LUẬN văn THẠC sĩ SINH học (FULL) phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân keratin từ lông vũ gia cầm và thiết kế vector tái tổ hợp biểu hiện keratinase trong TBVK e coli

Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị MinhDANH MỤC CÁC HÌNH VẼ 1.3 Ảnh dưới kính hiển vi các sợi bên trong tế bào keratin 6 3.1 Khả năng thủy phân lông vũ của 4 chủng chọn lọc Sau 4

Luận văn Thạc sĩ khoa học

LỜI CẢM ƠN

Em xin bày tỏ lòng biết ơn tri ân và sâu sắc tới TS Nguyễn Huy Hoàng

– Phó trưởng Phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CNViệt Nam, là người thầy_người anh đã tận tình hướng dẫn, dìu dắt, tạo mọiđiều kiện thuận lợi giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn cùng em trong suốt quátrình nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Trong quá trình nghiên cứu vừa qua, em đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ

bảo tận tình của các cán bộ Phòng Vi sinh vật đất, đặc biệt là Th.S Nguyễn Quỳnh Mai, CN Nguyễn Thu Hiền đã giúp đỡ em trong quá trình tiến hành

thí nghiệm

Em cũng xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo tham gia giảng dạy tạiKhoa Sinh-KTNN Đại Học Thái Nguyên- ĐH Sư Phạm Thái Nguyên- Khoađào tạo sau đại học đã truyền đạt cho em những kiến thức bổ ích trong suốt 2năm qua

Bên cạnh đó, em cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới BGH cùng toànthể cán bộ giáo viên trường THPT Điềm Thụy, Phòng ADT ứng dụng thuộcPhòng thí nghiệm trọng điểm CNG đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ emtrong quá trình học tập và nghiên cứu tại Trường và Viện

Cuối cùng, em xin gửi tới bố, mẹ và những người thân trong gia đìnhlòng biết ơn sâu sắc, cảm ơn những người bạn đã chia sẻ khó khăn thử tháchtrong cuộc sống và công việc để em có được kết quả này

Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn!

Thái Nguyên, tháng 09 năm

MỤC LỤC

Trang

MỞ ĐẦU 1

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Keratin 3

1.2 Keratinase 6

1.3 Đa dạng vi sinh vật có khả năng sinh keratinase cao 8

1.4 Tình hình nghiên cứu 12

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 12

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 13

1.5 Sản xuất và ứng dụng quá trình thuỷ phân keratin trong lông vũ 14

1.5.1 Tăng hàm lượng chất dinh dưỡng trong thức ăn gia súc 17

1.5.2 Tạo phân bón 17

1.5.3 Tạo enzyme trong các ngành công nghiệp 18

1.5.4 Cải tạo đất 18

1.5.6 Tạo hợp chất màu 19

1.5.7 Ứng dụng trong công nghiệp dược và sản xuất thực phẩm chức năng

19 PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 20

2.1 Nguyên liệu 20

2.1.1 Nguyên liệu 20

2.1.2 Hoá chất 20

2.1.3 Thiết bị 20

i

2.1.4 Môi trường nuôi cấy 20

2.1.4.1 Môi trường Broth Peptone 20

2.1.4.2 Môi trường I 20

2.1.4.3 Môi trường II 21

2.1.4.4 Môi trường III 21

2.1.4.5 Môi trường để phân lập chủng Chryseobacterium 21

2.1.4.6 Môi trường nuôi lắc lông vũ 21

2.1.4.7 Môi trường MPA 21

2.2 Phương pháp nghiên cứu 22

2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao 22

2.2.1.1 Lấy mẫu và đo pH đất 22

2.2.1.2 Phân lập chủng vi khuẩn Chryseobacterium 22

2.2.1.3 Phân lập chủng vi khuẩn Vibrio 23

2.2.1.4 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus 23

2.2.2 Xác định khả năng thuỷ phân lông vũ 23

2.2.2.1 Nuôi giống cấp 1 vào môi trường MPA 23

2.2.2.2 Xác định mật độ tế bào 25

2.2.3 Lựa chọn môi trường thích hợp cho các chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao 25

2.2.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH lên khả năng sinh trưởng của vi khuẩn thủy phân lông vũ 26

2.2.5 Xác định đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn 26

2.2.6 Xác định gram âm và gram dương của vi khuẩn 26

2.2.6.1 Phương pháp Hucker cải tiến 26

2.2.6.2 Xác định bằng cách kiểm tra độ kết dính 27

2.2.7 Phương pháp phân loại vi khuẩn theo đặc tính sinh hoá 28

2.2.8 Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu hiện pET32a 30

2.2.8.1 Tách chiết DNA tổng số của chủng vi khuẩn 30

2.2.8.2 Nhân bản đoạn DNA bằng PCR 32

ii

2.2.9 Phân tích hoạt tính keratinase ngoại bào 38

PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41

3.1 Kết quả lấy mẫu ở các địa điểm 41

3.2 Giá trị pH của các mẫu đất 41

3.3 Phân lập và tuyển chọn các chủng vi sinh vật có khả thủy phân keratin .42 3.4 Lựa chọn môi trường thích hợp của các chủng được chọn lọc 44

3.5 Tối ưu nhiệt độ của các chủng vi khuẩn chọn lọc 47

3.6 Đặc điểm hình thái nhóm vi khuẩn thuỷ phân lông vũ 48

3.7 Kết quả xác định gram của các chủng vi khuẩn 49

3.8 Phân loại các chủng phân lập theo phương pháp sinh hoá 50

3.8.1 Phân loại theo kit API 50CHB của chủng vi khuẩn Đ.GT.2.2 50

3.8.2 Phân loại theo kit API 20NE của chủng vi khuẩn L.SC.1.2 51

3.9 Phân loại theo kiểu gene 52

3.9.1 Tách DNA tổng số 52

3.9.2 Nhân đoạn gene mã hóa 16S rARN bằng kỹ thuật PCR 53

3.10 Chọn dòng gene keratinase vào vector biểu hiện pET32a 55

3.10.1 Nhân đoạn gene keratinase bằng kỹ thuật PCR 55

3.10.2 Gắn sản phẩm PCR đã thôi gel tinh sạch vào vector tách dòng pET32a 56

3.10.3 Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào khả biến DH10B 58

3.10.4 Tách DNA plasmid tái tổ hợp 59

3.11 Đánh giá hoạt tính ezyme dịch thô của chủng chọn lọc 60

3.11.1 Định lượng Protein bằng phương pháp Bradford 60

3.11.2 Thử hoạt tính enzyme bằng azokeratin 62

PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 64

4.1 Kết luận 64

4.2 Kiến nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 65

BẢNG CHỮ VIẾT TẮT

PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp)

