao hơn NaCl 1.5% [16], [38]

1.2.2 Khả năng gây bệnh của vi khuẩn Edwardsiella ictaluri

Vi khuẩn E ictaluri xâm nhập vào cá theo 2 hướng:

- Vi khuẩn có trong nước xâm nhập vào cá qua cơ quan khứu giác và di chuyển vào dây thần kinh khứu giác, sau đó vào não Từ đó, bệnh lan rộng từ màng não đến sọ và da [38]

- Cá còn có thể nhiễm khuẩn qua đường tiêu hóa, thức ăn qua đường miệng sẽ gây nhiễm khuẩn ruột hoặc qua niêm mạc ruột vào máu và gây nhiễm trùng máu Bằng con đường này thì vi khuẩn đi vào các mao mạch trong biểu bì gây hoại tử và mất sắc tố của da [38]

Ngoài ra, vi khuẩn cũng có thể xâm nhập qua những vết thương ở da, di chuyển trực tiếp vào máu hay những tế bào bạch huyết để gây bệnh [40]

Bệnh này nếu nhẹ thường khó được phát hiện sớm do cá bệnh ít có biểu hiện bên ngoài Cá bị nhiễm bệnh gan thận mủ thường ăn kém hoặc bỏ ăn tùy theo mức

độ bệnh Quan sát bên ngoài có thể thấy bụng hơi sưng to, mắt bị đục Cá bệnh thường bơi lờ đờ gần bề mặt ao Khi mổ bụng cá thường thấy những đốm trắng nhỏ (như đốm mủ) trên bề mặt một số cơ quan nội tạng như gan, thận và lách

Trường hợp bệnh nặng, cá bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt nước, thường nhào lộn và xoay vòng tròn, và không phản ứng với tiếng động Những tổn thương ở gan lan rộng khiến cho gan không còn giữ đươc chức năng khử độc và lọc máu, lúc này chất độc tích tụ trong cơ thể kết hợp với những yếu tố khác làm cho cá chết Một số

cá xuất huyết ở tất cả các vi hoặc xuất huyết toàn thân, và nếu xuất huyết trầm trọng thì khi nhấc cá ra khỏi mặt nước máu sẽ chảy ra từ da và mang cá Ngoài ra, khi mổ một số cá mới chết sẽ thấy túi mật bị vỡ, dịch mật lan tràn khắp các nội tạng do ống dẫn mật và túi mật bị hoại tử Một số cá biểu hiện màu sắc nhợt nhạt, có nhiều đốm nhỏ lớn trên da Số lượng cá chết hằng ngày tăng cao và theo tỷ lệ tăng dần Tốc độ lây lan của bệnh rất nhanh Do đó, việc điều trị phải triệt để và đồng bộ

Hình 1.2 Cá Tra khỏe mạnh (A) và cá Tra bị bệnh gan thận mủ (B)

Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra những nhân tố có tính độc ở E ictaluri

gồm lông roi, polysaccharide vỏ ngoại bào, lipopolysaccharide (LPS), outer membrane protein (OMP), hemolysins (chất tiêu hồng cầu) và chondroitinase [12]

Những kháng nguyên của E ictaluri được nghiên cứu trước đây đã sử dụng phép

phân tích SDS PAGE hay Western blot Những protein sinh kháng nguyên hay

không sinh kháng nguyên của E ictaluri cũng đã được nghiên cứu bằng phép phân

tích 2-D SDS PAGE [12]

Sự phát sinh bệnh từ E.ictaluri dựa vào khả năng kiểm soát hệ protein của nó

để tránh sự phòng ngừa của vật chủ, và như vậy, sự nghiên cứu hệ protein là quan trọng đối với việc hiểu được cơ chế gây bệnh của vi khuẩn [12]

1.3 Sơ lược về protein màng và vai trò của protein màng OmpN (outer

membrane protein N) trong vi khuẩn Edwarsiella ictaluri

1.3.1 Sơ lược về protein màng

Thành của vi khuẩn Gram âm gồm lớp peptidoglycan vững chắc và lớp màng ngoài Cấu trúc của lớp màng ngoài là protein, phospholipids và lipopolisaccharide (LPS) Màng ngoài giúp bảo vệ vi khuẩn chống lại các tác động bất lợi của môi trường như: sự tấn công của các vi khuẩn khác, sự xâm nhập của các chất có hại cho

tế bào [31] Protein chiếm khoảng 50% khối lượng lớp màng ngoài của vi khuẩn gram âm Protein màng ngoài (OmpN) đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì tính toàn vẹn và chọn lọc tính thấm của màng vi khuẩn [7],[34] Có hai loại protein chính trên màng tế bào là protein xuyên màng và protein ngoại biên không xuyên màng Protein ngoại biên không xuyên màng còn được gọi là protein bề mặt màng Các protein này thường liên kết với lớp đôi lipid và nằm ở bề mặt ngoài màng Protein xuyên màng đã được nghiên cứu là không tan trong nước, có bề mặt ngoài của protein là phần kị nước Màng ngoài của vi khuẩn gram âm thực hiện nhiệm vụ sàn lọc phân tử, cho phép các phân tử có kích thước xác định đi qua, cản trở các phân tử lớn, các thành phần gây hại khác, vì vậy các protein vận chuyển xuyên màng còn được gọi là Porin [15]