DANH MỤC CÁC BẢNG

1.1 Sự đa dạng của vi sinh vật có khả năng sinh

keratinase và các đặc tính hóa sinh của keratinase

9

3.3 Tỷ lệ thủy phân lông vũ của các chủng tuyển chọn 43 3.4 Mật độ tế bào và khả năng thủy phân 1 gam lông vũ

ở các nhiệt độ khác nhau(Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)

47

3.6 Kết quả phép thử sinh hóa theo kit API 50 CHB của

Luận văn Thạc sĩ khoa học HVCH: Nguyễn Thị Minh

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

1.3 Ảnh dưới kính hiển vi các sợi bên trong tế bào

keratin

6

3.1 Khả năng thủy phân lông vũ của 4 chủng chọn lọc

(Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)

44

3.2 Khả năng sinh trưởng và thủy phân lông vũ của

các chủng vi khuẩn trên các môi trường khác nhau(Sau 4 ngày nuôi cấy lắc)

46

3.3 Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi

khuẩn trên các môi trường khác nhau (Sau 4 ngàynuôi cấy lắc)

46

3.4 Khả năng thủy phân lông vũ của các chủng vi

khuẩn các khung nhiệt độ khác nhau (Sau 4 ngàynuôi cấy lắc)

vi

Luận văn Thạc sĩ khoa học

vii

3.11 Sản phẩm tinh sạch gene ker và vector

pET32asau khi xử lý bằng 2 enzyme cắt

57

3.13 Sản phẩm biến nạp của 2 chủng vi khuẩn vào tế

bào khả biến E.coli DH10B

58

3.14 Ảnh điện di sản phẩm tách DNA plasmid tái tổ

hợp của các chủng sau biến nạp

59

3.15 Sản phẩm phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp

bằng 2 enzyme cắt XhoI và BamHI

60

MỞ ĐẦU

Lông vũ có lượng protein keratin thô rất cao (90 - 95%), nhưng phần lớnprotein trong lông vũ không hòa tan trong nước Mặc dù rất khó bị phân hủy,nhưng các chất thải keratin có thể bị phân hủy bởi các chủng vi khuẩn, xạkhuẩn và nấm có khả năng sinh tổng hợp keratinase Vi sinh vật sinh tổng hợpkeratinase đã được phân lập từ nhiều vị trí địa lý khác nhau, từ đất Nam cựcđến suối nước nóng, kể cả ở điều kiện môi trường hiếu khí và kỵ khí Ðếnnay, các keratinase được nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn như

Bacillus, Chryseobacterium, Pseudomonas,… Vì vậy, việc khai thác đa dạng

vi sinh vật sẽ cung cấp sản phẩm keratinase phù hợp với từng ứng dụng cụthể

Keratinase phá vỡ cầu nối disunfua của keratin làm đứt liên kết của vòngxoắn Sau khi thủy phân hợp chất keratin trong lông vũ đã được phân huỷ vàchia nhỏ thành các axit amin và peptit ngắn Như vậy, gia súc, gia cầm có thể

sử dụng lông vũ sau khi bị thủy phân làm thức ăn Chính vì vậy, keratinase đã

và đang được nghiên cứu ứng dụng trong các quá trình thủy phân lông vũ đểtạo thành các hợp chất có thể bổ sung vào thức ăn gia súc, gia cầm hoặc làmphân bón hữu cơ,…

Ở Việt Nam hiện nay ngành công nghiệp tái tạo nguồn phế thải làm phânbón và thức ăn cho gia súc vẫn còn non trẻ và đang trong giai đoạn tìm nguồnnguyên liệu cũng như định hướng để phát triển Phương pháp được ứng dụngphổ biến hiện nay để xử lý phế thải lông vũ là sử dụng kiềm hoặc acid Tuynhiên, phương pháp này còn nhiều hạn chế (giá thành cao, hiệu suất thấp…),

do vậy việc ứng dụng enzyme từ vi khuẩn để xử lý phế thải có nhiều ưu điểmhơn như tạo sản phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, giá thành thấp, mặt khác cònrất thân thiện với môi trường Vì vậy, việc nghiên cứu enzyme từ vi khuẩn đểthủy phân lông vũ vừa có ý nghĩa khoa học, vừa có ý nghĩa thực tiễn

Với những ưu điểm trên, để phục vụ cho việc nghiên cứu ứng dụng vi sinh vậtđất và trên lông vũ có khả năng phân huỷ lông vũ, chúng tôi đã tiến hành

nghiên cứu đề tài: Tên đề tài “Phân lập và tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả năng thủy phân keratin từ lông vũ gia cầm và thiết kế vector tái tổ

hợp biểu hiện keratinase trong tế bào vi khuẩn E.Coli ”.

 Mục tiêu của đề tài:

- Tuyển chọn được bộ chủng vi sinh vật đất thuộc các nhóm vi sinh vật như

Bacillus, Chryseobacterium và Vibrio có hoạt tính thủy phân với hiệu suất 70

– 80% lượng keratin lông vũ trong môi trường nuôi cấy

- Thiết kế được vector tái tổ hợp biểu hiện keratinase ở E.Coli.

 Ý nghĩa của đề tài:

Ứng dụng xử lý lông vũ trong sản xuất phân bón

Thay thế hoặc tăng hàm lượng protein trong thức ăn gia súc gia cầm

Ngoài ra, việc nghiên cứu của đề tài còn mang lại nhiều ý nghĩa thiết thựctrong đời sống như: Cải tạo đất trồng, giảm thiểu ô nhiễm môi trường và tạo

ra nguồn keratinnase vô cùng phong phú

 Nội dung:

- Thu thập mẫu đất chăn nuôi gia cầm hoặc nơi giết mổ gia cầm

- Tuyển chọn được các chủng Bacillus, Pseudomonas, Chryseobacterium trên

môi trường nuôi cấy

- Nhận dạng về hình thái và đặc điểm hóa sinh của các chủng thu được có khảnăng phân giải mạnh keratin

- Thiết kế và nhân đoạn gen keratinase từ chủng có hoạt tính mạnh

- Chọn dòng keratinase trong vector biểu hiện pET32a để biểu hiện trong tế

bào vi khuẩn E coli.

- Phân tích hoạt tính enzyme keratinase (enzyme ngoại bào).

1.1 Keratin

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Keratin là một hợp chất sừng rất khó phân huỷ, là thành phần chủ yếu củalớp biểu bì, tóc, lông, móng chân móng tay và men răng Keratin là một phứcchất hóa học có chứa một lượng lớn sulfua, các acid amin, đặc biệt là cystein.Ngoài ra còn có tyrosin, histidin, lysin, arginin, các muối: carbonat canxi,phosphat canxi

Hình 1.1: Một số hình dạng lông vũ

Nhìn hình dạng bên ngoài của lông vũ có thể thấy được lông vũ bao gồm haithành phần chính đó là các sợi lông và cuống lông (Hình 1.1) Trong lông vũhàm lượng protein keratin chiếm tỉ lệ rất cao chiếm từ 90 – 95% Từ các sợikeratin có chứa hàm lượng lưu huỳnh lớn đã được ép thành các bó keratin lớnhơn Trên các sợi lông, chất keratin rất mềm dẻo và dễ dàng bị phân cắt thànhnhững sợi nhỏ và tan hết vào môi trường Tuy nhiên, trên cuống lông thìkeratin lại có hàm lượng lưu huỳnh cao, tạo ra những hợp chất cứng, thô nênrất khó có thể thuỷ phân được Khi cấy các vi khuẩn để thuỷ phân lông vũ thìtất cả các cuống lông nhỏ đều được thuỷ phân hoàn toàn nhưng các cuốnglông to thì mới chỉ được phân cắt thành những đoạn và những sợi rất nhỏ

trong khoảng thời gian hơn từ 7- 10 ngày Như vậy, hàm lượng hợp chấtkeratin trong lông vũ là nguyên nhân gây nên mùi khét rất lớn khi đốt lông vũ[13,14,15].

Keratin là thành phần chính của biểu bì và ở tóc, lông vũ, sừng, móng,len Dựa trên xác định cấu trúc cơ bản bậc hai, keratin được phân thành α và β(α-helix của tóc và len, β-sheets của lông vũ) [33] Các sợi keratin ở cả haidạng α-helix và β-sheets được xoắn song song với nhau để đảm bảo độ bền ổnđịnh của sợi [34,35] Các keratin được chia thành keratin cứng và keratinmềm tùy thuộc vào lượng sulfur Keratin cứng ở lông vũ, tóc, móng guốc,móng có nhiều cầu nối disulfur và không thể kéo dài ra Trong khi đó, keratinmềm như da, chai ở da có ít cầu nối disulfur và mềm dẻo hơn Các enzymeđược biết đến như trypsin, pepsin và papain có khả năng cắt các cầu nối trongkeratin để phân hủy [36] Mặc dù rất khó phân hủy, nhưng các chất thảikeratin có thể bị phân hủy bởi vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm do chúng tạo ra cácprotease – keratinase

Thủy phân keratin từ vi sinh vật đã được nghiên cứu từ năm 1959 [37],tuy nhiên cơ chế thủy phân từ vi khuẩn vẫn chưa được nghiên cứu nhiều,nhưng việc giảm cầu nối disulfur có thể có ảnh hưởng đáng kể đến sự phânhủy keratin [38,39] Keratinase [EC 3.4.21/24/99.11] là serine hay là cácmetalloprotease có khả năng phân hủy cấu trúc protein keratin khó tan Cáckeratinase tham gia thủy phân các chất thải keratin từ lông vũ trong côngnghiệp chăn nuôi gia cầm đã tạo ra các sản phẩm có giá trị như thức ăn chănnuôi, phân bón, các polymer và các amino acid hiếm như serine, cysteine vàproline

Trong móng chân tay và men răng thì hàm lượng keratin tồn tại ở dạngcứng nên rất khó phân huỷ Ngoài ra, keratin còn tồn tại trong sừng và móngcủa các loài động vật có vú.Còn ở 1 số động vật chân đốt, lớp giáp xác thường

có các bộ phận giống như chiếc áo giáp hoặc giống bộ xương ngoài làm

Hình1.2: Cấu tạo phân tử keratin

Theo cấu tạo của keratin có 2 loại chính sau:

Anpha- keratin (α-keratin)α-keratin): Trong tóc (kể cả lông cừu), sừng, móng tay, móng

chân, móng và móng guốc của động vật có vú Cấu tạo là các sợi đơn proteinliên kết với nhau bằng liên kết hydro

Beta keratin (α-keratin)β-keratin): Trong móng tay và móng vuốt của loài bò sát, họ vỏ

chelonians (ba ba, rùa, …), và trong lông, mỏ, móng vuốt của chim và nhím,

được hình thành chủ yếu trong các tấm β Cấu trúc β cứng, chắc hơn cấu trúc

α do các tấm β được nối với nhau bằng các cầu nối disulfide.

Keratin được tạo thành bởi keratinocytes, các tế bào sống tạo nên mộtphần lớn của da, tóc, móng tay móng chân, và keratin khác có chứa trong các

bộ phận của cơ thể Các tế bào từ từ đẩy lên trên bề mặt, cuối cùng chết và tạothành một lớp bảo vệ của các tế bào Hàng ngàn các tế bào này có thể đượcsản sinh ra trong các điều kiện khác nhau, chẳng hạn như bệnh vẩy nến Do đógây hư hại cho các lớp bên ngoài của keratin, cho nên có thể làm, tóc, móngtay móng chân hay gãy và da bong ra từng mảng (Hình 1.3)

Hình 1.3: Ảnh dưới kính hiển vi các sợi bên trong tế bào keratin 1.2 Keratinase

Keratinase là một enzyme thuộc nhóm protease Đây là enzyme có khảnăng thuỷ phân cấu trúc phức tạp của keratin lông Keratinase được tạo ra từnhiều nguồn vi sinh vật khác nhau thuộc nhóm vi sinh vật cổ, nhóm vi sinhvật nhân thật và nấm Keratinase thuộc nhóm enzyme protease, có khả năngthủy phân protein keratin không tan Các enzyme này được tạo ra trong sự quátrình phân hủy các cơ chất như keratin trong tóc, lông, sừng, … Các đặc tính

về hóa sinh và lý sinh của keratinase là rất đa dạng Phần lớn keratinase hoạtđộng ở điều kiện tối ưu là pH trung tính tới kiềm và nhiệt độ từ 300C đến

600C Kerainase có tiềm năng ứng dụng lớn trong nông nghiệp, dược học vàcác lĩnh vực y sinh học Ngoài ra, sử dụng keratinase trong sinh khối sinh học

có thể giải quyết một phần nào đó về chuyển đổi năng lượng và tái sử dụngcác nhiên liệu.