Hình 1.3 Màng ngoài của vi khuẩn Gram âm [44]

Protein xuyên màng có hai dạng cấu trúc là α và β-barrel Bên trong của cấu trúc β-barrel là các gốc ưa nước với các liên kết hydro bền chặt, bên ngoài là các gốc kị nước để liên kết với đuôi kị nước của lớp đôi lipid Ngược lại, cấu trúc α thường không có khu vực ưa nước [21]

Một số chức năng sinh học của protein màng:

- Chức năng cấu trúc: protein màng giúp cho màng có được tính ổn định

- Chức năng vận chuyển qua màng: phần lớn các protein màng đóng vai trò là các kênh vận chuyển vật chất giữa môi trường bên trong và bên ngoài Protein vận chuyển là nhịp cầu của màng sinh học

- Chức năng thu nhận và truyền tín hiệu giữa các tế bào và trong nội bộ tế bào

- Chức năng miễn dịch: protein màng đóng vai trò là các kháng nguyên trên về mặt và là thụ quan của tế bào, tham gia vào quá trình miễn dịch

- Đóng vai trò là các protein dung hợp màng

- Liên kết với bộ khung của tế bào, giúp tế bào có được hình dạng bền vững và

ổn định

Một số protein màng có khả năng gây độc Khả năng gây độc của protein được biểu hiện ở các vi khuẩn gram âm, và chúng cần thiết cho sự sinh tồn của vi khuẩn chống lại sự xâm nhập của các đại thực bào và các tế bào eukaryote [3]

Protein màng ngoài của E ictaluri hay các vi khuẩn gram âm gây bệnh nói

chung có vai trò quan trọng trong việc tương tác với tế bào chủ trong quá trình bám, hấp thu chất dinh dưỡng từ tế bào chủ và loại bỏ cơ chế bảo vệ của tế bào chủ Nó cũng có tính kháng nguyên vì thành phần của màng ngoài được dễ dàng nhận ra như

cơ chất lạ bởi hệ thống phòng thủ miễn dịch của tế bào chủ

1.3.2 Protein màng OmpN của vi khuẩn E ictaluri

Cơ chế gây độc thật sự rõ ràng ở E ictaluri vẫn chưa được làm sáng tỏ Trong phạm vi họ Enterobacteriaceae, tác nhân giúp vi khuẩn bám dính và xâm nhập vào

tế bào chủ là protein màng Các protein này cùng với các tác nhận gây độc khác kết hợp với cơ chế hoạt động của tế bào chủ để xâm nhập vào [22]

OmpN liên quan đến quá trình vận chuyển chất tan qua màng tế bào, chúng tham gia vào quá trình bám dính và xâm nhập vào tế bào vật chủ Chúng cũng có chức năng như một thụ quan đối với thể thực khuẩn và các bacteriocin (thuốc kháng sinh làm bằng vi khuẩn) Từ khi những protein này được xác định có trên bề mặt ngoài của của màng tế bào, chúng có thể hoạt động như những nhân tố quyết định kháng nguyên và vì thế chúng được xem như những ứng cử viên vaccine tiềm năng

để phòng bệnh cho cá Do đó những hiểu biết về cấu trúc và chức năng của OmpN

là rất quan trọng [27]

Trong trình tự bộ gen của E ictaluri có 3 gen khác nhau mã hóa cho OmpN Gen OmpN1 được tìm thấy trên một sợi bổ trợ của DNA E ictaluri và được chặn

bởi một protein liên kết peniciline ở một đầu và một protein mang tính giả thuyết ở

đầu kia Gen OmpN2 cũng được tìm thấy trên một sợi bổ trợ của E ictaluri và đã

được chặn bởi β-ketoadipate enol-lactone hydrolase ở một đầu và phosphofructose kinase ở đầu còn lại Khác với gen OmpN1 và OmpN2, gen OmpN3 đã được tìm thấy trên một sợi thực của DNA và bị chặn bởi một protein họ HAD và một tRNA giả định (uracil-5-) methyltransferase [27]