Gần đây, một nghiên cứu đã công nhận và định nghĩa keratinase làprotease serine do hình dạng cấu tạo có tới 97% giống với protease kiềm và

nó cũng bị ức chế bởi các thuốc ức chế giống như ức chế protease serine [18].Khối lượng phân tử tùy theo từng loại sinh vật có thể dao động từ 18 đến 35kDa đối với protease serine có khối lượng phân tử nhỏ và lớn hơn 90 kDal đốivới protease serine có khối lượng lớn

Hình 1.4: Cấu tạo phân tử của enzym Keratinase

Tính chất:

 Keratinase thuỷ phân thành các axit amin:

Với tính chất thuỷ phân của keratinase, nó phá vỡ cầu nối disunfua củakeratin làm đứt liên kết của vòng xoắn Như vậy, sau khi thuỷ phân hợp chấtkeratin trong lông vũ đã được phân huỷ và chia nhỏ thành các axit amin vàpeptit ngắn Khi đó protein keratin mang đầy đủ các tính chất của protein tannhư là: Tính hoà tan, kết tủa, điện ly lưỡng tính, thuỷ phân và phản ứng màuđặc trưng

Keratinase chủ yếu tấn công vào các liên kết disulfide (S-S), làm suy giảmcác protein dạng sợi fibrin, elastin, collagen và sợi protein khác

 pH và nhiệt độ:

Keratinase chịu được ở nhiệt độ từ 30oC - 80oC nhưng nhiệt độ tối ưu là:

50oC và enzyme này được ổn định khi bảo quản ở -20oC [21] Keratinase bềnvững trong khoảng pH từ 6,0 - 9,0 nhưng pH tối ưu là 7,5 [21]

 Chất kìm hãm:

Khi bổ sung đường sucrose và lactose làm ức chế sự tổng hợp keratinase[21] Chất nền có nồng độ và lượng cơ chất quá cao cũng sẽ làm ức chế sựtổng hợp keratinase [21] Khi bổ sung các chất có chứa các ion kim loại nặnghoá trị hai như: Cu2+, Ag2+, Hg2+ và Pb2+ thì cũng làm ức chế sự hoạt động củakeratinase [22] Một số hoá chất khác cũng ức chế phản ứng enzymekeratinase như: EDTA,…[21]

 Chất hoạt hoá:

Theo nhiều nghiên cứu trên thế giới thì khi bổ sung các chất có chứa cácion kim loại hoá trị hai như: Ca2+, Mg2+, Mn2+ thì kích thích sự hoạt động củakeratinase [22]

1.3 Đa dạng vi sinh vật có khả năng sinh keratinase cao

Các keratinase là một dạng protease rất phổ biến trong thế giới vi sinh vật

và được phân lập từ nhiều vị trí địa lý khác nhau cả ở điều kiện môi trườnghiếu khí và kỵ khí Vì vậy, vi khuẩn tổng hợp keratinase có sự đa dạng rất lớn

về đặc tính hóa sinh và lý sinh Các đặc tính của một số vi khuẩn tổng hợpkeratinase được tóm tắt trong bảng 1.1

Bảng 1.1: Sự đa dạng vi sinh vật có khả năng sinh keratinase và các đặc tính hóa sinh của keratianse

Ðến nay, keratinase được nghiên cứu chủ yếu có nguồn gốc từ vi khuẩn, trong

đó Bacillus được nghiên cứu nhiều nhất Nhiều chủng B licheniformis và B subtilis được mô tả có khả nãng thủy phân keratin [44, 63-66], những loài khác như B pumilus và B cereus cũng có khả nãng tổng hợp keratinase [40,

43, 67, 68] Các loài khác nhau của cùng một chi (chẳng hạn, Bacillus) có thể

tạo ra các keratinase khác nhau (Bảng 1.1)

Sinh tổng hợp keratinase cũng được nghiên cứu ở xạ khuẩn, chủ yếu là từ

các chi Streptomyces Nhóm vi khuẩn này được phân lập từ các vùng đất khác

nhau, có khả năng thủy phân một loạt các chất chứa keratin như tóc, len và

lông Gushterova và cộng sự [69] đã phân lập hai chủng xạ khuẩn chịu nhiệt

có hoạt tính thủy phân keratin cao là Streptomyces flavis 2BG và Microbispora aerata IMBAS-11A Các loài chịu nhiệt như Streptomyces gulbarguensis [60], Streptomyces thermoviolaceus [61] và Streptomyces thermonitrificans [70] cũng đã được phân lập từ đất Ngoài những chủng ưa nhiệt, một số Streptomyces kém bền nhiệt đã được phân lập như Streptomyces pactum DSM 40.530 [59], Streptomyces graminofaciens [39] và Streptomyces albidoflavus K1-02 [58].

Ngoài các chủng thuộc Bacillus sp và xạ khuẩn, một số chủng vi khuẩn có

khả năng thủy phân keratin diễn ra ở nhiệt độ cao, pH và kiềm nhiệt hóa đã

được công bố như Fervidobacterium pennavorans [50], Fervidobacterium islandicum [49], Meiothermus ruber H328 [72], Clostridium sporogenes [47]

và các chủng Thermoanaerobacter sp [62] được phân lập từ các môi trường

khắc nghiệt như suối nước nóng, lỗ thông hơi nhiệt, và khu vực núi lửa Một

số vi sinh vật hoạt động ở môi trường kiềm như Nesternkonia sp [73] và Nocardiopsis sp TOA-1 [54] cũng có khả nãng thuỷ phân keratin.

Đặc tính hóa sinh của keratinase

Các đặc tính của enzyme được tạo ra từ vi khuẩn là rất đa dạng, tùy thuộcvào loại vi sinh vật sản xuất ra keratinase Các enzyme này chủ yếu là enzymengoại bào được tiết ra từ vi sinh vật Một số đặc điểm sinh hóa của keratinase

đã được trình bày ở bảng 1.1 Phần lớn các keratinase được tiết ra từ vi khuẩn

có pH là kiềm hoặc trung tính, pH tối ưu từ 7,5-9,0 Tuy nhiên, một sốkeratinase khác được tối ưu hoạt động ngoài phạm vi này, pH hoạt động ởkiềm hóa [74] hoặc pH là axít [75,76] Một số keratinase ổn định trên một

khoảng pH rộng Ví dụ như keratinase của chủng Nocardiopsis TOA-1, được

ổn định trong khoảng pH từ 1,5-12, trong 24 h ở 30°C [54]

Điều kiện hoạt động tối ưu của keratinase rất thay đổi, thường phụ thuộc vào

nơi và nguồn gốc phân lập (bảng 1.1) Keratinase từ chủng chịu nhiệt F pennavorans có nhiệt độ tối ưu ở 80°C [50] trong khi keratinase từ chủng nhiệt độ thường Stenotrophomonas maltophila DHHJ có hoạt động tối ưu ở 40°C [55] Nam và công sự [49] đã chứng minh được F islandicum AW-1 có

nhiệt độ tối ưu ở 100°C Trọng lượng phân tử keratinase đã được xác định

Mặc dù trọng lượng phân tử các enzyme từ 18 kDa (S albidoflavus [58]) đến

240 kDa (K rosea [51]) nhưng phần lớn keratinase có trọng lượng phân tử

thấp hơn 50 kDa (bảng 1.1) Phần lớn các keratinase là các đơn enzyme, tuynhiên phân lớp đa enzyme cũng đã được ghi nhận [57] Trọng lượng phân tửcao thường kết hợp với các keratinase với các đặc tính của metalloproteasehoặc chúng có nguồn gốc từ chịu nhiệt (bảng 1.1)

Ảnh hưởng của các ion kim loại và các bất hoạt hoạt tính keratinase đã vàđang được nghiên cứu Gần đây các nghiên cứu của Gupta và Ramnani [77]cho thấy các ion kim loại hóa trị 2 như Ca2+, Mg2+ và Mn2+ có xu hướng kíchthích hoạt tính enzyme keratinase Ảnh hưởng này có thể liên quan tới việcduy trì hoạt tính của enzyme và tạo ra sự ổn định phức hợp giữa cơ chất vàenzyme Ngoài ra các ion kim loại có thể bảo vệ cho enzyme chống lại biếntính về nhiệt độ [53, 58] Ngược lại, sự chuyển trạng thái và các kim loại nặngkhác như Cu2+, Ag+, Hg2+ và Pb2+ là nguyên nhân của sự bất hoạt các enzymekeratinase Các keratinase thường ổn định trong sự hiện diện của dung môihữu cơ như DMSO, Triton X-100

1.4 Tình hình nghiên cứu

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Việt Nam là nước sản xuất gia cầm chủ yếu ở quy mô nhỏ tiêu thụ ngaytrên thị trường địa phương hoặc các tỉnh lân cận, nhưng đến nay đã có nhiều

hộ gia đình bắt đầu sản xuất gia cầm ở quy mô công nghiệp như các trại gà

lạnh khép kín theo dây truyền sản xuất của Cộng Hoà Liên Bang Đức Nhiềucông ty cũng bắt đầu tập trung vào đầu tư chế biến sản xuất gia cầm như công

ty CP dự định xây dựng thêm 2 nhà máy chế biến gia cầm mới ở ngoại ô HàNội với công suất 50.000 con gia cầm/tuần và một nhà máy sẽ được đặt tạiĐồng Nai Theo tổng cục thống kê, năm 2003 tổng gia cầm của Việt Nam lêntới 250 triệu con và cho ra sản lượng thịt gia cầm đạt tới 371 ngàn tấn [27]

Do lông tạo nên 5% trọng lượng cơ thể gia cầm do đó lượng lông vũ từ giacầm có thể là 18,6 ngàn tấn năm, đây có thể là nguồn nguyên liệu lớn làmphân bón hữu cơ và thức ăn gia súc cho ngành nông nghiệp Năm 1993, VănThị Hạnh cùng cộng sự đã nghiên cứu tạo protein hòa tan từ lông vũ phế thảibằng phương pháp kiềm để thủy phân [3] Hiện nay, tại Phòng Vi sinh vật đất,Viện Công nghệ Sinh học đã và đang tiếp tục phân lập các chủng vi khuẩn cóthể thuỷ phân lông vũ Sau khi tìm ra những điều kiện tối ưu cho các chủng cókhả năng thuỷ phân tốt sẽ tiến hành định tên chủng bằng các phương pháp hoásinh (API 20 NE và API 50 CHB) cũng như định loại bằng phương pháp sinhhọc phân tử Sau khi phân lập và tuyển chọn các chủng tốt, nhóm nghiên cứuđang tìm ra những ứng dụng hữu ích và thiết thực nhất đối với vật nuôi và câytrồng

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Hiện nay trên thế giới, các kết quả nghiên cứu về keratinase cho thấynhiều nhóm vi sinh vật khác nhau có khả năng thủy phân lông vũ, chẳng hạn

các chủng thuộc các nhóm Bacillus, Chryseobacterium, Actinomycetes, Vibrio

và nấm [18, 19, 20] Sử dụng vi sinh vật và keratinase nhằm nâng cao chấtlượng sản phẩm dinh dưỡng từ bột lông vũ đã và đang được quan tâm Bột

lông vũ thủy phân bằng Bacillus licheniformis có bổ sung amino acid làm

thức ăn cho gà đã tạo ra sự tăng trưởng của gà tương tự như gà sử dụng nguồn

thức ăn ở đậu tương [22] Sử dụng keratinase thô từ chủng Bacillus licheniformis làm tăng khả năng phân giải nguồn lông vũ thô cũng như là bột

lông vũ Enzyme thủy phân này sẽ làm tăng khả năng tiêu hóa lông vũ tới82% và có thể thay thế tới 7% protein ăn cho gà [24].

Mỗi năm trên thế giới có 24 tỷ gà bị chết tạo ra khoảng 9 tỉ tấn lông giacầm Thời gian cần thiết để một chiếc lông thực hiện quá trình phân hủy tựnhiên của mình là 5-7 năm, dẫn đến hậu quả ô nhiễm môi trường

Một số nghiên cứu đã chứng minh được rằng vi sinh vật thủy phân keratin

có thể tồn tại trong lông, móng, guốc Chính sự xuất hiện của vi sinh vật này

đã làm tăng khả năng xử lý chất thải, giảm thiểu gây ô nhiễm môi trường Đặcbiệt keratinase của chủng vi sinh vật là thành phần quan trọng trong côngnghệ sinh học liên quan tới nguồn chất thải công nghiệp lông vũ và trong chănnuôi [24]

Đối với phân bón, keratin sau khi bị thủy phân thành các amino acid, cácpeptide hòa tan sẽ cung cấp dinh dinh dưỡng cho cây trồng Các dạng phânhữu cơ này có thể được bón qua lá với một lượng nhỏ nhưng có tác dụng làmtăng quá trình phát triển của cây, giảm được lượng phân bón hoá học vào đất

và có khả năng tăng chất lượng cho sản phẩm Nhiều nghiên cứu trên thế giớicũng đã chỉ ra rằng phun qua lá tăng hiệu quả hơn bón qua gốc từ 8-10 lần

1.5 Sản xuất và ứng dụng quá trình thuỷ phân keratin trong lông vũ

Keratinase đã được sản xuất và bán trên thị trường với nhiều mục đíchkhác nhau Sinh tổng hợp keratinase thường được cảm ứng bởi keratin Do đó,

cơ chất keratin (lông gà, bột lông vũ, tóc) thường được bổ sung vào môitrường nuôi cấy Tuy nhiên, việc bổ sung cơ chất keratin không phải nhất thiếtcho sản xuất keratinase Các chất không phải là keratin, như bột đậu nành[78], đậu nành [79], sữa tách kem [54], bột tôm [48], gelatin [52], casein và

phomat lỏng [80], đã được chứng minh là những chất cảm ứng của sinh tổnghợp keratinase.