OmpN1 có 402 amino acid, với khối lượng phân tử là 4.41 kDa và điểm đẳng

điện là 5.3 OmpN2 có 373 amino acid với khối lượng phân tử 4.10 kDa và điểm

đẳng điện là 5.39 Và OmpN3 có 376 amino acid với khối lượng phân tử là 4.2 kDa

và điểm đẳng điện là 8.95 [27]

Những đặc tính hóa lý của OMPs này đã được xác định Đoạn petide tín hiệu

và những vùng chuyển màng của protein cũng được xác định Một liên kết gồm nhiều trình tự đã được thực hiện để xác định vị trí các khu bảo tồn trong protein Cấu trúc này đã có được thông qua một mô hình tương đồng Đoạn peptide tín hiệu của OmpN1 là “MKYKYLAVAIPVLLAAGMANS” , nằm giữa alanine thứ 21 và alanine thứ 22 Đoạn peptide tín hiệu của OmpN2 nằm giữa alanine 21 và alanine 22; chuỗi tín nhiệu là “MKRNLLAAVIPALLVAGAANA” Chuỗi tín hiệu của OmpN3 là “MNTIRSLVALSTIGCIGIFPLISHA” và nằm giữa alanine 25 và alanine 26 [27]

Nghiên cứu đã cho thấy rằng OmpN của vi khuẩn E ictaluri là Porin và có 16

sợi xuyên màng di chuyển thông qua màng tế bào bên trong và bên ngoài

Đối với OmpN1, sự hiện diện của họ Galactokinase đã chỉ ra rằng protein này tham gia vào quá trình vận chuyển đường, phosphoryl hóa hay truyền tín hiệu OmpN1 là một Porin Dấu hiệu của protein Flagellar R-ring trong OmpN1 cho thấy rằng protein tham gia vào quá trình níu giữ lông roi trong lớp peptidoglycan giữa lớp màng trong và ngoài Ngoài ra, sự hiện diện của EDG-6 sphingosine 1-phosphate đã cho thấy sự tham gia của protein vào quá trình truyền tải tín hiệu và nhận diện tế bào

OmpN2 là một Porin và có liên quan đến tính độc của tế bào Những thụ quan orphan GPR6 đưa ra vai trò của protein này trong con đường truyền tín hiệu và bắt đầu phản ứng với tế bào [27]

Sự có mặt của những dấu hiệu protein màng biểu mô trong OmpN3 cho thấy vai trò của protein này trong quá trình kiểm soát sự phát triển của tế bào Protein này cũng tham gia vào quá trình thu nhận sắt như đó là sự hiện diện dấu hiệu transferring trong protein OmpN3 cũng là một Porin

Trong phạm vi đề tài này, chúng tôi chú ý nghiên cứu protein màng OmpN1

Hình 1.4 So sánh amino acid của OmpN1, OmpN2 và ompN3 [27]

‘*’: Những phần giống hệt nhau trong tất cả các trình tự

‘:’ thay thế bảo tồn

‘.’: thay thế bán bảo tồn

Hình 1.5 Cấu trúc mẫu tương đồng của OmpN1, OmpN2, OmpN3[27]

Hình 1.6 Hình ảnh của cấu trúc OmpN1 (xanh da trời), OmpN2 (vàng) và OmpN3

(xanh lam) xếp chồng lên nhau [27]

1.4 Tình hình nghiên cứu vaccine kháng khuẩn Edwardsiella ictaluri cho cá tra

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Trên thế giới cũng chưa có nghiên cứu cụ thể nào về vaccine cho cá tra kháng

vi khuẩn, nhưng đã có rất nhiều nghiên cứu về việc sử dụng vaccine phòng một số

bệnh cho các loại cá da trơn khác như cá Nheo Mỹ, cá Hồi …

Năm 1976, vaccine ngâm cho cá hồi để phòng bệnh vibriosis (do vi khuẩn

Vibrio anguillarum) và Yersiniosis (do vi khuẩn thuộc chi Yersinia gây ra) mới

được sản xuất thành công

Theo nghiên cứu của J.A Plumb và cộng sự năm 1995, việc sử dụng vaccine

E ictaluri đã được giết chết bằng formalin cấp cho cá theo con đường: ngâm 1 lần,

ngâm 2 lần, ngâm kết hợp với cho ăn lần lượt cho tỉ lệ sống như sau: 56,7%; 64,2%

và 68,8%, còn đối chứng có tỷ lệ sống sót là 43.% [31]

Bên cạnh đó, vaccine E ictaluri ngăn ngừa bệnh nhiễm trùng máu đường ruột

cho cá Nheo Mỹ của công ty dược phẩm Biomed (Mỹ) đã được sản xuất và đưa ra thị trường Tuy nhiên, vaccine vi khuẩn đã được giết chết cấp cho cá Nheo mỹ chống lại bệnh nhiễm trùng máu đường ruột không cho kết quả đáp ứng miễn dịch trong thời gian dài và hiệu quả không rõ ràng [33],[36],[39]