Bổ sung vào môi trường keratin với các nguồn carbon hoặc các nguồnnitơ khác nhau có thể làm tăng sinh tổng hợp keratinase Ví dụ, bổ sungglucose, sucrose, tinh bột, mật đường, và thêm các nguồn nitơ, chẳng hạn nhưurê, dung dịch peptone, tryptone, men chiết xuất, amoni clorua và nitrat natri

đã nâng cao sản lượng enzyme [39, 47, 51, 81] Tuy nhiên ở một số vi sinh vậtnhất định lại giảm sản xuất enzyme do bị ức chế quá trình trao đổi chất[82,83] Do đó, hiệu quả của sinh tổng hợp keratinase có sự biến động lớn,phụ thuộc vào chủng vi sinh vật, chất cảm ứng và nồng độ nguồn carbon vànitơ Vì vậy, thành phần môi trường phải được xác định theo từng trường hợp

cụ thể Bên cạnh thành phần môi trường nuôi cấy, các điều kiện khác nhưnhiệt độ, pH, và sục khí cũng là những yếu tố quan trọng để có được sảnlượng keratinase cao

Bài tiết keratinase thường đạt được cao nhất trong pha log hoặc pha sinh

trưởng cân bằng của tế bào Tuy nhiên, chủng Serratia sp HPC 1383 có hoạt

tính cao nhất trong giai đoạn sinh trýởng (24 h đầu tiên) trên môi trường bộtlông vũ, trong khi nhiên liệu sinh học tối đa được đạt được ở 96 h [84]

Ðể tăng cường khả năng sinh tổng hợp keratinase và thủy phân keratin các kỹthuật sinh học phân tử đã được sử dụng trong nghiên cứu phát triển các chủngđột biến và tái tổ hợp Bằng kỹ thuật chọn dòng và biểu hiện gen tái tổ hợp,sinh tổng hợp keratinase tái tổ hợp trong tế bào vi sinh vật không gây hại vớithông tin di truyền từ vi sinh vật có nguồn bệnh tới sức khỏe cũng đã được

nghiên cứu Gen kerA, mã hóa keratinse của chủng B licheniformis, được

biểu hiện cùng với lông vũ (lông vũ là nguồn cacbon và nitơ) trong môitrường nuôi cấy dẫn đến sự biểu hiện mạnh của protease thủy phân keratin.Ngoài ra, tăng năng suất keratinase đã được nghiên cứu bằng cách tích hợp

nhiễm sắc thể với nhiều bản sao của gen kerA ở B licheniformis và B subtilis

[85]

Phần lớn các báo cáo nghiên cứu sản xuất keratinase đều ở dịch lỏng, gầnđây sản xuất các enzyme thủy phân keratin qua quy trình sử dụng môi trườngrắn cũng đã được nghiên cứu [86] Parkash và cộng sự [87] đã nghiên cứu sảnxuất keratinase bằng các vi sinh vật lên men tĩnh

Keratinase vi sinh vật được coi là chất xúc tác sinh học đầy hứa hẹn chocác mục đích khác nhau, bao gồm các ứng dụng trong thức ăn chăn nuôi, phânbón, chất tẩy rửa, thuộc da, và các ngành công nghiệp dệt, ngoài ra còn ứngdụng trong dược phẩm và ứng dụng y sinh học [77, 88] Mặc dù vậy, so vớicác ngành công nghiệp sản xuất enzyme khác thì keratinase vẫn còn trong giaiđoạn non trẻ Bảng 1.2 đưa ra các ứng dụng hiện tại và tiềm năng củakeratinase

Các keratinase có giá trị phân hủy protein keratin khó tan Chính vì vậy, sựhiểu biết về vi sinh vật sản xuất keratinase và các đặc tính hóa sinh củakeratinase sẽ góp phần trong việc quản lý nguồn chất thải keratin trong nôngnghiệp một cách hợp lý và hiệu quả Ngoài ra, sử dụng các kerainase làm tăngđường dẫn thuốc, quá trình hydroxyl hóa, sản xuất các film thủy phân bằngsinh học, và sản xuất các nguyên liệu sinh học, đã và đang làm tăng lên cácứng dụng của keratinase, cụ thể như sau:

1.5.1 Tăng hàm lƣợng chất dinh dƣỡng trong thức ăn gia súc

Khi bổ sung các vi khuẩn đã được phân lập và tuyển chọn vào các loạithức ăn thì làm cho thức ăn của gia súc bảo quản được lâu hơn, khi gia súc ăn

sẽ dễ tiêu hoá hơn [3, 24].Trong công nghiệp, phế liệu lông được biến đổithành lông bị thuỷ phân sử dụng nhiệt độ và áp suất cao Tuy nhiên sử dụngbột lông đã thuỷ phân để thay thế protein có một số giới hạn Khi thêm 6% bộtlông đã thuỷ phân vào bữa ăn của gà con làm giảm trọng lượng cơ thể củachúng Tuy nhiên, sử dụng thuỷ phân bột lông bằng vi khuẩn có thể tạo ra sảnphẩm thay thế đến 15% protein trong thức ăn gia cầm [26]

Thí nghiệm trên gà, người ta nhận thấy rằng feather lysate, được cân bằng vớimột số axit amin, có thể thay thế đậu nành như là một nguồn protein tới 70%trong khẩu phần Trong các nghiên cứu khác, bột lông thương mại được ủ quađêm với Keratinase để tạo ra một phần bột lông thuỷ phân Khả năng tiêu hoáamino acid của bột lông thủy phân với Keratinase ở gà trưởng thành là 82%cao hơn so với bột lông thủy phân thương mại, 60%

Vậy có thể kết luận rằng keratinase có khả năng thuỷ phân và biến đổi bộtlông vũ thành nguồn protein có thể tiêu hoá ở mức tối đa là 70% protein khẩuphần trong thức ăn

1.5.2 Tạo phân bón

Với tác dụng của các chủng vi khuẩn này chúng có thể sử dụng làm cácloại phân bón vi sinh như: phân vi sinh vật cố định đạm, phân vi sinh vật phân

Lớp Sinh K17

http://www.lrc-tnu.edu.vn

18

Chuyên ngành Di truyền học

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

giải lân, phân vi sinh vật kích thích điều hoà sinh trưởng thực vật, phân vi sinhvật phân giải xenllulo [2]

Dịch môi trường sau khi đã thuỷ phân lông vũ được ly tâm, tinh chế táchchiết đem lại tác dụng kích thích sinh trưởng giúp cây phát triển tốt và chốngchịu tốt với các loại bệnh hại cây trồng

1.5.3 Tạo enzyme trong các ngành công nghiệp

Chủng vi khuẩn Bacillus Licheniformis ngoài tác dụng thuỷ phân tốt hợp

chất keratin trong lông vũ còn có tác dụng quan trọng trong ngành sản xuấthai enzyme proteases và amylases [9, 10] Các enzyme phân giải protein làcác enzyme quan trọng nhất trong công nghiệp vì các ứng dụng rộng rãi củachúng trong công nghiệp tẩy rửa, sữa, dược, thuộc da và công nghiệp thựcphẩm Keratinase trong môi trường lông kích thích tiết ra ít nhất hai proteasekiềm là subtilisin Carlsberg và subtilisin BPN có khả năng chịu nhiệt (35-