Vaccin phòng bệnh do vi khuẩn E ictaluri gây ra đã được nghiên cứu từ các

kháng nguyên màng dễ nhận biết nhất để phát triển Omp đã được thử nghiệm đáp ứng miễn dịch trên cá da trơn, với tỉ lệ sống sót là 65% Nghiên cứu cũng cho thấy một lượng nhỏ OmpN cũng có khả năng kháng bệnh trên cá [6]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Việc nghiên cứu và ứng dụng vaccine trong nuôi trồng thủy sản ở nước ta vẫn đang ở giai đoạn đầu Đã có một số công trình nghiên cứu và phát triển vaccine tại Việt Nam trong những năm gần đây, tuy nhiên vẫn chưa có sản phẩm thích hợp, đáp ứng được nhu cầu

Công trình nghiên cứu của giáo sư Peter Coloe, Trưởng khoa ngành Khoa học Ứng dụng tại Đại học RMIT và Phan Ngọc Thuỷ đang nghiên cứu tạo vaccine vi khuẩn sống làm tăng khả năng miễn dịch cho cá Đây là vaccine sống nhược độc không gây bệnh và có thể kích thích toàn bộ hệ thống miễn dịch [42]

Năm 2008, viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản II đã kết hợp với công ty thuốc Thú Y TW (Navetco) thực hiện đề tài cấp nhà nước “ Nghiên cứu vaccine phòng bệnh nhiễm khuẩn cho cá tra, cá basa, cá mú, cá giò, cá hồng mỹ nuôi công nghiệp”, trong đó đối tượng được quan tâm đặc biệt là cá Tra Sau 2 năm thực hiện, nghiên cứu sử dụng vaccine phòng bệnh gan thận mủ cho cá tra đã đạt đựơc một số kết quả khả quan và có triển vọng áp dụng vào thực tế [41]

Từ cuối năm 2009, những thử nghiệm bước đầu trong việc tiêm vaccine phòng bệnh gan thận mủ trên cá tra nuôi của Đại học Cần Thơ đã được tiến hành ở 3 điểm thí nghiệm thuộc Đồng Tháp, An Giang và Bến Tre Thử nghiệm đã đạt kết quả rất hứa hẹn và cho phép ứng dụng thực tiễn rộng rãi trong thời gian không xa Việc ứng dụng này sẽ giúp ngăn ngừa dịch bệnh, giảm tổn thất cho người nuôi, loại trừ việc

sử dụng thuốc kháng sinh trong nuôi cá và ngăn chặn nguy cơ ảnh hưởng xấu đến môi trường, bảo đảm sự phát triển bền vững của ngành sản xuất loài thủy sản chiến lược này của Việt Nam

Tại trung tâm công nghệ sinh học thành phố Hồ Chí Minh cũng đã có nhiều đề tài nghiên cứu vaccine phòng bệnh cho cá Tra Vào năm 2008, Thạc sĩ Nguyễn

Trọng Bình đã hoàn thành xong đề tài “tạo chủng Edwardsiella ictaluri đột biến

bằng phương pháp tái tổ hợp gen sử dụng làm vaccine ngừa bệnh mủ gan cho cá tra”

Vào năm 2010, đề tài “Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa cho protein màng

OmpN (outer membrane protein N) của Edwarsiella ictaluri trong hệ thống E coli” được thực hiện xong, và đã thu được chủng E coli mang plasmid pGEX4T1::

OmpN

Đến đầu năm 2011, Trung tâm Công nghệ Sinh Học Thành Phố Hồ Chí Minh

đã nghiên cứu thành công 5 chủng vaccine nhược độc và đang tiến hành nghiên cứu việc sửng dụng 2 protein màng OmpA, OmpN làm vaccine tiểu phần giúp kháng bệnh gan thận mủ cho cá tra Việt Nam Hiện các sản phẩm trên của Trung tâm CNSH TP HCM với những thử nghiệm bước đầu ở mức độ phòng thí nghiệm

Sản xuất vaccine từ protein Omp để phòng ngừa bệnh trên cá da trơn là một hướng phát triển mới Protein OmpN có vai trò trong việc tương tác với tế bào chủ, loại bỏ cơ chế bảo vệ của tế bào để gây bệnh Do đó, nghiên cứu protein OmpN để

sản xuất vaccine tiểu phần phòng ngừa bệnh gan thận mủ từ E ictaluri là rất cần

thiết và hữu ích

1.5 Sơ lược về các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp

Có rất nhiều hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp được sử dụng như: hệ thống

vi khuẩn, nấm men, tế bào động vật và côn trùng … Tuy nhiên, trong phạm vi đề tài

chúng tôi chỉ sử dụng 2 hệ thống thông dụng nhất là: hệ thống vi khuẩn E coli và

hệ thống nấm men Pichia pastoris

1.5.1 Hệ thống vi khuẩn E coli

Hình 1.7 Hình thái vi khuẩn Escherichia coli [45]