37oC) và ổn định trong thời gian dài Hai protease này thuộc nhóm subtilisin.Subtilisin Carlsberg là protease vi sinh vật công nghiệp quan trọng nhất, được

sử dụng nhiều trong sản xuất các chất tẩy rửa Subtilisin Carlsberg có tính đặchiệu rộng, thủy phân nhiều loại liên kết peptide cũng như các liên kết ester,nhất là những liên kết được tạo thành từ các amino acid thơm Dưới tác dụngcủa enzyme này, một số triglyceride cũng có thể bị thủy phân như tripropionin

và tributyrin Subtilisin Carlsberg thủy phân từ 30 đến 40% liên kết peptidecủa casein Subtilisin BPN là một dãy protease ngoại bào và là một lớpenzyme đại diện lớn nhất của dãy protease có cấu trúc đặc trưng là α/β/α vàtrung tâm hoạt động gồm Ser 221, His 64, Asp 32 Cấu trúc không gian bachiều của chúng bền vững trong khoảng pH rộng và ngay cả khi có mặt củadung môi hữu cơ Hai protease này đều phân huỷ keratin trong lông thành cácpeptide ngắn và axit amin, những chất này được vi sinh vật sử dụng làmnguồn cacbon và nitơ

1.5.4 Cải tạo đất

Như chúng ta đã biết hệ vi sinh vật trong đất có tác dụng cải tạo đất rấtlớn Nơi nào càng chứa nhiều vi sinh vật thì tại đó đất càng tơi xốp và giàuchất dinh dưỡng Trong thành phần của hệ vi sinh vật đó có rất nhiều chủng vikhuẩn mà chúng ta đã phân lập và tuyển chọn được Khi biết chính xác têncủa từng chủng vi khuẩn ta có thể bổ sung vào từng loại đất cây trồng thíchhợp [1] Những chủng vi khuẩn được bổ sung sẽ cải tạo đất, làm tăng độ kếtdính của đất và làm cho cây trồng được phát triển nhanh hơn vì có nhiều chấtdinh dưỡng cần thiết Ngoài ra những vi khuẩn này còn có thể tạo ra tính đốikháng với các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng.

1.5.5 Đối với môi trường sinh thái

Hiện nay, với sự phát triển của nghành chế biến gia cầm, đã kéo theo mộtlượng lớn rác thải lông vũ từ các khu giết mổ và trang trại chăn nuôi Nếukhông được xử lý thì lượng rác thải này sẽ gây ra những mùi hôi thối từ khí

H2S làm ảnh hưởng đến cuộc sống của con người và môi trường sống Chúng

ta có thể bổ sung các chủng vi khuẩn đã được phân lập tuyển chọn vào cácđống rác ủ để các chủng vi khuẩn này phân huỷ các hợp chất khó tiêu huỷ nhưlông vũ Đây là ý nghĩa rất quan trọng giúp môi trường được trong sạch vàgiảm thiểu sự ô nhiễm một cách cần thiết.

1.5.6 Tạo hợp chất màu

Một số vi sinh vật như tảo, nấm và vi khuẩn tạo ra các chất màucarotenoid Trong công nghiệp, chúng được sử dụng làm chất màu thực phẩm.Cantaxanthin, một xantophyll carotenoid được sử dụng như thức ăn bổ sungcùng với astaxanthin trong công nghiệp gia cầm nhằm cải thiện màu của gà,lòng đỏ trứng gà Cantaxanthin chính là chất màu được các chủngKeratinase.rosea tổng hợp

1.5.7 Ứng dụng trong công nghiệp dược và sản xuất thực phẩm chức năng

Các peptide có hoạt tính sinh học từ keratin có chứa trong các vật liệu nhưlen, da, tóc và lông là một trong những thành phần của thực phẩm chức năng

có giá rẻ và phong phú từ các nguồn tự nhiên Các chuỗi axit amin giàu prolin

có hoạt tính sinh học đượcdùng để phòng chống các bệnh cho con người baogồm: ngăn chặn sự hình thành khối u, kiểm soát tăng huyết áp và bệnhAlzheimer [24]

PHẦN II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Nguyên liệu

2.1.3 Thiết bị

Các thiết bị được sử dụng đặt tại Phòng Vi sinh vật đất và Phòng Thínghiệm Trọng điểm, Viện Công nghệ Sinh học – Viện Khoa học và Côngnghệ Việt Nam

2.1.4 Môi trường nuôi cấy

2.1.4.1 Môi trường Broth Peptone [16]

KH2PO4

2.1.4.2 Môi trường I

3,5 g1,5 g

H2OpH

1000 ml7,2 ±0,2

Môi trường để phân lập chủng Bacillus licheniformic [12]

NH4Cl

K2HPO4

0,5 g0,3 g

Bột lông vũThạch

2.1.4.5 Môi trường đệm Phosphate – buffered – Saline [17]

1000 ml7,2- 7,3

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao

2.2.1.1 Lấy mẫu và đo pH đất

Lấy mẫu

Loại bỏ lớp dất dày 2-3 cm trên bề mặt Sau đó dùng dao hay xẻng để lấynhững tảng đất theo độ sâu của lớp đất nghiên cứu Các mẫu đất và lông lấyđược cho vào túi li lông tiến hành phân tích ngay hoặc được bảo quản ở 40C

2.2.1.2 Phân lập chủng vi khuẩn Chryseobacterium

Từ các mẫu lông thu được, cân 10 gram lông ủ trong môi trường brothpeptoneở 24h, 30oC Sau đó lấy 1ml dịch nuôi cho vào 90 ml nước vô trùng

(độ pha loãng 10-1) Dùng pipet vô trùng hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm cóchứa sẵn 9 ml môi trường nước muối sinh lý vô trùng (độ pha loãng là 10-2),thay pipet tiếp tục hút 1 ml dung dịch vừa pha loãng sang ống tiếp theo Tiếptục làm như vậy ta sẽ được các dung dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 , hút 0,05

ml dịch pha loãng trải ra đĩa thạch chứa môi trường III Mỗi nồng độ phaloãng được lặp lại 3 lần và được nuôi ở 30oC Sau 24, 48 giờ số lượng khuẩnlạc được đếm bằng mắt thường và tiến hành chọn khuẩn lạc theo hình tháiriêng