Escherichia coli là vi khuẩn Gram âm, hình que, thường được tìm thấy trong

đường ruột của các sinh vật máu nóng Hầu hết các chủng E coli là cần thiết cho

quá trình tiêu hóa thức ăn hoặc vô hại Tuy nhiên, một số dạng huyết thanh có thể

gây ra ngộ độc thực phẩm nghiêm trọng ở người

E coli là loài quan trọng trong các lĩnh vực công nghệ sinh học và vi sinh học

Nó được ưa chuộng trong quá trình sản xuất protein tái tổ hợp Thao tác kỹ thuật

trên E coli dễ dàng và dễ chuẩn hóa ở mọi phòng thí nghiệm Rất nhiều hệ thống promoter đã được thiết kế cho việc biểu hiện protein trên E coli, tuy nhiên chỉ có

một số ít được trở nên thương mại và phổ biến Một promoter hữu ích phải có khả năng biểu hiện mạnh, có một mức độ biểu hiện nền thấp và dễ dàng chuyển nạp

giữa các chủng E coli khác nhau Ngoài ra, quá trình cảm ứng biểu hiện cũng cần

đơn giản và rẻ tiền

Để tăng cường khả năng biểu hiện các protein eukaryote hoặc protein có chứa

codon hiếm ở E coli, chúng ta có thể chọn lựa những chủng E coli đã được cải

biến di truyền phù hợp với mục đích sử dụng Ngoài các vấn đề về vật chủ,

promoter thì số lượng bản sao plasmid cũng liên quan đến mức độ biểu hiện Protein với các cầu nối disulfide thường được tiết ra ngoài vùng ngoại vi tế bào chất thay vì trong tế bào chất Để định hướng tiết protein biểu hiện ra vùng ngoại vi bào chất, protein tái tổ hợp cần được gắn một đoạn peptide dẫn đường ở phía đầu N

Thông thường, các chủng E coli K12 hoặc B thường sử dụng cơ chế tiết protein

kiểu I và II với các signal peptide như: Lpp, LamB, LTB, MalE, OmpA, OmpC, OmpF, OmpT, PelB, PhoA, SpA và Tat [47]

Một trong những bất lợi trong việc sản xuất protein ở E coli nhằm mục đích

liệu pháp y học là thường lẫn với lipopolysaccharide, một loại nội độc tố ở người

Ngoài ra, hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp E coli còn có một nhược điểm khác

đó là không có khả năng sửa đổi hậu dịch mã cho các chuỗi polypeptide của các protein có cấu trúc phức tạp Vì vậy, mà một số loại vi khuẩn Gram dương như

Bacillus megaterium, B subtilis … được thay thế để làm vật chủ Ngoài ra, cũng có

các hệ thống biểu hiện protein tái tổ hợp khác như nấm men Saccharomyces

cerevisiae, Pichia pastoris … được dùng thay thế cho E coli tùy theo cấu trúc

protein và mục đích sử dụng [47]

1.5.2 Hệ thống nấm men Pichia pastoris

Hình 1.8 Hình thái nấm men Pichia pastoris [46]

Nấm men Pichia pastoris là một trong 4 chi thuộc nấm men methylotrophic (3 chi khác là Candida, Hansenula và Torulopsis), có khả năng chuyển hóa methanol

như một nguồn cacbon duy nhất của chúng [17]

Đầu những năm 1970, Pichia pastoris đã được sử dụng như một công cụ sinh

học chuyển hóa methanol thành những protein có chất lượng cao hơn, trộn chung vào thức ăn để tăng lượng đạm có trong thức ăn dùng cho vật nuôi Nhưng đến giữa những năm 1970, thì phương pháp này không thể cạnh tranh được về chi phí với đậu nành, và sự xuất hiện của ngành công nghệ sinh học lúc này đã thúc đẩy những

nổ lực để tìm ra những protein có chất lượng cao hơn từ Pichia Vào đầu những năm 1980, Pichia được giới khoa học sử dụng như một hệ thống vi sinh vật nhân

thật điển hình để sản xuất ra các loại protein tái tổ hợp với số lượng lớn [17]

Pichia pastoris là vi sinh vật nhân thật, có thể thao tác dễ dàng như E coli và

mang nhiều lợi thế của hệ thống biểu hiện nhân thật như sản xuất protein, tái gấp cuộn, sửa sai sau quá trình dịch mã, ngoài ra nó nhanh hơn, đơn giản hơn vả rẻ hơn

so với việc sử dụng các hệ thống khác như bacullovirus, mô của tế bào động vật Và

nó cũng đưa ra mức độ biểu hiện cao hơn có thể sinh trưởng mạnh trong điều kiện đơn giản và rẻ tiền Có thể phát triển tốt trong cả bình lắc và bình lên men, nên có thể sử dụng được ở cả quy mô nhỏ và quy mô công nghiệp

Bước đầu tiên trong quá trình chuyển hóa methanol thành protein là oxy hóa methanol thành formaldehyde bằng enzyme alcohol oxidase và tạo ra hydro peroxide Để tránh độc tính của hydrogen peroxide, quá trình chuyển hóa methanol diễn ra bên trong một tế bào chuyên biệt là peroxisome, cô lập hợp chất trung gian độc từ những phần còn lại của tế bào Alcohol oxidase được cô lập trong peroxisome và có chức năng như một octomer-homo, với mỗi tiểu đơn vị liên kết cộng hóa trị với nhân tố flavin adenine dinucleotide (FAD) Alcohol oxidase có ái lực yếu với O2 và P pastoris đền bù cho điều này bằng cách tạo ra một lượng lớn

các enzyme [17]

Có 2 gen trong P pastorsi mã hóa cho alcohol oxidase là AOX1 và AOX2,

nhưng gen AOX1 chịu trách nhiệm đối với phần lớn các hoạt động của alcohol oxidase trong tế bào Biểu hiện của gen AOX1 được cảm ứng và kiểm soát chặt chẽ bởi methanol đến mức cao, thường ≥ 30% tổng số protein hòa tan trong quá trình phát triển tế bào với methanol như là nguồn carbon Biểu hiện của gen AOX1 được

kiểm soát ở mức độ phiên mã Cơ chế kiểm soát AOX1 cũng tương tự như của gen

GAL1 của S cerevisiae, gồm 2 quá trình: ức chế/ giải phóng và cảm ứng Quá trình

ức chế của gen được gây ra bởi glucose [9][17]

Mất gen AOX1 sẽ làm giảm hoạt động của enzym alcohol oxidase của tế bào

do đó dẫn đến quá trình sử dụng methanol chậm, ức chế quá trình sinh trưởng của tế bào nuôi trong môi trường có methanol, kết quả là sẽ tạo kiểu hình MutS (methanol utilization slow) [17]

Trên các vector biểu hiện phổ biến được sử dụng riêng cho chủng P pastoris,

protein mong muốn được sản xuất như một sản phẩm dung hợp với tín hiệu tiết

α-mating factor (α-MF) từ Saccharomyces cerevisiae Tín hiệu này được sử dụng thường xuyên và thành công trong quá trình tiết của tế bào Điều này làm cho

protein được tiết vào môi trường nuôi cấy, thuận lời cho việc tinh sạch protein sau này [9],[17]

P pastoris còn có khả năng tạo các liên kết disulfide, gắn thêm các

hydratcarbon vào protein – điều này là cần thiết đối với những protein có cấu trúc

phức tạp Trong khi đó, E coli lại có thể tạo ra những protein tái gấp cuộn nhầm, và

làm protein trở nên bất hoạt hay không hòa tan được [17]

Thêm vào đó, P pastoris cũng được sử dụng như một mô hình để nghiên cứu

những vấn đề khó xác định trong sinh học tế bào bao gồm cả sự phát sinh phi sinh học và lắp ráp thể peroxisome, tái chế protein và các bào quan một cách tự động, tổ chức thể Golgi [9]

Với những ưu điểm có được, hệ thống P pastoris hiện đang được sử dụng

rộng rãi để sản xuất protein tái tổ hợp với số lượng lớn và đáp ứng được nhu cầu sử dụng của con người

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thiết bị, hóa chất và dụng cụ

2.1.1 Thiết bị và dụng cụ

- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5810R (Eppendorf)

- Máy ly tâm lạnh Centrifuge 5415R (Rppendorf) 13200 max

- Máy điện biến nạp (BTX ECM 399)

- Máy PCR (MasterCycler gradient) (Eppendorf)

- Bộ điện di DNA Power Pac200 (Biorad)

- Máy gel doc (Biorad)

- Tủ ủ lắc (Bioteck)

- Máy Sonicator (Misonix 3000)

- Cột His trap FF 5ml (GE Healthcare)

- Máy tinh sạch protein AKTA purifier (GE Healthcare)

- Máy đo quang phổ (Thermo)