2.2.1.3 Phân lập chủng vi khuẩn Vibrio

Từ các mẫu lông thu được, cân 10 gram lông đưa vào môi trường đệmPhosphate – buffered – Saline (PBS) → lắc 20 - 30 phút, 200v/p Sau đó lấy1ml dịch nuôi cho vào 90 ml nước vô trùng (độ pha loãng 10-1) Dùng pipet vôtrùng hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml môi trường nướcmuối sinh lý vô trùng (độ pha loãng là 10-2), thay pipet tiếp tục hút 1 ml dungdịch vừa pha loãng sang ống tiếp theo Tiếp tục làm như vậy ta sẽ được cácdung dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 , hút 0,05 ml dịch pha loãng trải ra đĩathạch chứa môi trường II Mỗi nồng độ pha loãng được lặp lại 3 lần và đượcnuôi ở 37oC Sau 24, 48 giờ số lượng khuẩn lạc được đếm bằng mắt thường vàtiến hành chọn khuẩn lạc theo hình thái riêng

2.2.1.4 Phân lập chủng vi khuẩn Bacillus

Từ các mẫu đất thu được ta nghiền nhỏ, cân 10 gram cho vào 90 ml nước

vô trùng (độ pha loãng 10-1) → lắc 30’, 200v/p Sau đó dịch mẫu được xử lýsốc nhiệt ở 80oC trong thời gian 10 phút Dùng pipet vô trùng hút 1 ml mẫu đãđược ủ ở 80oC trong 10 phút cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 9 ml môitrường nước muối sinh lý vô trùng (độ pha loãng là 10-2), thay pipet tiếp tục

hút 1ml dung dịch vừa pha loãng sang ống tiếp theo Tiếp tục làm như vậy ta

sẽ được các dung dịch pha loãng 10-3, 10-4, 10-5 (pha loãng 9-10 lần), hút

0,05 ml dịch pha loãng trải ra đĩa thạch chứa môi trường I Mỗi nồng độ phaloãng được lặp lại 3 lần và được nuôi ở 37oC Sau 24, 48 giờ số lượng khuẩnlạc được đếm bằng mắt thường và tiến hành chọn khuẩn lạc theo hình tháiriêng.

2.2.2 Xác định khả năng thuỷ phân lông vũ

2.2.2.1 Nuôi giống cấp 1 vào môi trường MPA

Cách tiến hành:

- Pha môi trường MPA (đã nêu ở phần 2.1.4.7)

- Dùng que cấy giống, hơ phần đầu của que cấy giống trên trên ngọn lửa đèncồn cho cháy đỏ rực Sau đó đưa qua đưa lại phần thân của que cấy trên trênngọn lửa đèn cồn để vô trùng tuyệt đối→ Làm nguội que cấy→ Lấy 1 ít chủngtrong ống nghiệm đưa vào các bình môi trường, đồng thời giũ mạnh que cấy

để cho tất cả chủng giống được cấy vào môi trường → Ghi tên chủng và ngàycấy ngoài vỏ bình → Đem đi nuôi lắc qua đêm, ở nhiệt độ 30oC với vận tốc

200 vòng/phút

(Lưu ý: Khi lấy chủng phải thật khéo không được để chạm vào thành ốngnghiệm và khi mở nắp bình phải hơ miệng bình môi trường và nút bông quangọn lửa đèn cồn để tránh nhiễm khuẩn)

Cấy giống cấp 1 vào bình môi trường nuôi lắc có bổ sung lông vũ

Cách tiến hành:

- Pha môi trường nuôi lắc lông vũ (đã nêu ở phần 2.1.4.6)

- Dùng pipet thuỷ tinh lấy 0,5 ml giống cấp 1 cho vào bình môi trường (mỗibình 1% giống) Mỗi chủng giống cấy vào 1 bình Sau đó đem đi nuôi lắccùng với bình đối chứng ở 30oC - 35oC, với tốc độ 200 vòng/phút, trongkhoảng thời gian là 3-5 ngày

- Pha loãng và cấy trải giống cấp 1, theo dõi các chủng giống qua các ngàynuôi cấy

Nhận xét và đo pH của dịch nuôi từng chủng sau khi nuôi cấy

Chuyên ngành Di truyền học

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

- Đo pH, nhận xét của từng chủng nuôi cấy

- Xác định trọng lượng lông còn lại sau thời gian nuôi lắc (Làm khô lông vàcân khối lượng còn lại sau nuôi cấy lắc) → xác định tỉ lệ % về khả năng thuỷphân lông vũ của các chủng vi khuẩn theo công thức:

A (%): Tỉ lệ phần trăm về sự thuỷ phân của các chủng

mBĐ: Trọng lượng lông vũ ban đầu

mC: Trọng lượng lông vũ còn lại sau thời gian nuôi cấy lắc

→ Chọn lọc các chủng vi khuẩn có khả năng thủy phân keratin mạnh nhất(sinh keratinase cao)

2.2.2.2 Xác định mật độ tế bào

Mật độ tế bào vi khuẩn sau khi pha loãng và cấy trải trên môi trường đượctính bằng công thức:

Y = a x 20 x 10 n

Y: Số khuẩn lạc thu được trên 1 ml dịch

a: Số khuẩn lạc thu được trên đĩa thạch

20: (1000 µl/50 µl)

10 n : Độ pha loãng mẫu.

2.2.3 Lựa chọn môi trường thích hợp cho các chủng vi khuẩn có khả năng sinh keratinase cao

Các chủng vi khuẩn đã được tuyển chọn là những vi khuẩn có khả năngthuỷ phân lông vũ tốt nhất Sau đó đem đi thử nghiệm trên các môi trườngkhác nhau với mục đích là tìm ra môi trường thích hợp và có giá trị kinh tế.Chuẩn bị môi trường để cấy chủng bao gồm: Môi trường giàu dinh dưỡng(môi trường MPA), môi trường dinh dưỡng bình thường (môi trường khoáng)

và môi trường nghèo dinh dưỡng (môi trường nước)

Cách tiến hành: các bình môi trường làm như phần phương pháp nghiên cứu

(2.2.2.1)

- Cấy giống cấp 1 vào các bình thử môi trường nuôi lắc có bổ sung lông vũ

Cách tiến hành: làm như phần phương pháp nghiên cứu (2.2.2.1).

Các chủng được thử trên các khung nhiệt độ là: 25oC, 30oC, 35oC và 40oC.Chuẩn bị giống cấp 1, cấy giống cấp 1 vào các bình môi trường làm như phầnphương pháp nghiên cứu (2.2.2.1) Sau đó, pha loãng để đếm mật độ giốngcấp 1 sau 3 ngày nuôi lắc Đo pH, nhận xét sự thuỷ phân của từng chủng trênmỗi nhiệt độ sau từng ngày nuôi cấy Cân khối lượng lông còn lại của từngchủng trên các nhiệt độ sau 3 ngày nuôi cấy

2.2.5 Xác định đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn

Các chủng vi khuẩn được ria sạch trước 24 h, đưa lên lam kính đã nhỏ sẵn

1 giọt muối sinh lý Đánh tan sinh khối rồi đậy lam men lên Sau đó, cácchủng vi khuẩn được đem lên kính hiển vi để nhận biết về hình dạng, kíchthước tế bào