- Máy ủ heat block techne (Dri-block DB-2D)

- Bộ điện di protein (Biorad)

- Vortex (Vortex-2genie, Jencons-PLS)

- Tủ ủ 370C (Memmert)

- Tủ ủ 280C (Sanyo)

- Bể điều nhiệt (Memmert)

- Tủ đông sâu -800C (Sanyo)

- Tủ lạnh -200C (Sanyo)

- Tủ 4oC (Alaska)

- Cân phân tích (Sartorius)

- Và các dụng cụ chuyên dùng khác

2.1.2 Hóa chất và môi trường

2.1.2.1 Hóa chất và môi trường dùng để biểu hiện OmpN trong hệ thống E coli

b Tinh sạch và tái gấp cuộn đồng thời trên cột sắc ký ái lực Niken

- Binding buffer (pH 7.4): 20mM sodium phosphate; 10% glycerol; 15mM glucose; 0.5M NaCl; 5mM imidazole; 6M Urea

- Đệm tái gấp cuộn (refolding buffer) (pH 7.4): 20mM sodium phosphate; 10% glycerol; 15mM glucose; 0.5M NaCl; 5mM imidazole; 0.4M arginine

- Đệm thôi giải (Elution buffer) (pH 7.4): 20mM sodium phosphate; 10% glycerol; 15mM glucose; 0.5M NaCl; 500mM imidazole; 0.2M arginine

c Tinh sạch trong điều kiện biến tính với Urea

- Binding buffer (pH 7.4): 20mM sodium phosphate; 10% glycerol; 15mM glucose; 0.5M NaCl; 5mM imidazole; 6M Urea

- Đệm thôi giải (Elution buffer) (pH 7.4): 20mM sodium phosphate; 10% glycerol; 15mM glucose; 0.5M NaCl; 500mM imidazole; 6M Urea

d Hóa chất sử dụng trong Western Blot

- PAGE electrophoresis buffer (1X): 100ml stock 10X + 10ml SDS 10%/1L

- Blotting buffer: 10% methanol, stock 1X

- TBS 10X: 24.2 g Tris HCl + 80g NaCl/1L

- TBS/T: 100 ml TBS 10X + 1ml Tween 20/1L

- Blocking buffer: 5% skim milk trong TBS/T

e Hóa chất sử dụng trong double sandwich ELISA

- PBS 1X, pH 7.2 (phosphate buffered saline): 137mM sodium chloride, 2.7mM potassium chloride, 10mM sodium monohydrogen phosphate, 1.8 mM potassium dihydrogen phosphate

- Coating buffer: 0.2 M sodium carbonate/bicarbonate, pH 9.4

- Wash buffer : PBS + 0.05% Tween 20

- Blocking buffer: 5% Bovine serum albumin (BSA) trong wash buffer

- Substrate buffer (pH 4.9) : 0.1M sodium acetate, 0.1 citric acid, TMB, 3%

- Môi trường YPD (Yeast extract peptone medium)

- Hóa chất dùng để tách chiết plasmid:

Bộ kit tách chiết plasmid của Qiagen (bộ kit Miniprep của hãng Qiagen)

- Hóa chất dùng để tinh sạch sản phẩm PCR:

Bộ kit tinh sạch sản phẩm PCR của Qiagen (PCR Purification kit của hãng Qiagen)

- Hóa chất dùng để tách chiết DNA từ gel agarose:

Bộ kit tách chiết DNA từ gel agarose của Qiagen (bộ kit Gel Extraction kit của hãng Qiagen)

- Hóa chất dùng cho phản ứng cắt giới hạn:

Các enzyme cắt giới hạn (EcoRI, NotI) được cung cấp bởi hãng Biolab (các

thành phần của phản ứng cắt được sử dụng theo hướng dẫn của nhà sản xuất)

- Hóa chất dùng cho phản ứng PCR

Các thành phần cần thiết cho phản ứng PCR được cung cấp bởi hãng

Fermentas: Taq DNA polymerase, dNTP, MgCl2, Taq buffer 10X Thành phần phản ứng PCR được liệt kê trong Bảng 2.1

- Hóa chất dùng cho điện di DNA

+ 50X TAE buffer (Tris-acetic-EDTA buffer)

TAE buffer 0,5X vừa đủ 100ml

- Thang DNA (Fermentas)

- Hóa chất dùng cho điện di SDS – PAGE

Thành phần gel SDS-PAGE và dung dịch điện di được liệt kê ở Bảng 2.2 và

Bảng 2.3

10% a.acetic 100 ml

- Thang protein (Fermentas)

- Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào E coli DH5α khả nạp bằng phương pháp

hóa biến nạp

Glycerol 10%

CaCl2 0,1M

- Hóa chất dùng cho chuẩn bị tế bào Pichia pastoris khả nạp bằng phương

pháp điện biến nạp

1M Sorbitol

2.1.3 Chủng vi sinh vật

2.1.3.1 Chủng vi khuẩn Escherichia coli:

- E.coli BL21(DE3) mang plasmid pET 28 chứa đoạn gen OmpN

- E coli BL21 mang plasmid pGEX-4T1 chứa đoạn gen OmpN

- E coli DH5α mang plasmid pPIC9K

2.1.3.2 Chủng nấm men Pichia pastoris

Pichia pastoris GS115

2.1.4 Các plasmid

2.1.5.1 Plasmid pET 28

Hình 2.1 Vector pET28 a+

Hình 2.2 Vùng MCS của vector pET28 a+

pET 28a+ là vector dùng để biểu hiện protein thuộc dòng vector pET do Novagen sản xuất Dòng vector pET có vùng T7 promotor sử dụng T7 RNA polymerase để phiên mã và mang trình tự khởi đầu là pBR22 Hệ thống pET là hệ thống tốt nhất được phát triển cho việc tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp

trong E.coli Các gen mục tiêu được tạo dòng trong plasmid pET chịu sự kiểm soát

của hệ thống phiên mã của thực khuẩn thể T7 và những tín hiệu dịch mã Sự biểu hiện được cảm ứng bằng cách kích hoạt T7 RNA polymerase trong tế bào ký chủ T7 RNA polymerase hoạt động mạnh và hiệu quả Khi được cảm ứng, hầu như tất

cả nguyên liệu trong tế bào đều được dùng để biểu hiện gen mục tiêu Sản phẩm mong muốn có thể chiếm đến hơn 50% lượng protein của tế bào ký chủ chỉ trong vài giờ sau cảm ứng

Protein được biểu hiện trong pET28 có mang đuôi dung hợp His-tag histidine) ở 2 đầu của protein Đuôi dung hợp này giúp cho quá trình tinh sạch có định hướng và dễ dàng hơn Protein dạng dung hợp với đuôi His tag được tinh sạch bằng phương pháp ái lực với cột sắc kí Ni2+

(6-Bảng 2.4 Đặc điểm của plasmid pET28 a+

Đặc điểm Vị trí trên plasmid

Điểm khởi đầu phiên mã T7 369

Trình tự mã hóa His tag 270-287

Trình tự mã hóa T7 tag 207-239

Vùng nhận biết của các enzyme

cắt giới hạn (BamH 1-Xho I) 158-203

Trình tự mã hóa His tag 140-157

pPIC9K là vector dùng để biểu hiện protein tái tổ hợp trong hệ thống P

pastoris Vector có vùng promoter AOX1, cho phép methanol cảm ứng để biểu hiện

protein ở mức độ cao Vertor mang trình tự mã hóa cho gen HIS4 - gen có ở dạng

hoang dại của P pastoris mã hóa cho enzyme histidinol dehydrogenase (~2.4 kb) –

là dấu hiệu lựa chọn để phân lập các chủng P pastoris tái tổ hợp Đặc biệt, trong

vertor có mang trình tự mã hóa cho gen kanamycine, gen này được sử dụng như

một công cụ để sàn lọc chủng P pastoris có khả năng biểu hiện protein cao Ngoài

ra, trên pPIC9K còn mang một chuỗi tín hiệu α-factor cho phép P pastoris tiết

protein mong muốn ra ngoài môi trường Vector pPIC9K thường được dùng trong

dòng Pichia GS115 và KM71

Bảng 2.5 Đặc điểm của pPIC9K

Đặc điểm Vị trí trên plasmid

Tín hiệu tiết α-factor 949-1218 Primer α-factor 1152-1172 MCS 1192-1241

Hình 2.4 Vùng MSC của vector pPIC9K

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thu nhận và khảo sát gây đáp ứng miễn dịch ở cá tra của OmpN tái tổ

hợp trên hệ thống E.coli

Sơ đồ 2.1 Tổng quát quá trình thu nhận protein OmpN tái tổ hợp trên hệ thống E

coli và khảo sát đáp ứng miễn dịch ở cá Tra đối với protein OmpN tái tổ hợp

2.2.1.1 Biểu hiện protein OmpN trong E coli

¾ Tăng sinh chủng E coli BL21 (DE3) mang plasmid pET 28 chứa đoạn gen

OmpN trong falcon 50ml có chứa 5ml môi trường LB bổ sung kana nồng độ 100 μg/ml qua đêm (16-18h) ở 370C, lắc 250 vòng/phút

Chủ g E.c l BL2 (DE3) mang

Hò tan thể vùi với Ur a

Tin sạ h pr tein the phương